Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập nấm gây bệnh đốm đen trái xoài và khảo sát hiệu lực của chitosan và phức hợp nano chitosan đối với nấm Lasiodiplodia sp. gây bệnh đốm đen trái xoài ở điều kiện phòng thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINHKHOA NÔNG HỌC 3k 2s 3É 2s 3k ok sk KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP PHAN LAP NAM GÂY BỆNH DOM ĐEN TRÁI XOÀI VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA CHITOSAN VÀ PHỨC HỢP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 2s 3É 2s 3k ok sk

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LAP NAM GÂY BỆNH DOM ĐEN TRÁI XOÀI VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA CHITOSAN VÀ PHỨC HỢP NANO CHITOSAN DOI VỚI NAM Lasiodiplodia sp GÂY

BENH DOM DEN TRAI XOAI O DIEU KIEN

PHONG THI NGHIEM

SINH VIÊN THUC HIỆN : TRAN THÀNH NAM

NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VAT

KHÓA : 2018 — 2022

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 02 năm 2023

PHAN LAP NAM GÂY BỆNH DOM ĐEN TRÁI XOÀI VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC CỦA CHITOSAN VÀ PHỨC HỢP

NANO CHITOSAN DOI VỚI NAM Lasiodiplodia sp GAY

BENH DOM DEN TRAI XOAI O DIEU KIEN

PHONG THI NGHIEM

Tac gia TRAN THANH NAM

Khóa luận được dé trình dé đáp ứng yêu

cầu cấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

Hướng dẫn khoa học

TS Võ Thị Thu Oanh ec

ThS Chu Trung Kién Nl

Thanh phố Hồ Chi Minh

Tháng 02/2022

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ đã luôn tin tưởng, ủng hộ và tạo

mọi điều kiện tốt nhất dé tôi hoàn thành bậc đại học

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ

Chí Minh, quý thầy cô khoa Nông học đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn chân thành và biết ơn sâu sắc đến TS Võ Thị Thu Oanh vàThS Chu Trung Kiên đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyênmôn và nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Khoa học Ky thuật miền Nam, các

anh chi và các ban trong bộ môn Bảo vệ thực vật đã nhiệt tình giúp đố, góp ý cho tôi

trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè và tập thé lớp DHI§BV trường đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã đồng hành với tôi trong 4 năm học tập va

TÓM TẮT

Đề tài: “Phân lập nam gây bệnh đốm den trái xoài và khảo sát hiệu lực củaChitosan và phức hợp nano Chitosan đối với nam /asiodiplodia sp gây bệnh đốm đentrái xoài ở điều kiện phòng thí nghiệm” đã được tiễn hành tại Bộ môn Bảo vệ thực vật

— Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023

Mục tiêu nghiên cứu là xác định được tác nhân gây bệnh đốm đen trên xoải tại thành

phố Cao Lãnh - Đồng Tháp, và xác định nồng độ Chitosan va số phức hợp nanoChitosan trong việc phòng trừ nam Lasiodiplodia sp trong điều kiện phòng thí

Kết quả định danh bang đặc điểm hình thái cho thấy nam Lasiodiplodia sp làtác nhân gây bệnh bệnh đốm đen trái xoài tại thành phố Cao Lãnh - Đồng Tháp với cácđặc điểm: sợi nam có mau trắng đục, mọc nồi lên trên môi trường thạch, phân bố tròn

đều, phân nhánh, mọc nhanh; bào tử ở giai đoạn còn non không có màu, hình ovan, khitrưởng thành xuất hiện 1 vết ngăn ở giữa, màu nâu sam, có các vân sọc trải dai và đối

xứng: bao tử có kích thước trung bình từ 23,83+ 0,88 x 14,83+ 0,68 um.

Nội dung 2: Khao sát hiệu lực ức chế nam Lasiodiplodia sp của Chitosan vaphức hợp nano Chitosan điều kiện phòng thí nghiệm, thí nghiệm đơn yếu tố được bốtrí theo kiểu hoàn toàn ngau nhiên với 4 nghiệm thức là 4 hoạt chất sinh học vànghiệm thức đối chứng sử dụng môi trường PDA, 5 LLL, 2 đĩa petri/NT/LLL

Kết quả ghi nhận cho thấy khi xử lý nam Lasiodiplodia sp bằng Chitosan vàChitosan/1a cho hiệu lực ức chế tốt nhất ở nồng độ 2.000 ppm tương ứng đạt 57,15%

và 67,76% sau 36 giờ sau cấy Trong khi đó phức Chitosan/Zn và phứcChitosan/ZnO/1› với nồng độ tương ứng là 2.000 ppm và 3.000 ppm đã cho hiệu lực ức

il

chế gần như hoàn toàn sự sinh trưởng và phát triển nam Lasiodiplodia sp sau 36 giờ

cây.

11

MỤC LỤC

Trang

i ng iiTAINO, BANE, AGS CWE A crecrncccrccencesorsncratcos meninassereamrninassnearaeci viDANH SÁCH CAC BẢNG -22222-2222222222 22222222 re viiDat vấn G6 oo eececccccesessesseeseessesscsessessessessessessessesssssessseessessessessessessesseesesstsseesesseesessesseeseesees 1

Mie tiều:iphH1SH GỮ Os xesce ssc asss cnssusaresunanuss scans eaweyesmasorearesneaese rea eau area me NERS 2

Giúp HE ĐÌ oeennoesnrenteerereSngtiidthyttisrirftrorrfilnorfi0tfoerdiiSfssrSietiugSfuuTdogrtfEtngntgrrnrfrei 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2 2222222E22E22EE22EzEzzxezrszrxezszrsees x -31.1 So luge Tác hhỈ¿ỪDÃA34344 31.1.1 Nguén géc cy XOdb cecceccccceessesssessesssesseesecssessessussseesessieesessuseseesssueeseesuseseeseesees 3

1.2 So lược về bệnh đốm den trên xoài 2 2 2+22+E+EE+EE+EeEeExrrxerxrrxrrxrrxrrxerxee.i

TDA pS UGGS Đến Ho seseseeosikabtrnsetdrinloerisgilrussgavlipuenksshieesinbrlgophsriigesuilExrgkiodsiristlifklescksi2 3

1.2.2: Tác:nhần gầy bệnH e.-e.csczccsc kháng rien asisenseadtnreneanscnnsanwnrensnstartacncnassennetntd 4

1.2.3 Phương thức lây truyền bệnh 2-2 22+S222E+2E2EE£EE+2EEZEEE2EE22E2222222Eezrrre 5

139 Sư Tempe về năn: Leet ai yp «ch etsiniisioisnsmomnninsnbonaencbaniivon mii 5

1.3] V1 trí plat lOẠIsee sere asereeseeererecmpeses ever sereemraer serene ae eee 5

ee | er 51.4 Téng quan vé cac hop Chat 1 a4 7

I0 7

LA ODIO Sgfìn 1D mcsssccessnsessemmesuszasseesanc ee wescauad nies staal uaa ERE 9 1A 3) CRSA Trong rceerre seuss ere nvar enue a err EERE RE 9 I9 )//4090/ 11108 10

