Luận văn thạc sĩ Bảo vệ thực vật: Đánh giá khả năng hạn chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long (Hylocereus undatus) của Streptomyces sp

Từ thực tế trên đề tài “Đánh giá khả năng hạn chế nấmNeoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long Hylocereusundatus của Streptomyces sp.” đã được tiễn hành từ tháng 03

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG DAI HỌC NÔNG LAM TP HCM

LẠI THÀNH GIANG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG HAN CHE NAM Neoscytalidium dimidiatum

GAY BENH DOM NAU TREN CAY THANH LONG

(Hylocereus undatus) CUA Streptomyces sp.

LUAN VAN THAC Si BAO VE THUC VAT

Thanh phố Hồ Chí Minh, Thang 11/2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

LẠI THÀNH GIANG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG HAN CHE NAM Neoscytalidium dimidiatum

GAY BENH DOM NAU TREN CAY THANH LONG

(Hylocereus undatus) CUA Streptomyces sp.

Chuyén nganh: Bao vé thuc vat

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG HAN CHE NAM Neoscytalidium dimidiatum

GAY BENH DOM NAU TREN CAY THANH LONG(Hylocereus undatus) CUA Streptomyces sp

LAI THANH GIANG

Hội dong châm luận van:

TS Võ Thị Ngọc Hà Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

PGS TS Nguyễn Bảo QuốcTrường Đại học Nông Lâm TP HCM

TS Phan Công Kiên

Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hồ

TS Nguyễn Thị Hai

Trường Đại học Công Nghệ TP HCM

1

Tốt nghiệp Đại học ngành Bảo vệ thực vật, hệ Chính quy tại Trường Đại học

Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Quá trình công tác: Nhân viên khảo nghiệm thuốc bảo vệ thực vật tại Công tyTNHH Arysta Lifescience Việt Nam từ năm 2019 đến nay

Tháng 09 năm 2019 theo học Cao học ngành Bảo vệ thực vật tại Trường Đại học

Nông Lâm, Thủ Đức, thành phó Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: 300/5D, ấp Tam Đông 2, xã Thới Tam Thôn, huyện Hóc Môn,Thành phố Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0963644499

Email (Fax): gianglaithanh@gmail.com

11

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêutrong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

nào khác.

Học viên

Lại Thành Giang

1V

CẢM TẠ

Lời dau tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đên Ba Mẹ cùng người thân trong

gia đình luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt quá trình

học tập.

Em xin chân thành cảm ơn và tri ân đến Quý Thầy Cô làm việc tại Trường

Đại học Nông Lâm Tp HCM, đặc biệt là Khoa Nông học đã truyền đạt những kiến

thức quý báu dé em có cơ hội tiếp thu va nâng cao trình độ trong suốt thời gian học

tập tại trường.

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện dé em có thé hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng em xin kính chúc Quý Thầy Cô đồi dào sức khỏe, đạt được nhiều

thành công trong công việc và cuộc sông.

Tp HCM, ngày 20 tháng 11 năm 2022

Lại Thành Giang

TÓM TẮT

Bệnh đốm nâu trên thanh long do nam Neoscytalidium dimidiatum gây ra ảnhhưởng nghiêm trọng đến năng suất chất lượng Việc sử dụng liên tục thuốc bảo vệ thựcvật hóa học kiểm soát bệnh sẽ dé lại du lượng trên sản phẩm, gây ô nhiễm môi trường,biến đổi hệ sinh thái Từ thực tế trên đề tài “Đánh giá khả năng hạn chế nấmNeoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long (Hylocereusundatus) của Streptomyces sp.” đã được tiễn hành từ tháng 03 đến tháng 09 năm 2022.Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá được khả năng hạn chế nam Neoscytalidiumdimidiatum gây bệnh đôm nâu trên thanh long của chủng Streptomyces sp

