Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu quy trình sản xuất dung dịch phân bón sinh học từ xác ruồi lính đen (Hermetia illucens)

TÓM TẮTNghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo ra dung dịch làm nguyên liệu sản xuấtphân bón sinh học bằng phương pháp thủy phân protein xác ruồi lính đen Hermetiaillucens với thiết kế th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRINH SAN XUẤT

DUNG DICH PHAN BÓN SINH HOC

TỪ XÁC RUOI LINH DEN (Hermetia illucens)

: 17126068 : 2017 — 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRINH SAN XUẤT DUNG DICH PHAN BÓN SINH HOC

TỪ XÁC RUOI LÍNH DEN (Hermetia illucens)

Hướng dan khoa học Sinh viên thực hiện

TS Nguyễn Ngọc Hà Nguyễn Hoàng Câm Ly

TP Thủ Đức, 03/2023

3

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành khóa luận nay, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS NguyễnNgọc Hà — Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình hướng dẫn,chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Khoa học Sinh học, Trường Đạihọc Nông Lâm TP.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập.Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trìnhnghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quý báu dé em bước vào đời một cách vữngchắc và tự tin hơn

Tiếp theo, em xin cảm ơn các anh, chị hiện đang công tác cùng tập thé sinh viênphòng Lab RIBE 106, các bạn của mình cũng đã giúp đỡ, hướng dẫn, nhắc nhở, độngviên em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã cho con cơ hội học tập, luôn bên

cạnh con trong mọi hoàn cảnh, luôn ủng hộ, động viên con khi gặp khó khăn, cũng như

chia sẻ mọi niềm vui và nỗi buồn, giúp con có thêm động lực dé hoàn thành khóa luận

nảy.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng song bài báo cáo này khó tránh khỏi những thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý Thay, Cô để khóa luận được hoàn

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Hoang Cam Ly, MSSV: 17126068, Lớp: DH17SM (Số di động:

0355656904, Email: 17126068@st.hemuaf.edu.vn), thuộc khoa Khoa học Sinh học,

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp

do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam kết

nảy.

Tp Ho Chí Minh, ngày 16 tháng 03 năm 2023

Người viet cam đoan

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo ra dung dịch làm nguyên liệu sản xuấtphân bón sinh học bằng phương pháp thủy phân protein xác ruồi lính đen (Hermetiaillucens) với thiết kế thử nghiệm Box — Behnken dé tối ưu hóa các điều kiện thủy phân.Đồng thời đánh giá hiệu lực của dịch thủy phân xác ruồi lính đen (ermetia illucens)lên cây rau ăn lá ở quy mô phòng thí nghiệm Trong nghiên cứu này, kết quả hóa lý củabột protein thô cũng được xác định với độ 4m: 1,13 %; tro tổng số: 5,18 %; protein tổngsố: 60,51 %; hàm lượng chất hữu cơ và axit humic cao lần lượt là 52,37 % và 50,98 %.Điều kiện tối ưu để thủy phân xác ruồi lính đen (Hermetia illucens) tạo dung dịch giàudinh dưỡng của các yếu tô khảo sát như nhiệt độ là 50°C; thời gian là 5,3 giờ; pH là 7,0;enzyme/protein là 106 UI/g; cơ chất/dung dịch là 1: 5 Với điều kiện tối ưu từ mô hìnhthu được dịch thủy phân có giá trị đinh dưỡng cao với hàm lượng nito tổng số trong dịchđạt 1,17 %; axit humic: 4,57 %, axit fulvic: 14,02 % và chất hữu cơ có hàm lượng là11,03 % Khi khảo sát hiệu lực dịch thủy phân xác ruồi lính đen lên cây cải bẹ xanhtrong môi trường không có chất dinh dưỡng từ các nguồn khác thì dịch thủy phân có ảnhhưởng đến sự phát triển hệ rễ của cây ở nồng độ bổ sung là 0,1% tương ứng 1 ml dịchthủy phân góc trong 1 lít nước

Từ khóa: ruồi lính đen, thủy phân bằng enzyme, dịch thủy phân protein, phân bón sinh

học.

This study was conducted to create a solution as a raw material for biofertilizer

production by protein hydrolysis of black soldier fly (Hermetia illucens) carcasses with

Box — Behnken experimental design to optimize hydrological conditions feces At the same time, evaluate the effect of hydrolyzate of black soldier fly (Hermetia illucens)

carcass on leafy vegetables at laboratory scale In this study, the physicochemical results

of crude protein powder were also determined with moisture: 1.13%; total ash: 5.18%; total protein: 60.51%; high content of organic matter and humic acid was 52.37% and 50.98%, respectively Optimal conditions for hydrolysis of black soldier fly (Hermetia illucens) carcasses to create a nutrient-rich solution of investigated factors such as temperature is 500C; time is 5.3 hours; pH is 7.0; enzyme/protein is 106 UI/g;

substrate/solution is 1: 5 With optimal conditions from the model, hydrolyzate with

high nutritional value is obtained with total nitrogen content in the solution reaching 1.17%; humic acid: 4.57%, fulvic acid: 14.02 % and organic matter with a content of

11.03 % When investigating the effect of hydrolyzate on black soldier fly carcasses on

broccoli in the absence of nutrients from other sources, the hydrolysate had an effect on the root system development of plants at additional concentrations of 0.1% corresponds

to 1 ml of stock hydrolysate in 1 liter of water.

Keywords: black soldier fly, enzymatic hydrolysis, protein hydrolyzate, biological fertilizer.

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM 0) 22 5-222222122112112212112112112112112112112112111111211112111111112112111 1 ca iRACNEAN VA CAM DOAN nomemennce nce iiTOM TAT oo — iii

DI ng ncn RF Rc Pic bh Sasi Fi Pgs rie hic iv MỤC LUG occ scsscscsessesssessessseesecesesseceseeseesnessetsussssessssneesssusssssusssessnssiessnssuessesseesesseseieeseesees Vv

DANH SÁCH CHU VIET TAT cscsscssssssssessessessessessessessessessessessessessessessessessesaeeaeeaeeaee viii

ee a co aseteseeenenaesrooreatostaoeersiossgesntemesoessal iixDANH SÁCH CÁC HINH 0.0 c0.ccscsssessesssessesesessecseeesetsneeneesessersssstsessssseesnsssetinesieeecseeeees xech oo) — kinh HH HE HEƯ,.nHg ,2020.02424000201<170.2010e |LiL Dat Vain G6 7a 1

OR cg: 1 (en ae -)

1,3; Nội dune thre hiỆNeszecscesses 6692416350886 6%95016016GE2398061602198SuBE850164634884cH43SPESgHSSHEBECSGEBSESE 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU 2- 2 22S2SE2E£2E£EE2EE2E2EE2E22E22522522223222 2222 32.1 Tổng quan về Ru6i lính đen (/1erretla iÏÏiu€eØiS), 2-©5:©522222552252z22222+z222222z<: 32.1.1 Đặc điểm sinh học của Rudi lính đen 2-2 22©222222E22EE22E+2EEz2EE2EEzzxzzrxee 3

GL lofi, Pin rawvaeaeaerrrgrtrrrrrrrroorttotgieogarororiettingitortaetroinrtysoinee 32.1.1.2 Đặc điểm hình thai cccccccecccccccesececseeseceesecseceesecsececsecsecsesevseceesevsecsesevseeeeeeeeeeeee 32.1.1.3 Dac diém 8h 45.1.1.4 Đặt điểm đỉnh đường «D2 HH HH0 HH giáng 02 excel 42.1.1.5 Đặc điểm sinh sản - 2-22 2222221 221221122122112112211211221121121121121121211 21c e6 42.1.2 Nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của Rudi lính đen -22-52 5522 52.2 Téng quan về enzyme có khả năng thủy phân protein . -2222z52+z55+2 7

