2.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: Tháng 05/2021 đến tháng 06/2022.
Địa điểm: Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá sự đa dạng của các mẫu Cordyceps spp. thu được từ Vườn Quốc gia Bidoup-Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng dựa trên chỉ thị hình thái.
Đánh giá sự đa dang di truyền các mẫu Cordyceps spp. bằng chỉ thị ITS.
Đánh giá sự đa dang di truyền các mẫu Cordyceps spp. bằng chỉ thị ISSR.
2.3. Vật liệu thí nghiệm
Các mẫu Cordyceps được thu thập tại Vườn Quốc gia Bidoup — Núi Bà. Thời gian thu thập: từ ngày 22 tháng 5 đến ngày 28 tháng 5 năm 2021.
Số mẫu: 24 mẫu Cordyceps thu thập được lưu trữ ở 40C.
Bảng 2.1. Phiếu thông tin nguồn mẫu
Độ cao Nnigt ay DO Thoi
basa \ không 2 diém Stt Ky hiéu N E (DEM) khi/DAt am thu
(m) dep ee
1 BCp0l 120g›3oq› 108923407 1546317 23,4/18,1 90 8h25”
2 BCp02 1z0g›3sằ 108923738” 1531,693 22,4/18,0 94 8h11’
3 BCn03 120g›37ằ› 10892343? 1547,625 22,3/18,0 96 8h40’
4 BCp04 120g›27ằ› 108923732? 1544.378 23,3/18,5 90 9h25?
5 BCn05 1z0g›2gsằ 108923738” 1547.717 23,3/18,6 86 10h09) 6 BCn06 1zog›32ằ 10892337? 1537261 23,1/18,3 92 10h40”
7 BCp07 120g›22ằ 10892347” 1526,962 23,6/18,2 82 13h02’
8 BCn08 = 47013796” ~— 198931757” 1382,628 21,4/18,0 94 13h05”
9 BCn09 = 49011733” ~— 198926757” 1568,580 22,8/18,2 87 11h54 10 BCnl0 = 4704495 10g926Đgọằ 1509,695 24,1/18,6 84 12h07’
II BCnll 49049794 10g92722ằ 1499,157 24,3/18,8 84 12h41?
12 BCnl2 129I3›4o> 10g93s47 1170148 20,0/18,1 93 16h14’
l3 BCn13 4701954 ~— 198933741 ~—ô:1476,882 20,5/18,3 91 15h52’
14 BCnl4 = 4901435 10g926Đgoằ 1474265 20,7/18,1 92 16h14’
I5 BĐCnlŠ§ 120Il4g4? 1. 98927722” 1615,709 21,0/18,1 94 16h24’
l6 BCnl6 12042›22; 1gg934›47› 1229307 20,0/18,0 96 9h54”
I7 BCnl7 129I2›s3? 10g934?3s? 1308.011 20,2/18,1 95 13h28’
18 = BCpl8 490) 4:41” ~~ 19893547” 1209,420 20,5/18,3 92 16h14’
19 BCn19 = 4909967ằ 108937753” 1621,466 23,2/18,2 82 10h14’
20 BCn20 120o›41ằ 108937745” 1558407 23,4/18,7 80 11h34’
21 = BCn21 120g›3oằ 108923748” 1548,566 22,2/18,2 93 14h25’
22 BCn22 = 490) 445” = 198927745” 503,798 22,8/18,1 80 15h35”
23 BCn23 47049735 ~— 198927745” 1458,038 23,1/18,0 79 11h15”
24 BCn24 120o›s2ằ 10893741? 1567070 20,3/18,0 94 10h22’
2.4. Thiết bị và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong quy trình thực nghiệm gồm Máy Vortex (Velp Scientifica, Ý), Cân đện tử (Ohaus, Trung Quốc), Máy ly tâm (Hermile,
Đức), Máy đo OD (BioDrop, Anh), Máy điện di (Mupid- One, Nhật, Lò Viba
(Sharp, Trung Quốc), Bồn ủ nhiệt (Memmert, Đức), May PCR (LifeECO, Trung Quốc), Máy PCR-2720 (Appliedbiosystems, Mỹ), Tủ lạnh (Sanaky, Trung Quốc), Tủ âm 20°C (Sanyo, Nhật), Kính soi nổi (Euromex, Hà Lan), Kính hiển vi
(Euromex, Hà Lan).
