Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn cao ethyl acetate EA4 của cây Ruột gà dạng hóng

Quy trình điều chế các cao phân đoạn và cô lập các hợp chất trên cao ethyl acetate của cây Ruột ga dang hong Spermacoce ocymoides Burm.f... Dé đáp ứng nhu cầu đó, việc nghiên cứu tìm ra

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, hướng dẫn từ các thây cô, gia đình vả bạn bè.

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn

Thị Anh Tuyết-người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm qui báu

và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện khoá luận Cám ơn cô đã chỉ dạy

em khi em mới chập chững bước vào làm đề tài tốt nghiệp và động viên em nhữnglúc khó khăn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Hoá, khoa Hoá trường Đại

học Sư Phạm Tp.HCM đã giảng day và truyền thụ kiến thức nén tang dé em có thé

vận dụng dé góp phần hoản thiện khóa luận nảy.

Bên cạnh em xin cảm ơn các anh, chị trong phòng thí nghiệm hóa học hợp

chat thiên nhiên đã giúp đỡ em những lúc khó khăn, cùng những người bạn luôn bên cạnh động viên, chia sẻ niềm vui, nỗi buôn và cho em nghị lực dé hoàn thành khóa

DANH MUC KY HIEU VA CAC TU VIET TAT

brs Mui don rong (broad singlet)

Cc Chloroform

COSY Tuong quan H-H (COrrelation SpectroscopY)

d Mũi đôi (doublet)

dd Mũi đôi-đô! (doublet of doublet)

EA Ethyl Acetate

H Hexane

HMBC Tương quan H-C qua nhiều nỗi (Heteronuclear Multiple Bond

Coherence)

HSỌC Tương quan H-C (Heteronuclear Single Quantum Correlation)

J Hang sé ghép (coupling constant)

m Mii da (multiplet)

Me Methanol

NMR Phê cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm Phân triệu (part per million)

$ Mũi don (singlet)

SKLM Sic Ky Lép Mong

SKC Sắc Ký Cột

t Mii ba (triplet)

ID/2D-NMR 1 chiéu/ 2 chiều-phô Cộng hướng từ hat nhân (One! Two

Dimensional-Nuclear Magnetic Resonance)

DANH MỤC HÌNH ANH

Tên hình

Hình 3.3 Cau trúc hợp chất Q2.

Hình 3.4 Một số tương quan HMBC chính của hợp chất Q2

Hình 3.5 Cau trúc hợp chat so sánh.

DANH MUC BANG BIEU

STT Tên bảng biểu Trang

Bang 1.1 Thanh phan hóa học các loải trong chi Spermacoce

Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Bảng 2.3 Kết quả sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3

Bang 3.1 Dữ liệu phô 'H-NMR và C-NMR của hợp chất

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các cao phân đoạn và cô

lập các hợp chất trên cao ethyl acetate của cây Ruột ga

dang hong Spermacoce ocymoides Burm.f.

DANH MỤC PHỤ LỤCPhu lục 1 Phé 'H-NMR của hợp chat QI

Phụ lục 1.1 Phé ‘H-NMR giãn rộng của hợp chat Q1

Phụ lục 1.2 Phô ‘H-NMR giãn rộng của hợp chất Q1

Phụ lục 1.3 Pho 'H-NMR giãn rộng của hợp chất Q1 Phụ lục 2 Phố !3C-NMR của hợp chất Q1

Phụ lục 2.1 Phố "C-NMR giãn rộng của hợp chat Q1

Phụ lục 2.2 Phô C-NMR giãn rộng của hợp chất Q1Phụ lục 3 Phỏ COSY của hợp chất Q1

Phụ lục 3.1 Pho COSY giãn rộng của hợp chất QI

Phụ lục 7.1 Phô C-NMR giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 7.2 Pho "C-NMR giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 8 Pho COSY của hợp chất Q2

Phụ lục 8.1 Phé COSY giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 9 Pho HSQC của hợp chat Q2

Phụ lục 9.1 Phô HSQC giãn rộng của hợp chất Q2

Phụ lục 10 Pho HMBC của hợp chất Q2

Phụ lục 10.1 Pho HMBC giãn rộng của hợp chất Q2

MDĐTI, acc ix

CHƯƠNG 1 TONG QUAN cccceccesccsessessessecseessesseseesssessessesseesucsecsecsssetsetseeeneeeteesses |

