Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền của Cordyceps spp. tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà tỉnh Lâm Đồng

Chỉ thị sinh học phân tử với cặp primerITS5/ITS4 hỗ trợ các kết quả về hình thái học bằng cách bước đầu xác định 20 mẫuCordyceps thuộc 2 nhóm loài O.. Tổng diện tích của vườn quốc gia là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

TRÀN MINH HIÉN

ĐÁNH GIÁ DA DẠNG DI TRUYEN CUA CORDYCEPS SPP.

TAI VUON QUOC GIA BIDOUP - NUI BA

TINH LAM DONG

LUẬN VAN THAC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HOC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

TRÀN MINH HIÉN

ĐÁNH GIÁ DA DẠNG DI TRUYEN CUA CORDYCEPS SPP.

TAI VUON QUOC GIA BIDOUP - NUI BA

TINH LAM DONG

Chuyén nganh: CONG NGHE SINH HOC

ĐÁNH GIÁ DA DANG DI TRUYEN CUA CORDYCEPS SPP.

TAI VUON QUOC GIA BIDOUP - NUI BA

TINH LAM DONG

TRAN MINH HIEN

Hội đồng cham luận van:

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các sô liệu, kêt quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được tôi công bô trong

bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Trần Minh Hién

LỜI CẢM ƠN

Những lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất xin được gửi đến:

Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã hỗ trợ toàn bộ, trang thiết bị

dé nghiên cứu này được hoàn thành

Trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thị Mai đã tận tình, chu đáo hỗtrợ và giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này.

Trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS Huỳnh Văn Biết đã tận tình, chu đáo hỗ

trợ và giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến bạn Trương Quang Toản và các thành viêntrong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học vàMôi trường, Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ détôi có thé hoàn thành nghiên cứu này

Xin cảm ơn tập thể lớp cao học CNSH.2019 đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kiếnthức, gắn bó và cùng nhau tạo nên những kỷ niệm vui buồn, những khoảnh khắcđáng nhớ trong thời gian qua.

Xin cảm ơn quản lý trực tiếp của tôi là ông Morten Borge và ông JesperClausen đã hỗ trợ cho tôi được linh động trong thời gian làm việc dé hoàn thànhkhóa học và luận văn này Xin cảm ơn chị Đặng Thị Đoan Trang và các anh chịtrong phòng nghiên cứu và phát triển sản phâm của công ty Deheus đã tư vấn vềkiến thức và hướng dẫn thao tác trong việc xử lý với mẫu thí nghiệm và dữ liệu báocáo.

Bên cạnh đó, tôi cũng gửi lời cám ơn đến Ban giám hiệu trường Đại họcNông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh, các quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinhhọc đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi, giúp tôi hoàn thiện kỹ năng cũng nhưkiến thức

Đặc biệt hơn cả, cảm ơn ba mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con,luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con được học tập, là niềm vui và độnglực lớn nhất cho con trong suốt thời gian qua

TÓM TATCordyceps đã được biết đến với nhiều thành phan, công dụng quí giá đối vớisức khỏe con người như: cordycepin, adenosine và hydroxyethyl adenosine Trênthế giới có hơn 680 loài Cordyceps Tuy nhiên, chỉ có hai loài là O sinensisvaCordyceps militaris được ứng dụng trong thương mại và nghiên cứu nhiều nhất, vi

vậy cần tìm kiếm các loài khác có thành phần, công dụng tương tự hoặc thậm chí tốt

hon dé thay thé O sinensisva Cordyceps militaris Trong đó bước quan trọng đầutiên là hiểu được sự đa dang của các loài Cordyceps bản địa ở Việt Nam đặc biệt làkhu vực Biduop Núi Bà nơi có sư phong phú về hệ động thực vật và nam Với mụctiêu đó, 24 mẫu Cordyceps được thu thập từ Bidoup Núi Bà dé đánh giá các chỉ tiêuhình thái của ký chủ và quả thể Ngoài ra, các phần như perithecia, asci, ascopoređược quan sát dưới kinh hiển vi quang học để đánh giá sâu hơn về hình thái Sau đó,

24 mẫu Cordyceps được tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB cho chu trìnhPCR với cặp primer ITSS/ITS4 Trình tự các sản phẩm PCR được sử dụng dé cayphát sinh loài với 22 trình tự trên ngân hang gen Dựa trên chi thị hình thái, cho kếtquả là tương đồng cao với loài Ó sphecocephala ký sinh trên bộ cánh mang và loài

O nutans ky sinh trên bộ Bộ cánh nửa Chỉ thị sinh học phân tử với cặp primerITS5/ITS4 hỗ trợ các kết quả về hình thái học bằng cách bước đầu xác định 20 mẫuCordyceps thuộc 2 nhóm loài O sphecocephala và O nutans tương đồng với kếtquả đánh giá hình thái với mức bootstrap tương ứng với 100% cho nhóm mẫu thuộcloài O nutans và 76% cho nhóm mau Cordyceps thuộc loài O sphecocephala Déđánh giá rõ hơn sự đa dạng giữa các cá thể, chỉ thị ISSR được sử dụng với 12primer được sang lọc từ 21 primer cho két qua số tỷ lệ đa hình cao từ 88,89% đến

100,00% với số băng đa hình từ 10 - 12 băng và chia 20 mẫu thử nghiệm thành 5

nhóm Việc sử dụng chỉ thị ITS và ISSR rất hiệu quả khi kết hợp với chỉ thị hìnhthái giúp góp phần định danh và phân loại và đánh giá đa dang di truyền trongnghiên cứu này.

Từ khóa: Cordyceps spp., Da dang di truyền, hình thái, ITS, ISSR

Cordyceps has been known for a variety of functional and valuable human health components such as: cordycepin, adenosine, and hydroxyethyl adenosine that lead to high demand for their usage There are more than 680 species of Cordyceps around the world However, O sinensisand Cordyceps militaris are the two most researched species, that led to the pressure to look for other species that have at least

similar functions or even better than O sinensisand Cordyceps militaris Following

by the first step should be diversity understanding With that objective, 24

specimens collected of Cordyceps from Bidoup Nui Ba were examined for

morphology for host and qua théta, and also examined with microscopic for thesharp Perithecia, Asci, and Ascopore Then 20 specimens were extracted DNA with the CTAB method for the PCR cycle with ITS4/ITSS primers PCR products were sequenced to get data for phylogeny tree construction by combining with 22 reference sequences from Genbank Based on the finding of morphology we found that collected samples related to 2 different species: O sphecocephala which is parasitic on Hymeoptera and O nutans which 1s parasitic on Hemiptera Molecular phylogeny analyses of ITS support the results of morphology results by divined 20 samples into 2 different clade like what finding by morphology with high with bootstrap support corresponding to 100% for the O nutans group and 76% for the O sphecocephala group To better assess the diversity between individuals, the ISSR primers was used with 12 primers were screened from 21 primers, resulting in a high polymorphic rate from 88.89% to 100.00% with the number of polymorphic bands from 10 to 12 bands and divide 20 test samples into 5 groups By combining morphology markers with ITS and ISSR contributing to faster, more accurate in identification and classification for Cordyceps.

Keywords: Cordyceps spp., diversity, ITS, ISSR, morphology

MỤC LỤC

Trang tựa

Tay ni creer coe 1

Ley Teh: cá a0 casecsessseisrinieisiobuit ti123156158633Đ3863693E83ESESXS.S ESH20G.SN4SGGE40E104G3395485225E088 il

LO1 CAM O11 0 1V

Tóm tẮ( - 2 5252222E2221221211211211221211211211211211211211111111111111112121211221 xe VNHG tae ee ee ee ee ViiDanh mục chữ viết tat 0 cccccccccscecscseesecseseesecsececsecsecsesscsseesscsvcsesecsecsesecereseseceeseeeeeees xDanh muc Cac Dang TT xH

THỦ ĐÃ U sesueneetoiideirtsorG0DEAGi008610/6001838061108550/00150G0140630019015010005G080006001/01/2010 1tChuơnz T1 Recess 31.1 Téng 0/162.) -:iẻ(44 Ả.Ả 31.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại Cozj€eps -: +©22©5255z552252s25c+: 3(OB địa điểm Tinh: Thấi Lea, ee 81.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái của O speeocephala - -: 2 5 - 101.1.1.3 Mô tả đặc điểm hình thái của ký chủ của O nutans và O sphecocephala 12

1.1.2 Chu trình sống của Cordyceps -22-©222222++222+22ESz2E2+2Exrsrrxesrrrer 15

1.1.3 Thành phần được chất của Ó sinensis .ccccccccccsseesvesseessesseessessesstessessesses 151.2 Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà -2-©5-222222222212322322122112122122122222e2 16[UP TN TA BY cere css research aac ere cere pectin cement cron tee 161.2.2 Đặc điểm địa lý- thủy văn -2-©22222222222222122112712211221 221122121121 xe 171.3 Da dạng sinh học và đa dang di truyên -. 2-©22222222+22++2z2zxzrxrzrrerxeee 181.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng sinh học và đa dạng di truyén 191.5 Một số phương pháp nghiên cứu đa dang di truyền -. 2-5222: 22