2.2.1 Khái niệm enzyme có kha năng thủy phân protein - - -+-++- 7 P2928) ENZYME: PrOvease - -ceracnncsneuretsromnsiionassnscsnnsnensnetscatisnnacgeensnecnnnastpsatentsenssonsneonenees 7 22225: ed vAuiiice al (cel EC eee ee re 8 2.3.1; Enzynie-A lealase 235: itssssszssizsseoeeetcgicggedostkgt3:9003S-2i ei neperiian taupe vane eree 8

2.2.3.2 Một số nghiên cứu về ứng dụng của Enzyme Alcalase -2©5z-: 8

2.3 Qua trinh thuy 001009: 50 010177 9

2.3.2 Cấu tạo hóa học của protein - 2 2+ ©2¿22222E22EE22E22E122122112212112212211211 22121 cze, 92.3.2.1 Cấu trúc bậc l -222222+2222Ettt.EEE .rrrie 102.3.2.2 Cấu trúc bậc 2 -+2+2222E1211211211211211211211211211 2111112121221 re 102.3.2.3 Cấu trúc bậc 3 -2-2222212211211221121121121111211211111112111211211121 re 11SAP Np tt HiBleeeeeereeenoneerasdirooingidoiuo22teipsRkc@prpnsicasngsfisEirggjntotsirlxsstixggope 11

23600: SU THUẾ TDHðÍÏ-ssssassssssseostossitittondogEgogtgDESERSaH9gDH071338/1023GIf.GSg2/3Đ5901G03G208.SHGE.I0HS038013851000300001558 11 2.3.3.1 Khái niệm thủy phân eeeecececeeeecceeeseeeeseeeeseeecsceseeeescseeseeeeseeeseceeeseeeeatees 11

2.3.3.2 Các yêu tố anh hưởng đến qua trình thủy phân protein -. -: ¿-52=52 12DGD 2.1 Acie hướng es ĐI er cessererreeeeereererzernereniemmmnenieeenienenien 122.3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 2 2 2222E2EE£EE2EEEEE221271271712121212121 22C 132.3.3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân -2- 22 ©+2+++2+++zx+szxvzrxrsrrrres 132.3.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme - 2© 2+222+2E£+EE£2EE£+EE22EE222E222Ez2rzzee 132.3.3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất -2-22©2++22+++22+2EE+z2rxzzrrxrzrrrrr 132.3.3.3 Một số nghiên cứu thủy phân protein phương pháp sinh học - 132.4 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)) -2- 2-52222z+2zz2zzc>x2 14

2.4.1 COng dung cia RSM 14

2.4.2 Ưu, nhược điểm của RSM u ccccsccccscesessesesessesceseseevcecevesesceeeesesscsvsrsecaveesvetseveeseseees 15

5411 tu HIỂN greesessinsngtououiptgrsetostgiigutiGt0.G1E105GNIGĐHGTHGHSEGGEIGD.G.E-SES05RG-G./201G08380G.E0G0.SH 15

2.5 Téng quan vé phan 0n 1 15

2.5.1 Khai niém phan 0n 15

2.5.2 Phan loai phan Wttu CO 15

2.5.3 Ưu điểm của phân hữu cơ - 22 22222222E222E22212221222122212271227122212221221 22.220 152.5.4 Những nghiên cứu về phân bón hữu cơ liên quan đến Ruồi lính đen 162.6 Tổng quan về phân bón lá trong sản xuất nông nghiệp - -22 222552 17

Pˆ Na 0 on nh 17 2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng phân bón lá trong canh tác -«=<+-<<+<<c+<s 18

CHUONG 3, VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP scsisse:comneseuvmmmmreameutrscenaereninwersns 193.1 Thi gian ce, | nh 19

8: Vat HIỂU Va DHẩH VÌ iphilETT GỮN ssssssessssesbootiniinnotiaBMIGTSS8 S98 B2E9g02000386380391905G835093300250.008048 19

3.2.1 Vat LGU 19

3.2.1.1 ThiẾt bị 5- 2-5221 2E2E1212212112111211211112111111111211111111111122111221112 21 re 20

S0) áo 20 3.2.2 Pham vi nghién CU 0176 20

3:5: Phươn pháp ñBhiÐH GỮU ssescsvemeveeneeecermencenwsneevenesveseveseue cements emerees eres, 20

3.3.1 Chuan bị mẫu và xác định thành phần dinh dưỡng của xác ruồi lính đen 203.3.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát các điều kiện cho quá trình thủy phân xác RLD 21

3.3.2.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 5552 <S2<£22£+£szczeeererek 21

MD eg a at GIẾT cac sec cgah ng ga nho ng Hhidbi036-308434018631.30:61G:37001g:23860u23.6.430Ì 21

3.3.3 Đánh giá hiệu lực phân bón sinh học lên cây rau ăn lá quy mô phòng thí nghiệm.23

51t bú HÀ dĩ be eneeaenneinnhinutgtiuttktittlDtiottud0iNiS0000000000307008002080080103300100000 233.3.3.2 Chuẩn bị hạt giống 2: 2¿2222222212212221221121122112112211211211211211211211 112 re 2335.45, HỘ trí HH ngHÏỆM: ~—xockesceEe.EL2E01.mHE 200130001-10.7-e.cExrd cirSrctmgrdtrierrzee 243.3.3.4 Chăm sóc cây sau bố trí thí nghiệm - 2-22 2 2222222E22EE2EE22EE2EEczEezrxrred 24

3:3„3.5 CIG:CHỈ tiểu (Heo AGL aeaseeiesnoateoiolSilLsSd80400048180001631381005030t811X850190116816s8139185300308 24

BAe Pitesti pháp it nrtfCh THÊM eeeeeeseeniokadiosukcanhhihhucgnhiitouegudtgDiE3HiEGI,0003006)9.609810688,.00160/00020003 253.5 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 2-©22222222EE22E+2EE2EEE2EE+EEE+EEzEE+rxrred 25CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN ssssssssessessessessessesseesessessessessessessesinssesaesees 264.1 Ham lượng dinh dưỡng trong xác ruồi lính đen 2-2: 22©22222222+22zz2z+z2sz2 264.2 Kết qua phân tích của các hàm mục tiêu -2- 2-2252 SS+2E+2E2£E2ZEZE2E.zEzzeze, 274.2.1 Tối ưu các thông số thủy phân cho hiệu suất thủy phân -2252-552 274.2.2 Kết quả kiểm tra thực nghiệm - 2-22 ©2222222E22EE22E22EE22E2221221222E221 2E crxe2 314.3 Thanh phan dinh dưỡng và các axit amin của dịch thủy phân xác ruồi lính den 32

3.4.1, Chiều cao cấy rau h ei 25020 -060830x 40230 c8 02 xe 354.4.2 S61 cay rau cai Xam occ ái4 Ả 374.4.3 Chiều đài rễ cây rau cải xan cece cecccesseeesesseessesseesseeeseestesseesseessesseeeeseeeeeeens 38

E1 ae 40E7 D777 7000 0 ưa 40TÀI LIEU THAM KHẢO 22+ 2+522S22E2E22E2122125121221211212212112121211212121121 11 xe 41

PHU LUC oocecscescscecsscessseesssesssvesssesssvesssecssseessuesssecsssecessessssesssesssesssvesssvesssecesseseseeseseeeeseessees 43

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của ấu trùng RLĐ nuôi trên ba chất nên 6