Vi, Mô Gà THỰ VỆ đccoooiniiiioiiiiiiiiitiisssi6110111111111611856658555155155358388856688555555885585858885355 |

1.2 Các nghiên cứu được tính - << 5< xxx HH Tnhh 2

IL2:1;TÁc:dụng Bảo VỆ Ga MAY ::cccinttiiiii01011131351313130111133353588333563333531395353373833355833 2

1.2.2.Tác dụng khang viêm HH ng ng 2

1.2.3.Tác dụng kháng ký sinh trùng và chống oxi hóa - . -cs2 2

1.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học -255225c27scczccrxerrrxrcrrecccscee 3BB: CODA :iosiistsstiitiitiitntists1311313313015551363855556358158158568568583553358918565588563858553581561585585688835533 3

Pace LOCOS Cea THỊ a Ce) LO eee 13

Dl, Far Ritts (RMAC Bf sscaesssasessnessssesscsnctssgnanscsesansusssisapesssenesssassssniesestsacasssszs 13

DDN) FROM CHING aasssssscassssssssossssssesvensssassussaissicanosssscsnosasssunnssssisannassaaiunaaasiiasimasssia 13

BOND IEHIEUĐ]Li:1610655055116010000060011738119160021111000116105)1830000001111001901135053110000001631910103 13

D203: iPDiữdngpháp:iEnlHANTissscesicoinitoobeiiiiibiiiitiitiiigi406041305380450330346 14

2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp Chat cccsssesssesssessessessseeesveessessnesees 14

2.1.3.2 Phương pháp xác định cau trúc hoá học các hợp chất 14

8`2:.ThulBäi/VAfllý PÌẾNc:.::coocccccnbicec:c6010021100000620606212006632161480026600223063258338232022236385 14

513.1 lie00Ile 080)105Ì/G8fftssrntcpcatstoreeeap300027910170t2034200568011300984481749222312033907401837x4E2221 14 2.4 Phân lập một sô chất hữu cơ trong cao cthyÌ acefat€ - cccsccscc5sc55c: 15

2.4.1 Phân lập hợp chat hữu cơ ở phân đoạn EA4 -5 -5- l6

2.4.2 Phân lập hợp chat hữu cơ ở phân đoạn EA4.3 -ccc- 17

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ THAO:LUAN ississsssscsssssvsssssvssssssssssasssssssasssssosssessssose 19

3:lI Khảo sát cẫu:trúe hợp CHA OM acsccsssscsssissssanssssucosssssadsascassassnccsanssidipoasonassaoess 19

3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chat Q2 -¿cs+cxecxscczzcCxecrxerrkerrxerrsercseee 23 KET LUẬN VA ĐÈ XUTT 6c 2 6 2552211221117211122112211110111121112 2x22 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined

MO DAU

Xã hội ngày càng phát triển, mức sống con người ngày một nâng cao nênnhu cầu chăm sóc sức khỏe con người dang là một trong những việc quan trọnghàng đầu Dé đáp ứng nhu cầu đó, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tinh

sinh học cao có trong các loài cây cỏ đã và đang là vấn dé quan tâm của toàn xã

hội Trên tinh thần đó, nhiều quốc gia trên thé giới, trong đó có Việt Nam, đã cónhiều công trình nghiên cứu xác định thanh phần hỏa học va cô lập được nhiềuhợp chat có hoạt tính kháng khuẩn, chong ung thư góp phần vào sự phát triểncủa nên y học

Chi Spermacoce (thuộc họ Rubiaceae) có khoảng 280 loài phân bỗ ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Âu [1,2] Một SỐ loài của các chi nay có vai trò quan trọng trong y học cô truyền dùng dé điều trị sốt

rét, tiêu chảy, các van dé tiêu hóa, bệnh ngoài da, sốt xuất huyết, nhiễm trùng

đường tiết niệu và đường hô hap, dau đầu, viêm mat và nướu răng [2]