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -2- 5z 12

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ce cee 525 *22E*2 E2, 12

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2-2 2+2S+2E£EE£2E2EE22E+EE2EZEZEzEzxrzxee 12

2z] | HỢI/đián:THIẾH CU vespseseccseremseeanmenerenm ap arm eer EERE 12

2.3.1 Nguồn mẫu phân lập và nghiên cứu 2-2 2 2222++2+2E+£E++£E+zz+zzszzzzzzxz 122.3.2 Môi trường nuôi cấy nắm 2-22 ©22+SS2E2EE22E122122112212211211271211211 21.22 2e 12

2.3.3 Vật liệu Chitosan và một số phức nano ch1fOSa - - 55555 ++s£+s++eeseesss 13

2.4.1.1 Thu thập mẫu bệnh ¿2 2522 SE+S£S2E£E£EE£E£EE2E£EEEE2E22E21232121222222222xxe 13 2.4.1.2 Phương pháp bảo quản mẫu bệnh ¿2 2222 +S+EE+E££E+EE+E£EzzEzzzxrrxzrs 14

2.4.1.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu bệnh - 2-2: 14

2.4.1.4 Phương pháp phân lập mẫu bệnh - +22 22 ++2z+2++2z+£zzx+zxzxzxezxez 14

2.4.1.5 Định danh nam Lasiodiplodia sp dựa vào đặc điểm hình thái 15

2.4.1.6 Lay bệnh nhân tạo nam Lasiodiplodia sp trên xoài bằng quy trình Koch 152.4.2 Khảo sát hiệu qua ức chế nắm Lasiodiplodia sp của Chitosan và một số phức

hợp nano Chitosan trên dia petri trong điều kiện phòng thí nghiệm 16

2.4.2.3 Khao sát hiệu quả ức chế nam Lasiodiplodia sp Của Chitosan ở các mức nồng

GLO KNB ONAN: s66 6c n1 Hán G155 gác 5ã 840536056.833 18A S82⁄85838831580S55.83808385343085463304S&38iS08338115ã303548.83353.83338/56243538 17

2.4.2.4 Khảo sát hiệu qua ức chế nam Lasiodiplodia sp Của phức hợp nano Chitosan

Prete thiểu mững đổ khôn gÌNisssesssuienioioiiERDiiiGTEiuijdA33060u.8000000388/0)50060101080000g0080 17

2.4.2.2 Phương pháp tiến hành: - 2-2 ©2222+222+222E2221222127112231222127212711222 22 ee 18

2.4.2.5: CHỈ tiểu: theö: đổi os ccssestsconssovesnesnsemsnconsins sohewnsevassesseenastsaveneassentecncenonesteveeniswesweeass 18

2.5 Phuong phap i02 0/0 1454 19

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-22222E+2E2EE2EE222222322222212222222e 20

3.1.1 Xác định nắm Lasiodiplodia sp theo đặc điểm hình thái 252- 223.1.2 Kiểm chứng kết quả định danh nam Lasiodiplodia sp theo quy trình Koch 223.2.1 Ảnh hưởng của Chitosan đến nam Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA .243.2.2 Ảnh hưởng của Chitosan/I2 đến nam Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA 263.2.3 Ảnh hưởng của Chitosan/Zn đến nắm Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA 283.2.4 Ảnh hưởng của Chitosan/ZnO/I2 đến nắm Lasiodiplodia sp trên môi trường

PDA 2c 22221 21211211211211211 211211212121 1 1 1n 1 1212121112121 21k 31

¡354100694 '2.15j15.1:7100 mm 34TÀI LIEU THAM KHẢO 2-52 22S2+E2EE£E£EEEEEEEEEerkerrkrrserrrrrerrrrerrre 3

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

Chữ viết tắt Viết đầy di/nghia

CRD Hoàn toản ngẫu nhiên

PR Protein liên quan đến mầm bệnh

QCVN Quy chế Việt Nam

STT Số thứ tự

TSS Hàm lượng chất rắn hòa tan

VI

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2 1 Tính chất và đặc điểm các hoạt chất sử dụng trong thí nghiém 13Bảng 2 2 Các mức nồng độ Chitosan sử dụng trong thí nghiệm đối với nam

HHÔ THỊ GHHNHO EIHTHNG LTpiizasotiltirotzeas64tizrcBtisoEoiiitlstprj4EiriogsmifimgtcrB38igngfigtlsmgi0i38isgiSrirtkagiGioiniesgiisaipd60Z6zn8 17

Bảng 2 3 Các mức nồng độ phức hợp chitosan/Ia đối với nam Lasiodiplodia sp 17

Bảng 2 4 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/Zn đối với nam Lasiodiplodia sp L8

Bảng 2 5 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/ZnO/I› đối với nắm Lasiodiplodia sp

Bảng 3 1 Ảnh hưởng của các mức nồng độ Chitosan đến đường kính tan nam (mm)Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi .- 24

Bảng 3 2 Hiệu lực ức chế (%) của các mức nồng độ Chitosan đối với nam

Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 25Bang 3 3 Ảnh hưởng của các mức nồng độ Chitosan/I› đến đường kính tan nắm (mm)Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 27Bảng 3 4 Hiệu lực ức chế (%) của các mức nồng độ Chitosan/I› đối với nam

Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 28Bảng 3 5 Ảnh hưởng của các mức nồng độ Chitosan/Zn đến đường kính tản nắm

(mm) Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 29Bảng 3.6 Hiệu lực ức chế (%) của các mức nồng độ Chitosan/Zn đối với nắm

Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 30

Bảng 3 7 Ảnh hưởng của các mức nồng độ Chitosan/ZnO/I› đến đường kính tản nam(mm) Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 3ÓBảng 3.8 Hiệu lực ức chế (%) của các mức nồng độ Chitosan/ZnO/I› đối với nam

Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA qua các thời điểm theo dõi 33

Vil

DANH SÁCH CÁC HÌNHHình 1.1: Triệu chứng bệnh đốm den trên trái xoài - 2 22552 s+2szzs+>zz>s2 4

Hình 1.2: A: Hình bào tử non; B: hình anh bao tử già; C: hình ảnh nhánh bào tử 5 Hình 1.5: Hình dạng tâng Lasiodiplodia sp trên đa PDA series 6

Hình 1.4: Sự chuyên hóa chitin thành chitosan 22- 22-552 22222S2222222222Exczzzczxeex 7

Hình 1.5: Cơ chế tác động trực tiếp của Chitosan lên tế bào vi sinh vật gây bệnh 8

Hình 3.1: Triệu chứng bệnh đốm den trên trái Xoải + s+s+zSEEzE+EzEcEvrxrerrrrree 20Hình 3.2: Tản nam Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA - -¿-5z555- 21Hình 3.3: Quả thé và hình dang bào tử nam /asiođiplođia sp - -. - 21Hình 3.4: Vết bệnh đốm đen sau khi nhiễm nam Lasiodiplodia sp - 22Hình 3.5 Ty lệ bệnh đốm den trái xoài khi lây nhiễm nam Lasiodiplodia sp qua các

