Bài giảng Giới thiệu về đột biến gen TS.BS. Hoàng Anh Vũ

ĐỘT BIẾN VÔ NGHĨA Gen P53 trong ung thư khoang miệng: c.586C>T p.R196X Thường làm mất chức năng protein và gây bệnh... ĐỘT BIẾN MẤT CHỨC NĂNG Đột biến surfactant protein C SP-C trong bệ

GIỚI THIỆU VỀ ĐỘT BIẾN GEN

TS.BS Hoàng Anh Vũ

Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 10 năm 2013

1

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

BÁC SĨ CÓ CẦN BIẾT VỀ ĐỘT BIẾN GEN?

1 Ngày càng nhiều bệnh thuộc các chuyên khoa

3 Thông tin hội thảo khoa học, sách chuyên khoa cũng thường đề cập đến đột biến gen

(Cooper DN, Hum Mutat 2010)4

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

3 CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN

4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

5 MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN

6 CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

TỪ GEN ĐẾN SẢN PHẨM PROTEIN

7

PROTEIN THỰC HIỆN CHỨC NĂNG

8

KHÁI NIỆM VỀ GEN (1)

Gen là một phần của phân tử

deoxyribonucleic acid (DNA) có vai trò

làm khuôn mẫu cho việc phiên mã để tạo

thành phân tử ribonucleic acid (RNA) có

chức năng quan trọng:

• Trình tự gen chứa 4 loại base là

adenine (A), cytosine (C), guanine (G)

và thymine (T)

• RNA: Thymine được thay bởi uracil (U)

• Purine = A & G

• Pyrimidine = C, T & U

NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION

11

12

TRÌNH TỰ DNA CỦA GEN

• Codon: Bộ ba nucleotide mã hóa cho 1 amino acid

• Start codon ở người là ATG (mã hóa methionine): A được đánh số +1

• Stop codon ở người là TAG, TAA hoặc TGA

• Chiều của gen 5’ -3’

KHÁI NIỆM VỀ GEN (2)

15

Amino Acid Three-Letter

Abbreviation

One-Letter Abbreviation

INTRON CẦN CHO SỰ GHÉP NỐI EXON

17

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN

4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

5 MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN

6 CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

ĐỊNH NGHĨA ĐỘT BIẾN GEN (MUTATION)

Đột biến gen: Sự thay đổi trình tự nucleotide của gen

Phân loại theo cấu trúc

1 Mất nucleotide (deletion): frameshift hay in-frame?

2 Thêm nucleotide (insertion)

3 Thay thế nucleotide:

+ Đồng nghĩa/ im lặng (synonymous/ silent): Không

thay đổi amino acid

+ Sai nghĩa (missense): Thay đổi amino acid

+ Vô nghĩa (nonsense): Tạo stop codon

4 Đột biến phức tạp

Phân loại theo chức năng

1 Đột biến mất chức năng (loss-of-function)

2 Đột biến thêm chức năng (gain-of-function)

DANH PHÁP VỀ ĐỘT BIẾN GEN

(den Dunnen JT, Human Mutation 2000;15:7-12)

• Adenine đầu tiên của mã khởi đầu ATG mang số +1,

• “c.” để chỉ cDNA (complementary DNA)

• “g.” để chỉ genomic DNA

• “IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron mang số

+1, G của AG cuối cùng trong intron mang số -1

2 c.218T>C: Thay T bằng C tại vị trí 218 của cDNA

3 IVS2+1G>T: Thay G bằng T tại vị trí đầu tiên của intron 2

ĐỘT BIẾN VÙNG EXON

Đồng nghĩa

(silent)

Sai nghĩa (missense)

Vô nghĩa (nonsense)

21

ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE

Đột biến gen KIT trong u mô đệm đường tiêu hóa

(c.1669_1674del hoặc p.W557_K558del)

Bảo tồn khung đọc (in-frame mutation)

ĐỘT BIẾN MẤT NUCLEOTIDE

Lệch khung đọc (frameshift mutation)

Gen BRCA1 trong ung thư vú: c.5335delC

ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE

Gen KIT trong bệnh u mô đệm đường tiêu hóa:

c.1509_1510insGCCTAT; p.Y503_F504insAY

Bảo tồn khung đọc

Nhân đoạn nội tại (internal tandem duplication)