Bang 2.2 Thành phần khoáng chat của au trùng RLĐ nuôi trên ba chất nền 6

Bang 2.3 Nong độ axit amin (mg/g) trong ấu trùng RLD nuôi trên ba chất nền iP Bang 3.1 Gia tri thực nghiệm của các yếu tố khảo sát -2- s2 2E EErxerrxe 22 Bang 3.2 Nghiệm thức bố tri để đánh giá hiệu lực dịch thủy phân 24

Bảng 4.1 Thành phần dinh dưỡng trong xác RLĐ -2- 22 ©52222222222zz22222xze2 26 Bảng 4.2 Kết quả quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken 27

Bang 4.3 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố đến HSTP 29

Bảng 4.4 Kết quả HSTP và hàm lượng nito axit amin - -:::2222zcccscszec 31 Bảng 4.5 Hiệu suất thủy phân lý thuyết và thực nghiệm ở điều kiện tối ưu 31

Bang 4.6 Kết quả đánh giá thành phần dinh dưỡng của dịch thủy phân xác RLĐ 32

Bang 4.7 Kết quả đánh giá thành phần axit amin của dịch thủy phân xác RLĐ 33

Bang 4.8 Ảnh hưởng của dịch thủy phân xác RLĐ đến chiều cao cây 36

Bang 4.9 Ảnh hưởng của dịch thủy phân xác ruồi lính đen đến số lá 37

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của dịch thủy phân xác RLĐ đến chiều dài rễ 39

Phần tng: thity phân:PT0ÏÌGTTSscsseisc-6ti5066012602224161300333353809638.0650g3802:c8gSg6ã358gi0 12 Watt liệu tHị:HGHH1ỂTTTeseengenenorsgiEiSoRADSSREASEEPSGUDISSRENSNSERGINRIBSOTRGIGSSIBSEBSSSRSESE 20

Sắc ký đồ các thành phần axit amin trong dich thủy phân 33

Phân bón lá Amino TV cua công ty Tri VIỆt 2-52 ee eee 35 Hình ảnh rau sau thu hoạch dai diện cho từng nghiệm thức 3 2

Hình ảnh rau sau thu hoạch đại diện cho từng nghiệm thức 37

Hình ảnh rau sau thu hoạch đại diện cho từng nghiệm thức 38

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt van đề

Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội hiện nay, ngành nông nghiệp cũng

có những thay đôi rat đáng kế Nhu cầu xã hội ngày càng cao, đòi hỏi con người sử dụngnhiều biện pháp khác nhau dé tăng năng suất sản lượng của sản phâm Nhiều máy móctiên tiến, công nghệ trồng trọt, giống mới ra đời đã đáp ứng kịp thời với những nhu cầu

đó Việt Nam là nước nông nghiệp nên phân bón và giống là hai yếu tô quyết định đếnnăng suất và chất lượng Ngành nông nghiệp ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phânbón hóa học, nhiều nơi do sử dụng quá mức cần thiết dư lượng phân bón, thuốc bảo vệthực vật làm cho đất bị bạc màu nhanh chóng, gây 6 nhiễm môi trường dat, môi trườngnước và ảnh hưởng nhiều đến hệ sinh vật và vi sinh trong đất, làm cho chúng có khuynhhướng ngày càng nghèo nan và mat cân bang, ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng chuyênhóa cũng như hấp thụ chất dinh dưỡng của cây trồng Những hóa chất có trong phân bónkhi lạm dụng không chỉ ảnh hưởng đến động vật, nó còn ảnh hưởng đến chuỗi thứ ăngây ra độc tính và tạo ra nhiều bệnh phức tạp và nguy hiểm cho cơ thể con người

Dé trả lại độ phì nhiêu cho đất, khắc phục được những hậu quả trên, đáp ứng nhucầu đời sống của con người về nâng cao mức sống, nhu cau an toàn thực phẩm, đảm bảosức khỏe con người, bảo vệ được môi trường sinh thái, phát trién nông nghiệp bền vững,biện pháp cấp thiết nhất đó là sử dụng phân hữu cơ chế biến từ các nguồn khác nhau,đây chính là biện pháp hay nhất hiện nay dé giải quyết các các van dé quan trọng nhưduy trì độ màu mỡ của đất, khắc phục tình trạng ô nhiễm môi trường Do đó, xu hướngquay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón hữu

cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới

nói chung.

Ruồi lính đen có tên khoa hoc là Hermetia iluciens, là một loại ruồi được nhiềunước trên thế giới sử dụng để phân hủy rác thải hữu cơ rất hiệu quả Chúng xử lý rácthải bang cách chuyên hóa các chất dinh dưỡng có trong đất thành sinh khối và thải raphân hữu cơ Nhận thấy ruồi lính đen sau khi đẻ trứng sẽ chết đi, hàm chượng chất hữu

cơ trong xác ruồi thường rất cao, phù hợp ứng dụng làm phân bón hữu cơ cho cây Âutrùng Rudi lính đen cũng đã được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước thực hiện, còn

xác rudi thì đây là một hướng mới, có tính mới mẻ dé nghiên cứu Từ thực tế trên tôithực hiện đề tài nghiên cứu quy trình sản xuất phân bón sinh học từ xác ruồi lính đen

này.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài thực hiện nhằm sản xuất ra dung dịch phân bón sinh học từ xác Ruồi lính

đen (Hermetia illucens).

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài bao gồm 2 nội dung chính:

Nội dung 1: Khảo sát tối ưu hóa điều kiện thủy phân xác ruồi lính den mang lạihiệu quả cao nhất khi làm phân bón sinh học

Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực phân bón sinh học lên cây rau ăn lá ở quy mô phòng thí nghiệm.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về Rudi lính đen (Hermedla illucens)

2.1.1 Đặc điểm sinh học của Rudi lính den

Phân loại sinh học

Rudi lính đen được phân loại như sau:

Giới (regnum): Animalia 3

Chi (genus): Hermetia

Loài (species): Hermetia illucens Hinh 2.1 Rudi linh den

2.1.1.1 Phân bố (Hermetla illucens)

Ruồi lính đen là loại ruồi phô biến được ghi nhận có mặt tại cả năm châu lục(Oliverira, 2015) Loại ruồi này phân bố chủ yếu tại khu vực nhiệt đới và vùng khí hậu

ấm áp nằm trong khoảng 45° vĩ Bắc và 40° vi Nam (Diener và ctv, 201 1) Loài côn trùngnày xuất hiện trong một phạm vi địa lý rộng lớn từ Mỹ cho tới Đông Nam Á (Hardouin

và ctv, 2003; Rozkosny, 1983) Các nhà khoa học ghi nhận ruồi lính đen xuất hiện tạiChâu Á từ đầu thế kỷ 20 (Marshall, 2015)

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triểncủa ruồi lính đen Trong đó, thích hợp nhất là khu vực Nam Trung bộ và Nam bộ vì làhai khu vự có nền nhiệt độ trung bình khá cao 28°C — 30°C, độ âm trung bình 80 %(Tran Tan Việt, 2005)

2.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Ru6i lính đen thường có vẻ bên ngoài giống ong bắp cày về hình thái và cách vậnđộng nhưng không can và chích Do đó về mặt dịch té học thì ruồi lính đen không là tácnhân gây bệnh trên người và động vật (Trần Tan Việt, 2005)

Rudi lính đen là loại ruồi lớn có chiều dai 2 cm (5/8 inch), chân nhỏ màu den vàbàn chân trắng vàng, cánh có màu đen khói (xám) được thu lại ở trên thân khi chúngnghỉ ngơi, phần đốt thân khoang bụng có màu sáng Phần đầu có 2 râu nhỏ là cơ quanxúc giác cảm thụ mùi vị và giúp ruồi định hướng khi bay.