Các dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu: đầu típ các loại, Eppendorf các loại, micropIpet các loại, ống đong, giấy bạc, thước, kéo cắt mẫu, nhíp kẹp mẫu, kính lap, đèn cồn, bình xịt cồn...
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: Phenol, Chloroform, NaCl, Ethanol
99,5%, Ethanol 70%, Dịch trích DNA -CTAB, Agarose, Gen red, Loading Dye 6X, TE 1X, TBE 0,5X, Nước khử lon, Ladder 100 bp, Ladder 1kb, Master mix, ISSR primers, ITS Primers.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu các bước thực hiện được tóm tắt như so đồ 2.1.
Thu thập mẫu
Ỷ
Đánh giá các chỉ tiêu
| hình thái học |
Đánh giá hình thái ký Đánh giá hình thái chủ stroma
Ly trích DNA
M
Đo mật độ quang/xác định nông độ
Ỷ
Phản ứng PCR với hai chỉ thị
| phân tử |
Khảo sát (Nhiệt độ bắt cặp Khảo sát (Nhiệt độ bắt cặp với
với primer ISSR) primer ITS)
Ỷ Ỷ
San lọc (primer ISSR đa hình Thực hiện phản ứng ITS- cao) PCR với tất cả mẫu
Ỷ Ỷ
Thực hiện phản ứng ISSR- Giải trình tự gen
PCR với tất cả mẫu
Ỷ Ỷ
Vẽ sơ đồ cây phân nhóm Vẽ sơ đồ cây phát sinh loài
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt qui trình đánh giá đa dang di truyền
2.5.1. Đánh giá đa di truyền bằng chỉ thị hình thái học
Việc đánh gia chỉ thị hình thái được chia làm 3 bước: bước | quan sát ký chủ
và sợi quả thể dưới kính lúp và kính soi nổi để quan sát các đặc điểm phân loại;
bước 2 đo đạt kích thước và cân trọng lượng, bước 3 quan sát phần quả thể dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X, 40X và 100X. Tắt cả các chỉ tiêu quan sát, đo đạc được thê hiện chỉ tiết qua bảng 2.4. Việc chọn lựa các chỉ tiêu để quan sat và đo đạt dựa trên tham khảo tài liệu về Côn trùng học của Nguyễn Viết Tùng (2006), đối
với ky chủ va tai liệu “Atlas of invertebrate- pathogenic of fungi Thailand” của tác
giả Luangsa-ard (2008) đối với qua thê.
Bảng 2.2. Chỉ tiết các chỉ tiêu quan sát và đo đạt
Ký chủ Quả thé
Chiều dài Hình dạng phần đầu sinh sản: chùy, sợi,
phân nhánh
Hình dạng giáp ngực Màu sắc phần đầu sinh sản Hình dạng râu Số lượng quả thê
Loại cánh Cấu trúc mặt ngoài quả thé
Cấu trúc miệng Màu sắc phần quả thể dưới phần đầu sinh
sản
VỊ trí mọc quả thé
Chiéu dai phan dau sinh san (cm) Chiều dai tổng (cm)
Quan sát hình dang túi bao tử Quan sát hình dạng sợi bao tử Quan sát hình dạng bào tử Trọng lượng mẫu vật (g)
Chiêu dài phan tong (cm) = (chiều dài quả thé + chiêu dài ký chủ); Trọng lượng mẫu vật (g) = tong trọng lượng ký chủ và quả thể
2.5.2. Đánh giá đa dạng di truyền với chỉ thị phân tử
Các mẫu Cordyceps thu thập sẽ được ly trích DNA, xác định nồng độ DNA trước khi thực hiện các bước tiếp theo cho phản ứng PCR với các primer ITS và
primer ISSR.