Qua khảo sát bằng phương pháp đồng nuôi cây va đo vòng vô khuẩn trên đĩa

thạch trong phòng thí nghiệm đã xác định được hai chung Streptomyces BT02 và

BT13 có hiệu quả ức chế Neoscytalidium dimidiatum lần lượt là 70% va 68% Địnhdanh hai chủng xạ khuẩn này dựa vào trình tự gen 16S-rRNA cho kết qua làStreptomyces rochei Một thí nghiệm trong điều kiện nhà lưới cũng đã được tiếnhành sau đó, kết quả cho thay Streptomyces BT02 (1%, 2% và 4%) cho hiệu quaphòng trừ bệnh đốm nâu trung bình trên cả ba giống thanh long (ruột đỏ, ruột trắng,ruột tím hồng) và hiệu quả tương đương so với Tetramycin 0,2% Kết quả thínghiệm ngoài đồng cho thấy Streptomyces BT02 12% cho hiệu quả hạn chế bệnhđốm nâu trên cảnh thanh long cao nhất, 41,8% ở 7 ngày sau phun (NSP) lần 5 và44.5% ở 7 NSP lần 6, cao hơn Tetramycin 0,2%

VI

Brown spot on dragon fruit caused by Neoscytalidium dimidiatum affects yield and product quality seriously The continuous use of chemical fungicide will leave residues on the products, causing pollution, changing the ecosystem Stemming from that fact, the project "Evaluating the ability to reduce Neoscytalidium dimidiatum causing brown spot disease on dragon fruit (Hylocereus undatus) of Streptomyces sp." was conducted from March to September 2022 The objective of the study was to evaluate the ability to reduce Neoscytalidium dimidiatum causing brown spot disease

on dragon fruit of Streptomyces sp.

Through investigation by dual-culture assay and agar disk diffusion method in the laboratory, two strains of Streptomyces (BT02 and BT13) indicated inhibitory efficiency of Neoscytalidium dimidiatum 70% and 68%, respectively Identification of BT02 and BT13 based on 16S-rRNA gene sequences resulted in Streptomyces rochei.

A greenhouse trial was conducted, the results showed that Streptomyces BT02 (1%, 2% and 4%) demonstrated moderate performance for control brown spot disease on all three varieties of dragon fruit (red-flesh, white-flesh, purple-pink-flesh) and equivalent efficacy compared to Tetramycin 0,2% The results of field trial showed that Streptomyces BT02 12% gave the highest efficacy for control brown spot on dragon

fruit, 41,8% at 7 days after 5" application and 44,5% at 7 days after 6" application,

higher than Tetramycin 0,2%.

vil

oh er vi

DS EI LIAR csr anes auras ne tt a rls eet tease vil

OC LƯU OP ee ee ee Vili

4 HE CL ICE: TT các ccjcctecccacccceecceoccckilgcccitscolotdildckgi xiDANH SÁCH CÁC BẢNG 2222222222 2222 cc 2 rie xiiDANE MIC CE WIE TAT ưa 77 XIV

Đặt vấn đỀ - + s2 1221 2212112112121121111211222121 2112121121211 211 2121112121 re 1Mục tiêu đề tài - 5 1 2221 2121121221211212112111111211111011012111110121121212112110121 212cc 2YOU CAU AE tL mm 2Giới hạn đề tai ec ceccceeccccssecessesecsesecseceesecsececsecsecsesucsecevsucssesesecsceesecsessesececevseeeeceeeeeeees 2Chương 1 TONG QUAN TÀI LIỆỆU - 2-22 222222 2EE22EE22EE22EE222E222E222Ezzzxree 31.1 Sơ lược về cây thanh long , 2-52 ©5222S2ESzxertetrerxerkererrrerrerserrerrc.re.31.2 Tổng quan về bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum) gây hại trên thanh long 4