1.5.2 Phương pháp sử dụng chi thị isozyme 55c ceseeeeceseeseeeseeeesees 22

1.6 Một số Chỉ thị dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền - 23

1.6.2 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) -+5-s>+-+>+ 24 1.6.3 RAPD (Random Amplified polymorphism DNA) - -< 5+ 25 1.6.4 SSR (Simple Sequence Repeat) 2 22 2232221221221 221 2211512111 exrre 261.6.5 Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng kỹ thuật ISSR -2- 2522552 27

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoai NUGC - 5- 5+ ++<*=++x£++eeexeezxes 29

1.7.1 Các công trình nghiên cứu trong nước liên quan đến đa dạng di truyền nắm ký

Sth COM trUng 11115 291.7.2 Các công trình nghiên cứu trên thé giới liên quan đến da dạng di truyền nam

kỹ Sih CON FÙHỠ semen essen 10181 5E23390040333381I205530013148300L00043583V9S.0RSESBIDSP.ESESEES829940E 30Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨCU 332.1 Thời gian và địa điỂm 2-©2S222S221921221211211211211211211211211211211211 2112 xe 33

2.2 NOI dung nghién UU 33 2.3 Vật liệu thí nghi@m ccccccccccccesssessesssessesseessessesssessesesessesseesesseessesstsesessesasessess 33

DA THIẾY bị vã hóa C18 beers eecernmuesrmevemanieneinervencemeneresmumrenuecmneneecnmenn 35

DS n01019)112111112197211210115 00141700 TP ẺnSmsn CS 36

2.5.1 Đánh giá đa di truyền bang chi thị hình thái học -2 5-=- 37

2.5.2 Đánh giá đa dang di truyền với chỉ thị phân tử -. 2 ¿2z+s2szzz5sz 382.5.2.1 Ly trích DNA tổng 86 ccscsccsccscsesssesssesnccsecsesssencesiesenesnecsessucsntenscenesnnetucctacs 38

2.5.2.2 Xác định nồng độ DNA và định tính DNA -©2225222222+222zz>2z 382.5.2.3 Đánh giá đa dang di truyền vùng ITS-rDNA -¿22222z2zzz2zz+2 39

2.5.2.4 Đánh giá đa dang di truyền bằng chi thi ISSR -c -: 42

ee de ee) | sang H¡gtHgutncigBGENGS000106600010000040.00001800ui682038 44Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - -ss<©c<eeee+eeereeesee 45

3.1 Sự đa dạng về mặt hình thái học -2- 2¿©22+22+222EE22E22EE22E222E.2Ezzxerxee 45

3.1.1 Đánh giá các:;chỉ tiêu hình that kỹ chủ ác ceek bi 2aeaedi 45

3.1.2 Đánh giá các chỉ tiêu hình thái quả thê - -22©2222++22+z2z+z2zxzecxe2 46

3.2 Định danh loài dựa trên vùng gen rDNA-ÏÏTS - -c+ccsccseeeererreerree 61

3.2.1 Phan ứng PCR với cap primer [TSS5/TTS4 -55-cS+<c+sccsceseeexee 61 3.2.2 Xây dựng cay phat sinh loại dựa trên chỉ thị ITS - 62

3.3.1 Khao sát nhiệt độ cho phản ứng ISSR-PCR . 5-55 5-cS+cc+<ccxx 66 3.3.2 Khao sát primer cho phan ứng ISSR-PCR cece S5 S2 sssreerey 67

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 5-2 5° ©s<£seEeeEreerserrerrserserrsrrserr 72TÀI LIEU THAM KHẢO - 5< 5< 5< 5£ ©S£©S££S££S£EEeEseEseEEerserrerserrsrr 73

Lh rsesteetenenrensooyrtnoivgtorntUia4000000010050019900000070%00TS00990008S) 79

DANH MỤC CHỮ VIET TATAcus Số nhiều của Asci

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

AFLP Amplified Fragment Length Polymophism

SSR Simple Sequence Repeat

ISSR Inter — Simple Sequence Repeat

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

ITS Vung đệm trong được sao ma

IGS Intergenic spacer

rDNA ribosome DNA

VNTR variable number tandem repeat

SSCP Single Strand Conformation Polymophism

OD Optical density

Perithecia Bao tu dang chai

Sclerotium Hanh nam

Scutellum Phién mai

Vườn Quốc Gia

Khu Dự trữ Sinh quyềnBidoup — Núi Bà

Bảng 1.1.

Bảng 2.1.

Bảng 2.2.

Bảng 2.3.

Bảng 2.4.

Bảng 2.5.

Bảng 3.1.

Bảng 3.2.

Bảng 3.3.

Bảng 3.4.

Bảng 3.5.

Bảng 3.6.

Bảng 3.7.

Bảng 3.8.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Mô tả hình thái một số loài nam thuộc chi Cordyceps ( Liu va ctv, 2011)6 Phiếu trông Tín nguÖM THẤỂN xueseescisnd0sg80014i0080200600.2h80.gS0050040180000030050G00440436 34 Chỉ tiết các chỉ tiêu quan sát và đo đạt - 2-55 5522522z22z2zz2zzzse2 37 Danh sách các trình tự va xuất xứ dùng dé xây dựng cây phat sinh loài 40

Ký hiệu mẫu khảo sát nhiệt độ - 22-5252 2z222E22EzzEzzzzxrrxrrs 42 Primer ISSR được sử dụng trong nghiên cứu eee eee 43

Kết quả phân loại nhóm mẫu theo ký chủ; với scale bar:1 em 45

Phân loại mẫu thu thập theo ký chủ -2- 2-5 2+5z+zz2z+zzzzzx+z+z 46 Kết quả do đạt các mẫu Cordyceps trên ký chủ họ Ho ong 54

Kết quả đo đạt các mẫu Cordyceps trên ký chủ họ bọ xít mép 55

Kết quả đo đạt các mẫu Cordyceps trên ký chủ họ bọ xít năm cạnh 56

Kết quả thủy văn tại thời điểm thu mẫu theo mẫu phân bó 59

Tỷ lệ đa hình của các primer ISSR cho 3 mẫu khảo sát 67

Ty lệ da hình của các primer ISSR ee eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeereseseeeeeeees 68

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hinh 1.1, ‘O.ssimersis sài KỸ CU óc eeesessniebisndEeligEiiBRnidLgiEoi2v%4058.2SU6551400 10E038/1G00703000g004603/078 5 Hình 1.2 O sinensisva các loài cùng chi Cordyceps - -c+-c<<-c+-cc<e+ 7Hình 1.3 Bản đồ phân bó loài nam Vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà 8Hình 1.4 O nutans và cấu trúc qua thÊ 2:222222222222S2EEt2EEz2E+zEExrzrrrrrree 9Hình 1.5 Cordyceps sphecocephala và cau tạo sợi bào tử -. -2 11Hiình.1:6 Bo xíÍ:nim:GA1llseeseeenseeisenisserboiroiiniiisikodisaigbosflSEESG0I0104d080451380800800/4660308704 12Hình 1.7 Bọ xit dài (Nguồn Chu Nghiêu, 1960), -. 2-©2255++2c+sez+scsvee 13Hinh 1.8 Ho Ong ii T1 14 Hình 1.9 Vông đời O SIMCHSIS cú cao Gà ga öcg 1446101104414 345815k53K043531536.11-4053885636 15Hhh,1.1C0utrfr tũng TH sa ggaetegtrotbiotdgiorobgitbyEi3gto108g0206000000006 07-0 084006 28Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt qui trình đánh giá đa dang di truyễn -. - 36Hình 3.1 Tóm tắt các đặc điểm định tính quả thẻ - 2-22 5z+22++22z+25+z£2 54Hình 3.2 O mutans và cấu trúc qua thê - 2-22 ©22+22++22++£2++£E+z2zrsrrrsrrreer 57Hình 3.3 Cordyceps và cấu trúc quả thê -5+ 5522222222 ccrrrrrrrerrrree 58Hình 3.4 Bang đồ mô tả vị tri phân bố các mẫu Corj;ceps -. - 58Hình 3.5 Sự phân nhóm theo số quả thê 2-2¿22+22+z222++22xz+zrxzsrrrrzee 60Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp primer ITS5/TTS4 62Hình 3.7 Sơ đồ cây phat sinh loài dựa trên chỉ thị ITS5/ITS4 - 63Hình 3.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ cho phản ứng ISSR-PCR - 67Hình 3.9 Sơ đồ cây phân nhóm với chỉ thị ISSR -2-2- 525225252552 69

MỞ ĐẦU

Đặt Vẫn Đề

Chi Cordyceps được ghi nhận với hơn 680 loài phan bố khắp 6 lục dia tại các

địa hình, khí hậu và kí chủ rất đa dạng (John Holliday và Matt Cleaver, 2008) Tuy

nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài O.sinensis và C militaris; với nhiều hoạt chất trong Đông trùng hạ thảo có giá trịdược liệu thần kỳ như cordiceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl

adenosine (Trần Văn Năm va ctv, 2019) do đó Cordyceps được sử dụng rất nhiều

trong y học dé chữa trị các loại bệnh, giúp kéo dài tuổi thọ, tăng sức bền trong vận

động điền kinh, và còn là thuốc hỗ trợ chống ung thư (Phạm Quang Thu và Lê Thị

Xuân, 2009) Ngoài ra Cordyceps còn có thé ứng dụng dé sản xuất thuốc trừ sâu

sinh học sử dụng trong các lĩnh vực khác như nông nghiệp, phòng trừ dịch hại do có

nhiều chất có hoạt tính sinh học (Bai Duy Ban va Lưu Tham Muu, 2009)