2.5.2.1. Ly trích DNA tổng số
DNA được ly trích theo qui trình CTAB phát triển bởi Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường TP. HCM. Mau được cắt tại phần đầu quả thé
sau đó cho vào eppendorf 1,5 ml vô trùng; thêm vào 600ul dung dịch ly trích va
nghiền mẫu với dung dịch này; thành phần dịch trích gồm: 20 g CTAB/L, 1,4M
NaCl, 0,1M Tris/HCl, 20 mM EDTA; sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút;
thu 300ul dịch nổi sau đó chuyền sang eppendorf 1,5 ml chứa sẵn 3001 PCI; thành phần gồm phenol/chloroform/isoamyl alcohol (ty lệ 25:24:1; tiếp đến hỗn hợp lắc mạnh mẫu; sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó thu 200u1 dịch nồi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới; bổ sung thêm 200u1 dịch CI với thành phân gồm: chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), lắc mạnh mẫu sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó thhu 100u1 dịch nổi sau đó chuyên sang eppendorf 1,5 ml mới; Thêm vào 60 ul isopropanol, tiến hành lắc nhẹ và ủ ở -20°C trong 20 phút; sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút; loại dịch nổi phía trên; thêm 500ul ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dich nỗi;
lặp lại bước 6 một lần; phơi ống cho đến khi không còn dung dịch nào bên trong ống; Thêm vào kết tủa DNA 50ul TE 1X, sau đó trộn đều và bảo quản ở - 20°C.
2.5.2.2. Xác định nồng độ DNA và định tính DNA
Số lượng mẫu thu thập hạn chế do đó mẫu BCn24 được sử dụng dé khảo sát phương pháp ly trích, nhiệt độ tối ưu nhằm giảm thiểu việc mat mẫu. Việc xác định nồng độ DNA của mẫu sau khi ly trích được thực hiện trên máy Biodrop. Các mẫu (BCp01, BCp07, BCn20) sau nhiều lần ly trích vẫn không có nồng độ DNA và không còn mẫu để ly trích thêm nên sẽ loại khỏi các bước tiếp theo. Phương pháp điện di được sử dụng đề định tính DNA với các bước: Cân 1,00 g agarose vào 50 ml dung dich đệm TBE 0,5X. Sau đó đun trong lò vi sóng cho đến khi dung dịch hoàn
toàn trong suốt. Dé nguội ở nhiệt độ phòng đến khoảng 50°C — 60°C. chuyển dung dịch agarose vào khay đã cày sẵn lược. Sau một thời gian gen đông lại thì rút lược và đặt bản gen vào bồn điện di có chứa dung dịch đệm TBE. Tra 5] mẫu DNA với 10ul dịch tra mẫu vào giếng trên bang gen. Điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V trong 30 phút- 65 phút tùy theo mức độ phân tách các băng.
Sau khi kết thúc điện di, bản gen được lấy ra quan sát và chụp ảnh gen dưới máy chiếu tia UV.
2.5.2.3. Đánh giá đa dạng di truyền vùng ITS-rDNA
Khảo sát nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho phản ứng khuếch đại vùng ITS-rDNA Dựa trên thông tin về nhiệt độ bắt cặp đối với primer ITS5/ITS4 theo White và ctv (1990), 3 mức nhiệt độ được chọn để khảo sát (Ta) là 57°C, 60°C va 63°C.
Với Primer ITS5 (5° - GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG - 3’) va ITS4 (5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’).
Phan ứng chuỗi PCR được tiến hành với tong thé tích là 25uL bao gồm
12,5ul 2X Mastermix, lHl primers ITSS, 1ul primer ITS4, 8,5u1 nước khử ion, 2,0
ul DNA template.Bảng 2.7. Phan ứng PCR được thực hiện theo chu trình: tiền biến tinh 94°C trong 3 phút, sau đó là 40 chu kỳ với ba giai đoạn; biến tính kéo dai 94°C trong 30 giây; bắt cặp Ta (57°C - 63°C) trong 50 giây; Kéo dai 72°C trong 2 phút, Kéo dài kết thúc 72°C trong 10 phút. Sau quá trình khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho băng sáng rõ sẽ được chon cho phản ứng PCR với toàn bộ 20 mẫu.
Sản pham PCR với cap primer ITSS/ITS4 sẽ được mang đi điện di, các san phẩm PCR cho băng sáng rõ sẽ được gửi di giải trình tự tại công ty TNHH DV &
TM Nam Khoa. Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh sau khi so sánh với các dữ liệu tương đồng trên Mycobank đề chọn ra các trình tự có mức tương đồng và bao phủ, tổng điểm cao nhất và sai số thấp nhất cùng các trình tự tham khảo từ các bài báo về O. nutans và O. sphecocephala. Ngoài ra hai loài là O. sinensis và C.
militaris được sử dụng dé làm nhóm đối sánh (tổng cộng 22 trình tự). Sau đó 20 trình tự của các mẫu Copdyceps thu thập sẽ được sắp dong hàng với 22 trình tự tham khảo với chức năng ClustalW Multiple alignment được thực hiện bởi phan
mềm Bioedit. Phan mềm Mega 11 được xử dung dé xậy dựng cây phát sinh loài với chức năng Maximum Likelihood với 1000 bootstrap. Bảng hệ số khác biệt được xây dựng với chức năng Pairwise Distances. Ngoài ra các 20 trình tự của các mẫu Cordyceps thu thập được tải lên trang web NCBI với số Accession number được thé hiện qua Bảng 2.3 dé thuận tiện cho việc lưu trữ dit liệu va so sánh.