Cây Ruột gà dạng hong (Spermacoce ocymoides) là cây thuộc chỉ

Spermacoce xuất hiện ở nhiều tinh của nước ta: Thừa Thién-Hué, Đà Nẵng (Tourane), Kon Tum (Đác Giây, Đác Món; Kong Plóng, Tân Lập), Lâm Đông

(Đức Trọng, Bao Lộc), Đông Nai (Biên Hòa), Bà Rịa-Vũng Tàu (Núi Dinh) Theo

y học cô truyền, cây Ruột gà dang hóng được sử dụng chữa dau đầu, nam da, eczecma, vét loét, hắc lào Tuy nhiên các công trình nghiên cứu về thành phan

hóa học của cây Ruột gà đạng hóng còn rat it Chính vì vậy ma cây Ruột ga danghóng được chọn trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn caoethyl acetate EA4 của cây Ruột gà dạng hóng” với mong muốn lam rõ thêm

thành phan hóa học, từ đó hiểu thêm vẻ tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp

những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho được liệu của Y hoc dan tộc Việt

Nam.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Mô tả thực vật.

Tên khoa học Spermacoce ocymoides Burm.f.

Thuộc ho: Ca phê (Rubiaceae), chi: Spermacoce.

Spermacoce ocymoides Burm.f được phân bó rộng rãi ở vùng nhiệt đới va

cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Phi và châu Á [2] Ở Việt Nam cây phần bố ở Thừa Thién-Hué, Da Nẵng, Kon Tum (Dac Giây, Dac Món, Kong Plóng, Tân

Lập), Lâm Đồng (Đức Trọng, Bảo Lộc), Đồng Nai (Biên Hoa), Bà Rịa-Vũng Tau

(Núi Dinh).

Cây còn có tên khác là Borreria ocymoides (Burm.f.) DC [1].

Ở Việt Nam cây được biết đến dưới tên gọi Ruột gà dạng hóng.

Cây Ruột gà là một loại thảo mộc hàng năm, thân cây dựng lên hiểm khi

năm sat mặt đất Cây tương đối dé dàng dé phân biệt với các loài khác với lá hình

clip rộng, không có lông hoặc với lông rai rác trên mạch dudi lá và lề Cây

thường ra hoa từ thang 3-8 hang năm Cây thường được tìm thay ở các dongbăng, dat đọc theo đưởng, sườn đồi và ngoạt vi rừng của các vùng nhiệt đới, cậnnhiệt đới như: Châu Phi nhiệt đới, Mauritius, Án Độ, Myanmar, Java, bán đảo

Malaysia và Philippines [2].

Cây Ruột gà dạng hóng có thân mọc sát mặt đất Lá nhỏ, với chiều dai

khoảng 3 cm, chiều rộng từ 5 đếm 12 mm Qua dang quả nang, mọc từ đài hoa có

4 thuỳ, luôn luôn nằm ở đỉnh Hoa có mau trắng, kết thành cum, đường kính

2.5-6 mm, cánh hoa dài hơn nhiều so với ống Nhuy nhô ra nhưng ngắn hơn nhiều so

với cánh hoa [1].

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Spermacoce ocymoides Burm.f,

1.2 Các nghiên cứu được tính

1.2.1.Tác dụng bảo vệ đạ dày

Năm 2009, CN Okwuosa vả cộng sự đã nghiên cứu trên lá của cây

Spermacoce ocymoides Burm.f cho thay dịch chiết nước và dịch chiết methanol

từ lá ở nông độ §00 mg/kg có tác dung lam tăng khả năng vận động da day từ

6.1% đến 22.5% Thuốc nhuận tràng bisacody] (Smg/ kg) có tac dụng làm tang

khả năng vận động của da day thêm 17.4% Nếu ding kết hợp bisacodyl (5

mg/kg) với dich chiết nước hoặc dịch chiết methanol, kha năng vận động của dạ

day tăng lên dang kế ở mức 67.8% -70.1% Ngoài ra dich chiết nước và dich chiết methanol còn thể hiện kha năng chong loét da dày 89.0-95.8% có thé xem

như tương đương với kha nang bảo vệ loét của cimetidine (96.9%) [3].