Phạm Quang Thu và Lê Thị Xuân (2009), cho rằng trên thực tế, giá trỊ củanhiều loại nắm kí sinh côn trùng nói riêng còn chưa được biết đến trong khi khu vựcphân bố của Cordyceps rất rộng lớn, ngoại trừ Nam Cực sự phân bố của Cordyceps

Ở các vùng nhiệt đới và các vùng cận nhiệt đới như Nam Á và Đông Á, tính đadạng rất cao (Vũ Tiên Luyện và ctv, 2015; Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, 2009 )

Theo Dai Duy Ban và Lưu Tham Muu (2009), ký chủ của Cordyceps rat dadạng như sâu bướm, côn trùng cánh cứng, bọ xít, chuồn chuôn, ve sau, kiến, nhện

và ngay cả nam Với điều kiện địa lý da dang về địa hình và khí hậu là yếu tổ quan

trong cho sự phát triển của các loại côn trùng là ký chủ của Cordyceps Việt Namnằm trong khu vực nhiệt đới với hệ sinh thái trên cạn; các khu rừng có sự đa dạngsinh học phong phú cả động thực vật do khí hậu nhiệt đới gió mùa với nhiệt độ cao

và lượng mưa lớn Đây là một thuận lợi môi trường cho nam ký sinh côn trùng phát

triển Khu dự trữ sinh quyên Lang Biang nằm ở tinh Lâm Đồng va bao gồm một

khu rừng nguyên sinh rộng lớn với núi Lang Biang thuộc lõi, một trong những bốntrung tâm đa dạng sinh học (Thuan Duc Lao và ctv, 2021) Tọa lạc tại vùng lõi củakhu dự trữ sinh quyền LangBiang, vườn quốc gia Bidoup Núi Bà là sinh cảnh chonhiều loài động vật quý hiếm; đặc biệt các điều kiện tự nhiên trên đây rất thuận lợicho sự phát triển của nam lớn nói chung va nam kí sinh côn trùng nói riêng

Phương pháp định danh phổ biến đối với Cordyceps là dựa trên các chỉ thị

hình thai Tuy nhiên, việc xác định loài nam Cordyceps là rất khó khăn bởi hình thái

chúng thay đồi theo môi trường và hình thức sinh sản hữu tinh và hình thức sinh sản

vô tính Ngoài ra Cordyceps còn chịu tác động của các yếu tố môi trường nên có théxuất hiện dạng dị hình thái điều này gây khó khăn cho các nhà phân loại Do đó,việc phân tích DNA để xác định các loài khác nhau của Cordyceps là cần thiết (DaiDuy Ban và Luu Tham Muu, 2009).

Trên cơ sở đó, dé tài “Đánh giá da dang di truyền của Cordyceps spp tạivườn quốc gia Bidoup núi Bà tỉnh Lâm Đồng” bằng phương pháp giải trình tựvùng rDNA-ITS và chỉ thị ISSR kết hợp với việc đánh giá chỉ thị hình thái được

thực hiện.

Mục tiêu của đề tài

Đánh giá được sự đa dang di truyền của các mẫu Cordyceps spp được thuthập tại Vườn Quốc gia Bidoup - núi Bà dựa trên các đặc điểm hình thái học kết hợp

với việc sử dụng chỉ thị (Marker) phân tử ITS, ISSR.

Yêu cầu của đề tài

- anh giá sự đa dang của các mẫu Cordyceps spp dựa trên đặc điềm hình thai

- Đánh giá sự đa dang di truyền dựa trên trình tự nucleotide ở vùng rDNA- ITScủa các mẫu Cordyceps spp

- - Đánh giá sự đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị ISSR của các mẫu

Cordyceps spp.

Chương 1

TONG QUAN

1.1 Tong quan vé Cordyceps

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại Cordyceps

Cordyceps với đa phần là các giống nam ky sinh trên côn trùng ngành chân

khớp thuộc bộ Hypocreales; Lớp Sordariomycetes; Nganh Ascomycota; Giới Fungi.

Theo Tran Văn Năm và Lê Thị Diệu Trang (2014), Đông trùng hạ thảo (Chinesecaterpillar fungus), còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng thảo,

là một loại đông được quý có bản chất là dang ký sinh của loài nam O Sinensis(thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thé sâu Hepialus fabricius Phần được tinh của

đông trùng hạ thảo đã được chứng minh là do các chất chiết xuất từ nắm Ó

sinensis.

Theo Dai Duy Ban va Luu Tham Muu (2009), hiện nay đã phát hiện đượcnhiều loài Cordyceps, trong đó O Sinensis được chú ý hơn ca về mặt hình thái sinh

học va phân loại Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi O sinensis) O sinensis có

nam dạng quả thé mọc trên xác sâu bướm thuộc giống Hepialus ở độ cao trên 3800

m ở Tây Tạng, các tỉnh Tây Nam Trung Quốc, Nepal và trên các đồng cỏ ở caonguyên thuộc Himalaya Cây nam O sinensisco gốc gắn với đầu của sâu, đầu cóhình chùy (giống Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh, Cord = chùy, ceps = dau).Nam dạng quả thé có mau nâu đen hoặc màu đen, dài khoảng 4 -11 cm, trọnglượng khoảng 0,06 g Sâu khi còn tươi có dạng con tằm, có màu vàng đến màu nâu,đầu màu đỏ nhạt, dai khoảng 3-5 cm Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân giữa than sâu làtrông rõ nhất khi nắm đạt đến độ thành thục nhất tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng

từ thân sâu và biến thành xác khô Nắm quả thê thành thục sẽ phát tán các bào tử raxung quanh khoảng vài em, nếu gặp gió có thê phát tán xa hơn Một số loài sâu của

giống Hepialus bị nhiễm bởi các bao tử nam O sinensis Nam O Sinensis thuộc

vào loại nam phát triển hàng năm Trên các đồng cỏ của Tây Nam Trung Quốc hoặccao nguyên Himalaya, người ta thu hoạch O Sinensis vào tháng 4 đến tháng 8 hàng

năm Cơ chế xâm nhiễm của nắm O Sinensis và sâu đến nay vẫn chưa biết rõ Vàomùa đông sâu bị nhiễm bao tử nắm qua ăn phải bào tử nắm hoặc qua hơi thở của

sâu Nắm phát triển bằng chất dinh dưỡng của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng

của sâu làm sâu chết khô Đến mùa hè, nắm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu

vươn ra khỏi mặt đất Thời gian dé nam phát triển thành dạng quả thé kéo dai trong

cơ thê sâu cả các tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè Cũng từ việc quan sát thực

tế đặc điểm của Cordyceps khi vào mùa đông thì giống con sâu (côn trùng), còn vào

mùa hè thì giống một loài thực vật (thảo mộc) mà tên gọi “Đông trùng hạ thảo”

được hình thành “Đông trùng hạ thao” được ghi chép là vị thuốc xuất hiện lần đầutiên trong cuốn “Bản thảo cương mục” vào đời nhà Minh của danh y thời Lý Trần(năm 1575), Đông Trùng Hạ Thảo được xếp ngang với nhân sâm về công năngchữa bệnh — thuộc vào loại toàn diện nhất (Tran Van Nam va Lé Thi Diéu Trang,2014).

Trong sự phát triển của nam hiện nay cũng có tranh cãi là nam ky sinh haynắm cộng sinh Hiện có 2 quan điểm Theo nhà bệnh lý côn trùng Weiser và Jayaraj(1965) thì Cordyceps là ký sinh vì trong đó có nhiều loài của Beauveria,Metarhizium, lsaria và ngay cả Cordyceps cũng gây bệnh côn trùng và được sửdụng trong phòng trừ sâu hại Ngày nay, các giống nam trên được gọi là đồng danh,

cùng loài có tên khác nhau hay dị hình thái Một số nhà sinh học khác coi là nắm

cộng sinh (Suh và ctv, 2001) Sở dĩ như vậy là khi nuôi trồng O sinensis nhân tạophát hiện thấy giai đoạn phát triển di hình thái dang nấm men đã tìm thay trong cơ

thể côn trùng, cũng như có lợi cho đời sống côn trùng đó Ở ngành nắm, phần lớn là

sợi (mycelium), 6 dang này nấm thường tồn tại lâu hơn dang qua thé và bền vữnghơn Dạng quả thé chịu tác động của nhiều yếu tố: nóng, lạnh và nguồn dinh dưỡng.Một khi các yếu tô này đáp ứng thì mới thành dạng quả thể Điều này thấy rõ trong

việc nuôi trồng nam O sinensis, ở dạng cấy nam hay dạng sợi tùy theo điều kiện

nuôi cấy được đảm bảo đầy đủ (Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, 2009)

S1 bu sga 8 Gi630061608i19808066i006)2071242/80i05516160208665606xs.sdsbŸ)

Hinh 1.1 O sinensis và ký chủ;

(Nguồn: Guo và ctv, 2016)

Trong lịch sử thuật ngữ “Cordyceps” hay còn gọi “Đông trùng hạ thảo”

thường được dùng để chỉ loài O sinensis Tuy nhiên, trong vai năm gần đây

“Cordyceps” được sử dụng dé chỉ các loài trong chỉ Cordyceps có quan hệ gần với

O sinensis (Holliday va Cleaver, 2008).