Bảng 2.3. Danh sách các trình tự và xuất xứ dùng để xây dựng cây phát sinh loài Mẫu Mã Loài Khu vực Nguồn
accession
BCp02 OP787082 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap
BCn03 OP78/083 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCp04 OP787084 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCn05 OP787085 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCn06 OP787086 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCn0§ OP787087 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCn09 OP787088 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCn10 OP787089 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCnll OP787090 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCnl2 OP787021 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCnl3 OP787092 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCnl4 OP787093 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCn15 OP787094 Cordyceps spp. Viét Nam Thu thap BCn16 OP787095 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCnl7 OP787096 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCpls OP787097 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập BCnl9 OP787098 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCn21 OP787099 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCn22 OP787100 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thap BCn23 OP787101 Cordyceps spp. Việt Nam Thu thập
EU573348 O. oxycephala Thai Lan — ae va ctv,
: GenBank; Wang va ctv,
JX177484 O. nutans Trung Quoc —
Mẫu Mã Loài Khu vực Nguồn
accession
AJ786583 O. nutans Tham EEnBank Stensrud va-ety,
2005
AJ309367 O. nutans Trung Quéc Genbank; Liu, 2001
JX988781 O. nutans Trung Quéc et lai AB544478 O. nutans Nhat Ban i eile AJ786566 O. irangiensis TiấiTau “ EHEBHE vn Ge, AY646400 O. irangiensis Thi fa, “mg ane ite
JN943336 O. irangiensis Thai Lan GenBank; 2n 5 oh và cw, JN943335 O. irangiensis Titan, ‘mPa VI lá ho, JN943334 O. irangiensis Thi Tan ẾHHaHb a lược JN943350 ể. sphecocephala Nhật Bản ni Sản ơ SH VÀ. ate,
JN943351 O. sphecocephala Nhat Ban GesBaulg a aa GU723778 Ó.sphecocephala Thaitan “SẨHBAHHLBARGSB-RTU va
ctv,2011
AJ536553 O. oxycephala Trung Quéc GenBank; Hu, 2003
KX197239 O. neonutans Brazil Friedrich va ctv, 2018 KX197240 O. neonutans Brazil Friedrich va ctv, 2018 KX197244 O. neonutans Brazil Friedrich va ctv, 2018 KX197241 O. neonutans Brazil Friedrich va ctv, 2018 KX197242 O. neonutans Brazil Friedrich va ctv, 2018 AJ309329 C. militaris Trung Quéc GenBank; Liu., 2001
JN049854 O. sinensis - GenBank; Kepler, 2011
2.5.2.4. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị ISSR
Khảo sát nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho phản ứng ISSR-PCR
Dựa trên khuyến cáo nhiệt độ bat cặp primer từ nhà sản xuất, các primer được lựa chọn với tiêu chí đại diện cho ba mức nhiệt độ thấp, trung bình và cao tương ứng với 3 ba mức nhiệt độ (Ta) là 49,0°C, 52,4°C và 55,0°C. Hai mẫu (BCn24 và BCn23) được chọn ngẫu nhiên để khảo sát nhiệt độ bắt cặp prime với 3 primer
UBC 888, UBC810 va UBC 850 được mô tả như Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Ký hiệu mẫu khảo sát nhiệt độ
Mẫu Primer Nhiệt độ (°C) Ký hiệu
UBC 888 49,0 888-1 UBC 888 52,4 888-2 UBC 888 55,0 888-3 UBC 810 49,0 810-1 Ben24 UBC 810 52,4 810-2 UBC 810 55,0 810-3 UBC 550 49,0 850-1 UBC 550 52,4 850-2 UBC 550 55,0 850-3 UBC 888 49,0 888-4 UBC 888 52,4 888-5 UBC 888 55,0 888-6 UBC 810 49,0 810-4 Ben23 UBC 810 52,4 810-5 UBC 810 55,0 810-6 UBC 550 49,0 850-4 UBC 550 52,4 850-5 UBC 550 55,0 850-6
Khảo sát primer cho phản ứng ISSR-PCR
Sau khi đã chọn được nhiệt độ phù hợp cho phản ứng ISSR-PCR, ba mẫu ngẫu
nhiên va đại diện cho hai bộ cánh nửa va cánh màng (Bep18, Ben24, Ben23) được
khảo sát với 21 primer ISSR như bảng 2.5 nhằm chọn ra 12 primer cho băng sáng, rõ, với số băng đa hình, tỷ lệ đa hình cao và không trùng lấp cho phan ứng ISSR-
PCR.