Au trùng ruôi lính den có hình dạng như quả ngư lôi, phần đầu nhọn còn phan đuôi

tù hơn, mặt dưới dẹt và phẳng hơn mặt trên Cơ thể phân thành nhiều đốt nhỏ Giai đoạncuối, au trùng có thể dài tới 16 — 27 mm và rộng 2,8 — 6,0 (Rozkošný, 1982)

2.1.1.3 Đặc điểm sinh thái

Rồi lính đen phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 20°C — 28°C (Sylvester va ctv,1959), âu trùng của chúng sinh trưởng tốt trong khoảng 27,5°C — 37,5°C tốt nhất là 32°C

(Newton và ctv, 1995).

Khoảng pH thích hợp cho ấu trùng ruồi lính đen phat triển là từ 6,8 — 7,2 Rudilính đen có thê sống trong môi trường có độ ẩm thấp, tuy nhiên chỉ sinh trưởng tốt ở môitrường có độ âm khá cao 50 - 90 % nhưng độ ẩm tối ưu nằm trong khoảng 65 - 80 %

2.1.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Ruồi lính đen có khả năng sử dụng các chất thải hữu cơ bằng cách biến chúngthành một sinh khối giàu protein và giàu chất béo, thích hợp cho các mục đích khácnhau, bao gồm làm thức ăn cho vật nuôi, biodiesel và sản xuất chitin (Diener và ctv,

2011; Huis và ctv, 2013).

Au trùng rudi lính den có khả năng phân hủy phan gia súc, gia cam, các dư thừathực vật từ trang trại, sản phẩm ton trữ, san pham dư thừa từ qua trình chế biến thựcphẩm chat thải từ nhà hàng, nhà bếp (Newton và ctv, 1995; Shepard, 1992) Au trùng cóthé ăn từ 25 — 500 mg/ngay trên một số vật liệu hữu cơ dang phân rã như trái cây bịrụng, bột cà phê, cá chết và đặc biệt là phân động vật (Hardouin va ctv, 2003; Diener vactv 2011; Huis va ctv 2013) Trong điều kiện lý tưởng, au trùng trưởng thành trong 2tháng, nhưng giai đoạn ấu trùng trưởng thành trong 4 tháng khi không đủ thức ăn

(Hardouin và ctv, 2003).

2.1.1.5 Đặc điểm sinh sản

Ruồi lính đen sinh sản trên thực vật thối rữa và phân gia súc Con trưởng thànhkhông ăn và dựa vào chất béo được lưu trữ trong giai đoạn ấu trùng Rudi lính den đẻtrứng vào các vét nứt và khe hở khô gần nguồn thức ăn (Diener và ctv, 2011) Rudi cái

đẻ trứng mỗi lần khoảng 500 — 1000 trứng và cần 4 -5 ngày đề nở, với nhiệt độ trung

bình là 24°C và độ 4m khoảng 60 % trở lên

Au trùng nhộng ruồi có màu trắng đục, có thé dài tới 27 mm, chiều rộng 6 mm vanặng đến 220 mg trong giai đoạn phát triển cuối cùng của chúng Giai đoạn nhộng cần

2 tuần sau đó biến thành ruồi và chỉ sống được từ 5 — 8 ngày Ruôi lính đen chỉ đẻ trứng

một lần trong một chu kỳ song trong diéu kién khi hau mién Nam Viét Nam, giai doan

trứng kéo dai 1 -2 ngày, au trùng kéo dai 55 — 60 ngày tuôi; tiền nhộng sống trong 7 —

11 ngày; nhộng trải qua 5 — 13 ngày dé biến thành ruôi (Tran Tan Việt, 2005)

cũng chứa nhiều thành phần khoáng và các axit amin khác cụ thé được thé hiện ở

Mangan 1,4+ 0,01 0,9 + 0,01 1,1+ 0,01

Coban 4,6 + 0,01 2,6 + 0,01 6,5 +0,02 Kém 0,3 + 0,01 0,3 + 0,01 0,3 + 0,02

Ca:P (tỷ lệ) 8.3 5.2 3.7

Về thành phần khoáng chat, nghiên cứu của Marwa va ctv (2019) tiến hành phântích trên các mẫu ấu trùng ruồi lính den say khô và cho thấy ấu trùng chứa đa dạng cácthành phần khoáng chất khác nhau Thành phần khoáng chất của ấu trùng được nuôibằng các nền vật chất khác nhau như phân gà, chất thải nhà bếp, ngũ cốc đã qua sử dụng

cụ thé được trình bày trong bảng 2.1 và bảng 2.2

Nghiên cứu của Marwa và ctv (2019) cũng cho thấy rằng ấu trùng ruồi lính đencũng chứa rất nhiều loại axit amin Kết qua phân tích thành phần axit amin từ au trùngruôi lính đen được thê hiện trong bảng 2.3.

Bảng 2.3 Nong độ axit amin (mg/g) trong ấu trùng RLD nuôi trên ba chất nền

Chất thảinhà Ngũ cốc đã qua sử

Axit amin Phan ga ,

bêp dụng Histidin 3,5+0,3 3.3:+ 1.6 4,7+0,5

2.2 Tổng quan về enzyme có khả năng thủy phân protein

2.2.1 Khái niệm enzyme có khả năng thủy phân protein

Enzyme là các protein có tác dụng làm chất xúc tác sinh học Chất xúc tác thúcđây phản ứng hóa học Các phân tử được enzyme tác động lên được gọi chất nên, và cácenzyme biến đôi các chất nền thành các phân tử khác nhau được gọi là sản phẩm Hầunhư tat cả các quá trình trao đôi chất trong các tế bào đều cần sự xúc tác (enzyme catal-ysis) dé chúng xảy ra ở tốc độ cho phép sự sống tồn tại

Một số enzyme có thể sử dụng đề làm chất xúc tác sự đứt gãy các liên kết hóa học

từ phản ứng thủy phân như: Glycoside hydroxylase, Nuclease, Protease.

2.2.2 Enzyme Protease

Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) là nhóm enzym thủy phân có

khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và

một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp.

Trong cùng một phản ứng, các protease khác nhau có các hướng xúc tác khác nhau.

Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông

qua hai bước chính (Barrett, 1994):

Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine vớinguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm im-

1dazole từ histidine.

Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo

chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyền proton của gốc -OH

từ serine cho nhóm amine dé tái sinh lại enzyme

2.2.3 Enzyme Alcalase

2.2.3.1 Enzyme Alcalase 2,5 L

Enzym Alcalase 2.5L là chế phẩm protease Alcalase là enzyme được chiết xuấtbằng cách lên men chìm dòng vi khuan Bacillus licheniformis Là enzyme hiệu quả nhất

để sản xuất các loại protein thủy phân Alcalase có thể thủy phân hầu hết các liên kết

peptide trong phân tử protein.