Chi Cordyceps được ghi nhận với hon 680 loài (John Holliday va MattCleaver, 2008) Theo Kobayasi (1941, 1982) va Mains (1958), Ban đầu chiOphiocordyceps được phan loại là một chi con của chi Cordyceps Nam 2007, một

họ mới được thành lập là ho Ophiocordycipitaceae (Sung va ctv, 2007), bao gồmchi Ophiocordyceps, dựa trên các phân tích hình thai học và sinh hoc phân tử thông

qua xây dựng cây phat sinh loài Việc phân biệt chỉ Ophiocordyceps với chi

Cordyceps được thê hiện qua phần quả thé có sam màu, có cấu trúc mềm déo, nhănhoặc san sùi và dai của chi Ophiocordyceps so với sắc tố sáng của quả thé ở chiCordyceps Cac qua thé có thé dai, nhăn, xơ hoặc mềm túi bao tử dang chai(Perithecia) có thé từ bề ngoài đến hoàn toàn chìm, xiên hoặc sắp xếp có thứ tự Cácloài Ophiocordyceps spp có khả năng gây bệnh trên nhiều loại côn trùng Ky chủchủ của các loài Ophiocordyceps spp là âu trùng của bộ Coleoptera va Lepidoptera

cũng như con trưởng thành của bộ Araneae, Diptera, Hemiptera, Hymenoptera,

Odonata và Orthoptera (J Luangsa-ard va ctv, 2018; Thuan Duc Lao va ctv, 2021).Bang 1.1 Mô tả hình thái một số loài nam thuộc chi Cordyceps ( Liu va ctv, 2011)Loai Au tring Qua the

Phan cơ thé ấu trùng giống Quả thé hình trụ mảnh, 4 - 7

¬ như nhộng tằm, có chiều dài cm chiều dài và khoảng 3

ĐH ESPEEED từ 3 - 5 cm, đường kính từ 3- mm, với đỉnh nhọn

8 mm, màu vàng đậm tới vàng nâu

Phần cơ thé ấu trùng giống Quả thê hình trụ, mập và thô,như nhộng tằm, dai từ 3 — 6 chiều đài 4 - 12 cm, đường

C gunnii cm, đường kính 3 — 10 mm, kính 4 mm, với phần đầu

vàng nâu đên nâu phinh ra ở đỉnh quả thé

Cơ thé ấu trùng giống như một Qua thể như soi chi, 2 - 3 cm

con tằm, mảnh, chiều dài 2-4 chiều dài và khoảng 2 mm

C gracilis cm va đường kính 2 - 5 mm; đường kính, với phan phinh ra

màu vàng nâu, tím, nâu hoặc ở đỉnh, có hình câu Quả thê

nâu đỏ bám không chắc

Cơ thé ấu trùng cong hình Chi có 1 qua thé, mảnh va

C barnesii thận, ngắn, 1,5 - 2 cm chiều cong, 2 - 6 em chiều dải và

€.liangshanensis

Cơ thé ấu trùng giông con tăm,dày, chiều dai 3 cm - 6 cm,đường kính 6 mm - 10 mm; Bềmặt bên ngoài với màu nâu đểmàng mau nâu sâm.

Quả thé dang soi, phannhánh hoặc không phânnhánh, 10 em - 30 em chiềudai và đường kính 1 mm - 2

mm.

C militaris

Môi trường chat dinh dưỡngkhông có cơ thê ấu trùng

Qua thé có kích thước to đều

từ trên xuống dưới, hơicong, chiều dài khoảng 5

cm, màu vàng cam đến màu

đỏ da cam.

Hình 1.2 O sinensisva các loài cùng chi Cordyceps

(A) O sinensis; (B) Cordyceps Gunnii; (C) Cordyceps barnesii; (D) Cordyceps

gracilis; (E) Cordyceps liangshanensis; (F) Cordyceps militaris

(B) (nguồn: Liu va ctv, 2011)

Dựa trên thông tin về bang đồ phân bố nam Ophiocordyceps sp Vườn quốcgia Bidoup Núi Bà Tinh Lâm đồng (Phạm Thị Hà Nguyên, 2021) thì hai loàiCordyceps phân bố pho biến trong khu vực Bidoup Núi Bà là O nutansva O

sphecocephala (Hình 1.3) Các tài liệu tham khảo sẽ được san lọc và tập trung vào hai nhóm loài Cordyceps O nutans và O sphecocephala.

BAN ĐÒ PHAN BO NÁMOphiocordycepssp.

VƯỜN QUOC GIA BIDOUP, NÚI BA, TINH LAM BONG

1082200"E 108°300"E 108°40'0"E 108°S0'0"E

° vig 4 F S2 \ INLAMDONG PROVINCE, VIETNAM

st Š + 4 +

a Dae DAK LAK DAK LAK ,

= 8 oer ® fy Đáp 433 = b Dam Ron,

Ni fA, 3 Đà Lạt

xã 4 0M, 4 Lâm Hà

2 a By Bao Lim Don Dương

A› Cat Tiên Hàng

——- —- Ranh giới tinh

—— —- Ranh giới huyện eee Ranh giới xã

Đường bình độ

~——— Sông suối

Đường giao thông

ĐI s \ Phân vùng chức năng VQG

H LAM DONG 8m Ts HEB ku vue bio ve

S lia Ề Ỳ = Khu vực hệ sinh thái

0 3 6 12

Khu vực dịch vụ Phân bố nắm Ophiocordyceps sp.

a = Ophiocordyceps nutans

4 — Ophiocordyceps sphecocephala 1089200"E 108°300"E 108°400"E 108°500"E

12°200"N 12°100"N

12°0'0"N

Hình 1.3 Ban đồ phân bố loài nắm Vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lam Đồng

(Nguồn: Pham Thị Hà Nguyên, 2021)

1.1.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của O nutans

Giới Fungi; Ngành Ascomycota; Lớp Sordariomycetes; Bộ Hypocreales; Họ

Ophiocordycipitaceae; Chi Ophiocordyceps; Loài O nutans (Pat.) G.H Sung, J.M.

Sung, Hywel-Jones & Spatafora (2007); Tên cũ: Cordyceps nutans (Pat, 1887);

Đồng danh: Cordyceps bicephala subsp nutans (Pat.) Moureau, Mémoires de

l'Institut Royal Colonial Belge 7: 47 (1949) [MB#352017] ; Tên ở dạng sinh sản vô

tính: Hymenostilbe nutans (Samson & H.C Evans).

a-b qua thể phát sinh từ vật chủ; c mặt cắt ngang cua dau sinh sản cho thấy quả

thé dang chai (Perithecia); d các sợi bào tử (asci); e sợi bào tử trưởng thành, ƒ sợi

bào tử chưa trưởng thành; g-h bào tử ban phan; i-j cum sợi nam mọc trên trên môi

trường PDA Scale bar = 1 cm trong hình a-c, iÿ, = 5 um trong hình d-h (Nguồn

Janet Jennifer Luangsa-ard và ctv, 2008)Theo mô ta của Luangsa-ard va ctv (2008), thi các mau vat được tìm thaytrong lớp lá mục hoặc vùi trong đất Vật chủ là bọ xít bộ Bộ cánh nửa Nhánh đơnđộc trên các ký chủ nhỏ, các nhánh nhiều mọc trên các ký chủ lớn hơn (kích thước

cơ thé 20-30 mm), dai 50-90 mm, ngang 400 - 800 um, phần thân nhánh màu đen

hoặc nâu đen, có màu đỏ kích thước 8 - 12 mm dưới phần đầu sinh sản màu đỏ, màu

hồng giống màu thịt cá hồi hoặc vàng cam kích thước 6 - 17 x 3 - 5 mm Perithecia

chìm, thành hyalin dạng xiên với cổ cong, kích thước 550-800 x 130-200 pm.Miệng thé quả có thé nhìn thấy trên bề mặt Soi bào tử hình trụ, kích thước 780 um

x 7-8 um, 8 bào tử Soi bào tử dé vỡ thành 64 bào tử bán phần Một phan bào tửhình trụ hoặc hình thùng, hai đầu cùn kích thước 9,5-15 x 1,5-2 pm

Theo Theo Phạm Quang thu và Lê Thị Xuân (2009), phần chất đệm quả thể

có màu vàng nhạt, dạng thịt lỏng lẻo Đặc điểm của hệ sợi nắm: Sợi nắm có màu

trắng xám, rất ngắn, hệ sợi rất mỏng, sợi nắm mọc bám chặt trên bề mặt môi trường

tạo thành các múi, sợi nắm sinh trưởng rất chậm

Đặc điểm phân bố của nam: loài này được phát hiện dưới tán rừng tự nhiên,

ký chủ bị vùi sâu dưới lớp đất có tầng thảm mục dây, độ âm trung bình, độ tán che

trên 0,7 Đất tại vị trí thu mẫu âm, có hàm lượng mùn cao Nam phan bố ở độ cao

hơn 400 m so với mực nước biển Tổ thành của rừng nơi nắm phân bố là các loại

cây lá rộng thường xanh mưa 4m nhiệt đới với các loài cây ưu thế: Giẻ, Máu chó,Ngát, Vàng anh, Trâm sừng (Phạm Quang thu và Lê Thị Xuân, 2009).

