Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng s XT và h CP16 trên sâu xanh da láng spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H – CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA TUYẾN TRÙNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực : LÊ QUỐC VŨ MSSV: 1151110545 Lớp: 11DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối Trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hồn tất chương trình học Tơi cam đoan nghiên cứu tơi tiến hành phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh Những số liệu, hình ảnh hồn tồn trung thực chưa có cơng bố Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 Sinh viên thực Lê Quốc Vũ LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng xin ghi khắc cơng lao cha mẹ gian khó ni dạy thành người Cha mẹ chỗ dựa vững nhất, người nâng dậy sau lần vấp ngã, động lực để tiếp tục phấn đấu sống Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình truyền đạt cho em kiến thức quý giá từ ngày bước vào giảng đường đại học Đặc biệt, xin chân thành biết ơn Nguyễn Hồi Hương, người thầy đáng kính, ln dạy để hồn thành đồ án Và lời khuyên, học sống cô dạy bảo, hành trang quý báu cho sau Con xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai tận tình hướng dẫn phương pháp ni sâu, tuyến trùng người cho nguồn nấm bệnh thí nghiệm Con chân thành Đỗ Thị Tuyến cho vi khuẩn thị hố chất để hồn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phịng thí nghiệm Cảm ơn tất bạn lớp 11DSH ln khích lệ giúp đỡ suốt trình học tập trường Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đồng hành, sát cánh ngày làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 SVTH: Lê Quốc Vũ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 1.1.1 Khái niệm EPN 1.1.2 Vai trò ƣu EPN .4 1.2 Khái quát tuyến trùng ký sinh côn trùng 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Chu trình sống tuyến trùng Steinernema Heterorhabditis 1.3 Khái quát vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus Xenorhabdus .7 1.3.1 Một số đặc điểm họ Enterobacteriaceae .8 1.3.2 Phân loại Photorhabdus Xenorhabdus 1.3.3 Một số đặc điểm phân biệt 11 1.4 Tổng quan Serratia marcescens 16 1.4.1 Lịch sử phát Serratia marcescens 16 1.4.2 Phân loại Serratia marcescens 17 1.4.3 Đặc điểm Serratia marcescens 17 1.4.3.1 Đặc điểm sinh lý 17 1.4.3.2 Đặc điểm sinh hóa 18 1.4.3.3 Đặc điểm phân bố .20 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp Serratia marcescens 20 1.4.4.1 Sắc tố 20 1.4.4.2 Biosurfactants .21 1.4.4.3 Acid béo .22 1.4.4.4 Enzyme 22 1.4.5 Yếu tố độc lực Serratia marcescens 22 1.5 Mối quan hệ cộng sinh .23 1.5.1 Vai trò tuyến trùng 23 1.5.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh 24 1.5.3 Tổng quát mối quan hệ tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 24 1.5.4 Mối quan hệ cộng sinh tuyến trùng EPN Serratia sp 28 1.6 Khái qt lồi trùng bị EPN vi khuẩn tiêu diệt 29 1.6.1 Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt 29 1.6.2 Các lồi trùng bị EPN tiêu diệt .29 1.7 Khái quát SXDL Spodoptera exigua 30 1.7.1 Đặc điểm hình thái 30 1.7.2 Đặc điểm sinh học sinh thái .30 1.6.2.1 Vòng đời (30 – 40 ngày) 30 1.7.2.2 Thiên địch .31 1.7.3 Một số biện pháp phòng trừ 32 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.1.1 Thời gian 33 2.1.2 Địa điểm 33 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2 Vật liệu – thiết bị - hoá chất .33 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 33 2.2.2 Môi trƣờng ni cấy hóa chất sử dụng .33 2.3 Bố trí thí nghiệm 36 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm .38 2.4.1 Phƣơng pháp ni sâu phịng thí nghiệm 38 2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo 38 