21 VỊ trị DHaH loại SG CS c7 00/1 4/2/5755 s97 1/7 v3 4

1.2.2 Những ky chủ của nam Neoscytalidium đimidiafurn 22-55+ 5725555525552: 41.2.3 Đặc điểm hình thái của nắm Neoscytalidium đimidiafuim -5-©5255+ 61.2.4 Triệu chứng gây hại của nam Neoscytalidium dimidiatum trên thanh long 71.2.5 Các điều kiện phát sinh, phát triển bệnh 2- 2-22 2+2£22E22E22E+zEzzzzzxze2 7

1,2:0 Điện phap phone ttt ssascnsuueenn areas enraea ee eee 8

1.2.6.1 Biện phan giẾH cccscccccscsancocsansannaccenusensnncananasnavesesennnmenuseenenmessenancess 81.2.6.2 Biện pháp vệ sinh đồng ruộng 2-2-2522 2E+SE+SE2EE2E22E22E22322322322322222Xe2 8

12.6.3 B1ênDHAT GaN: 186 hung nụ ccncs cr sere er RSIRQISESEHLRRSGINGUAGIGHHEGROBSRSERNSSISSSESi3NNiStENNEikstRd 8

ID 05:0 j0 9 IS? 209i 001 91.2.7 Một số nghiên cứu về nam Neoscytalidium đimidiatuin -5-©52-55+ 10

vill

de ee ee 111.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của Streptomyces trong nông nghiệp 12

PB 11/0 1inx9 140512272772) s70 ốố ốc ốc a Paste sora eee Noa avec tout Fassia ee wate eeeae eee 12 11.2, Trorre nông re Et Spy sce ses was ee eeepc ee eee ee ne 12

Chương 2 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2-52 152.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2-2 2 5S+2E+2E+2E+EE+2E+EEtZEZEZEzEezxezree 15

PÄ) (ÐNo¡ s20 2i0à nh 15 3:3 Vật liệu và dụng cụ tht hPHIÔTÏÌöseesssscsssoxessissnkadoadbisllot4ÄBSSGSSESSLSSBE333g8S880883688.g9.058 15

ST SOUT as SSR es 15

PEA gái Gi C4 ee are 16

2.3.3 MỚI trims Ste Ayn g 11g HI1€H:GITU -‹s-x2:2c2zos22e3azse2s034a55358856E303802~300e314280/1:284/2050220.3E 16

2.4 Phương pháp tiến amb o.oo cece cec ccc cseeesesscssssesseesessessessessssessessessessessessesseeseeseeeee 162.4.1 Khảo sát khả năng ức chế của các chủng xa khuẩn Streptomyces sp vớinam Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh d6m nâu trên cây thanh long 162.4.1.1 Phương pháp cấy kép (dual-culture asSay) -©22©2252222222x22E22xczxzzzxee 172.4.1.2 Phương pháp đo vòng vô khuẩn trên môi trường thạch (Agar dish diffusion) 182.4.2 Định danh xạ khuẩn Streptomyces -2-22+©2222222222222E2222+2EE2E2Excrxsrxee 182.4.3 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh đốm nâu Neoscytalidium dimidiatum bang

Streptomyces BT02 trên 3 gidng thanh long trong điêu kiện nhà lưới 19 25⁄4: 3i.1 PHữñg PHáP KH: Nt so ssscesns ssscasceusmmemennacaremen manera 19 28121152) CHÍ HCU: 66:06 lnssnnnaniisesindeioiisrosgixiE/20TS001088EESESEGHHENGESEIHGOEHURGEAGB-EĐ0008H00GG0803830308 20

2.4.4 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh đốm nâu do nam Neoscytalidium dimidiatum

của xạ khuân BT02 trên cây thanh long ngoai đông - -555<55<++<<<++ 21

2.4.4.1 Bố trí thí nghiệm (TCCS 162:2014/BVTV) ¿©222222222222+22+22xzzxzzzzee 212.4.4.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm (TCCS 162:2016/BVTV) - 222.5 Phương pháp xử lí số liệu - 2 2¿+22+E+2E+2E+2E2E2E22E2212211212212211212222212222 Xe 24Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 22222222 22222222212212222EczErcrrees 253.1 Kha năng hạn chế nam Neoscytalidium dimidiatum của các chủng xạ khuẩn trong

phố THÍ ng hHIŠTTT:zeespcg1t581o2s2sgtSSJSEEISGSISSIIREHSSSEHISG.SSL5)885:31881250583k08320/002EgEgÌBISEỮRg8+SSEEESf 25