1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái của O sphecocephala

Giới Fungi; Ngành Ascomycota; Lớp Sordariomycetes; Bộ Hypocreales; Họ Ophiocordycipitaceae; Chi Ophiocordyceps; Loài O sphecocephala (Klotzsch ex Berk.) G.H Sung, J.M Sung, Hywel-Jones & Spatafora (2007) Tên cũ: Cordycepssphecocephala (Klotzsch ex Berk); Đồng danh: Sphaeria sphecocephala Klotzsch

ex Berk., London Journal of Botany 2: 206 (1843) [MB#529403], hoặc Torrubia

sphecocephala (Klotzsch ex Berk.) Tul & C Tul., Selecta Fungorum Carpologia 1:

16 (1865) [MB#530326], hoặc Sphaeria sphecocephila Klotzsch ex Berk (1843)

[MB#529127].

Theo Pham Quang thu và Lê Thị Xuân (2009), đặc điểm giải phẫu và giámđịnh nam: quả thé mảnh dài, nhọn ở phía đầu, toàn bộ quả thé được bao phủ bởimột lớp lông mịn Nam ky sinh trên ong thuộc bộ Cánh màng (cánh màng) Trênmột ký chủ có từ 2 - 4 cây nam, chiều dai từ 3 - 4 cm, đường kính 2,0 - 2,5mm Túibào tử hình trụ, mỗi túi bao tử chứa 8 bao tử, mỗi một bào tử là chuỗi rất nhiều đoạnbao tử dé gãy đính với nhau, đoạn bao tử hình que 2 đầu nhọn và ở giữa phinh to

Kích thước đoạn bào tử 10,5 — 15,0 um, chiều rộng 1,5 - 2,5 um.

Đặc điểm của hệ sợi nam: Soi nam ban đầu có màu trắng hơi vàng sau mộtthời gian chuyền thành màu vàng Sợi nắm dài mọc dầy và bông mịn tạo thành từngvòng sinh trưởng rõ rệt Môi trường dinh dưỡng xung quanh hệ sợi nắm có màuvàng (Phạm Quang thu và Lê Thị Xuân, 2009).

độ cao từ 300 m so với mực nước biển (Phạm Quang thu và Lê Thị Xuân, 2009)

1.1.1.3 Mô tả đặc điểm hình thái của ký chủ của O nutans và O.sphecocephala.

Theo Phạm Quang thu và Lê Thị Xuân (2009), một số loài nam kí sinh trêncôn trùng có tính chất chuyên biệt, O nutans chỉ ky sinh trên các loài bo xít thuộc

bộ cánh nửa (Hemiptera), O sphecocephala chỉ ky sinh trên các loài ong trưởng

thành thuộc bộ cánh màng (Hemenoptera).

a) Mô tả đặc điểm của bộ cánh nửa cứng (Hemiptera = Heterotera)

Bộ này có khoảng 20.000 loài, kích thước cơ thé nhỏ hoặc trung bình Miệngkiểu chích hút, vòi chia đốt nằm ở phía trước đầu giữa 2 đốt chậu chân trước Rau

đầu hình sợi chi, chia 3 - 5 đốt Manh lưng trước rộng, phiến mai (Scutellum) phát

triển nằm giữa hai chân cánh Phién này có loài phát triển che khuất một nửa hoặctoàn bộ mặt lưng của bụng Có 2 đôi cánh, bình thường khi không hoạt động thì xếpbằng trên lưng Một nửa cánh trước về phía gốc bằng chất sừng hoặc da tương đốicứng, nửa phía ngoài bằng chất màng, một số ít loài cánh thoái hóa hoặc không.Chân phần nhiều dạng chân bò, một số ít loài có chân bơi Bàn chân có 2 - 3 đốt

Cuối bụng không có lông đuôi Phần lớn côn trùng của bộ này về phía mặt bụng của

ngực gần đốt chậu chân sau có đôi lỗ tuyến hôi Côn trùng bộ này thuộc về nhómbiến thái không hoàn toàn Phần lớn sống trên cạn, có loài sống dưới nước, trên mặtnước Những loài sống trên cạn có thé sinh sống

trên cây hoặc dưới vỏ cây hoặc dưới thảm lá cây

rụng hoặc trong đất Chúng dùng vòi chích hút dịch

cây gây thiệt hại trực tiếp đồng thời có thể truyền

bệnh cho cây trồng Tính ăn của côn trùng bộ cánh

nửa cứng khá đa dạng, có loài ăn thực vật, có loài

ký sinh động vật bậc cao như chim và động vật có

vú hoặc ăn các loài côn trùng khác (Nguyễn Viết

Tùng, 2006).

Hình 1.6 Bọ xít năm cạnhMột số loài trong bộ này có bộ phận phát ra (Nguồn Chu Nghiêu, 1960)tiêng kêu băng cách cọ giữa răng dưới gôc cánh với

gai Ở đốt ngực sau Giai đoạn sâu non có sự thay đổi màu sắc rõ rệt, khác hắn với

giai đoạn trưởng thành Trứng của chúng có nhiều hình dạng và màu sắc Nói chungtrên mặt trứng thường có lông hình kim hoặc có nắp trứng Nhiều loài đẻ trứngthành 6, đẻ trứng trong mô cây (Nguyễn Viết Tùng, 2006)

@ Họ Bọ xít nắm cạnh (Pentatomidae)

Kích thước trung bình hoặc lớn Đầu nhỏ, hình tam giác Râu đầu có 5 đốt

(một số ít loài có 4 đốt) Mắt kép phát triển Có hai mắt đơn Vòi có 3 -4 đốt Manh

lưng ngực trước khá phát triển Phiến mai hình tam giác hoặc hình lưỡi tương đốilớn, kéo dai ra sau tới quá nửa chiều dai cơ thể và sát tới phần mang của cánh Banchân có 2 - 3 đốt Nói chung có tính ăn thực vật, một số có tính ăn thịt (NguyễnViết-Tùng, 2006)

@ Họ bọ xít dài (Coreidae)

Kích thước cơ thể trung bình hoặc lớn, mình

thon dài Râu đầu có 4 đốt Có mắt đơn, vòi có 4 đốt

Phiến mai rất nhỏ Phần cứng, phần màng và phần

phiến mông trên cánh trước phân biệt rõ ràng Mạch

cánh trên phần màng phân nhánh rất nhiều, tất cả đều

xuất phát chung trên một mạch ngang về phía gốc

phần màng Bàn chân có 3 đốt Có vật lồi giữa

móng Nói chung chích hút nhựa cây, có nhiêu loài

là sâu hại quan trọng đối với cây trồng (Nguyễn Viết

b) Mô tả đặc điểm của bộ cánh màng (cánh màng)

Bộ cánh màng là một bộ lớn trong lớp côn trùng Số loài đã biết có trên120.000 loài Tất cả những loài kiến, ong thường gặp hàng ngày đều thuộc bọ này,ngoài ra còn có nhiều loài ong kí sinh bé nhỏ khác (Nguyễn Viết Tùng, 2006)

Đặc điểm chủ yếu của bộ cánh màng là: Miệng gậm nhai hoặc gậm hút Có 2đôi cánh bằng chất màng, cánh trước lớn hơn cánh sau Mép trước của cánh sau có

một dãy móc câu nhỏ móc lên nêp cuôn của mép sau cánh trước, hệ thông mạch

cánh thay đôi phức tạp Các mạch cánh thường gấp khúc, có tên gọi là mạch quay.

Có loài mạch cánh thoái hóa gần hết, thậm chí có loài không còn cánh Chân pháttriển bình thường, có 1 - 2 đốt chuyên Đốt bụng thứ nhất thường nhập vào đốt ngực.Trừ những loài thuộc bộ phụ bụng không thắt nhỏ, tất cả đều có đốt bụng thứ hai rấtnhỏ tựa hình cuống Nói chung con cái có ống đẻ trứng dạng răng cưa hoặc dạng

ngòi châm (Nguyễn Viết Tùng, 2006).

Bộ cánh màng thuộc nhóm biến thái hoàn toàn Sâu non phần nhiều có đầu

phát triển, ngực chia 3 đốt, bụng chia 10 đốt Sâu non là loài ong ăn lá, đa số có 3

đôi chân ngực và nhiều đôi chân bụng rất giống sâu non bộ cánh vây, nhưng cuối

chân không có móng và từ đốt bụng thứ 2 đã có chân Nhiều loài sâu non không có

chân, mình mềm, màu trắng nhạt, có loài đầu không cứng lắm Nhộng dạng nhộngtrần Có nhiều loài trước khi hóa nhộng nhả tơ làm kén (Nguyễn Viết Tùng, 2006)

Cũng theo Nguyễn Viết Tung (2006), đặc điểm sinh vật học của bộ này rấtphức tạp Hầu hết đều sống trên cạn Tính ăn có thực vật và ăn thịt (bắt môi và kísinh) Nhìn tổng quát cả bộ thì loài có ích chiếm đa số Có những loài là giúp thụphấn cho cây trồng, có những loài là thiên địch của sâu hại khác, có loài là nguồncung cấp mật và sáp cho y học và công nghiệp Trong bộ cánh màng có nhiều loài

có đặc tính sống quần tụ hoặc xã hội với tô chức chặt chẽ có nhiều tập tính, hành vitiến hóa cao

@ Ho ong vàng (họ ong)

Thuộc bộ cánh màng có vân màu đen.