2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 38 2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927) 39 2.4.2.3 Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) 39 2.4.2.4 Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 40 2.4.2.5 Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) 40 2.4.2.6 Phƣơng pháp xác định hoạt động tuyến trùng (Albrecht M Koppenhofer, 2007) 41 2.4.2.7 Thí nghiệm xác định LD50 cho chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL tuổi 41 2.4.2.8 Thí nghiệm khảo sát tƣơng quan số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ chu kì kí sinh – phát tán chủng tuyến trùng vật chủ SXDL .43 2.4.2.9 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu hai chủng tuyến trùng S – XT, H – CP16 phƣơng pháp tiêm bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết 44 2.4.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn .46 2.4.3.1 Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp Akhurst (1980) Sun Ho Park Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) 46 2.4.3.2 Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp Lawrwnce A Lacey (2011) .48 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.3 Phƣơng pháp chứng minh nội sinh 48 2.4.3.4 Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh 49 2.4.4 Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập .49 2.4.4.1 Phƣơng pháp kiểm tra độ khiết 49 2.4.4.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý 50 2.4.4.3 Thử nghiệm sinh hoá 50 2.4.4.4 Phƣơng pháp định danh APIKIT 20E 50 2.4.4.5 Giải trình tự 16S rRNA 50 2.4.5 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học 50 2.4.5.1 Phƣơng pháp định tính enzyme 50 2.4.5.2 Phƣơng pháp khảo sát khả kháng kháng sinh .51 2.4.5.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo 51 2.4.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng nấm 53 2.4.5.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu phƣơng pháp tiêm .53 2.4.5.6 Khảo sát tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn tuyến trùng EPN 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 56 3.1 Kết đánh giá LD50 hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 56 3.1.1 Chủng S – XT 57 3.1.2 Chủng H – CP16 .58 3.2 Khả sinh sản tuyến trùng S – XT H – CP16 SXDL .60 3.2.1 Khả nhân chủng tuyến trùng SXDL tuổi 62 3.2.1.1 Chủng S – XT .62 3.2.1.2 Chủng H – CP16 63 3.2.2 Mối tƣơng quan số lƣợng IJ gây nhiễm sản lƣợng IJ sinh .63 iv Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.1 Chủng S – XT .64 3.2.2.2 Chủng H – CP16 66 3.2.3 Chu kỳ kí sinh phát tán hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL .68 3.2.3.1 Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL 68 3.2.3.2 Chu kỳ phát tán hai chủng tuyến trùng EPN S – XT H – CP16 SXDL 69 3.3 Xác định tác nhân gây chết sâu 72 3.4 Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng 75 3.5 Kết định lƣợng tổng số vi khuẩn tuyến trùng (cfu/IJ) .79 3.6 Quan sát hình thái, sinh lý 80 3.7 Thử nghiệm sinh hóa 83 3.8 Kết định danh KIT API 20E (Biomerieux) .85 3.9 Kết giải trình tự rRNA 16S 86 3.10 Khả tiết enzymme ngoại bào 88 3.11 Khả kháng kháng sinh .91 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn .94 3.14.1 Đối kháng không tiếp xúc .95 3.14.2 Đối kháng tiếp xúc 96 3.13 Hoạt tính kháng nấm 98 3.14 Hiệu lực diêt sâu .101 3.17 Khảo sát tƣơng tác tuyến trùng vi khuẩn 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 v Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO .109 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PTSH : P òng trừ sinh học IJ EPN : Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles) : tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: entomopathogenic nematodes) S-XT : Steinernema guangdongense XT H-CP16: Heterorhabditis indica CP16 VKCS : Vi khuẩn cộng sinh BSL : Bƣớm sáp lớn SB : Serratia marcescens SB HB : Serratia marcescens HB VSV : Vi sinh vật SXDL : Sâu xanh da láng vii Đồ án tốt nghiệp Hình 15 Thử nghiệm khả di động Từ trái sang phải: E coli + ; SB + ; HB + Hình 16 Kết Apikit 20E chủng SB Hình 17 Kết Apikit 20E chủng HB 21 Đồ án tốt nghiệp Hình Khả kháng khuẩn Serratia marcescens SH1 theo phương pháp đục lỗ thạch A Đối với Bacillus subtilis B Đối với Staphylococcus aureus C Đối với Escherichia coli D Đối với Salmonella Hình 19 Khả kháng khuẩn Serratia marcescens SS1 theo phương pháp đục lỗ thạch A Đối với Bacillus subtilis B Đối với Staphylococcus aureus C Đối với Escherichia coli D Đối với Salmonella 22 Đồ án tốt nghiệp Hình Khả kháng khuẩn Serratia marcescens SH1 theo phương pháp cấy chéo A Đối với Bacillus subtilis B Đối với Staphylococcus aureus C Đối với Escherichia coli D Đối với Salmonella Hình Khả kháng khuẩn Serratia marcescens SS1 theo phương pháp cấy chéo A Đối với Bacillus subtilis B Đối với Staphylococcus aureus C Đối với Escherichia coli D Đối với Salmonella 23 Đồ án tốt nghiệp Hình 22 Đối chứng dương kháng khuẩn Hình 23 Sâu xanh tuổi 4, tuổi 24 Đồ án tốt nghiệp Hình 24 Sâu xanh tuổi 2, tuổi Hình 25 Ổ trứng sâu xanh sâu nở (tuổi 1) 25 Đồ án tốt nghiệp Hình 26 Nhộng sâu xanh sâu ngày tuổi (tuổi 1) Hình 27 Bướm sâu xanh Từ trái sang : Bướm đực, Bướm 26 Đồ án tốt nghiệp Hình 28 Từ trái sang : Tuyến trùng S – XT, H – CP16 Hình 29 Bố trí thí nghiệm tương tác Tuyến trùng – Vi khuẩn Từ trái sang: Nghiệm thức, Đối chứng 27 Đồ án tốt nghiệp Hình 30 Kết định danh APIKIT hai chủng SB, HB Hình 31 Đối chứng tiêm E coli hóa nhộng 100% 28 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Summary Statistics for San Luong S – XT by Nong Do Nong Do Count Average Standard deviation 12053.0 66.9104 10 30420.0 348.281 15 45993.7 98.6374 20 45593.7 342.534 25 44646.7 307.3 30 38300.0 2832.26 35 25277.0 223.336 40 9658.0 135.709 Total 24 31492.8 14120.1 Minimum Maximum Range 12009.0 30030.0 45907.0 45307.0 44320.0 35030.0 25039.0 9549.0 9549.0 12130.0 30700.0 46101.0 45973.0 44930.0 39980.0 25482.0 9810.0 46101.0 Multiple Range Tests for San Luong S – XT by Nong Do Method: 95.0 percent LSD Nong Do Count Mean Homogeneous Groups 40 9658.0 X 12053.0 X 35 25277.0 X 10 30420.0 X 30 38300.0 X 25 44646.7 X 20 45593.7 X 15 45993.7 X ANOVA Table for San Luong S – XT by Nong Do Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4.56877E9 6.52681E8 618.86 Within groups 1.68745E7 16 1.05466E6 Total (Corr.) 4.58564E9 23 29 121.0 670.0 194.0 666.0 610.0 4950.0 443.0 261.0 36552.0 Đồ án tốt nghiệp Summary Statistics for San Luong H – CP16 by Nong Do Col_1 10 15 20 25 30 35 40 Total Count 3 3 3 3 24 Average 22119.7 56497.7 86007.0 85613.7 84650.7 70624.0 50301.3 18662.3 59309.5 Standard deviation 10.504 248.591 99.5791 335.722 307.692 518.825 194.415 134.931 26291.7 Minimum 22109.0 56231.0 85937.0 85327.0 84324.0 70029.0 50100.0 18550.0 18550.0 Maximum 22130.0 56723.0 86121.0 85983.0 84935.0 70982.0 50488.0 18812.0 86121.0 Range 21.0 492.0 184.0 656.0 611.0 953.0 388.0 262.0 67571.0 Multiple Range Tests for San Luong H – CP16 by Nong Do Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups 40 18662.3 X 22119.7 X 35 50301.3 X 10 56497.7 X 30 70624.0 X 25 84650.7 X 20 85613.7 X 15 86007.0 X ANOVA Table for San Luong H – CP16 by Nong Do Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.58976E10 2.27108E9 30061.13 Within groups 1.20878E6 16 75548.8 Total (Corr.) 1.58988E10 23 30 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC SỐ LIỆU THÔ VÀ BIỂU ĐỒ Bảng Hiệu lực gây chết sâu xanh tuổi chủng S – XT Số lượng IJs/sâu Số lượng thí nghiệm (đối chứng) Tỷ lệ sâu chết (%) Số sâu chết Sau ngày phơi nhiễm 20 0 20 12 60 10 20 13 65 15 20 15 75 20 20 17 85 25 20 18 90 30 20 19 95 35 20 19 95 40 20 20 100 45 20 20 100 50 20 20 100 LD50= 4,84 ± 0,01 IJ Bảng Hiệu lực gây chết sâu xanh tuổi chủng H – CP16 Tỷ lệ sâu chết (%) Số lượng IJs/sâu Số lượng thí nghiệm Số sâu chết (đối chứng) 20 0 20 11 55 10 20 14 70 15 20 15 75 20 20 17 85 25 20 18 90 30 20 18 90 31 Sau ngày phơi nhiễm Đồ án tốt nghiệp 35 20 19 95 40 20 20 100 45 20 20 100 50 20 20 100 LD50= 4,81 ± 0,01 IJ Bảng Sản lượng tuyến trùng chủng S – XT Nồng độ gây nhiễm (IJs/sâu) 10 15 20 25 30 35 40 Chủng S - XT, Sản lượng IJs/sâu Lần 12020 30030 46101 45501 44690 35030 25482 9549 Lần 12130 30700 45907 45307 44930 39980 25039 9810 Lần 12009 30530 45973 45973 44320 39890 25310 9615 Bảng Sản lượng tuyến trùng chủng H – CP16 Nồng độ gây nhiễm (IJs/sâu) 10 15 20 25 30 35 40 Chủng H - CP16, Sản lượng IJS/sâu Lần Lần Lần 22120 22130 22109 56231 56723 56539 86121 85937 85963 85531 85327 85983 86693 85935 84324 71029 72982 73861 50488 50100 50316 18550 18812 18625 32 Đồ án tốt nghiệp Bảng Tổng số vi khuẩn tuyến trùng (cfu/IJ) Chủng vi cfu/IJs Mẫu Mẫu Mẫu SB 119 110 114 114,33 ± 3,11 HB 97 99 98 98 ± 0,67 khuẩn Trung bình Bảng Đường kính vòng nấm Colletotrichum sp Colletotrichum gloeosporioides Fusarium sp Neoscytalidium sp Rhizoctonia sp Đường kính vịng nấm (cm) SB HB Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 3,5 3,7 1,4 3,3 3,2 Đối chứng 7,5 3,3 3,3 3,8 4,3 3,2 4,2 2,4 3,9 2,3 3,1 3,8 2,4 4,2 3,3 4,4 2,4 4,5 2,1 6,3 6,2 Bảng Số lượng tuyến trùng chết thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn Số tuyến trùng chết/ đĩa (S - XT/ SB) Đĩa Đĩa Đĩa Sau ngày 0 Sau ngày 0 Sau ngày 2 Sau 12 ngày 4 Thời gian Bảng Số lượng tuyến trùng chết thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn Số tuyến trùng chết/ đĩa (H - CP16/ HB) Đĩa Đĩa Đĩa Sau ngày 0 Sau ngày 0 Sau ngày 3 Sau 12 ngày 5 Thời gian 33 Đồ án tốt nghiệp Bảng Số lượng tuyến trùng chết thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn Số tuyến trùng chết/ đĩa (Đối chứng S - XT) Đĩa Đĩa Đĩa Sau ngày 0 Sau ngày 3 Sau ngày 10 13 Sau 12 ngày 14 15 18 Thời gian Bảng 10 Số lượng tuyến trùng chết thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn Số tuyến trùng chết/ đĩa (Đối chứng H - CP16) Đĩa Đĩa Đĩa Sau ngày 0 Sau ngày Sau ngày 12 15 13 Sau 12 ngày 20 20 18 Probit Thời gian -4 -3 -2 00,010 00,009 00,008 00,007 00,006 00,005 00,004 00,003 00,002 00,001 00,000 -1 Probit hộp Probit hộp Probit hộp y = 1.0904x + 7.7876 R² = 0.857 y = 1.1139x + 7.8145 R² = 0.8809 y = 1.141x + 7.7871 R² = 0.8804 Log (cfu/sâu) Hình Biểu diễn khả diệt sâu SB sau 48 tiêm vào sâu xanh 34 Đồ án tốt nghiệp Probit -4 Probit hộp Probit hộp Probit hộp 10 -3 -2 -1 y = 1.1953x + 7.8429 R² = 0.8687 y = 1.2206x + 7.7657 R² = 0.8404 y = 1.2206x + 7.8199 R² = 0.8688 Log (cfu/sâu) Hình Biểu diễn khả diệt sâu HB sau 48 tiêm vào sâu xanh 35 ... Blast NCBI Di động H? ?nh 2.2 Quy trình khảo s? ?t đặc điểm sinh lý, sinh h? ?a định danh vi khuẩn Chủng vi khuẩn Tăng sinh 24 khử trùng – phân lập Khảo s? ?t hoạt tính sinh h? ??c khử trùng – phân lập Khả. .. tranh sinh h? ??c bảo vệ thực vật Nhiệm vụ nghiên cứu Đánh giá hiệu lực diệt s? ?u khả sinh s? ??n hai chủng tuyến trùng S – XT H – CP16 đối tƣợng SXDL Phân lập chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh côn trùng. .. tài Xác định đƣợc s? ?? LD50 khả sinh s? ??n hai chủng tuyến trùng đối tƣợng SXDL Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt tuyến trùng S – XT H – CP16 Kết định danh cho thấy chủng SB, HB thuộc