UE CED ee) | Sn 23Hình 3.6 Chi số bệnh đốm đen trái xoài khi lây nhiễm nam Lasiodiplodia sp qua cácthời điểm theo đối (%) 2-©2¿2222222122E22122122512212112212211211221211221211211 21 Ly ee 23Hình 3.7: Tan nắm Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA được xử ly Chitosan trêngác rỗng đồ Kháo BBA saseeesenbudordkeritnrindiosrletcsdlotoigolti6054/100035101/810030000100/ 100010 E0 25Hình 3.8: Soi nam Lasiodiplodia sp bi u sưng khi xử ly Chitosan ở nồng độ 26Hình 3.9: Tan nam Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA được xử ly Chitosan/T; trêncác nồng độ khác nhau - 2-2 ©2222++2E22EE2EE2SEE2EEEEEE2EEEEEE2EE22E2EE22E2EE2EEEEerrrea DẤUHình 3.10: Soi nam Lasiodiplodia sp bị teo nhỏ khi xử lý Chitosan/1› 28Hình 3.11: Tan nắm Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA được xử lý Chitosan/Zntrên gấu tông đồ Táo 1 | ee 29Hình 3.12: Soi nam Lasiodiplodia sp bị u sưng khi xử lý Chitosan/Zn 30Hình 3.13: Tan nắm Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA được xử lý

Chitosan/Zn0/I› trên các nồng độ khác nhau - 2-22 ©++22++2E+2EE++2E+z£z++cszze 32Hình 3.14: Soi nắm Lasiodiplodia sp khi xử lý Chitosan/ZnO/1; ở nồng độ 33

vill

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Xoài có tên khoa học là Mangifera indica L là một loại trái cây phô biến của

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Tại Việt Nam xoài là một trong những loại cây ăn

qua được trồng phổ biến có giá trị xuất khẩu cao Theo Cục Trồng trọt, Bộ Nôngnghiệp và Phát triển Nông thôn, Việt Nam vào năm 20221 có 92,746 ha trồng xoài và

sản lượng 788.233 tấn Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long là vùng sản xuất xoài

lớn nhất, chiếm đến 46,1% diện tích và 64,4% sản lượng xoài của cả nước Tuy nhiênviệc xuất khẩu cũng như tiêu thụ vẫn còn nhiều hạn chế, do tình trạng hư hỏng sauthu hoạch, đặc biệt là bệnh đốm den gây thiệt hại nghiêm trọng và làm tôn thất kinh tế

khá lớn.

Nam Lasiodiplodia sp là một trong nam bệnh phổ biến nhất ở các nước nhiệtđới và cận nhiệt đới, nam này thường gây bệnh đốm đen trên các loại quả như chuối,

họ cây có múi, xoài (Assuah, 1999) Theo khảo sát tại khu vực Tiền Giang của Viện

Cây ăn quả miền Nam nam Lasiodiplodia sp là nam gây bệnh phổ biến trên xoài cátHòa Lộc, giống xoài chủ lực của Việt Nam hiện nay Đề giảm thiểu thiệt hại củabệnh, người ta sử dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như vệ sinh đồng ruộng,bón phân hợp lí, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Trong đó việc sử dụng thuốc bảo vệthực vật để phòng trừ bệnh là pho bién nhat Tuy nhién, viéc lam dung thuốc bảo vệthực vật đã và đang mang lại nhiều hiểm họa đối với môi trường, đe dọa sức khỏe conngười, mất cân bằng sinh thái, làm xuất hiện nhiều loại dịch hại thứ cấp

Từ những tác động tiêu cực ngày càng lớn của hóa chất bảo vệ thực vật, các nhànghiên cứu đang hướng dần đến những nguồn vật liệu an toàn — xanh — hiệu quả,trong đó nano là một trong những nguồn vật liệu mới góp phần thực hiện định hướngnày Công nghệ nano đã được nhiều thành tựu trong nông nghiệp nói chung và ngành

bảo vệ thực vật nói riêng Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy

Chitosan không những mang lại hiệu quả cao trong việc quản | dịch hại cây trồng màcòn kích kháng làm tăng khả năng miễn dịch bên trong cây trồng, ngoài ra đảm bảo

an toàn cho người sử dụng và môi trường Hiện nay, Chitosan đã được sản xuất, ứngdụng rộng rãi trong nông nghiệp, khi đưa về kích thước nano đã làm tăng khả năngdiệt nắm bệnh (Mustafa và ctv, 2013) Bên cạnh đó, việc kết hợp Chitosan với cácnano kim loại, iot cũng làm gia tăng mạnh hiệu qua kiểm soát nguồn bệnh đốm đen

trái xoài, tuy nhiên những nghiên cứu này còn nhiều hạn chế

Từ những van dé trên đề tài: “Phân lập nắm gây bệnh đốm đen trái xoài và

khảo sát hiệu lực của Chitosan và phức hợp nano Chitosan đối với namlasiodiplodia sp gây bệnh đốm den trái xoài ở điều kiện phòng thí nghiệm” được

thực hiện Nhằm tạo tiền đề cho việc tìm hiểu tác nhân gây bệnh đốm đen trên xoài.Cùng với đó là nghiên cứu sử dụng các hoạt chất nano Chitosan và số phức hợp nano

Chitosan đối với nam Lasiodiplodia sp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Thu mau từ các trái xoài bị bệnh đốm den tại thành phố Cao Lãnh — Đồng Tháp

Phân lập, xác định nam Lasiodiplodia sp

Bồ trí thí nghiệm các dãy nồng độ Chitosan và một số phức hợp nano Chitosan

dé xác định hiệu quả ức chế đối với nắm Lasiodiplodia sp ở điều kiện phòng thi

nghiệm.

Giới hạn đề tài

Nắm Lasiodiplodia sp sử dung trong thí nghiệm là được định danh theo đặcđiểm hình thái hình thái

Chỉ định danh dừng lại ở giống

Do thời gian và điều kiện có hạn nên chỉ tiến hành khảo sát hiệu lực của một sốloại nồng độ chitosan và một số phức nano Chitosan đối với nắm Lasiodiplodia sp.trong điều kiện phòng thí nghiệm

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Sơ lược về cây xoài

1.1.1 Nguồn gốc cây xoài

Xoài có tên khoa học là Mangifera indica L thuộc Họ Đào lộn hột

(Anacardiaceae) và có nguồn góc ở Đông Bắc Ấn Độ, bắc Myanmar, ở vùng đồi núi

chân dãy Himalaya và từ đó lan đi khắp thế giới sớm nhất là Đông Dương, NamTrung Quốc và các nước khác vùng Đông Nam Á (Vũ Công Hậu, 1999) Khởi đầu tạitrung tâm nguồn gốc An Độ, từ thế ki 15-18 xoài được đem trồng ở một số nướcthuộc vùng nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới do các nhà truyền đạo Hồi, các nhàhằng hải, các nhà buôn Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha ( Trần Thế Tục và ctv, 2004)1.2 Sơ lược về bệnh đốm đen trên xoài