Râu dạng đầu gối Cánh xếp dọc bên lưng lúc

đậu Hai mảnh bên sau của mảnh lưng ngực

trước kéo dài tới phiến vai Buồng giữa thứ nhất

cánh trước thường rất dài Cuối đốt chày chân

Họ Ong vàng có một sô loải có tính chât xã hội, một sô loài sông đơn độc Loài sông xã hội có sự phân hóa ra ong chúa, ong đực và ong thợ ở trong tô, ong

non ăn thức ăn bằng động vật Loài sống đơn độc làm tô ở trong đất, trong hốc cây

lâu năm, trên tường trên tô thường có con mồi là sâu non bộ cánh vay da duoc

gây mê dé lam thức ăn cho ong non sau này (Nguyễn Viết Tùng, 2006)

1.1.2 Chu trình sống của Cordyceps

Theo Trần Văn Năm và Lê Thị Diệu Trang (2014), Cordyceps thuộc họ nam,

nó ky sinh trên thân của côn trùng vào mùa Đông, nam ky sinh vào côn trùng, phat

triển thành hệ sợi nam (đây là giai đoạn vô tinh), sử dụng nguồn dinh dưỡng từ cơ

thể côn trùng và giết chết côn trùng Mùa hạ, sợi nắm vô tính chuyền sang giai đoạn

hữu tính, hình thành cây nam là cơ quan chứa bào tử vô tinh và nha lên khỏi mặt đất

nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu

(a) (b)

—_ờc Côn trùng trưởng cương - thành =— Sự phát triên của O.

1% oneness, el O senensis hinh thanh

O senensis phat tan bao tu

Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của đông trùng hạ

thảo có 17 đến 19 loại acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều

nguyên tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe trong đó cao nhất

là phospho) Quan trọng hơn là trong sinh khối đông trùng hạ thảo có nhiều chất

hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang khám phá dần, nhờ tiến bộ của

ngành hoá học các hợp chất tự nhiên Nhiều hoạt chất trong đông trùng hạ thảo cógiá trị được liệu thần kỳ Trong đó phải ké đến là cordiceptic acid, cordycepin,

adenosine, hydroxyethyladenosine Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA

(Hydroxy-Ethyl Adenosine- Analogs) Đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều loại

vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A;

116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitaminK), ngoài ra còn có khoảng 25% - 30% protein, 8% chat béo và đường mannitol.(Tran Văn Năm và Lê Thị Diệu Trang, 2014)

1.2 Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà

1.2.1 Phạm vi

Vườn Quốc gia (VQG) Bidoup — Núi Bà (BDNB) thuộc vùng lõi của

LBBR, Vườn Quốc gia được thành lập vào năm 2004 trên cơ sở Khu bảo tồn đượchình thành theo Quyết định số 01/CT ngày 13/01/1992 của Thủ tướng Chính phủ vàchuyền hang theo Quyết định số 1240/QĐ- TTg ngày 19/11/2004 của Thủ tướngChính phủ Vườn quốc gia Bidoup — Núi Bà với tọa độ 12°00'00" đến 12°30'00" vĩ

độ Bắc và 108°35'00" đến 108°75'00" kinh độ Đông, phạm vi độ cao dao động từ1.400 - 2.287 m Tổng diện tích của vườn quốc gia là 64.800 ha trong đó bao gồm 3phân khu là: Phân khu bảo vệ nghiêm ngặt (28.731 ha) được thiết lập nhằm mụctiêu ưu tiên bảo tồn đa dạng sinh học; Phân khu phục hồi sinh thái (36.059 ha) bao

gồm rừng có giá trị bảo tồn cao, là sinh cảnh cho nhiều loài động vật quý hiếm của

Vườn Quốc gia và cuối cùng là phân khu hành chính dịch vụ (10 ha)

Sự hình thành vườn quốc gia Bidoup — Núi Bà có chức năng đóng gópvào sự phát triển kinh tế cho người đồng bào K’Ho thông qua chương trình chi trả

dịch vụ môi trường rừng, du lịch sinh thái, du lịch cộng đồng Bên cạnh đó, các

chức năng như hỗ trợ hoạt động giáo dục và nghiên cứu khoa học ở mức độ địaphương, quốc gia và quốc tế cũng được thực hiện trong VQG Bidoup — Núi Bà

1.2.2 Đặc điểm địa lý- thủy văn

Dãy núi Bidoup-Núi Bà với đỉnh cao nhất là đỉnh Bidoup có độ cao là 2.287

m so với mặt nước biên Phía Đông, giáp với day núi Gia Rich và Hòn Giao Độ

dốc lớn hơn 25% chiếm phần lớn khu vực phía đông và nhiều khu vực khác như

thượng nguồn sông Krông nô, khu vực cổng trời, Hệ thống thực vật cũng đượcphân hóa bởi sự phân hóa phức tạp của địa hình từ độ cao, hướng và độ dài sườn.

Có thể chia độ VQG Bidoup — Núi Bà thành 3 bậc theo độ cao như sau: bậc 1 với

độ cao dao động từ 1.100 — 1.300 m, phân bố chủ yếu ở Tây Bắc khu vực sôngKrông nô Và được xem như là khu vực trũng nhất của sườn; bậc 2 với độ cao dao

động 1.400 m — 1.700 m, phân bố chủ yếu ở khu vực tây na, khu vực phía Bắc và

phụ cận làng Klong Klanh Độ chênh cao giữa đỉnh núi và chân núi khá lớn (200 —

300 m); Bậc 3 gồm các đỉnh có độ cao trên dưới 2.000 m, phân bố chủ yếu ở đaiphía đông của VQG với các đỉnh đặc trưng như: Hòn Giao (2.062 m), Gia Rich(1.923 m), Bidoup (2.287 m) Bậc cao này không có tinh liên tục Khối núi phía

đông với các đỉnh cao như “tương khí hậu” và tạo nên những nét đặc thù cho hệ

sinh thái khu vực nhất là tạo nên sự phân hóa đông- tây (Nguyễn Đăng Hội và ctv,2009).

Khí hau của VQG Bidoup — Núi Bà mang đậm nét khí hậu Tây Nguyên vớicường độ nang cao, lượng mưa lớn cùng với mùa khô rõ rệt Biên độ dao động nhiệt

độ ngày đêm lớn; mùa hè, mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10; mùa khô kéo

dài từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau VQG Bidoup- Núi Bà là khu vực đón nhận cả

2 khối khí thịnh hành từ hướng Đông Bắc và Tây Nam Điều này dẫn đến lượng

mưa hang năm kha cao dao động từ 2.200 — 2.800 mm.

Có rất nhiều hệ thống song suối bắt nguồn từ VQG Bidoup- Núi Bà Trong đó

có thé ké đến là sông Da Nhim và sông Krông nô Các mạch suối chính cũng bắtnguồn từ 2 dai núi là Bidoup (2.287 m) và núi hòn giao (2.062 mì)

VQG Bidoup — Núi Bà là một trong hai mươi tam vườn quốc gia nằm trong hệthống các khu rừng đặc dụng Việt Nam Vườn Quốc gia Bidoup — Núi Bà với 91%diện là rừng và đât rừng, trong đó, chủ yêu là rừng nguyên sinh với rât nhiêu loài

động — thực vật khác nhau Có 1933 loài thực vật có mach ở Vườn Quốc gia Bidoup

— Núi Bà, trong đó: 62 loài quý hiém phan bố trong 29 họ thực vật khác nhau, nằm

trong cấp đánh giá về mức độ quý hiểm của sách đỏ Việt Nam năm 2000, Nghị định

số 32-2006-NĐ-CP ngày 30.03.2006 của Chính phủ và Hiệp hội Bảo vệ thiên nhiên

Quốc tế (IUCN) VQG Bidoup — Núi Bà được đánh giá là 1 trong 4 trung tâm đadạng sinh học quan trọng của đất nước với các hệ sinh thái đặc trưng của vùng Ánhiệt đới (Nguyễn Đăng Hội và ctv, 2009)

1.3 Đa dạng sinh học và đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học không chỉ bao gồm các loài trên thế giới với lịch sử tiến hóa

của chúng, mà còn bao gồm sự biến đổi di truyền trong và giữa các quan thé loài và

sự phân bố của các loài trên các môi trường sống địa phương, hệ sinh thái, cảnhquan và toàn bộ lục địa hoặc đại dương (Diana và ctv, 1999).