1.2.2.Tác dụng kháng viêm

Năm 2011, R Sundhararajan và V Ravichandiran đã tiến hành nghiêncứu hoạt tính kháng viêm trên toản bộ cây Spermacoce ocymoides Burm.f vớidịch chiết n-hexan, cthyl acetate va cthanol được thử nghiệm trên chuột bị gây

viêm bởi carrageenan, chất đối chứng dương là indomethacin Kết quả khi thir

nghiệm với liều lượng 100-200 mg/kg thé trọng chuột cho thay dịch chiết ethanol

thé hiện hoạt tính kháng viêm đáng ké hơn so với dich chiết n-hexane và ethyl

acetate, cụ thé phan trim ức chế của các dịch chiết ethanol, ethyl acetate, hexane lần lượt là 56.01; 16.70;10.84% và cua chất đối chứng đương là 80.84%

n-(với liều lượng 10 mg/kg) [3]

1.2.3.Tác dụng kháng ký sinh trùng và chống oxi hóa

Năm 2016, Sunday Adeleke Adesegun va các cộng sự đã nghiên cứu kha

năng chong sot rét va chong oxy hóa của các địch chiết methanol, z-hexane,

dichloromethane, ethyl acetate và nước [4].

Kết qua cho thay rằng, dich chiết có tác dung chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei NK65 Cụ thé khi thir nghiệm các dich chiết trên ở nông độ

250 và 500 mg/kg với chất đối chứng đương chloroquine (10 mg/kg) kết qua chothấy rằng dịch chiết ethyl acetate có tac dung ngăn chặn ký sinh trùng cao nhất là

87.31% (ở nông độ 250 mg/kg), của chất đối chứng đương là 95.45% [4].

Ngoài ra, dịch chiết methanol được thử nghiệm về kha năng chong oxi

hóa với phương pháp bắt gốc tự đo DPPH, chất đối chứng đương là vitamin C

Kết quả cho thấy dịch chiết methanol thể hiện tác dụng chong oxi hóa với

ICsy=1.85 mg/ml [4].

1.3 Các nghiên cứu thành phần hóa học

Nam 2013, M Jeyachandran và cộng sự đã thực hiện các phản ứng định

tính một số nhóm hợp chat có trong S ocymoides thu hái ở Alwarkurichi (AnĐộ) Các nhóm hợp chất được phát hiện bao gồm: Steroid, đường khử, phenolic,saponin vả tannin [5].

Do các nghiên cứu vẻ thành phan hóa học trên cây Ruột gà dang hóng còn

ít nên chúng tôi xin trình bày thành phần hóa học của một số cây cùng chỉ (bảng

Linolcic acid (61),

Stearic acid (64),

histidine, isoleucine,leucine, lysine, methionine,

phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine, valine, Galactose, glucose, mannitol, protein.

Cariophyllene (36),

Gulaene (40),

13 R= OH, R: = OAc, Ra = z-OH

14R=Ri =OH, Ra =f-OAc

16 R= OMe, R; = OAc, R2 =z-OH

18 R=Ri = OH, R› = z-OH

19 R = OMe, R: = OH, R2 = /-OH

23 R = OH, Rị = OMe, Rạ = z-OH

2§ 5.7.4 -OH, 3-0 /-p-Glc 26 3.5.7,4'-OH, 3-OMe

27 5.7.4'-OH, 3-Ó-/-p-Glc 28 5,7.4'-OH, 3-O-Rut

35 3/-OH,R=Mce 43 3/-OH, R=Et

37 3/-O-Glc,R =EL 44 3/-OH, R = Et, A*

© Silica gel: silica gel 60, 0,040-0,063 mm, Án va Merck dùng cho cột

© Sắc kí bảng móng loại 25DC - Aflufolein 20x20, Kiesel gel 60F;s«¿,

Merck,

¢ Sắc kí bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.

¢ Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethanol,

chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước cắt

e Thuốc thứ hiện hình các vết chat hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng acid

sulfuric 20%,

2.1.2 Thiết bị

© Các thiết bị dùng dé giải ly dụng cụ chứa mẫu

e Cac cội sắc ki

e May cô quay chân không Heidolph.

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phô cộng hưởng từ hạt nhân: !H-NMR (500 MHz), C-NMR (125 MHz),

2D-NMR tại Phòng NMR, Viện Hóa Học, Viện KH-CN Việt Nam, số 18 Hoảng

Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội và Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Dại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hỗ Chí Minh.