Bệnh đốm đen trên xoài gây hại ở các thời điểm trong năm trước và sau thuhoạch đặc biệt là vào mùa mưa tỉ lệ bệnh xuất hiện cao Bệnh không những làm giảmnăng suất giá trị thương phâm mà còn gây hại sau thu hoạch khó khăn trong việc bảoquan, tồn trữ khi vận chuyên và sử dụng thương mai

Lasiodiplodia sp là một trong nắm bệnh phổ biến nhất ở các nước nhiệt đới vàcận nhiệt đới, nắm này thường gây bệnh đốm đen trên các loại quả như chuối, họ cây

có múi, xoài (Assuah, 1999) Theo khảo sát tại khu vực Tiền Giang của Viện Cây ăn

quả miền Nam cho thay chủng nắm Lasiodiplodia sp là chủng nam gây bệnh phổ

biến trên xoài cát Hòa Lộc, giống xoài chủ lực của Việt Nam hiện nay

1.2.1 Triệu chứng bệnh

Bệnh đốm đen trái xoài được thu nhận bằng cách quan sát hình thái và màu sắccủa trái xoài Trái xoài bị đốm đen thì ban đầu xuất hiện các đốm nâu sam hoặc nâuđen, vết bệnh xuất hiện từ phần cuốn trái, to nhanh thành từng mảng không đều sau

đó lan đến phần thịt trái ở đầu trái, thịt trái trở nên mềm Trái bệnh ở giai đoạn nặng

sẽ rơi xuống đất hoặc bị thối đen trên cành Các tôn thương trên bề mặt và phần thịt

bên trong xoài sẽ dân chuyên từ nâu đen sang đen và xẹp xuông Lasiodiplodia sp là

loại nâm gây hại nặng cho trái xoài khi gây hại chúng còn tạo ra các sợi nâm màu

trăng hơi xám bao phủ xung quanh phân vỏ quả bên ngoài, gây hoại tử Các khu vực

thối rữa nhanh chóng lan rộng từ đầu vỏ trái xuống các phần khác của vỏ dẫn đến lớp

vo ngoài của trai có mau nâu đen và mêm (Munrrah và ctv, 2017)

(Nguồn: Munirah và ctv, 2017)Hình 1.1: Triệu chứng bệnh đóm den trên trái xoài

1.2.2 Tác nhân gây bệnh

Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu tác nhân gây ra bệnh đốm den trên xoài tai

Việt Nam Tuy nhiên trên thế giới đã có những báo cáo về các tác nhân gây bệnh đốm

den trái xoài bao gồm: Dothiorella sp, Pestalotiopsis sp và Lasiodiplodia sp được coi

là nguyên nhân quan trọng nhất gây bệnh đốm đen trên xoài (Johnson, 1992) trái xoài

do các loại nam bệnh này gây ra cho thấy các biéu hiện chung bao gồm trái xoài vết

kim châm màu thâm đen trên vỏ màu đen, xám đen hoặc đen, kích thước vết bệnh tohoặc nhỏ và khối u cao hay thấp ở mỗi vết bệnh không giống nhau, nếu nặng có thể

làm cho trái bi nut, bi rụng (Chen va ctv, 2021).

Lasiodiplodia sp con được gi nhận tại Phúc Chau Trung Quéc ( Chen va ctv,2021) G Viét Nam nam Lasiodiplodia sp được xác định là loại nam chính gây ra

bệnh dom den trên xoài tại Tiên giang.

1.2.3 Phương thức lây truyền bệnh

Bệnh gây hại nặng trên các vườn trồng quá dày, rậm rạp và phát triển mạnh

trong mùa mưa nhất là những ngày mưa dam, âm độ cao, thiếu nắng Bệnh lây lan ratnhanh từ trái này sang trái kia bằng bào tử nhờ gió, côn trùng mang đi, có thể tồn tại

trong đất và có thé lây lan qua hệ thống tưới tiêu nước, kiến và con người hoạt động,

dễ tấn công khi trái đang có vết thương (Anamika Sharma & Rangaswamy

Muniappan, 2021)

1.3 So luge vé nam Lasiodiplodia sp

1.3.1 Vi tri phan loai

1.3.2 Dac diém hinh thai

Theo Serrato-Diaz (2013), Munirah va ctv (2017), Chen va ctv (2021), mô tả

bào tử khi chưa trưởng thành có dang hình oval hoặc elip, đỉnh tròn, vách dày, trong

suốt và đơn bao, khi trưởng thành thì có màu nâu sam, đơn đọc, có vách ngăn và xuất

hiện các vân sọc Bao tử có kích thước trung bình 22,5 - 27,8 um x 14,5 -17 um

(Munrrah và ctv 2017)

Hinh 1.2: A: Hình bao tử non; B: hình ảnh bào tử gia; C: hình ảnh nhánh bao tử

5

Tan nam trên PDA Sau 3 ngày nuôi cây ở trên môi trường PDA, soi nam có

màu trăng đục, mọc nôi lên trên môi trường thạch, phân bô tròn đêu, phân nhánh, mọc

nhanh chuyền sang màu xám đen đến đen sau 5 ngày (Chen và ctv 2021)

(N guon: Chen, 2021)

Hinh 1.3: Hinh dang tang nam Lasiodiplodia sp trén dia PDA1.3.3 Những ký chủ của nam Lasiodiplodia sp

Các tác giả Marquest va ctv (2013), Munirah va ctv (2017), Nguyễn Thi Dung

va ctv (2020) đã báo cáo nắm Lasiodiplodia sp gay ra bệnh đốm den trái xoài

Các loài Lasiodiplodia sp còn là nguyên nhân phô biến gây ra nhiều các loạibệnh như cháy lá, đốm lá, thối thân, thối quả và các bệnh khác sau thu hoạch (Zhang

và ctv, 2017; Yanling và ctv, 2021)

Lasiodiplodia sp là nguyên nhân gây bệnh thối trái nghiêm trọng đã làm matsản lượng và chất lượng sau thu hoạch của mận, đào và cây xuân đào ở Nam Phi,chôm chôm (Damm, 2007; Rahim, 2022; Thạch Thị Ngọc Yến, 2016) Tại TrungQuốc cũng ghi nhận nam Lasiodiplodia sp gây nám trái, hóa đen và thối trái trên dâu

tây và đu đủ (Chen và ctv, 2021).

Các loài Lasiodiplodia không có tính đặc hiệu cao đối với vật chủ Thực tế là

một số lượng lớn các loài Lasiodiplodia sp chỉ được ghi nhận trên một vật chủ không

có nghĩa là chúng chỉ dành riêng cho vật chủ.