Đa dạng di truyền là tổng hợp các kiểu di truyền trong nội bộ một loài Đadạng di truyền thé hiện qua sự đa dang về thành phan gen giữa các cá thé tồn tạitrong cùng một loài Sự đa dang về mặt di truyền giúp một loài có thê tồn tại trong

tự nhiên do sự thích nghỉ với thay đôi bat lợi của thời tiết, khí hậu, môi trường,phương thức canh tác, sức đề kháng bệnh Đa dạng di truyền thể hiện sự tách biệt vềtính kế thừa trong hay giữa các quần thể sinh vật

Nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền: Trong suốt quá trình tồn tại và phát

triển, một số loài có thé tạo thành những nhóm quan thé phân bố trong những điều

kiện sinh thái khác nhau và luôn biến đổi nên sẽ có những chiều hướng biến đổikhác nhau gây ra do đột biến (đột biến gen, đột biến nhiễm sắc thé) Biến đổi đótrước hết là trong kiểu gen và cuối cùng là kiểu hình thích nghi, điều đó tạo nên sự

khác nhau giữa các nhóm loài Sự biến đổi này không chỉ xảy ra giữa các quần thê

của loài mà còn xảy ra giữa các cá thê trong một quần thể được biểu hiện ra bằnghình thái hoặc chi mới là sự thay đổi genome Bên cạnh những biến đổi di truyền do

áp lực chọn lọc tự nhiên thì biến đổi do áp lực nhân tạo (gây ra đột biến nhân tạo)cũng góp phan rất lớn Do vật chất di truyền có thé sao chép chính xác từ thế hệsinh vật này sang thế hệ sinh vật khác qua sinh sản nên những biến đổi về mặt di

truyền luôn được bảo tồn và phát triển tạo nên tính đa dạng di truyền Sự đa dạng về

mặt di truyền là nền tang của đa dạng sinh học Cũng theo Diana va ctv (1999), Nếumỗi loài bị giảm xuống còn một số lượng nhỏ các cá thé giống nhau về mặt di

truyền, chúng ta sẽ mất đi nhiều sự đa dạng sinh học.

1.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng sinh học và đa dạng di truyền

Việc nghiên cứu đa dạng sinh học cung cấp kiến thức đồng thời cũng thúc

đây đổi mới công nghệ và tìm hiểu rõ hơn về sinh học và về sinh thái của con

người Các thành phần của đa dạng sinh học là nguồn cung cấp thực phẩm, nhiênliệu và các sản phẩm công nghiệp Việc sử dụng trực tiếp các thành phần của da

dạng sinh học đóng góp đáng kể vào nền kinh tế Theo Diana và ctv (1999), Nền

kinh tế của hầu hết các nước đang phát triển phụ thuộc nhiều hơn vào tài nguyênthiên nhiên, vì vậy các lĩnh vực liên quan đến đa dạng sinh học đóng góp tỷ trọnglớn hơn trong GDP (Tổng sản phẩm trong nước ) của họ

Việc xây dựng các khu bảo tồn đa dạng sinh học, các khu vườn ươm giúpcho việc phát triển 6n định của các loài sinh vật, hạn chế nạn tiệt chủng và cũng lànơi để con người thực hiện các hoạt động giải trí Ngoài ra, việc tìm hiểu đa dạngsinh học cũng cung cấp các kiến thức ứng dụng Như thông qua việc khám phá racách các loài khác nhau đã thích nghi như thế nào với môi trường đa dạng củachúng Da dang sinh học chứa đựng những tiềm năng về sự hiểu biết cho các giảipháp cho các vấn đề sinh học, cả hiện tại và tương lai Theo Diana và ctv (1999),chúng ta có thé phát hiện ra vi khuẩn sống trong suối nước nóng và có các enzymtiễn hóa hoạt động ở nhiệt độ cao bất thường, được sử dụng trong phản ứng PCR.Việc hiểu ra các cơ chế bảo vệ mới của thực vật đối với động vật ăn thịt; phát triển

các giải pháp thay thé thuốc trừ sâu chưa từng được biết đến trước đây cho lĩnh vực

thực phẩm Hay từ thông qua tìm hiểu về loài ếch phi tiêu độc; nghiên cứu về chất

độc và cơ chế gây độc của ếch phi tiêu độc đang cung cấp cái nhìn sâu sắc về các cơ

chế thần kinh cơ bản

Theo Diana và ctv (1999), đa dạng sinh học có tiềm năng để chúng ta hiểuban thân mình hơn Chúng ta đã phát triển những hiểu biết sâu sắc về văn hóa và xã

hội của chính mình thông qua việc nghiên cứu các dân tộc khác Tương tự như vậy,chúng ta có thê tìm hiểu về sinh lý của mình thông qua việc nghiên cứu các loàikhác Nhiều hiểu biết của chúng ta về bản thân chỉ có thé có được khi nghiên cứucác loài khác Ví dụ, kiến thức về sự phát triển và sinh sản của chúng ta phụ thuộcvào việc nghiên cứu nhiều loài da dang ngoài các loài thông thường trong phòng thi

nghiệm, chăng hạn như vi khuẩn, giun tròn, chuột công, chuột cống và khỉ Từ lâu,

người ta đã cho rằng testosterone cần thiết cho hành vi giao phối ở nam bởi vì nó là

trường hợp của tất cả các loài động vật đã được nghiên cứu Tuy nhiên, phát hiện rarằng điều này không đúng với trường hợp rắn lục đuôi đỏ cho thấy mối tương quan

giữa testosterone và hành vi ở động vật có xương sống rốt cuộc không phải là tiên

đề Cá ngựa van gan đây đã được chứng minh là một mô hình đặc biệt hữu ich détìm hiểu đi truyền học phân tử của sự phát triển thần kinh Ngay cả thực vật cũngtiết lộ những dấu hiệu quan trọng đối với sinh lý của chúng ta Nghiên cứu về đồngh6 sinh học của cây mù tat (Arabidopsis) đã dẫn đến các kỹ thuật nghiên cứu đồng

hồ sinh học ở động vật chi tiết hơn và chính xác hơn bao giờ hết Những tiến bộđáng kể trong sự hiểu biết về hệ thần kinh của con người đến từ việc nghiên cứuđộng vật không xương sống và động vật có xương sống Ví dụ, loài giun tròn

Caenorhabditis elegans đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc về các bệnh và rối loạn

thần kinh, chăng hạn như bệnh Alzheimer

Việc tác động lên các yếu tô liên quan đến đa dạng sinh học cũng là một

trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Việc nghiên cứu

và bảo tồn đa dạng sinh học góp phần cho sự phát triển bền vững và thịnh vượng

của nhân loại Theo Diana va ctv (1999), đa dạng sinh học đóng vai trò như một hệ

thống cảnh báo sớm đã báo trước các mối đe dọa đối với sức khỏe con người trước

khi thu thập đủ dữ liệu để phát hiện các tác động trực tiếp Ví dụ, Silent Spring(1962) của Rachel Carson đã thiết lập một trường hợp mạnh mẽ chống lại việc sử

dụng thuốc trừ sâu chủ yếu dựa trên các mối đe dọa đối với các quần thé động vat

hoang đã Các loại thuốc trừ sâu tương tự kế từ đó đã được phát hiện là có nguy cơsức khỏe cộng đồng nghiêm trọng Các bằng chứng ít được kết luận rằng các hợp

chất này có ảnh hưởng đến sinh lý con người, nhưng việc tích lũy bằng chứng từcác nghiên cứu về động vật hoang dã cho thấy nhu cầu nghiên cứu chỉ tiết hơn về

các tác động có thê xảy ra đối với con người

Phần lớn các nghiên cứu về đa dạng sinh học có thể không có giá trị ứngdụng ngay lập tức Tuy nhiên không thé đoán trước được kiến thức mới sẽ được sửdụng như thế nào Kiến thức về các dạng sống khác nhau, như đã thấy trong các ví

dụ trên, đã có tác động trực tiếp đến việc cải thiện sức khỏe con người và dẫn đến

các cuộc cách mạng trong khoa học, chăng hạn như kiến thức của chúng ta về đitruyền học phân tử Ít người vào thời Darwin có thể tưởng tượng được niềm đam

mê của ông với sự biến đổi của động vật sẽ thay đổi nghiên cứu sinh học và thay

đổi sâu sắc quan niệm của chúng ta như thé nao Di truyén vi khuẩn là một lĩnh vực

nghiên cứu ít người biết đến vào những năm 1950, nhưng nó đã dẫn trực tiếp đếncái mà ngày nay chúng ta gọi là sinh học phân tử Ngay cả một nhóm nhỏ các nhà ditruyền học vi khuẩn cũng không thể biết nghiên cứu của họ sẽ cách mạng hóa sinhhọc và y học như thế nào (Diana và ctv, 1999)

Tóm lại, đa dạng sinh học và các thành phần của nó đóng góp vào các quyếtđịnh về quản lý đa dạng sinh học Việc hiểu rõ yêu tố cấu thành và định nghĩa đadạng sinh học là điều cần thiết đối với các nhà quản lý và hoạch định chính sách,những người phải cô gang đưa các giá trị của nó vào các kế hoạch quản ly đất và

nước của họ Chỉ khi chúng ta hiểu được tất cả các khía cạnh khoa học tương táccủa đa dang sinh học, chúng ta mới có thé đánh giá chính xác được mức độ thông

tin cần được xem xét Da dang di truyền là co sở của tiềm năng tiến hóa của các loài

dé đáp ứng trước những thay đổi của môi trường, điều này trở thành một điều cầnthiết trụ cột trong di truyền học bảo tồn Hầu hết các quần thể của các loài nguy cấpthường được chia thành các nhóm nhân giống khác nhau, hoặc ở các đoạn khácnhau sinh cảnh, khu bảo tồn thiên nhiên, vườn ươm hoặc vườn thú, hoặc trong cácgiống hoặc chủng khác nhau trong trường hợp nội địa thực vật và động vật, đến lượt

nó, được chia thành các đơn vị sinh sản nhỏ hơn liên kết với nhau nhiều hơn hoặc íthon (Toro và ctv, 2005) Việc xác định được trình tự của các loài giúp cho việc xây

dựng cây phát sinh loài và mối tương quan giữa các loài (Diana và ctv, 1999) Do

đó việc nghiên cứu đa dạng di truyền không những góp phần cung cấp thông tin cho

việc định đanh loài nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu và phát hiện loàimới và đặc biệt liên quan đến việc bảo tồn các loài quí hiếm góp phần cho công tác

bảo tồn đa dạng sinh học của nhân loại Bởi vì đa dạng sinh học quyết định đến sự

ôn định là cơ sở cho sự sinh tồn của sự sống trên trái đất nói chung và con người nói

riêng khi mà đa phần các hoạt động sản xuất của con người dựa trên một hệ sinh

thái nhạy cảm với các tác động môi trường Việc mất cân bằng đa dạng sinh học lànguyên nhân dẫn đến với sự mat cân bằng loài trong hệ sinh thái Do đó việc bảo vệ

