2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và xác định nam Lasiodiplodia sp. gây bệnh đốm đen trên trái xoài tại thành phố Cao lãnh - Đồng Tháp
Nội dung 2: Khảo sát hiệu lực ức chế nam Lasiodiplodia sp. của Chitosan và phức hợp nano Chitosan điều kiện phòng thí nghiệm
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài dự kiến được thực hiện từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Mẫu bệnh dùng dé phân nam lập Lasiodiplodia sp. được thu thập từ các vườn trồng xoài tại thành phố Cao lãnh - Đồng Tháp
Các thí nghiệm khảo sát nồng độ của Chitosan và phức hợp Nano Chitosan được
thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Bảo vệ thực vật, viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp miên Nam.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Nguồn mẫu phân lập và nghiên cứu
Các trái xoài có triệu chứng đặc trưng của bệnh đóm den. Thu từ vườn xoài tại thành phố Cao Lãnh — Đồng Tháp. Tiến hành thu mẫu trong điều kiện thời tiết tốt, ngày nắng không mưa
2.3.2 Môi trường nuôi cấy nam
Môi trường PDA: 200 g khoai tây, 20 g Dextrose, 20 g Agar, 1000 ml nước cat.
12
2.3.3 Vật liệu Chitosan và một số phức nano chitosan
Chitosan và một số phức nano Chitosan được cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệ thực vật — Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam được sản xuất vào ngày
27/12/2021
Bảng 2. 1 Tính chất và đặc điểm các hoạt chất sử dụng trong thí nghiệm
Hoạt chất Nồng độ (ppm) Dạng
Chitosan 50000 Long
Chitosan/Iz 91750 Long
Chitosan/Zn 66500 Long
Chitosan/ZnO/Iz 98250 Long
Dụng cụ, thiết bi nghiên cứu
Trang thiết bị: nồi hap môi trường, tủ say, buồng cấy vi sinh, tủ định ôn, cân điện tử, thước kẻ dai 15 cm, kính lúp, kính hiển vi, bếp điện từ, máy anh và một số thiết bị khác.
Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, dao cay, đèn cồn, bình tam giác, bông không thấm, hộp nhựa chuyên dụng để nuôi cấy kiểm chứng tác nhân cồn 70°, cồn 90° và một số thiết bị cần thiết khác.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập, xác định nắm Lasiodiplodia sp. gây bệnh đốm đen trên trái xoài 2.4.1.1 Thu thập mẫu bệnh
Phương pháp thu thập mau bệnh: Cac mau bệnh được thu thập từ các vườn
trồng xoài tại thành phố Cao Lãnh - Đồng Tháp. Chọn những trái xoài có độ chín từ 100-120 ngày dé dé dang thu được bệnh vi đây là giai đoạn nam phát triển mạnh và gây hại trên trái xoài quan sát những trái có vết bệnh thâm đen, hóa nâu, màu xám nâu trên trái. Dùng kéo cắt các mẫu có biểu hiện triệu chứng điển hình. Các mẫu bệnh sau đó được bọc trong khăn giấy riêng lẻ, cho vào túi zip có hút âm. Mẫu bệnh được
13
đánh dau và ghi day đủ (ngày tháng năm, địa điểm lay mau, giống, người lay mẫu).
Các mẫu bệnh sau khi thu thập được đưa về phòng thí nghiệm lưu trữ tủ mát 4°C và
mang đi cây mau
2.4.1.2 Phương pháp bảo quản mẫu bệnh
Áp dụng phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật của Roger Shivas và Dean Beasley (2005): Sử dụng túi giấy đề lấy và giữ mẫu bệnh, gói mẫu cân thận tránh va
đập và hơi nước ngưng tụ, dùng bút ghi chú thông tin mẫu thu được.
2.4.1.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu bệnh
Môi trường PDA: Rửa sạch, gọt vỏ, xắt nhỏ 200 g khoai tây cho vào 800 ml nước cat, đun sôi, lọc bỏ bã qua ray mịn. Cho 20 g agar + 20 g đường glucozo, đun tan agar và thêm vào một lượng nước cất vừa đủ 1.000 ml. Hap khử trùng ở nhiệt độ
121°C trong 20 phút. Môi trường đồ cho mỗi đĩa tương ứng khoảng 20 ml.