Bảng 2.5. Primer ISSR được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tênprimer Trình tự (5’- 3’) Nguồn
| UBC807 (AG)8T Liang va ctv, 2008 2 UBC809 (AG)8G Liang va ctv, 2008 3 UBC826 (AC)8C Liang va ctv, 2008 4 UBC835 (AG)8 YC Liang va ctv, 2008
5 UBC836 (AG)8YA Liang va ctv, 2008 6 UBC840 (GA)8YT Liang va ctv, 2008 Ỹ UBC841 (GA)8YC Liang va ctv, 2008
8 UBC888 BDB (CA)7 Liang va ctv, 2008 9 UBC889 DBD(AC)7 Liang va ctv, 2008
10 UBC 808 (AG)8C Estrada va ctv, 2006 11 UBC 810 (GA)8T Estrada va ctv, 2006 12 UBC 818 (CA)8G Estrada va ctv, 2006 13 UBC 821 (GT)8T Estrada va ctv, 2006 14 UBC 828 (TG)8A Estrada va ctv, 2006 15 UBC 842 (GA)8YG Estrada va ctv, 2006 16 UBC 846 (CA)8RT Estrada va ctv, 2006 17 UBC 849 (GT)8YA Estrada va ctv, 2006 18 UBC 850 (GT)8YC Estrada va ctv, 2006 19 UBC 873 (GACA)4 Estrada va ctv, 2006 20 UBC 885 BHB(GA)7 Estrada va ctv, 2006 21 UBC 891 HVH(GT)7 Estrada va ctv, 2006 B=¢66,5,D=4,G6,T;H=A,C,7T;R=A,G; =A, Cứ; Y=C 1T
Phan ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf với tông thé tích là 25 uL bao gồm 12,5 pl 2X Mastermix, 2ul primer ISSR (10 mM), 8,5 pl nước khử ion, 2,0 pl DNA template. Phan ứng PCR được thực hiện theo chu trình: tiền biến tinh 94°C trong 5 phút, sau đó là 40 chu ky với ba giai đoạn; biến tinh kéo dai 94°C trong 45 giây; bắt cặp với nhiệt độ Ta (49°C- 55°C) trong 45 giây; Kéo dài 72°C trong 45 giây, Kéo dai kết thúc 72°C trong 5 phút.
Sản phẩm PCR với các primer ISSR sẽ được mang đi điện di. Kết quả bảng điện di sẽ được mã hóa theo hệ nhị phân 0 và 1 (Phụ lục 8). Kết quả được xử lý với phần mềm NTSYS 2.10Z để xây dựng cây phát sinh loài và tính toán tổng số băng
đa hình và tỷ lệ đa hình với từng primer.
2.5.3. Xử lý và phân tích số liệu
Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Excel và Minitab 16.0, Power BI. Hình ảnh của các mẫu Cordyceps thu thập được xử lý, đo dat bằng phan mềm Image J. Kết quả với cặp primer ITS5/ ITS4 được phân tích bằng phần mềm Bioedit, Mega 11, chức năng Blast trên NCBI và Mycobank để tìm các trình tự tương đồng. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng cánh so sánh trình tự của mẫu thu thập với các dữ liệu từ genbank (bảng 2.3) thông qua việc sắp gióng hàng với các trình tự qua chức năng ClustalW Multiple alignment trên phần mềm Bioedit.
Đối với chỉ thị ISSR kết quả được phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.10Z. bảng hệ số tương đồng được xây dựng với chức năng với coeffient theo phương pháp
SM. Cây phát sinh loài được xây dựng trên dựa trên chức năng Clustering với phương pháp UPGMA.
Chương 3