đa dạng sinh học, bảo vệ các nguồn gen là công tác quan trọng cần được quan tâm

và ưu tiên trong việc xây dựng chính sách phát triển kinh tế, xã hội

1.5 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

1.5.1 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái

Sự đa dang di truyền có thé phát hiện dựa vào các biéu hiện hình thái Gen théhiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà

người ta có thể đo đếm được- gen đó có thể xem như gen chỉ thị Việc lập bảng đồ

gen và chọn lọc dựa vào chỉ thị hình thái như vậy sẽ rất chậm số chỉ thị quá ít vàchỉ thị chỉ ở qui mô hình thái (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Do vậy việc áp dụng chỉ thị hình thái gặp một số hạn chế như tốn rất nhiều

thời gian dé quan sát từng chi tiết và bộ phận của mẫu vật, yêu cầu có kinh nghiệm

trong việc đánh giá và phân loại và có thé nhầm lẫn hoặc gây ling túng trong quátrình định danh khi cùng một loài ở các điều kiện môi trường khác nhau có thể tồn

tại ở các dang di hình thái khác nhau.

1.5.2 Phương pháp sử dụng chỉ thị isozyme

Thuật ngữ isozyme mô tả các dạng phân tử khác nhau cua của những enzyme

với cùng đặc tính về cơ chất Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác

cùng phản ứng, nhưng có nhiều dạng enzyme khác nhau và hiệu quả xúc tác khác

nhau Isozyme được phân biệt nhờ chạy điện di trên gen (Bùi Chí Bửu và Nguyễn

Thị Lang, 1999).

Isozyme được dùng làm chỉ thị trong tìm kiếm gen trong đánh gia mức đa

dạng về di truyền của loài Nếu những liên kết như vậy, người ta còn dùng thuậtngữ “recombinant enzyme” dé chỉ hiện tượng này Tuy nhiên, số lượng isozyme

khá ít không đủ nhu cầu lập bảng đồ di truyền (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,

1999).

1.5.3 Phương pháp sử dụng chỉ thị DNA

Bat cứ chuỗi mã DNA nao được phân biệt giữa hai cái thé, hai dòng hoặc hai

giống khác nhau đều có thể được xem là một chỉ thị phân tử các chỉ thị phân tử cóthé chia làm hai nhóm như sau: nhóm 1 là các chi thị dựa vào phương pháp lai

DNA (DNA- DNA hydridization based): RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism) (Bùi Chi Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999); và nhóm 2 là các chi Thịdựa vào phương pháp PCR: AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism), SSR (Simple Sequence Repeat), SSCP (Single Strand Conformation Polymophism),(Bùi Chí Bửu va Nguyễn Thi Lang, 1999) Và một số chỉ thị khác như RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), ITS (internal Transcribed Spacer).

1.6 Một số Chi thị dùng trong nghiên cứu đa dang di truyền

1.6.1 Restriction Fragment Length Polymorphysim (RFLP)

Trong số các Chi thị phân tử RFLP được phat triển đầu tiên được sử dung

trong lập bảng đồ gen người sau đó được cải biến cho kỹ thuật mapping cây trồng

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) RFLP hay còn gọi là tính đa hình chiềuđài các đoạn phân tử giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạnDNA khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộnhân hoặc trong các bào quan khác.

Với nguyên tắc đựa trên tính đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đốivới vi trí chúng nhận biết trên DNA bộ gen Trước tiên, DNA bộ gen sẽ được cắtbằng các enzyme cắt giới hạn, sau đó sẽ được phân tách theo kích thước dựa trên kỹthuật điện di trên gen agarose, tiếp đến sản phẩm được chuyền qua màng lai (với kỹthuật lai Southern blot) và lai với một mẫu dé DNA (được đánh dấu phóng xạ hoặc

huỳnh quang) việc nhận biết bằng việc chụp phim phóng xạ hoặc tín hiệu phát

huỳnh quang Sự khác biệt về vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắtkhác nhau.

Kỹ thuật RFLP thường được được áp dụng trong việc lập bảng đồ di truyềnvới mức chỉ phí thấp hơn giải trình tự, định vị gen gây ra các rối loạn di truyền, xácđịnh pha hé, Theo Nguyễn Thị Lang (2002), Các nhà chọn giốngsử dụng rất pho

biến chỉ thi RFLP dé phân tích DNA, RNA Các nhà khoa học có thé đánh dau gen

và lập bảng đồ số lượng và chất lượng.

RFLP có ưu điểm là Các chỉ thị RFLP có mức đa hình cao, là các chỉ thị đồng

trội (nên có thé phân biệt được các cá thé dị hợp tử và đồng hợp tử) và khả năng lặp

lại cao (Nguyễn Đức Thành, 2014) Tuy nhiên kỹ thuât RFLP cũng có những han

chế như: yêu cầu số công lao động lớn và thời gian (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị

Lang, 1999), yêu cầu DNA có chất lượng cao, phải phát triển thư viện đoạn dò từngloài, cần thông tin về trình tự để tạo đoạn dò, mức độ đa hình và số locus trên lầnphân tích thấp (Nguyễn Đức Thành, 2014), có thể nguy hiểm với sức khỏe người

nghiên cứu do sử dụng phóng xa dé đánh dấu

1.6.2 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

AFLP hay còn gọi là sự da hình các đoạn khuếch đại, có thể xem như là kỹthuật kết hợp giữa RFLP và PCR Kỹ thuật AFLP được tiến hành theo một số bước

như sau: đầu tiên DNA genome được cắt bởi enzyme cắt hạn chế cắt không thườngxuyên (EcoRI hoặc PstI) và cắt thường xuyên (Msel hoặc Taq]) Các phân đoạn tạo

ra sau khi cắt hạn chế được gan với các đoạn kết nối ở cả hai đầu Các đoạn kết hợpnày được thiết kế sao cho vị trí nhận biết ban đầu của enzyme cắt hạn chế khôngkhôi phục lại sau khi gắn Phản ứng PCR chỉ xảy ra khi các mồi có thể gắn với cácphân đoạn có trình tự kết nối cùng với các cặp bazơ bổ sung với các nucleotidechọn lọc Việc nhân bản được thực hiện hai lần trong điều kiện chặt chẽ với cácprimer bô trợ với các đoạn tiếp hợp và | đến 3 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ Phan

ứng PCR lần đầu (tiền nhân ban) được tiến hành với tô hop primer chứa một

nucleotide chọn lọc Phản ứng PCR lần hai (nhân bản chọn lọc) được tiến hành với

các cap primer có | dén 3 nucleotide chon loc Do mức độ chon loc cao, các primer

khác nhau chỉ một nucleotide sé cho các bộ phân đoạn nhân ban khác nhau Cacphân đoạn AFLP được phân tách bằng gen polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc(AgNOs) hoặc bằng máy giải trình tự tự động (Nguyễn Đức Thành, 2014) Kỹthuật AFLP được dùng để phát triển các chỉ thị đa hình (Bùi Chí Bửu và Nguyễn

Thị Lang, 1999) Kỹ thuât AFLP cũng được áp dụng trong xây phân nhóm di

truyền, cloning, bảng đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002)

Kỹ thuật AFLP có những ưu điểm như: độ tin cậy và lặp lại cao; không cầnthông tin về trình tự DNA của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả

năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp primer trên một gen và có

thể cho thấy các locus đặc thù (Nguyễn Đức Thành, 2014) Tuy nhiên AFLP cónhững nhược điềm đó là phải qua nhiều bước mới có kết quả; DNA cần phải sạch,không có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn chế; đòi hỏi công sức vàgiá thành cao Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không phân biệt được đồng hợp tử và dịhợp tử (Nguyễn Đức Thành, 2014)

1.6.3 RAPD (Random Amplified polymorphism DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khithực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm với các primer là các oligo nucleotide.Nguyên lý của kỹ thuật là cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trướcthứ tự nucleotide bằng cách dùng các primer tong hợp, đơn, ngắn, dãy mã đượcthiết kế ngẫu nhiên dé thực hiện PCR Primer sử dụng cho kỹ thuật RAPD là cácprimer ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dai primer thấp

(34°C — 37°C) Mặc dù trình tự primer RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được

hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải là 40% (thường là 50 - 80%) và không cótrình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau Sản phẩm PCR-RAPD thường được

phân tách trên gen agarose 1,5 - 2,0% (Nguyễn Đức Thanh, 2014) Kỹ Thuật RAPD

thường được áp dụng trong đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu xây dựng bảng

đồ gen (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Kỹ thuật RAPD với các ưu điểm như: đơn giản, nhanh cần một lượng DNA