1.4 Tổng quan về các hợp chất

1.4.1 Chitosan

Chitosan là sản pham deacetyl hoá một phan của chitin (Hình 1.4) Chitin là

một polymer sinh học tự nhiên khá phô biến, hiện diện trong lớp vỏ của một số loài

giáp xác (tôm, cua, mực), một số loài nam, sâu bo (Pillai và ctv, 2009; Broussignac vàctv, 1968; Kumar va ctv, 2000) Chitosan va chitin là chat không độc hai, tương hop,phân huỷ sinh học và có một số hoạt tính sinh học đặc biệt như: kháng ung thư

(Tsukada và ctv, 1990), kháng khuẩn (Benhabilesa và ctv, 2012; Heng Yin và ctv,

2010; Carmen Gómez — Guillén và ctv, 2014), kháng nắm (Jianying Huang va ctv,

2014; Xua va ctv, 2007), tăng cường miễn dịch và tiềm năng trong việc sử dung làm

hoạt chất BVTV (Heng Yin và ctv, 2010)

Hình 1.4 Sự chuyên hóa chitin thành chitosanChitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật khôngxương sống như: côn trùng, nhuyễn thé, giáp xác và giun tròn; có ở mô da; thành tếbao nam họ Zygenmyctes; Chitin có cấu trúc thuộc ho polysaccharide, hình thái tựnhiên ở dạng rắn Chitin được hợp thành từ cá đơn vị 2-acetamio-2-D-glucose (N-acetylglucosamine) qua liên kết 6 (1—>4) glycan tạo thành một plysaccharide có tên làpoly 6 (1—4)-2-acetamio-2-D-glucoseChitosan được xem là một vắc xin thực vật,được biết đến là các hoạt chất giúp cây trồng tăng cường sức đề kháng, tự tạo rakháng sinh tiêu diệt nam bệnh khi bị nắm bệnh xâm nhập (Heng Yin và ctv, 2010)

Cơ chế kích kháng nắm bệnh là thực vật tự tiết ra các phytoalexins liên kết với chitin

là thành phần chính của vách của tế bào nam bệnh và phá vỡ vách tế bào nắm bệnh

(Thakur và ctv, 2013; Das và ctv, 2015).

Ngoài tạo ra kháng thể, Chitosan còn tác động trực tiếp đến việc diệt trừ visinh vật gây hại theo cơ chế được mô tả theo hình 1.5 như sau: cơ chế thứ nhất, phá

vỡ màng tế bào của vi khuẩn do sự tương tác giữa các phân tử chitosan tích điện

dương với vách tế bào vi sinh vật tích điện âm Tương tác điện tích này có thể làmthay đổi hình thái bề mặt, làm tăng khả năng thâm thấu của màng, gây thất thoát các

chất nội 12 bao, hoặc làm giảm độ thấm màng, ngăn cản quá trình vận chuyền chất

dinh dưỡng Cơ chế thứ hai, là sự kết hợp của Chitosan với DNA của vi khuẩn, dẫnđến ức chế sự kết hợp mRNA và protein thông qua việc thâm nhập Chitosan vào

trong nhân của vi sinh vật Cơ chế thứ ba Chitosan có khả năng liên kết với các chất

dinh dưỡng quan trọng cho sự phát triển của vi sinh vật và hấp thu cation kim loại cótrong thành tế bào vi sinh vật (đặc biệt là khả năng chelate kim loại dạng vết), dẫnđến ngăn chặn vận chuyền chất dinh đưỡng cần thiết dé nuôi tế bào và làm tế bào bị

chết (Li và ctv, 2013)

t ] h

— ! _Tương tác tĩnh điện giữa chitosan

#9 Chitosan | H và vách tê bào vi sinh vật

! J

Vách tế bào Màng tế bào

oplasmic

SA [Meter P és

Thay đôi tinh thâm thâu của tê bao

Gay ton hại DNA

ï rách tế bào" es Phá vỡ màng tế bào @ Jon kim loại

Di qua vách te bao \ «Tạo phức với kim loa = pelo pitt vor tim "9

(Nguồn: Trích từ Bộ Môn BVTV-Vién KHKT Nông Nghiệp Miễn Nam, 2022)

Hình 1.5 Cơ chế tác động trực tiếp của Chitosan lên tế bào vi sinh vật gây bệnhTính kháng khuẩn

Chitosan thé hiện nhiều hoạt động kháng khuẩn khác nhau Trong một số nghiêncứu Chitosan oligomeric (pentamers và heptamers) đã được báo cáo thé hiện hoạt tinh

kháng nấm tốt hơn so với các đơn vị lớn hơn (Rabea và ctv, 2015) Chitosan tạo racác phức với các chất dinh dưỡng thiết yếu, làm ức chế sinh trưởng của vi khuẩn.Tương tác với các nhóm anion trên bề mặt tế bao và tạo ra các phức hợp điện phânvới các hợp chất trên bề mặt vi khuẩn Chitosan còn tạo ra một lớp không thấm quanh

tê bào, ngăn can sự vận chuyên của các chat hòa tan cân thiệt vào trong tê bao.

Đối kháng nắm

Chitosan có tính đối kháng các loại nam bằng các: cơ chế kích kháng khi namxâm nhập, liên kết với chitin trong vách tế bào nâm bệnh đề phá vỡ thành tế bào nắmbệnh Abdel-Rahman và ctv (2021), đã báo cáo rằng hiệu lực ức chế sự phát triển của

hệ khuẩn ty nam Penicillium expansum gây bệnh thối xanh trái táo của chitosan trongkhi nồng độ chitosan là 4.000 ppm Theo Lê Nguyễn Duy, 2014 Công bố kết quảnghiên cứu ức chế nam Colletotrichum Gloeosprorioides trên xoài cái Hòa Lộc bịbệnh thán thư khi ở nồng độ 1000 ppm

1.4.2 Chitosan-I2

I2 (iot) được biết đến là loại chất được ứng dụng sử dụng trong phòng trừ nam,khuẩn có hoạt tinh sinh học Sự Kết hợp giữa CTS và I2 có khả năng kháng bệnh, tạo

kích kháng, sát trùng sẽ làm tăng khả năng kháng bệnh thực vật do hiệu ứng cộng hợp

giữa chúng (Hassan, 2003) Chitosan tạo phức với Iz cũng đã được nghiên cứu tông

hợp và thử nghiệm hiệu quả kháng bệnh sử dụng trên thực vật Phức CTS-l¿ có khả

năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn và nam bệnh như vi khuẩn Z coli, tiêu diét hoàntoàn nam Staphylococcus aureus, Candida albican sau thời gian 10 phút ở nồng độ

200 mg/L (Banerjee, 2010) CTS-Is đã được ứng dụng làm chất bảo quản nông sản,

xử lý trên thực vật để giảm stress cây trồng, giúp cây trồng tăng khả năng chịu hạnmặn, chống oxi hóa, giảm VSV gây hai và tích lũy lb cho nông phẩm (Mallick, 2012)