Enzyme có hoạt tinh 2,5 AU - A/g Hoạt động tốt ở pH 6,5 - 8,5, tối ưu ở pH 8 khithủy phân nhộng ruồi lính đen (Lê Thị Thúy Hang, 2017), khi pH lệch sang hai bên phía

tối ưu, hoạt tính enzyme Alcalase giảm xuống Nhiệt độ 45 — 65°C với hoạt độ tối đa

vào khoảng 60°C khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu, hoạt độ của enzymegiảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm Tăng nhiệt độ làm cho hoạt động của enzyme và cơchất tăng phản ứng xảy ra nhanh hơn Do bản chất enzyme là protein nên dễ biến đổitính chất khi nhiệt độ cao và mat hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối

ưu, cơ chất và enzyme chuyền động chậm, tốc độ phản ứng giảm

2.2.3.2 Một số nghiên cứu về ứng dụng của Enzyme Alcalase

Năm 2018, Nguyễn Văn Mười và Hà Thị Thụy Vy đã sử dụng enzyme Alcalase

dé thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ chân trắng với nồng độ enzyme dùng dé thủyphân là 20 UI/g trong thoi gian là 4 giờ ở pH 7,65 và nhiệt độ 58,780C Với điều kiệntrên kết quả thủy phân đạt được 37,6 % và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phântốt (31,57 %)

Ung Minh Anh Thư (2019) thủy phân protein từ thịt cá lóc bằng enzyme alcalasevới hiệu suất thủy phân đạt tốt nhất (42,47 %) ở điều kiện pH là 8,1, nhiệt độ thủy phân

là 58°C, nồng độ alcalase là 2,9 % (v/w) và thời gian thủy phân là 3,94 giờ (236 phút).Nghiên cứu cho thấy tính khả thi của việc sử dụng enzyme alcalase thương mại trongthủy phan protein từ thịt cá lóc, mở ra triển vọng cho việc sản xuất dịch đạm giàu cácaxit amin và peptide mạch ngắn có giá trị dinh dưỡng, có thể ứng dụng trong chế biếncác sản phâm giàu protein

Phan Thị Yến Nhi và các cộng tác viên (2017), thủy phân protein rongCheatomorpha sp bang enzyme alcalase Kết quả cho thấy, điều kiện thủy phân tối ưu

để thu được dịch thủy phân có khả năng kháng oxi hóa cao nhất là nồng độ enzymeAlcalase 0,9 % với thời gian thủy phân 1,9 giờ Hiệu suất thu hồi protein tối ưu thu đượckhi nồng độ enzyme là 1 % với thời gian thủy phân trong 1,8 giờ Khi đó hiệu suất thuhồi protein với khả năng bắt gốc tự do của dịch thủy phân thu được là 84,1 % với 38,01

mg TE/g protein.

2.3 Quá trình thủy phân protein

2.3.1 Khái niệm protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các

amino acid amino acid được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amine (-NH›), hai

là nhóm carboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1nguyên tử Hydro và nhóm biến đổi R quyết định tinh chất của amino acide

2.3.2 Cau tao hóa học của protein

Là hợp chất hữu cơ gồm 4 nguyên tố cơ bản C, H, O, N thường có thêm S và đôi

lúc có P.

Thuộc loại đại phân tử, phân tử lớn nhất dài 0,1 micromet, phân tử lượng có thể

đạt tới 1,5 triệu đ.v.C.

Thuộc loại đa phân tử, đơn phân là các amino acid.

Có hơn 20 loại amino acid khác nhau tạo nên các protéin, mỗi amino acid có 3thành phan: gốc cacbon (R), nhóm amin (-NH›) và nhóm carboxyl (-COOH), chúngkhác nhau bởi gốc R Mỗi amino acid có kích thước trung bình 3A

Trên phân tử các amino acid liên kết với nhau bằng các liên kết peptide tạo nênchuỗi polypeptide Liên kết peptide được tạo thành do nhóm carboxyl của amino acid

này liên kết với nhóm amin của amino acid tiếp theo và giải phóng 1 phân tử nước Mỗiphân tử protein có thê gồm một hay nhiều chuỗi polypeptide cùng loại Từ 20 loại aminoacid kết hợp với nhau theo những cách khác nhau tạo nên vô số loại prétéin khác nhau(trong các cơ thể động vật, thực vật ước tính có khoảng 1014 — 1015 loại protein) Mỗiloại protein đặc trưng bởi sé luong, thanh phan va trinh tu sap xép cac amino acid trongphan tử Điều đó giải thích tai sao trong thiên nhiên các prôtê¡n vừa rat da dang, lai vừamang tính chất đặc thù.

Cấu trúc Protein có 4 bậc cấu trúc cơ bản: 1, 2, 3, 4

2.3.2.1 Cau trúc bậc 1

Các amino acid nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypeptide.Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của amino acid thứ nhất và cuối mạch là nhómcarboxyl của amino acid cuối cùng Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tựsắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide Cấu trúc bậc một của protein có vaitrò tối quan trọng vì trình tự các amino acid trên chuỗi polypeptide sẽ thé hiện tương tácgiữa các phan trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thé của protein và

do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắpxếp của các amino acid có thé dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.2.3.2.2 Cau trúc bậc 2

¡ lÝ -_ 9 Fs 8 GHy

RA WN AAA b

H H H

ö ö oO"

Gly Ser Gly Ala Gly Ala

Hình 2.3 Cấu trúc bậc | của protein

Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian Chuỗi polypeptidethường không ở dang thang mà xoắn lại tạo nên cau trúc xoắn ơ và cấu trúc nếp gap B,được có định bởi các liên kết Hydro giữa những amino acid ở gần nhau Các protein sợinhư keratin, Collagen (có trong lông, tóc, móng, sừng)gồm nhiều xoắn a, trong khi

các protein hình câu có nhiêu nêp gâp hơn.

CẤU TRÚC BAC 2 CUA PROTEIN

đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phíangoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử Các liên kết yếuhơn như liên kết Hydro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu.2.3.2.4 Cau trúc bậc 4

Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậcbốn của protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liênkết Hydro

2.3.3 Sự thủy phân

2.3.3.1 Khái niệm thủy phân

Thủy phân là một loại phản ứng phân hủy trong đó một chất phản ứng là nước.Thông thường, nước được sử dụng dé phá vỡ liên kết hóa học trong chat phản ứng khác.Thuật ngữ này xuất phat từ tiền tố Hy Lạp - (nghĩa là nước) với lysis (có nghĩa là vỡ ra).Thủy phân có thé được coi là đảo ngược phản ứng ngưng tu, trong đó hai phân tử kếthợp với nhau, tạo ra nước là một trong những sản phẩm

Phương trình tổng quát cho quá trình thủy phân như sau:

Hình 2.5 Phan ứng thủy phan protein

Ban chat của qua trình thủy phân protein: là quá trình phá vỡ các liên kết peptidekhi có mặt của nước Do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá trình thủy phân cần cómặt chất xúc tác Các tác nhân xúc tác gồm: Tác nhân hóa học như acid (HCI) hay base

(NaOH) và tác nhân hóa sinh học như enzyme thủy phân protein (có tên chung la

protease).

Các đặc tinh của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phan và cautrúc của peptit tạo thành Điều này phụ thuộc vào tinh chat tự nhiên của protein và tínhđặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủyphân như pH, nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme, hay tỉ lệ cơ chất với dung dịch.Protein bị cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như peptide hay axit amin

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất quyết định tốc độ thủy phân Phản ứng thủy phântạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptide san có cho enzyme Độ thủy phân phụthuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc trưng của enzyme

2.3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein

Enzyme bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH Giá trị pH thấp hay cao so với giá trị tối

ưu thì tốc độ phản ứng thường giảm và hoạt tính của enzyme cũng bị ảnh hưởng

12

2.3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và hoạt tính enzyme Đa sốenzyme Alcalase bị mất hoạt tính ở 80 — 100°C vì vậy enzyme thể hiện hoạt tính caonhất khi ở nhật độ giới hạn nhất định Nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 — 50°C,

và enzyme bị bất hoạt đa số khi nhiệt độ lớn hơn 70°C Nhiệt độ thích hợp của enzyme

có thé thay đổi khi có sự thay đôi về cơ chat hay pH

2.3.3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Thời gian thủy phân cần đủ để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thànhcác sản phâm cần thiết của quá trình thủy phân Khi các cơ chất cần thủy phân đã thủyphân hết thì quá trình thủy phân kết thúc Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phânprotein chưa hoàn toàn dẫn đến hiệu suất thủy phân thấp gây lãng phí nguyên liệu, chấtlượng sản phâm chưa đạt Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất vàđảm bảo chất lượng sản phẩm tốt

2.3.3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, thì nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phảnứng khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì dù tăng nồng độ enzyme baonhiêu đi nữa thi tốc độ phản ứng cũng ít thay đối

2.3.3.2.5 Anh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất khi tăngnồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng theo vì cơ hội cơ chất gặp enzyme nhiều Nồng

độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh

chóng.