2.4.1.4 Phương pháp phân lập mẫu bệnh
Quan sát các mẫu trái xoài có triệu chứng cơ bản về hình thái đặc trưng của nắm gây bệnh trên trái được lấy đi phân lập. Tiến hành phân lập khoanh vùng vết bệnh, mẫu bệnh. Tủ cấy phải được vệ sinh sạch sẽ, chuẩn bị đĩa môi trường PDA tiễn hành phân lập. Nắm được phân lập từ vỏ quả xoài bằng cách dùng dao cắt đọc theo vết bệnh. Lấy phần vỏ xoài có triệu chứng không lay phần thịt quả, khử trùng bằng cách nhúng qua môi trường nước cất, nhúng qua môi trường cồn 70° dé sát khuẩn sau đó đề lên bề mặt giấy thấm hút cho khô vùng vỏ quả. Sau khi để khô phần vỏ trái được cắt với kích thước 2 mm x 2 mm. Ở phan ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe.
dùng gap úp mặt trong vỏ qua xoài lên mặt thạch, trong đĩa petri đã dé sẵn môi trường PDA. Đặt dia petri đã cấy mẫu ở nhiệt độ 25 — 28°C. Kiểm tra đĩa cay hang ngày, quan sát sinh trưởng và sự phát triển của hệ sợi nam trên đĩa phân lập, chọn lọc để cấy truyền sang môi trường PDA và làm thuần bằng phương pháp cấy đỉnh sinh
trưởng
14
2.4.1.5 Định danh nắm Lasiodiplodia sp. dựa vào đặc điểm hình thái
Lasiodiplodia sp. sẽ sinh quả thé trên tan nắm được nuôi cấy trên môi trường PDA, mang quả thé nam làm tiêu bản rồi quan sát bào tử nắm dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần (thị kính 10 x vật kính 100). Mô tả đặc điểm hình thái bào tử và định danh theo Munirah va ctv (2017). Các chỉ tiêu quan sát bao gồm: mô tả đặc điểm màu sắc tản nắm, hình dọc, sợi nam, hình thai bao tử, loại bao tử, số vách ngăn, hình dạng, màu sắc, chiều dài và chiều rộng của bào tử
2.5.1 Lay bệnh nhân tạo nắm Lasiodiplodia sp. trên trái xoài bằng quy trình
Koch
2.5.1.1 Phương pháp tiến hành
Những trái xoài sau khi thu hoạch chọn những trái khỏe mạnh đồng nhất về kích thước màu sắc, không bị nhiễm bệnh, côn trùng tấn công, không bị hư hại. Được bảo quản trong túi zip có bông hút âm. Chọn những trái xoài khỏe không có dấu hiệu bệnh được rửa sạch dưới vòi nước chảy, dùng bông tam cồn 70 độ từ 1 — 2 phút dé khử trùng sau đó rửa lại qua nước cất, đặt vào hộp nhựa rồi dé khô tự nhiên. Các trái xoài được đặc trong hộp nhựa xếp thành 2 hàng đối diện nhau tổng cộng có 3 cặp.
Chiếu tia UV diét mam bệnh một lần nữa. Gây vét thương lên vỏ trái bằng kim tiêm sau đó nhỏ 4 wl dung dich bao tử ở cùng 1 diém/trai rồi đậy nắp kín hộp và ủ nhiệt độ
26°C trong tủ định ôn
Các dụng cụ đựng mẫu đều được tiệt trùng, thao tác thí nghiệm được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
2.5.1.1 Phương pháp tái phân lập
Chọn những trái xoài có triệu chứng đặc trưng, vết bệnh còn mới, phần mô khỏe còn nhiều mang đi phân lập dé xác định lại tác nhân gây bệnh nhân tạo. Tiến
hành phân lập tương tự mục 2.4.1.4
2.5.1.2 Kiểm chứng tác nhân
Theo dõi toàn bộ các trái xoải trong hộp ở mỗi thời điểm 1, 2, 3, 4 ngày sau nhiễm, theo dõi thời điểm xuất hiện vết bệnh
15
Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát toàn bộ sé trái của mỗi hộp dé xác định thời điểm vết bệnh và chỉ số vết bệnh ở các thời điểm theo dõi. Chỉ số bệnh được phân theo thang 9 cấp: theo
QCVN 01 — 177 như sau:
+ Cấp 1: 1-10% diện tích quả bị hại
TP Cấp 3: > 10% - 20% diện tích quả bị hại + Cấp 5: > 20% - 30% diện tích quả bị hại SE Cấp 7: > 30% - 40% diện tích quả bị hại SẼ Cấp 9: > 40% diện tích quả bị hại
Chỉ tiêu đánh giá:
+ Thời gian vết bệnh xuất hiện sau nhiễm.