1.4.3 Chitosan-Zn

Kém (Zn) là một nguyên tố vi lượng cần thiết cho cây trồng Kẽm có vai tròtăng cường khả năng tông hợp axit nucleic tổng hợp protein, sinh sản quá hình thànhgiống cây trồng, điều tiết tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng và ngăn ngừa dị tậtcây con Ngoài các vai trò nêu trên Zn còn có hoạt lực diệt nắm bệnh cao, các muốikẽm thường được ứng dụng là chất diệt nắm bệnh cho cây trồng Cho đến ngày nay,các hợp chất của kẽm vẫn cho hiệu quả cao trong công tác phòng trừ và diệt nắm

bệnh với hoạt tính xúc tác mạnh, giá rẻ, ít độc

Sự kết hợp giữa chitosan và Zn tạo lên kha năng hoạt tính kháng nắm cao hơn.Điều này có thể được giải thích do chitosan được biết đến là chất kích thích mạnh mẽ

các cơ chế bảo vệ thực vật Nắm có xu hướng tạo ra các mức axit khác nhau trong quá

trình lây nhiễm sang cây trồng Tính axit tạo ra proton hóa các nhóm amin của

9

chitosan dẫn đến giải phóng các ion Zn từ cấu trúc nano chitosan Hoạt tính khangnam của các ion Zn được tạo ra thông qua việc tạo ra các gốc hydroxyl phản ứngmạnh sau đó có thể làm hỏng các phân tử sinh hoc Tác dụng cùng lúc giữa chitosan

và tính kháng nắm của các ion Zn được giải phóng có thê góp phần làm tăng hoạt tính

kháng nam của các hạt nano Zn-chitosan

Chitosan có các đơn phân tử là glucosamin, mạch glucosamin có chứa các nhóm

chức -OH và -NH2 còn một cặp electron chưa sử dụng nên rất linh động, chúng cókhả năng tạo phức với hầu hết các kim loại như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+,

Co2+ (Fabrice Brunel va ctv, 2013; Vu Khac Hoang Bui va ctv, 2017; Nguyen Van Cuong va ctv, 2009)

Chitosan-Zn là sự kết hợp giữa sinh học và hóa học Loại vật liệu phức này làmgiảm độc tính cua ion Zn2+ trên thực vật, động vật và con người đã được công bố ở

nhiều công trình nghiên cứu Hiệu lực diệt vi sinh vật của phức chitosan và kim loại

bao gồm hiệu lực cộng hợp của Chitosan và kim loại Chính vì vậy, hiệu ứng diệt trừnam bệnh, vi khuẩn, vi rút gây bệnh trên cây trồng của phức Chitosan-Zn?* được giatăng mạnh mẽ Các muối kim loại thường được sử dụng dé tạo phức với chitosantrong việc phòng trừ bệnh cây trồng Phức Chitosan-Zn là nguyên tổ vi lượng cần

thiết cho sự phát triển của cây trồng, ion Zn?' có hiệu lực diệt nắm va vi khuân mạnh

Theo nghiên cứu của Wang, 2004 phức hợp Chitosan-Zn có khả năng chống lại

11 loài vi khuẩn và nam, phức hợp có kha năng kháng tốt đối với Corynebacteria ởmức nồng độ là 300 ppm

Tại Việt Nam, Đặng Văn Phú va ctv (2019) nghiên cứu hiệu ứng kháng nam

C truncatum trên cây đậu phộng của phức Chitosan/Zn cho thấy nồng độ 787 ppm;

1180 ppm; 1574 ppm đã có hiệu quả kiểm soát nắm bệnh đạt hiệu quả tương đương là

71,5; 91,7; và 100%.

1.4.4 Chitosan/ZnO/I,

Dựa vào các đặc tính kháng nam của phức ZnO-Chitosan, la-Chitosan, Chitosan

có hiệu quả trong việc diệt trừ nam và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng Việc phốihợp các đặc tính kháng bệnh của 3 chat này tạo ra phức Chitosan/ZnO/l ở kích

thước nano sẽ tạo nên hiệu ứng cộng hợp tạo ra kháng sinh và hiệu ứng tiêu diệt trực

tiếp bệnh thực vật sẽ làm giảm được nồng độ hoạt chất sử dụng

10

Nano ZnO-Chitosan, l›-Chitosan, Chitosan là phức mới với ưu thế vật liệu vôcùng an toan khi sử dụng ở nồng độ thấp dưới mức độc hại xử lý nam bệnh thực vật.Với nồng độ của các hợp chất chitosan là 120.000 g/mol nồng độ 5%, Zn 0,5% vànano I> 1000 - 2000 ppm Nồng độ được sử dụng dé kiểm soát các nắm bệnh là 50 —

100 ml/binh 20 lít đối với các bệnh: giả sương mai trên dưa leo, dưa lưới do nam P.

cubensis gây ra, bệnh thối nâu do vi khuân Erwinia carotovora gây ra, bệnh phan

trang do nam E Cichoracearum

11

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và xác định nam Lasiodiplodia sp gây bệnh đốm đen trên

trái xoài tại thành phố Cao lãnh - Đồng Tháp

Nội dung 2: Khảo sát hiệu lực ức chế nam Lasiodiplodia sp của Chitosan và

phức hợp nano Chitosan điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài dự kiến được thực hiện từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Mẫu bệnh dùng dé phân nam lập Lasiodiplodia sp được thu thập từ các vườn

trồng xoài tại thành phố Cao lãnh - Đồng Tháp

Các thí nghiệm khảo sát nồng độ của Chitosan và phức hợp Nano Chitosan được

thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Bảo vệ thực vật, viện khoa học kỹ thuật

nông nghiệp miên Nam.

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Nguồn mẫu phân lập và nghiên cứu

Các trái xoài có triệu chứng đặc trưng của bệnh đóm den Thu từ vườn xoài tạithành phố Cao Lãnh — Đồng Tháp Tiến hành thu mẫu trong điều kiện thời tiết tốt,ngày nắng không mưa

2.3.2 Môi trường nuôi cấy nam

Môi trường PDA: 200 g khoai tây, 20 g Dextrose, 20 g Agar, 1000 ml nước cat

12

2.3.3 Vật liệu Chitosan và một số phức nano chitosan

Chitosan và một số phức nano Chitosan được cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệthực vật — Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam được sản xuất vào ngày

Dụng cụ, thiết bi nghiên cứu

Trang thiết bị: nồi hap môi trường, tủ say, buồng cấy vi sinh, tủ định ôn, cânđiện tử, thước kẻ dai 15 cm, kính lúp, kính hiển vi, bếp điện từ, máy anh và một sốthiết bị khác

Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, dao cay, đèn cồn, bình tam giác, bông khôngthấm, hộp nhựa chuyên dụng để nuôi cấy kiểm chứng tác nhân cồn 70°, cồn 90° và

một số thiết bị cần thiết khác

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập, xác định nắm Lasiodiplodia sp gây bệnh đốm đen trên trái xoài

2.4.1.1 Thu thập mẫu bệnh

Phương pháp thu thập mau bệnh: Cac mau bệnh được thu thập từ các vườn

trồng xoài tại thành phố Cao Lãnh - Đồng Tháp Chọn những trái xoài có độ chín từ100-120 ngày dé dé dang thu được bệnh vi đây là giai đoạn nam phát triển mạnh vàgây hại trên trái xoài quan sát những trái có vết bệnh thâm đen, hóa nâu, màu xámnâu trên trái Dùng kéo cắt các mẫu có biểu hiện triệu chứng điển hình Các mẫu bệnh

sau đó được bọc trong khăn giấy riêng lẻ, cho vào túi zip có hút âm Mẫu bệnh được