2.3.3.3 Một số nghiên cứu thủy phân protein phương pháp sinh học

Honlada và Netto (2006) nghiên cứu thu hồi ba thành phần chính của phế liệu tôm,protein, chitin, astaxanthin vi trong phế liệu tôm có chứa 39,42 % protein, 31,98 % tro

và 19,92 % chitin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pancreatin Tiến hành thủyphân khử protein bằng enzyme Alcalase tại cá điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu (E/S)

3 %, nhiệt độ 60oC, pH = 8,5 Kết quả cho thấy khi tăng độ thủy phân (% DH) từ 6 %tới 12 % thì thu được 26 % và 28 % protein tương ứng Alcalase có ảnh hưởng nhiềuhơn pancreatin, có thé thu hồi protein từ 4,7 đến 5,7 mg astaxanthin/100g phế liệu khô

tại DH 12 %.

Năm 2014, Trần Thanh Trúc và ctv đã khảo sát khả năng thủy phân protein bằngenzyme protase nội bào có trong thịt đầu tôm sú cho thấy quá trình thủy phân proteinđạt tốt nhất khi pH là 9, thời gian thủy phân tốt nhất là 8 giờ, với thời gian trên thì dichthủy phân không có mùi lạ Điều kiện tiền xử lý nhiệt nguyên liệu là 50,73°C ở thời gian

lượng protein cao tới 88,2 %, lipit 1,4 % và tro 8,3 %.

Trong quy trình chiết suất chitosan từ ấu trùng Rudi lính đen của Lê Thi ThúyHang (2017) đã sử dụng enzyme Alcalase 0,2 % để khử protein 6 55°C, pH = 8, thờigian là 8 giờ thì độ thủy phân protein hiệu quả cao nhất là khoảng 34,61 %

2.4 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữliệu định lượng từ các thí nghiệm dé xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSMkhám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng

Y tưởng chính cua RSM là sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để cóđược một phản ứng tối ưu Đề làm điều này Box và Wilson đã sử dụng một mô hình đathức bậc hai Mô hình này chi là xấp xi, nhưng lại tương đối dé dang áp dụng

2.4.1 Công dụng của RSM

Xác định các mức yếu tô thỏa mãn đồng thời các thông số kỹ thuật mong muốn.Kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tố dé cho ra kết quả mong muốn đạt được và mô takết quả tôi ưu đó

Cho ra một kết quả đặc trưng khi nó bị ảnh hưởng bởi những sự thay đổi của các mứcyếu tô vượt qua mức dang quan tâm

Đạt được một sự hiểu biết về định lượng của hệ thống xử lý vượt quá vùng thử

nghiệm.

Sản xuất các sản phẩm đặc trưng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố

không chạy.

14

Tìm ra các điều kiện cho một quá trình 6n định — dấu hiệu vô tình.

2.4.2 Ưu, nhược điểm của RSM

2.4.2.1 Ưu điểm

Mang tính thực tế vì số liệu được lay từ thực nghiệm

Có thé áp dung cho bắt kì hệ thống nao có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra

Đánh giá được tá động của các yếu tố ảnh hưởng

RSM thiếu việc sử dụng các nguyên tắc thông kê

2.5 Tổng quan về phân hữu cơ

2.5.1 Khái niệm phân hữu cơ

Là những loại phân bón có nguồn gốc hình thành từ chất thải gia súc gia cầm, tàn

dư thân lá cây, thụ phẩm từ sản xuất nông nghiệp, than bùn hoặc các chất hữu cơ thải từ

sinh hoạt, nhà bếp, nhà máy sản xuất thủy, hải sản

Phân hữu cơ có chứa các chất dinh dưỡng đa, trung, vi lượng dưới dạng những hợpchất hữu cơ và được dùng trong sản xuất nông nghiệp Khi bón vào đất phân bón hữu

cơ giúp cai tạo đất, tăng độ tơi xốp phì nhiêu cho dat bằng việc bồ sung, cung cấp các

loại vi sinh vật, chất mùn, chất hữu cơ cho đất đai và cây trồng.

2.5.2 Phân loại phân hữu cơ

Dựa theo nguồn gốc, chia phân bón hữu cơ làm 2 loại

Phân hữu cơ truyền thống: Phân xanh, phân chuồng, phân rác,

Phân hữu cơ công nghiệp: Phân hữu cơ vi sinh, phân hữu co, phân hữu cơ khoáng.

2.5.3 Ưu điểm của phân hữu cơ

Cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng một cách đầy đủ, cân đối và lâu bền: Trongphân hữu cơ đều chứa đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng da lượng NPK, trung vi lượng cầnthiết cho cây, không bị mất cân đối như thường xảy ra khi sử dụng phân hóa học Cácchất dinh dưỡng trong phân hữu cơ được phân giải từ từ dé cung cấp cho cây trồng 1thời gian tương đối dai

Phân hữu cơ kích thích sinh trưởng cây trồng: Phân hữu cơ phân hủy thành các

chat mtn, có chứa vi sinh vật và các loại acid hữu cơ như acid humic, acid fulvic Cac

acid này có tác dụng kích thích sự phát triển hệ rễ để hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn.Các acid này nêu phun lên lá cũng kích thích cây tăng cường quang hợp

Tăng hàm lượng dinh dưỡng, cung cấp chất mùn, cân bằng vi sinh vật trong đất:Các chất hữu cơ được phân giải và tích lũy giúp tăng dần hàm lượng dinh dưỡng trongđất Phân hữu cơ phân giải hình thành chất mun, cải thiện và tăng sự kết dính của kếtcau dat Dat trở nên tơi xốp, tăng khả năng giữ nước và chất dinh dưỡng, tạo môi trườngthuận lợi cho vi sinh vật phát triển

Cải tạo đất trồng: Cải tạo đất trồng, đặc biệt đối với đất cát, đất bạc màu Phân hữu

cơ tác động mạnh đến cấu trúc đất, cải thiện các tính chất lý, hóa, sinh học của đất ngày

càng trở nên tốt hơn

Hạn chế việc dùng phân bón hóa học: Phân hữu cơ góp phần cải tạo đất trồng, đặc

biệt là những vùng đất bạc màu, đất cát Tác động mạnh tới cấu trúc đất, cải thiện đặctính sinh, lý, hóa của đất trở lên tốt hơn

Tiết kiệm nước tưới: Việc sử dụng phân bón hữu cơ thường xuyên trong thời giandài sẽ cai tạo đất trồng hiệu quả, giúp đất tơi xốp, tăng khả năng giữ nước, giữ 4m Chính

vì thé giúp hạn chế việc phải tưới nước thường xuyên, tiết kiệm chi phí

Bảo vệ môi trường và an toan vệ sinh cho nông sản: Việc sử dụng phân bón hữu

cơ giúp giảm lượng phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp, phục hồi đất canh tác.Phân hữu cơ sau khi chế biến không còn các yếu tốt độc hại với người, không để lại dư

lượng độc hại trên nông sản, đảm bảo nông sản được vệ sinh, an toàn.