+ Tỷ lệ bệnh (TLB):
TLB (%) = (Số trái bệnh/ tổng số trái theo doi) x 100 + Chi số bệnh (CSB):
CSB (%) = [((N1 x 1) + (N2 x 2) +...+ (Nn x n))/N x n] x 100.
Ghi chú:
+NI,N2,... Nn: Số trái nhiễm bệnh ở mỗi cấp 1,2,...n +N: Tổng số trái điều tra
+n: Cấp bệnh cao nhất
2.5.2 Khảo sát hiệu quả ức chế nam Lasiodiplodia sp. của Chitosan và một số phức hợp nano Chitosan trên đĩa petri trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2.5.2.1 Mục tiêu
Tìm ra nông độ Chitosan và một sô phức nano Chitosan có hiệu lực cao nhât.
16
2.5.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố bí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 5 nghiệm thức tương ứng với 4 mức nồng độ và 1 nghiệm thức đối chứng, 5 lần lặp lại, 2 đĩa petri/NT/LLL (4 mức nồng độ).
2.5.2.3 Khảo sát hiệu quả ức chế nam Lasiodiplodia sp. Của Chitosan ở các mức nồng độ khác nhau.
Bảng 2. 2 Các mức nồng độ Chitosan sử dụng trong thí nghiệm đối với nam
Lasiodiplodia sp.
Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm) NTI Đối chứng (nước)
NI2 Chitosan 500 NT3 Chitosan 1000 NT4 Chitosan 1500 NIS Chitosan 2000
2.5.2.4 Khảo sát hiệu qua ức chế nấm Lasiodiplodia sp. Của phức hop nano
Chitosan ở các mức nông độ khác nhau.
a. Chitosan/l;
Bảng 2. 3 Các mức nồng độ phức hợp chitosan/In đối với nắm Lasiodiplodia sp.
Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm) NTI Đối chứng (nước)
NT2 Chitosan/Iz 500 NT3 Chitosan/Iz 1000 NT4 Chitosan/Iz 1500 NT5 Chitosan/Iz 2000
17
b. Chitosan/Zn
Bảng 2. 4 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/Zn đối với nắm Lasiodiplodia sp.
Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm) NTI Đối chứng (nước)
NT2 Chitosan/Zn 500 NT3 Chitosan/Zn 1000 NT4 Chitosan/Zn 1500 NIS Chitosan/Zn 2000
c. Chitosan/ZnO/1;
Bảng 2. 5 Các mức nồng độ phức hợp Chitosan/ZnO/l› đối với nam Lasiodiplodia sp.
Nghiệm thức Hoạt chất Nông độ (ppm) NTI Đối chứng (nước)
NT2 Chitosan/ZnO/I2 750 NT3 Chitosan/ZnO/I2 1500 NT4 Chitosan/ZnO/I2 2250 NT5 Chitosan/ZnO/I2 3000
2.5.2.2 Phuong phap tién hanh:
Chuan bị môi trường PDA theo tỷ lệ đã tính toán (ap dung theo công thức ClxV1=C2xV2), môi trường mang đi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút, dé đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 45°C — 50°C rồi pha với thuốc theo nồng độ tính toán, lắc đều môi trường rồi đồ ra đĩa petri (ghi ký hiệu loại thuốc, nghiệm thức và lần lặp lại ở nắp đậy đĩa petri). Chờ môi trường 6n định rồi cay nam Lasiodiplodia Sp. (nguồn nam Lasiodiplodia sp. được kế thừa từ việc định danh nam ở mục 2.4.1)
lên môi trường thuôc.
2.5.2.3 Chỉ tiêu theo dõi
Đường kính tan nam: Quan sát và đo đường kính tan nam ở 12, 24, 36 giờ sau cấy cho đến khi tản nắm mọc chạm thành đĩa ở đĩa đối chứng thì ngừng quan sát.
Cách đo kích thước tan nam lấy bút lông kẻ 2 đường vuông góc mặt sau của đĩa petri.
18
Dùng thước kẻ có độ dài 15 cm để đo hai đường chéo vuông góc và lay giá trị trung bình (đường kính tản nắm tính bằng đơn vị mm).
Đường kính trung bình tản nắm được tính theo công thức:
d = (đ1 + d2)/2 Trong đó:
d: là kích thước tản nắm
d1, d2: là 2 đường kính vuông góc của tan nam Hiệu lực ức chế được tính theo công thức:
Hiệu lực ức chế (%) = [(D - d)/D] x 100
Trong đó:
HL: là hiệu lực ức chế nam
D: là đường kính tản nắm trên môi trường không xử lý thuốc.
d: là đường kính tan nam trên môi trường có xử lý thuốc 2.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Office Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1
19
Chương 3