13

đánh dau và ghi day đủ (ngày tháng năm, địa điểm lay mau, giống, người lay mẫu).Các mẫu bệnh sau khi thu thập được đưa về phòng thí nghiệm lưu trữ tủ mát 4°C và

mang đi cây mau

2.4.1.2 Phương pháp bảo quản mẫu bệnh

Áp dụng phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật của Roger Shivas và Dean

Beasley (2005): Sử dụng túi giấy đề lấy và giữ mẫu bệnh, gói mẫu cân thận tránh va

đập và hơi nước ngưng tụ, dùng bút ghi chú thông tin mẫu thu được

2.4.1.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu bệnh

Môi trường PDA: Rửa sạch, gọt vỏ, xắt nhỏ 200 g khoai tây cho vào 800 mlnước cat, đun sôi, lọc bỏ bã qua ray mịn Cho 20 g agar + 20 g đường glucozo, đun

tan agar và thêm vào một lượng nước cất vừa đủ 1.000 ml Hap khử trùng ở nhiệt độ

121°C trong 20 phút Môi trường đồ cho mỗi đĩa tương ứng khoảng 20 ml

2.4.1.4 Phương pháp phân lập mẫu bệnh

Quan sát các mẫu trái xoài có triệu chứng cơ bản về hình thái đặc trưng củanắm gây bệnh trên trái được lấy đi phân lập Tiến hành phân lập khoanh vùng vếtbệnh, mẫu bệnh Tủ cấy phải được vệ sinh sạch sẽ, chuẩn bị đĩa môi trường PDA tiễnhành phân lập Nắm được phân lập từ vỏ quả xoài bằng cách dùng dao cắt đọc theovết bệnh Lấy phần vỏ xoài có triệu chứng không lay phần thịt quả, khử trùng bằngcách nhúng qua môi trường nước cất, nhúng qua môi trường cồn 70° dé sát khuẩn sau

đó đề lên bề mặt giấy thấm hút cho khô vùng vỏ quả Sau khi để khô phần vỏ tráiđược cắt với kích thước 2 mm x 2 mm Ở phan ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe.dùng gap úp mặt trong vỏ qua xoài lên mặt thạch, trong đĩa petri đã dé sẵn môi

trường PDA Đặt dia petri đã cấy mẫu ở nhiệt độ 25 — 28°C Kiểm tra đĩa cay hang

ngày, quan sát sinh trưởng và sự phát triển của hệ sợi nam trên đĩa phân lập, chọn lọc

để cấy truyền sang môi trường PDA và làm thuần bằng phương pháp cấy đỉnh sinh

trưởng

14

2.4.1.5 Định danh nắm Lasiodiplodia sp dựa vào đặc điểm hình thái

Lasiodiplodia sp sẽ sinh quả thé trên tan nắm được nuôi cấy trên môi trường

PDA, mang quả thé nam làm tiêu bản rồi quan sát bào tử nắm dưới kính hiển vi với

độ phóng đại 1.000 lần (thị kính 10 x vật kính 100) Mô tả đặc điểm hình thái bào tử

và định danh theo Munirah va ctv (2017) Các chỉ tiêu quan sát bao gồm: mô tả đặcđiểm màu sắc tản nắm, hình dọc, sợi nam, hình thai bao tử, loại bao tử, số vách ngăn,

hình dạng, màu sắc, chiều dài và chiều rộng của bào tử

2.5.1 Lay bệnh nhân tạo nắm Lasiodiplodia sp trên trái xoài bằng quy trình

Koch

2.5.1.1 Phương pháp tiến hành

Những trái xoài sau khi thu hoạch chọn những trái khỏe mạnh đồng nhất về

kích thước màu sắc, không bị nhiễm bệnh, côn trùng tấn công, không bị hư hại Được

bảo quản trong túi zip có bông hút âm Chọn những trái xoài khỏe không có dấu hiệu

bệnh được rửa sạch dưới vòi nước chảy, dùng bông tam cồn 70 độ từ 1 — 2 phút dé

khử trùng sau đó rửa lại qua nước cất, đặt vào hộp nhựa rồi dé khô tự nhiên Các tráixoài được đặc trong hộp nhựa xếp thành 2 hàng đối diện nhau tổng cộng có 3 cặp

Chiếu tia UV diét mam bệnh một lần nữa Gây vét thương lên vỏ trái bằng kim tiêm

sau đó nhỏ 4 wl dung dich bao tử ở cùng 1 diém/trai rồi đậy nắp kín hộp và ủ nhiệt độ

26°C trong tủ định ôn

Các dụng cụ đựng mẫu đều được tiệt trùng, thao tác thí nghiệm được thực hiệntrong tủ cấy vô trùng

2.5.1.1 Phương pháp tái phân lập

Chọn những trái xoài có triệu chứng đặc trưng, vết bệnh còn mới, phần mô

khỏe còn nhiều mang đi phân lập dé xác định lại tác nhân gây bệnh nhân tạo Tiến

Chỉ tiêu theo dõi:

Quan sát toàn bộ sé trái của mỗi hộp dé xác định thời điểm vết bệnh và chỉ sốvết bệnh ở các thời điểm theo dõi Chỉ số bệnh được phân theo thang 9 cấp: theo

QCVN 01 — 177 như sau:

+ Cấp 1: 1-10% diện tích quả bị hại

TP Cấp 3: > 10% - 20% diện tích quả bị hại

+ Cấp 5: > 20% - 30% diện tích quả bị hại

SE Cấp 7: > 30% - 40% diện tích quả bị hại

SẼ Cấp 9: > 40% diện tích quả bị hại

+NI,N2, Nn: Số trái nhiễm bệnh ở mỗi cấp 1,2, n

+N: Tổng số trái điều tra

+n: Cấp bệnh cao nhất

2.5.2 Khảo sát hiệu quả ức chế nam Lasiodiplodia sp của Chitosan và một số

phức hợp nano Chitosan trên đĩa petri trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.5.2.1 Mục tiêu

Tìm ra nông độ Chitosan và một sô phức nano Chitosan có hiệu lực cao nhât.