3.1.1 Kết qua đồng nuôi cấy - 22 2¿222222+22E122E1222122212221222122212211221E 222 xe 25

1X

SD Wet gua kuilch #8 [it TH BÍ, s.-csesesckcd hoc code trian dụ no.o68n)gtgduiEabosSriindibbbiEssd 283.2 Định danh xạ khuẩn Streptomyces BT02 và BT13 2- 2¿©2+22zc2zzczxee 283.3 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh đốm nâu Neoscytalidium dimidiatum của xa

khuân B102 trên ba giông thanh long trong điêu kiện nhà lưới 293.3.1 Chiều dai cành thanh long -2- 2-5 22+2E2E+SE22E£EE£EE2E22E2E22E223223222222222e2 293.3.2 Tỉ lệ bệnh đốm nâu trên cành thanh long -2- 2 2222++2z222+z2+zzzzz2+zz2 313.3.3 Chi số bệnh đốm nâu trên cành thanh long 2 2222222222z22++2zz22+zz2 333.3.4 Hiệu quả hạn chế bệnh đốm nâu trên cành thanh long của xạ khuẩn BT02 trongđiều kiện nhà lưới + 2 2+S2SS+2E2E21221252122121121221211211121121112112111212111 2121 xe, 353.4 Đánh giá kha năng hạn chế bệnh đốm nâu do nam Neoscytalidium dimidiatum của

xạ khuẩn BT02 trên cây thanh long ruột tím hồng ngoài đồng -2-5- Bi3.4.1 Chi số bệnh đốm nâu trên cành thanh long -2¿2z52z+22++22zz2z++=2++2 373.4.2 Hiệu quả hạn chế bệnh đốm nâu trên cây thanh long của xạ khuân BT02 ngoài

KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, -525222 222tr 42TÀI LIEU THAM KHAO 2: 2-©2222222221222E222122212221222122312211221E222.E ree 43

P.HU2UC.- s «eseeSesseesiieisesbreinudEtoasbrgiTuausgknliusssmsulEoetgnlilbucagsggi0uergonkgJ3ogagirlgusskciiserogBsxi 47

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TRANG

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái nam Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PGA 6

Hình 1.2 Triệu chứng gây hại trên trái chín và trên cành non - 55-5 5-+ tý

Hình 1.3 Cầu trúc của Streptomyces GoccecccciinELgE SiH0SEG0E02KLỂn EU ELEE HU23013U0:G.8 302500 11ERC Geto gc: gl | see««eeeesekeeainoknhrackorercknoogrorkudtfghrndEtLd0nk/E0013E00f006g000300n.g6E 17Hình 3.1 Kha năng ức chế nam Neoscytalidium dimidiatum của 8 chủng xạ khuẩn 26Hình 3.2 Vòng vô khuân ở 2 ngày sau cấy -2-©222+22+222EE+22222E22222A222EEeecrr 28Hình 3.3 Kết quả phân tích di truyền dựa vào trình tự 16S-rRNA bằng phương pháp

€0 — 29

Hình 3.4 Bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 28 NSP -22©525525525522 35Hình 3.5 Vết bệnh đốm nâu trên cảnh thanh long ở lần phun thứ 3 - 40

XI

DANH SÁCH CÁC BANG

TRANG

Bane 231 Tra t Cay POS :oásceesssssssesnio6 gia G50 2nh3H554348889053 t410030008831SIRSSESRSSEBAE-GIGSEES8Vuáug18022E 19 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR - 255-222 222<22x22<2errrrrerree 19