ĐỘT BIẾN THÊM NUCLEOTIDE

Gen ATP7B trong bệnh Wilson: c.525_526insA

Lệch khung đọc

ĐỘT BIẾN IM LẶNG

(Gen perforin (PRF1) trong hội chứng thực bào máu: c.630C>T)

NSP (Single Nucleotide Polymorphism): > 1% dân số

• Có thể ảnh hưởng tới tính mẫn cảm với bệnh

(predisposition), tính đáp ứng với thuốc (IL28B:

rs12979860 liên quan với đáp ứng điều trị bằng

peg-interferon/ribavirin trong viêm gan mạn do HCV),…

ĐỘT BIẾN SAI NGHĨA

Gen HBB trong β-thalassemia (HbE):

ĐỘT BIẾN VÔ NGHĨA

Gen P53 trong ung thư khoang miệng: c.586C>T

(p.R196X)

Thường làm mất chức năng protein và gây bệnh

29ĐỘT BIẾN PHỨC TẠP

Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N

ĐỘT BIẾN MẤT CHỨC NĂNG

Đột biến surfactant protein C (SP-C)

trong bệnh phổi mô kẽ ở trẻ em:

c.218T>C (p.I73T)

ĐỘT BIẾN THÊM CHỨC NĂNG

• Đột biến JAK2 trong rối loạn

tăng sinh tủy (đa hồng cầu, tăng

tiểu cầu nguyên phát, xơ tủy)

• Các đột biến tiền gen sinh ung

trong ung thư (proto-oncogene)

• “hotspot”: Vùng thường tập

trung đột biến của gen

ĐỘT BIẾN VÙNG INTRON GÂY MẤT EXON

32

ĐỘT BIẾN VÙNG INTRON GÂY CHÈN ĐOẠN

33

Đột biến gen BTK trong suy giảm miễn dịch nguyên phát

X- linked agammaglobulinemia (Fiorini M, Human Mutation 2004)

PHỔ ĐỘT BIẾN CỦA MỘT GEN (MUTATION SPECTRUM)

• Các đột biến mất chức năng thường phân bố khắp

chiều dài của gen

• Các đột biến thêm chức năng thường tập trung hơn

nhưng cũng gồm nhiều kiểu đột biến đa dạng

34

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN

3 CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN

5 MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ BỆNH LÝ CÓ ĐỘT BIẾN GEN

6 CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

• Đột biến gen đã biết trước:

Các kỹ thuật dựa trên PCR

1 Khuôn mẫu (template DNA): đoạn gen mục tiêu được

khuếch đại (beta-globin: 1,6 kb/3.300 Mb = 1/2.000.000)

3 Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs): Nguyên liệu cho

tổng hợp chuỗi DNA

định pH, nồng độ HCl và Mg++ phù hợp)

CÁC THÀNH PHẦN QUAN TRỌNG CỦA PCR

GENOMIC PCR VÀ RT-PCR (reverse transcriptase)

Genomic-PCR:

• Khảo sát các exon và vùng nối exon – intron

• Có thể sử dụng các bệnh phẩm bảo quản trong mô vùi nến

PCR):

• Chỉ khảo sát các exon, không khảo sát intron

• Đặc biệt quan trọng trong khảo sát các gen tổ hợp (fusiongene) và biểu hiện gen

• Bệnh phẩm phải được bảo quản đúng cách: Không nên dùngchống đông heparin (máu, tủy), không dùng chất bảo quản môtươi, Nếu muốn giữ mẫu lâu nên giữ đông lạnh từ -200C (môđặc) hoặc trong sepasol (tế bào máu hoặc tủy)

GENOMIC PCR VÀ RT-PCR

1 Tạo sản phẩm ngắn: Vài trăm bp, tối đa 5 kb

2 Thiếu “trung thực” (infidelity): Taq DNA

polymerase không có hoạt tính proofreading

NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR

Phải sử dụng polymerase có hoạt tính sửa sai khi cần giải trình tự chuỗi DNA

Real-time PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) Tinh sạch

Lys Val Val

GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT

561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu

CCT TAT GAT

AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G

Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe

Lys Val Val

GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT

561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu

CCT TAT GAT

AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G

Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe

Điện di

PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR

43MÁY GIẢI TRÌNH TỰ

DNA sequencing

3. Tim mạch: Brugada syndrome (SCN5A)

Idiopathic cardiac hypertrophy

(sarcomere-gene mutations),Wafarin (CYP2C9, VKORC1)

4 Sản phụ khoa: Metformin/polycystic ovary

syndrome (STK11)

5 Nội tiết:

Tiểu đường type 2 (TCF7L2 polymorphisms)

6 Di truyền: Wilson, tăng cholesterol máu,

7 .