16

Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm)

NTI Đối chứng (nước)

NI2 Chitosan 500

NT3 Chitosan 1000

NT4 Chitosan 1500

NIS Chitosan 2000

2.5.2.4 Khảo sát hiệu qua ức chế nấm Lasiodiplodia sp Của phức hop nano

Chitosan ở các mức nông độ khác nhau.

a Chitosan/l;

Bảng 2 3 Các mức nồng độ phức hợp chitosan/In đối với nắm Lasiodiplodia sp

Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm)

NTI Đối chứng (nước)

NT2 Chitosan/Iz 500

NT3 Chitosan/Iz 1000

NT4 Chitosan/Iz 1500 NT5 Chitosan/Iz 2000

17

b Chitosan/Zn

Bảng 2 4 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/Zn đối với nắm Lasiodiplodia sp

Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm)

NTI Đối chứng (nước)

Bảng 2 5 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/ZnO/l› đối với nam Lasiodiplodia sp

Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm)

NTI Đối chứng (nước)

NT2 Chitosan/ZnO/I2 750

NT3 Chitosan/ZnO/I2 1500

NT4 Chitosan/ZnO/I2 2250 NT5 Chitosan/ZnO/I2 3000

2.5.2.2 Phuong phap tién hanh:

Chuan bị môi trường PDA theo tỷ lệ đã tính toán (ap dung theo công thứcClxV1=C2xV2), môi trường mang đi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút,

dé đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 45°C — 50°C rồi pha với thuốc theo nồng độtính toán, lắc đều môi trường rồi đồ ra đĩa petri (ghi ký hiệu loại thuốc, nghiệm thức

và lần lặp lại ở nắp đậy đĩa petri) Chờ môi trường 6n định rồi cay nam Lasiodiplodia

Sp (nguồn nam Lasiodiplodia sp được kế thừa từ việc định danh nam ở mục 2.4.1)lên môi trường thuôc.

2.5.2.3 Chỉ tiêu theo dõi

Đường kính tan nam: Quan sát và đo đường kính tan nam ở 12, 24, 36 giờ sau

cấy cho đến khi tản nắm mọc chạm thành đĩa ở đĩa đối chứng thì ngừng quan sát.Cách đo kích thước tan nam lấy bút lông kẻ 2 đường vuông góc mặt sau của đĩa petri

18

Dùng thước kẻ có độ dài 15 cm để đo hai đường chéo vuông góc và lay giá trị trungbình (đường kính tản nắm tính bằng đơn vị mm).

Đường kính trung bình tản nắm được tính theo công thức:

d = (đ1 + d2)/2

Trong đó:

d: là kích thước tản nắm

d1, d2: là 2 đường kính vuông góc của tan nam

Hiệu lực ức chế được tính theo công thức:

Hiệu lực ức chế (%) = [(D - d)/D] x 100

Trong đó:

HL: là hiệu lực ức chế nam

D: là đường kính tản nắm trên môi trường không xử lý thuốc

d: là đường kính tan nam trên môi trường có xử lý thuốc

2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Office Excel và xử lýthống kê bằng phần mềm SAS 9.1

19

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN3.1 Phân lập, xác định nắm Lasiodiplodia sp gây đốm den trái xoài

Mẫu bệnh đốm đen trên trái xoài được thu thập tại thành phố Cao Lãnh - Đồng

Tháp có triệu chứng như vết bệnh trên vỏ có đốm nhỏ hoặc lớn tùy vào tình trạng

bệnh mới hay lâu, trên vết đốm có các sợi khuẩn ty trắng, vết bệnh có màu nâu đenđến đen xuất hiện từ cuốn trái lên thịt trái ở đầu trái, phần thịt trái bên trong trở nên

mém.

Kết quả phân lập và làm thuần cho thay: Soi nam có màu trắng đục, mọc nỗi lên

trên môi trường thạch, sợi nắm mọc nhanh và phân nhánh, chạm thành đĩa (đĩa 90

mm) sau 36 giờ nuôi cấy; ban đầu tản nắm có màu trắng đục sau 5 ngày nuôi cấy tản

nam dan chuyén sang mau xám, trên bé mat phủ 1 lớp một lớp sợi mịn, mặt sau tannam có màu đen, không có vòng đồng tâm (Hình 3.2 B)

Sau 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng nam bắt đầu hình thành các quả thé,quả thể ban đầu là các cụm sợi nắm màu trắng nhỏ xuất hiện trên mặt thạch và sau đó

các quả thé dần lớn lên chuyên sang mau đen (Hình 3.2 C) Tiến hành lấy quả thé làmtiêu bản soi dưới kính hién vi với độ phóng đại 1.000 cho được kết qua bào tử khi ở

20

giai đoạn còn non có hình oval, đỉnh hơi tròn, vách dày, trong suôt (Hình 3.3 D), khi

trưởng thành xuất hiện 1 vết ngăn ở giữa, màu nâu sam, có các vân sọc trải dài và đối

xứng (Hình 3.3 C); bào tử có kích thước trung bình từ 23,83+ 0,88 x 14,83+ 0,68 um.

Hình 3.2 Tan nam Lasiodiplodia sp trên môi trường PDA

Ghi chu: (A) tan nắm sau 2 ngày nuôi cấy; (B) tản nam sau 5 ngày nuôi cấy; (C) tan nấm sau 10

ngày nuôi cây

3.1.1 Xác định nam Lasiodiplodia sp theo đặc điểm hình thái

Từ kết quả của phân lập đã được ghi nhận và mô tả trên cho thay, nam phân lập

được có những đặc điểm hình thái đặc trưng của chi nấm Lasiodiplodia, tương đồngvới mô tả của Munirah và ctv (2017) đưa ra kết luận nam gây bệnh dém den trái xoài

đã phân lập được là nắm Lasiodiplodia sp

3.1.2 Kiểm chứng kết qua định danh nắm Lasiodiplodia sp theo quy trình Koch

Kết quả lây nhiễm nam Lasiodiplodia sp lên trái từ nguồn nam Lasiodiplodia

sp phân lập ở mục 3.1.1 và kết quả tái phân lập ghi nhận được triệu chứng của vếtbệnh (Hình 3.1), sự phát triển, hình dạng, màu sắc của tản nam và hình thái bào tửtương đồng với kết quả phân lập nguồn bệnh gây bệnh đốm trái xoài là nam

Lasiodiplodia sp ở mục 3.1.1

Kết qua cho thấy 24 gid sau nhiễm bao tử nam Lasiodiplodia sp lên trái xoài

đã xuất hiện vết bệnh cấp độ 1, cấp độ 3 xuất hiện sau 48 giờ nhiễm, cấp độ 5 và cap

độ 7 xuất hiện sau 72 giờ nhiễm, cấp độ 9 xuất hiện sau giờ nhiễm 96 giờ (Hình 3.6)

Tý lệ bệnh tăng theo ngày theo dõi và cao nhất vào ngày 2, ngày 3 đạt 100% (Hình

3.5)

Theo báo cáo của Munirah và ctv (2017), khi lây nhiễm nắm Lasiodiplodia sp

vào ngày thứ 4 hơn 76% diện tích bề mặt bị hóa đen và hư tồn, xuất hiện các sợi nắm

mau xám nhạt và các giọt nước liti trên mặt vỏ trái.

22

Ty lệ bệnh

120

100 100

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Hình 3 5 Tỷ lệ bệnh đốm đen trái xoài khi lây nhiễm nam Lasiodiplodia sp qua các

thời điểm theo dõi (%)Chỉ số bệnh

ó0 88.89

90 ` 80

70 60 50 40

30

20 10 0

66.67

40.07

N

7.4

Ngay 1 Ngay 2 Ngay 3 Ngay 4

Hình 3 6 Chỉ số bệnh đốm den trái xoài khi lây nhiễm nam Lasiodiplodia sp qua các

thời điểm theo dõi (%)

23