Bảng 2.3 Phân cấp bệnh đốm nâu trên đoạn cành thanh long (TCCS 162:2016/BVTV) 21

Bảng 2.4 Phân cấp bệnh đốm nâu trên đoạn cành thanh long (TCCS 162:2016/BVTV) 23

Bảng 3.1 Khả năng ức chế nam Neoscytalidium dimidiatum của 8 chủng xạ khuẩn 25

Bang 3.2 Đánh giá khả năng ức chế nam Neoscytalidium dimidiatum của 5 chủng xa cme a nl PE LS PTE CIT STEGER 28 Bang 3.3 Chiều dài cành thanh long ở 7 ngày sau phun (em) - 2: 2252552 30 Bảng 3.4 Chiều dài cành thanh long ở 14 ngày sau phun (cm) -2 - 30

Bảng 3.5 Chiều dài cành thanh long ở 21 ngày sau phun (em) -2 5- 30 Bảng 3.6 Chiều dai cành thanh long ở 28 ngày sau phun (em) -2-5z 31

Bang 3.7 Ty lệ bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 7 ngày sau phun (%) 31

Bang 3.8 Tỷ lệ bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 14 ngày sau phun (%) 32

Bang 3.9 Ty lệ bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 21 ngày sau phun (%) 32

Bảng 3.10 Ty lệ bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 28 ngày sau phun (%) 33

Bang 3.11 Chỉ số bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 7 ngày sau phun (%) 33

Bang 3.12 Chỉ số bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 14 ngày sau phun (%) 34

Bang 3.13 Chỉ số bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 21 ngày sau phun (%) 34

Bang 3.14 Chỉ số bệnh đốm nâu trên cành thanh long ở 28 ngày sau phun (%) 34 Bang 3.15 Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm nâu trên cành thanh long của xạ khuẩn BT02 trong điều kiện nhà lưới ở 7 ngày sau phun (%) +-2¿222+2+2£+2E+2EzE+zzzzzzzzse2 36

XI

Bảng 3.16 Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm nâu trên cành thanh long của xạ khuẩn BT02trong điều kiện nhà lưới ở 14 ngày sau phun (%) 2- 2522 522E+2z222+2szxzzzzse2 36Bảng 3.17 Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm nâu trên cành thanh long của xạ khuẩn BT02trong điều kiện nhà lưới ở 21 ngày sau phun (%) -2-22-22c2S222xccxckecrrrree 37Bảng 3.18 Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm nâu trên cảnh thanh long của xạ khuẩn BT02trong điều kiện nhà lưới ở 28 ngày sau phun (%) -2 222 2222++2x+2zz22xzzxzzzxeex 37Bảng 3.19 Chỉ số bệnh (%) đốm nâu trên cảnh thanh 5 39Bảng 3.20 Hiệu quả hạn chế bệnh đốm nâu trên cành thanh long của xạ khuẩn

DO) 2 sugBRoiodugfostrclgikttdbsfedbrsl,SPynvfEverftBiEbidnetemsbsbozffndsrfeckkobrSt,gEninfsu/EoikeBozEtrDnsEgercbupBrDEnEbufszE, 41

XI

DANH MỤC CHU VIET TAT

DNA: Deoxyribo nucleic acid

PDA: Potato Dextrose Agar

G1: Gause I

PGA: Potato Glucose Agar

rRNA: Ribosomal Ribonucleic Acid

PCR: Polymerase Chain Reaction NT: Nghiệm thức

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Cây thanh long là loại cây nhiệt đới, có giá trị kinh tế cao được trồng khá phổbiến ở một số tỉnh miền Nam Việt Nam, chủ lực tại Bình Thuận, Long An, TiềnGiang và Tây Ninh Ước tinh 80% sản lượng thanh long được xuất khâu tới 40 quốcgia và vùng lãnh thổ trên thế giới trong đó có các thị trường khó tính như Mỹ, Châu