Chẩn đoán các đột biến gen

• Nguy cơ bệnh: BRCA1/2 (ung thư vú), APC (đa polyp tuyến gia đình), VHL (ung thư thận), đột biến vùng precore của HBV (ung thư gan), LDLR (tăng cholesterol gia đình),

• Chẩn đoán bệnh: JAK2 (tăng sinh tủy), globine

tật bẩm sinh

• Tiên lượng bệnh: P53 (các loại ung thư); FLT3, NPM1

(bạch cầu cấp), IDH1 và IDH2 trong glioma,…

• Điều trị nhắm trúng đích phân tử: EGFR (ung thư phổi),

(melanoma)

PCR VÀ DNA SEQUENCING: ỨNG DỤNG

45

ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide):

CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN ĐIỂM

1 100-bp ladder

ĐỘT BIẾN ĐIỂM JAK2 V617F

TRONG RỐI LOẠN TĂNG SINH TỦY

A

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 CÁC KHÁI NIỆM VỀ GEN

3 CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN GEN

4 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

6 CÁC LƯU Ý KHI NÓI VỀ ĐỘT BIẾN GEN

BỆNH THALASSEMIA

49

ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GLOBIN GÂY

α-THALASSEMIA

(Chong S, Clinical Chemistry 2000)50

ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN (HBB)

ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG BỆNH WILSON

• Rối loạn di truyền lặn/ NST thường.

• Lắng đọng đồng trong các mô.

• Triệu chứng tâm thần, thần kinh và bệnh gan.

• Đột biến trên 21 exon của gen ATP7B

p.S105X (exon 2)

c.525_526insA (exon 2)

p.R778L (exon 8)

52

ĐỘT BIẾN GEN BTK TRONG X-LINKED AGAMMAGLOBULINEMIA

• Rối loạn di truyền liên kết giới tính.

• Không tạo được tế bào B trưởng thành,

thiếu hụt kháng thể trong máu.

• Dễ nhiễm trùng nặng.

• Đột biến trên 19 exon của gen BTK.

53

VAI TRÒ BTK TRONG DÒNG TẾ BÀO B

54

ĐỘT BIẾN GEN PERFORIN (PRF1)TRONG HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS

(Weitzman S, Blood 2011)

(Voskoboinik I, Nat Rev Immunol 2006)

ATG

55

ĐỘT BIẾN GEN UNC13D (MUNC13-4)TRONG HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS

56

(Gholam C, Clinical and Experimental Immunology 2011)

CÁC VẤN ĐỀ VỀ ĐỘT BIẾN GEN

2 Đột biến gây bệnh hay vô hại?

• Dựa vào các nghiên cứu đã công bố (đột biến hay SNP)

• Các biến thể mới (variant): Nghiên cứu chức năng

• Chưa có cơ sở dữ liệu của người Việt

1 Phổ đột biến gen giữa các chủng tộc thường khác nhau

• Cần nghiên cứu trên người Việt Nam

• Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nên được sử dụng

• Phát triển các bộ kit chẩn đoán phù hợp

3 Chi phí nghiên cứu/ xét nghiệm cao

4 Vai trò quan trọng của bác sĩ lâm sàng trong chỉ định và

tư vấn trước/sau xét nghiệm

TÓM TẮT NHỮNG ĐIỂM CHÍNH

1 Đột biến gen gặp trong rất nhiều bệnh lý ở người

2 Xác định đột biến gen có thể giúp cho chẩn đoán, tiên

lượng, điều trị và đánh giá nguy cơ bệnh tật

3 Đột biến gen có thể xảy ra ở exon và intron, không phải

mọi đột biến đều gây bệnh

4 Phổ đột biến mất chức năng thường phân tán, đột biến

thêm chức năng nằm trong vùng “hotspot” của gen

5 Đột biến gen thường khác nhau giữa các chủng tộc

6 Giải trình tự DNA là phương pháp thích hợp cho việc

phát hiện đột biến trên dân số nghiên cứu mới

7 Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần không định danh

được các đột biến mới