2.5.4 Những nghiên cứu về phân bón hữu cơ liên quan đến Rudi lính den

Theo Frost và Hunter (2007), việc sử dụng phân bón từ quá trình phân giải hữu cơ

của ấu trùng ruồi lính đen có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của cây do sự gia tănghàm lượng nito, photpho, và chất hữu cơ trong đất Tuy nhiên, nồng độ ion cao của ionNH4+ trong phân bón có nguồn góc từ ấu trùng ruồi lính den cũng có nguy cơ làm giảm

sự phát triển của thực vật

Theo Klammsteiner va ctv (2020), phân bón có nguồn gốc từ ruồi lính đen có tiềmnăng lớn để bổ sung hoặc thay thé các loại phân bón thương mai Phân bón có nguồn

16

gốc từ ruồi lính đen có thê đóng vai trò là một loại phân bón có giá trị và không làm suy

giảm các đặc tính vệ sinh của đất.

2.6 Tổng quan về phân bón lá trong sản xuất nông nghiệp

2.6.1 Phân bón lá

Phân bón lá là loại có chứa các hợp chất đinh dưỡng hòa tan trong nước, dùng phunlên lá giúp bố sung các chất cần thiết cho cây trồng ở dạng dễ hấp thu Cung cấp dưỡngchất qua lá còn tạo điều kiện cho cây sinh trưởng khi gặp hạn hán, ngập úng hay sâubệnh hại tan công

Bộ lá và các bộ phận khác trên mặt đất, kế cả vỏ cây cũng có thê hap thu trực tiếpcác dưỡng chất Ở trên lá có rất nhiều lỗ nhỏ (khí không) Khí khổng là nơi hấp thụ cácchất dinh dưỡng bằng con đường phun qua lá Trên cây một lá mầm (đơn tử diệp) khíkhông thường phân bố cả 2 mặt lá, thậm chí mặt trên lá nhiều hơn mặt đưới lá như: lúa,lúa mì, Trên cây ăn trái (cây thân gỗ) khí không thường tập trung nhiều ở mặt dưới

lá Khi dùng phân bón lá phải theo đặc điểm cây trồng và đúng hướng dẫn thì lá cây mớihấp thụ cao được

Khi bón qua lá, dưỡng chất cung cấp cho cây trồng qua hệ thống khí không ở bềmặt lá Theo số liệu đã được công bố, hiệu suất sử dụng chất này qua lá đạt tới 95 %.Trong khi đó, bón qua đất, cây chỉ sử dụng được 45-50 % dưỡng chất Sở dĩ như vậy là

vì tổng diện tích bề mặt các lá trên một cây rộng gấp 15-20 lần diện tích đất được chephủ bởi cành và lá, nghĩa là diện tích hap thụ dưỡng chat của lá rộng hơn rất nhiều so

với diện tích đất trồng của một cây Qua khí khổng, các chất cần thiết được dẫn đến các

tế bao, mô cây dé sử dụng

Trong thành phan các chất của phân bón lá ngoài các nguyên tô đa lượng, cònnguyên tô trung lượng và vi lượng Các nguyên tô vi lượng này tuy có hàm lượng ítnhưng lại giữ vai trò rất quan trọng vì trong môi trường đất thường thiếu hoặc không có

Do đó, khi bổ sung các chat này trực tiếp qua lá sẽ giúp đáp ứng đủ nhu cầu và cân đốihàm lượng cho cây và tạo điều kiện cho cây tăng trưởng đầy đủ trong từng giai đoạn

sinh trưởng.

Loại phân này có tác dụng đặc biệt trong những trường hợp cần bé sung khan cấpdưỡng chất Ngoài ra, một số loại còn bé sung thành phan chất kích thích tăng trưởng,giúp tăng khả năng hấp thu vi sinh, kích thích đâm chi, ra hoa, đậu quả và cải thiện

năng suất của nông sản Trong sản xuất phân bón lá, những thành phần này được phốitrộn theo các quy trình khác nhau, tùy thuộc vào mục đích và nhu cầu sử dụng đối vớitừng giai đoạn phát triển của cây.

Hiện nay, bên cạnh các loại bón lá đã được sử dụng khá phổ biến, các loại mới vẫnđược tiếp tục nghiên cứu và phát triển, đó là các loại phân có nguồn gốc từ tự nhiên nhưphân bón lá vi sinh và sinh học, không chỉ góp phần tăng năng suất còn tăng cường sức

đề kháng chống lại sâu bệnh mà còn thân thiện với môi trường

2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng phân bón lá trong canh tác

Trần Thị Tường Linh và ctv (2017) thực hiện nghiên cứu đánh giá hiệu quả sửdụng phân bón lá chiết suất từ tran qué (Perionyx excavatus) trên hai đối tượng nghiêncứu là cây cải ngọt và cây cà chua Kết quả nghiên cứu cho thấy, với liều lượng phuntăng dan lần lượt là 10, 20, 30 mL/8L trên cây cải ngọt giúp năng suất cả ngọt tăng 14—

39 % so với đối chứng sử dụng phân bón lá chiết suất từ trùn quế với liều lượng 14, 30,

45 mL/8L trên cây cà chua cho thấy sự cải thiện khả năng sinh trưởng của cây cà chua,năng suất tăng 10 — 27 %

Nghiên cứu của Bùi Thị Cúc và Nguyễn Thị Lan (2014) cho thấy ảnh hưởng củacác loại phân bón lá đến sự sinh trưởng phát triển và năng suất chất lượng quả của câyCam đường canh tại Chương Mỹ, Hà Nội Các loại phân bón lá trong nghiên cứu đềulàm tăng trưởng kích thước quả, làm giảm tỉ lệ rụng quả so với đối chứng Trong đó loạiphân bón lá ProExel 6-32-32+Te khi sử dụng cho Cam canh cho kích thước quả lớn nhất(7,12 cm) có hiệu qua cao nhất về mặt sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất chấtlượng so với phân bón lá Kali+Te vhelate và phân bón lá Nam Bắc siêu lân trong cùng

nghiên cứu.

18

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 07 năm 2022 đến tháng 01 năm 2023

Địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Độc chất học môi trường - Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học

và Môi trường, Trường Dai học Nông Lâm Thành pho Hồ Chí Minh

Khu thực nghiệm - Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường

Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phạm vỉ nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Ruồi lính đen được nhân giống và thu nhận tại Khu thực nghiệm phòng Độc chất

học Môi trường, thuộc viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại

học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Enzyme Alcalase 2.5 L được sản xuất bởi Công ty Novozyme của Dan Mạch, đượcnhập khẩu và cung cấp bởi Công Ty TNHH Thương mại Nông san và Hóa chất Phương

Trâm.

Hạt giống rau cải xanh được dùng trong thí nghiệm là giống cải bẹ xanh mỡ caosản, thuộc nhãn hiệu hạt giống Phú Nông, được sản xuất từ công ty TNHH giống câytrồng Phú Nông Địa chỉ 58/26C, ấp Tiền Lân 1, xã Bình Điểm, huyện Hóc Môn, thànhphó Hồ Chí Minh

Dịch thủy phân xác ruồi lính đen sau khi tối ưu hóa được các điều kiện thủy phân

Hình 3.1 Vật liệu thi nghiệm (a) Xác rudi lính đen (b) Rudi lính den

xay nhuyên (c) Hạt giống rau cai; (d) địch thủy phân xác RLD

Thủy phân xác ruồi lính den lay sản phẩm làm dung dịch phân bón sinh học

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần dinh dưỡng của xác ruồi lính đen

Mẫu xác ruồi lính đen được nhân giống và thu nhận từ nhà bay sau đó rửa sạchloại bỏ tạp chất, say khô 6 60°C trong 24 giờ Sau khi sấy khô rồi say nhuyễn thành bột,

20

phân tích các thành phần dinh dưỡng có trong xác ruồi lính đen như độ 4m, khoáng,protein, axit humic, axit fulvic, chat hữu cơ, canxi, magie, photpho, kali, natri.