2.2 Thu hái và xử lý mẫu

Cây Ruột gà dang hóng Spermacoce ocymoides Burm.F, họ Cà phê

(Rubiaceae) được thu hai tại Long An yao năm 2016 được định đanh boi TS.

Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học nhiệt đới.

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phan sâu bệnh, phơi khô trong bóng ram, rồi xay thành bột mịn Bột này được sử dụng dé điều chế các loại cao.

2.3 Điều chế các loại cao

Các bộ phận cây Ruột gà dạng hóng (Spermacoce ocymoides) như rễ,

thân, lá được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối

Chaét lỏng-lỏng lần lượt với m-hexan

ethyl acetate

ở quay thu hồ: dung mdi.

(90.2 g)

lượng không đôi

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate.

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 96° bằng phương pháp ngâm

đầm, lọc vả cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô Cao ethanol thô được chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexane vả ethyl acetate, thu

được cao hexane va cao ethyl acetate Quá trình thực hiện được tom tat theo sơ

đồ 2.1,

2.4 Phân lập một số chất hữu cơ trong cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate của cây Ruột ga dang hong (98.5 g) được SKC silica gel

lan lượt với các hệ dung môi H-EA có độ phân cực tăng dan (20-40% EA), tiếp

sau là hệ dung môi EA-Me (5—20%) và 100% Me Dịch giải ly qua cột đượchứng vào các lọ Theo đối quá trình giải ly bằng SKLM Những lọ cho kết quả

SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết qua thu được 9

phân đoạn kí hiệu từ EAI-EA9 Kết quả được trình bảy ở bang 2.1

Bang 2.1 Kết quả sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Sắc kí lớp móng Ghi chú

Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát EA2 H-EA 35:15 10.23 | Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát

phe Geert se Nhiêu vết kéo vệt | Chưa khảo sát

EA-M:e 95:5 Nhiêu vết kéo vét Khảo sátEA-Me 90:10 ! Nhiều vết kéo vệt | Chua khảo satEA-Me 85:15 Nhiều vết kéo vét | Chưa khảo sat

2.4.1 Phân lập hợp chat hữu co ở phân đoạn EA4

Kết quả SKLM phân đoạn EA4 (18.03 g) cho nhiều vết có vết tách rõ nên

phân đoạn EA4 được thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải có độ

phân cực tăng dan từ EA-Me 95:5, EA-Me 90:10, EA-Me 84:16, EA-Me 80:20

và Me 100% Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ Theo đỗi quá trình giải

ly bing SKLM Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành

một phan đoạn Kết qua thu được 6 phân đoạn EA4.I-EA4.6, được trình bay

TT me EA-Mc 90:10 1.88 | Nhiều vết kéo vệt | Chưa khảo sát

EA4.3 | EA-Me84:16 3.92 | Nhiêu vết, có vết Khảo sát

tách rõ

EA44 | EA-Me 80:20| 3 + KẾ? | Chưa khảo sat

Kết quả SKLM phân đoạn EA4.3 (3.92 g) cho SKLM nhiều vết có vết

tách rõ nên phân đoạn EA4.3 được chọn dé SKC sillica gel với hệ dung môi rửa

giải EA-Me 80: 20, EA-Me-H:O 80:20:5 và EA-Me-H:O 80:20:10 Kết quá

thu được 6 phân đoạn EA4,3.1-EA4.3.6, được trình bay trong bang 2.3.

Từ phân đoạn EA4.3.3 (0.61 g) của bảng 2.3, tiếp tục SKC silica gel pha

dao nhiều lần với hệ dung môi rửa giải Me-H2O 43:7 thu được hợp chất Q1

(14.51 mg) ở dạng bột mau trắng.

Từ phan đoạn EA4.3.6 (0.29 g) của bang 2.3, tiếp tục SKC silica gel pha

đảo nhiều lần với hệ dung môi rửa giải Me-H2O 40:10 thu được hợp chất Q2

ia ali

EA4.3.S| EA-Mc-H:O | 0.44 | Nhiều vet Chưa khảo sát

80:20:10