Âu, Nhật Bản

Cùng với sự gia tăng về diện tích, tình hình dịch hại trên cây thanh long diễn

ra ngày một nghiêm trọng Trong đó, đốm nâu là một trong những mối quan tâmhàng đầu của bà con nông dân, đặc biệt trong mùa mưa với điều kiện thời tiết âmướt, độ âm không khí cao Hiện nay do chưa có thuốc đặc trị nên đốm nâu gây ảnhhưởng nghiêm trọng đến sự phát triển cũng như tới năng suất cây thanh long, mấtgiá trị thương phẩm

Hầu hết nông dân hiện nay sử dụng các loại thuốc hóa học để hạn chế bệnhđốm nâu trên thanh long vì hiệu quả tương đối cao Tuy nhiên việc sử dụng liên tụcthuốc bảo vệ thực vật hóa học sẽ gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏengười sử dụng và đặc biệt là dé lại dư lượng gây khó khăn trong việc xuất khẩu Với

xu thế phát triển nông nghiệp theo hướng hữu cơ, đáp ứng yêu cầu của các thị trườngkhó tính thì nhiều sản phẩm thuốc trừ bệnh có nguồn gốc sinh học đã ra đời tuy nhiênhiệu quả vẫn chưa cao Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra một sản phẩm sinh học cóhiệu quả cao trong hạn chế bệnh đốm nâu trên thanh long là rất cần thiết trong xuhướng phát triển của nền nông nghiệp thế giới hiện nay

Streptomyces là vi khuân gram dương có khả năng phòng trừ các loại nam, vikhuẩn gây bệnh trên cây trồng, tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng Streptomycesphòng trừ bệnh đốm nâu trên thanh long vẫn còn hạn chế

1

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Đánh giá khả năng hạn chế nắmNeoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long (Hylocereusundatus) của Streptomyces sp.” đã được tiễn hành.

Mục tiêu đề tài

Đánh giá khả năng hạn chế nam Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh dém nâutrên thanh long của các chủng Streptomyces sp nhằm áp dụng trong quản lý bệnh hại

cây trông.

Yéu câu đê tài

Xác định được kha năng hạn chế nắm Neoscytalidium dimidiatum của các chủngStreptomyces sp trong phòng thí nghiệm, từ đó xác định được loài có hiệu quả cao déphục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

Từ kết quả trong phòng thí nghiệm, xác định được mật số của chủngStreptomyces sp phù hợp có khả năng hạn chế được bệnh đốm nâu trên 3 giống thanhlong (ruột đỏ, ruột trắng, ruột tím hồng) trong điều kiện nhà lưới

Từ kết quả thí nghiệm trong điều kiện nhà lưới, tiếp tục xác định mật số và liềulượng của Streptomyces sp có khả năng hạn chế bệnh đốm nâu ngoài đồng ruộng

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ tập trung đánh giá khả năng hạn chế bệnh đốm nâu do nắm

Neoscytalidium dimidiatum trên thanh long của các chủng Streptomyces sp được cung

cấp từ phòng Sinh học ứng dụng thực vật trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới

và dong ruộng.

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây thanh long

Cây thanh long (Dragon fruit, Pitahaya) có nguồn gốc ở vùng sa mạc thuộcMexico và Colombia Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trên

100 năm nay, nhưng mới được trồng rộng rãi từ thập niên 1980 (Nguyễn Văn Kế,1997) Theo Mizrahi và Nobel (1997) có hơn 250 loài xương rồng được trồng như lànhững cây ăn trái Các loài này xuất phát từ 35 đến 40 giống khác nhau nhưng khôngphải tat cả đều có cùng giá trị kinh tế, trong đó giống Hylocerus có 4 loài: Hylocereus

trianlaris Britt va Rose, Hylocereus undatus Britt và Rose, Hylocereus ocamposis Britt va Rose, Hylocereus trigonus Saff.