3.3.2 Thiết kế thi nghiệm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân xácruồi lính den bằng enzyme alcalase 2,5L

3.3.2.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Dé xác định chính xác giá trị tối ưu các thông số: A (nhiệt độ), B (thời gian thủyphân), C (giá trị pH), D (tý lệ nồng độ enzyme/gam protein cơ chất), E (tỷ lệ rắn/lỏng)ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân (DH %) tiễn hành tối ưu hóa quá trình thủy phânbằng phương pháp thiết kế thử nghiệm Box-Behnken và tối ưu bề mặt đáp ứng (RSM)

để tối ưu các thông số

Số lượng thí nghiệm cần thực hiện theo phương pháp đáp ứng bề mặt được tínhtheo công thức: N= 2k(k - 1) + no Trong đó, N là số thí nghiệm, k là số yếu tố ảnh hưởng

và no là số thí nghiệm ở tâm Như vậy, qui hoạch thực nghiệm đưa ra ma trận gồm 46thí nghiệm, 6 thí nghiệm lặp lại tại tâm để đánh giá sai SỐ

Phân tích thống kê cho thấy mô hình thống kê biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suấtthủy phân (%) vào các điều kiện ảnh hưởng được mã hoá là một phương trình đa thức

bậc hai có dạng:

Y= Bo + Xi xi + XBụ xi xj + Bi x?

Trong đó:

Y: Hiệu suất thủy phân (HSTP) — dự đoán

Bo : hệ số hồi quy bậc 0; xi nhân tố độc lập thứ i ảnh hưởng đến hàm mục

tiêu Y fi : hệ số hồi quy bậc 1 mô ta ảnh hưởng của nhân tố xi tới hàm mục

tiêu Y

Bi: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng của yếu tố xi tới Y

Bị: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời của xi và x; với Y

3.3.2.2 Chọn miền khảo sát

Khi nghiên cứu điều kiện phù hợp cho quá trình thủy phân đạt hiệu suất cao thìphụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, thời gian, pH, nồng độ enzyme, tỉ lệ cơchat/dung dịch (rắn/lỏng) Dựa vào đặc tinh của enzyme, kết quả thủy phân ruồi của cácnghiên cứu tham khảo thì xác định được mô hình tối ưu tương ứng với các điều kiệnthủy phân Vì vậy, trong nghiên cứu này chọn miền khảo sát 5 yếu t6 dé tiến hành tối

ưu điều kiện thủy phân xác ruồi lính đen bằng enzyme như sau: pH 6,5 — 8,5; nhiệt độ

50 — 70°C; thời gian 1 — 6 giờ; nồng độ enzyme 10 — 250 UI/g protein; tỷ lệ cơ chat/dungdịch (rắn/lỏng) 1:5 — 1:20 với hàm mục tiêu là lượng đạm amin, đạm tổng và hiệu suất

thủy phân (Y).

Bảng 3.1 Giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát

Bảng 3.1 (tt) Giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát

NT: nghiệm thức (thứ tự chạy ngau nhiên của các thí nghiệm)

Thực hiện quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase 2,5L với nồng độenzyme, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH và tỷ lệ rắn/lỏng như Bảng 3.1 Chỉnh pHbằng NaOH IN Cứ 10 phút vortex 1 lần trong 30 giây Sau mỗi thí nghiệm, bat hoạtenzyme bang cách nâng nhiệt độ lên 90°C trong 5 phút Mau ở mỗi thời điểm thủy phân

đã bất họat enzyme, kết thúc quá trình thủy phân thì được trữ lạnh dé xác định hàm

lượng đạm tổng, đạm amin, hiệu suất thủy phân của mẫu.

3.3.3 Đánh giá hiệu lực phân bón sinh học lên cây rau ăn lá quy mô phòng thí nghiệm

khay và tưới âm đê đảm bảo điêu kiện cho hạt nảy mâm.

3.3.3.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thứclặp lại 5 lần Nghiệm thức đối chứng được bố trí chỉ sử dụng nước dé tưới (đối chứng

với các nghiệm thứ còn lại sử dụng phan bón lá) Các nghiệm thức còn lại: NT1, N12,

NT3, NT4, NT5 được bồ trí canh tác sử dụng phân bón lá từ dịch thủy phân xác ruồilính den theo các mức nồng độ tăng dan, lần lượt là 0,1 %; 0,3 % 0,5 %; 0,7 % và 1 %

dịch thủy phân so với nước không sử dụng phân bón hóa học.

Các nghiệm thức được bồ trí như Bảng 3.2

Bang 3.2 Nghiệm thức bố tri dé đánh giá hiệu lực dich thủy phân

Nông độ dung dịch thủy phânNghiệm thức Giá thể ,

3.3.3.4 Chăm sóc cây sau bồ trí thí nghiệm

Chăm sóc: Các ô thí nghiệm được phun nước đối chứng cũng như tưới dịch thủyphân xác ruôi lính đen với các nồng độ tăng dan theo từng nghiệm thức hằng ngày Tướinước đồng đều 18 ml cho mỗi chậu thí nghiệm vào 8 giờ sáng và tưới dịch thủy phânvào buổi chiều 16 giờ Thời gian thí nghiệm kéo dài 40 ngày

Bảo vệ thực vật: không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sau hóa học trongthí nghiệm Phòng trừ sâu hại bằng biện pháp theo dõi và bắt sâu bằng tay

3.3.3.5 Các chỉ tiêu theo dõi

Sau khi kết thúc thời gian thí nghiệm, các chỉ tiêu được tiến hành theo dõi trên cây

cải như:

24

Chiều cao cây (cm): chiều cao của cây được tính từ cổ rễ đến đỉnh của lá cao nhất.

Số lá: số lá được đếm và chỉ tính những lá đã thấy cuống lá

3.4 Phương pháp phân tích mẫu

Xác định độ ầm theo TCVN 4048:2011

Xác định hàm lượng tro khoáng theo TCVN 5105:2009

Xác định protein theo phương pháp KJeldahl

Xác định hàm lượng axit humic và axit fulvic theo TCVN 8561:2010

Xác định hàm lượng chất hữu cơ theo TCVN 9294:2012

Xác định hàm lượng Canxi — Magie theo TCVN 12598:2018

Xác định hàm lượng nito axit amin theo TCVN 3708:1990

Xác định hàm lượng photpho theo TCVN 8940:2011

Xác định hàm lượng kali theo TCVN 8562:2010

Xác định hàm lượng natri theo TCVN 8562:2010

Định lượng axit amin bằng máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu

Xác định độ thủy phân (DH) (Silvestre, 2003)

Đạm amin x 100

DH (%) =

Nito tổng

3.5 Phương pháp xử lí số liệu thống kê

Xử ly số liệu thực nghiệm sử dụng phần mềm MS Excel 2019

Phân tích trắc nghiệm phân hạng ANOVA 1 yếu tố bằng phần mềm Minitab 16.Phân tích số liệu thực nghiệm tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 13 được

sử dụng dé phân tích phương sai (ANOVA), tính toán hệ số của phương trình hồi quy

và đề xuất giải pháp cho mô hình tối ưu hóa