Thanh long Việt Nam là loại thanh long ruột trắng, năm 1995 Viện cây ăn quaMiền Nam đã nhập về 2 giống thanh long ruột đỏ và thanh long ruột vàng để nghiêncứu Qua kết quả khảo nghiệm, giống thanh long ruột đỏ có một số ưu điểm như: khảnăng ra hoa mạnh và kéo dai, phâm chất ngon, thịt trái màu đỏ đẹp Tuy nhiên giốngnày có khuyết điểm là khả năng thụ phan tự nhiên rất kém, trái nhỏ và hình dang tráikhông đẹp Vì vậy đến năm 1997, các nhà khoa học của Viện cây ăn quả Miền Nam đãtién hành tạo các tổ hợp lai cải thiện nhược điểm của các giống này Đến năm 2000 đãtuyển chọn được 12 con lai triển vọng và nhân giống khảo nghiệm tại các tỉnh BìnhThuận, Long An và Tiền Giang

Năm 2004, Viện cây ăn quả Miền Nam đã tuyên chọn được giống thanh longruột đỏ Long Dinh 1 Đến năm 2005, giống này đã được Bộ Nông nghiệp và PTNTcông nhận giống tạm thời và cho phép đưa vào sản xuất tại các tỉnh phía Nam

Năm 2009, Viện cây ăn quả Miền Nam đã chọn lọc và tiến hành lai hữu tinhgiữa giống thanh long ruột đỏ Long Định 1 và giống thanh long ruột trắng Chợ Gạo.Sau thời gian đánh giá chất lượng quả tập đoàn con lai và dòng lai thanh long có triểnvọng trồng khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng, nhóm đã cho ra đời giống thanhlong ruột tím hồng Long Định 5 đầu tiên tại Việt Nam

1.2 Tổng quan về bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum) gây hại trên thanh long

1.2.1 Vị tri phan loại

Nam Neoscytalidium dimidiatum thuộc:

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

Nam Neoscytalidium dimidiatum còn có tên gọi khác là Hendersonula

toruloidea (Nattrass, 1933), Nattrassia maniferae (Sutton và Dyko, 1989), Fusicoccum dimidiatum (Farr va ctv, 2005).

1.2.2 Những ky chủ của nam Neoscytalidium dimidiatum

Nam Neoscytalidium dimidiatum phân bố địa lý và có ký chủ khá rộng N.dimidiatum được ghi nhận như một tác nhân gây bệnh đốm cành trên xoài và một sốcây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới khác ở Hy Lạp (Nattrass, 1933) Ở Mỹ, N.dimidiatum gây bệnh trên cây thuộc họ đỗ quyên, họ dé, họ cam quýt, ho si, họ chuối,

họ dương, họ mận mơ, họ đào lộn hột, hoàng đàn (Farr và ctv, 1989) Ở Oman,Elshafie và Ba-Omar (2001) ghi nhận được N dimidiatum gây bệnh trên bồ kết tây

(Albizia lebbeck), phượng vy (Delonix regia), cây sung (Ficus carica), Ficus spp., cây

lim (Peltophorum spp.) và tra bồ dé (Thespesia populena) O Australia, N dimidiatum

4

gây hại trên cây bao bap (Adansonia gibbosa), cay keo (Acacia synchronica), cay lục lac đỏ (Crotalaria medicaginea), Grevillia agrifolia, xoài (Mangifera indica) va cây sung (Ficus carica) (Pavlic va ctv, 2008).

Ezra va ctv (2013) ghi nhận bệnh thối đen quả thanh long (internal black rot)tan công đầu tiên vào năm 2009 ở Israel va gây thiệt hai nặng nề cho nhiều vườnthanh long với tỷ lệ gây hại trên quả lên đến trên 50% Kết quả xác định và kiểmchứng tác nhân gây bệnh thối den qua là do nắm N dimidiatum

Chuang va ctv (2012) báo cáo tại Đài Loan vào năm 2009 — 2010 đã bắt đầuxuất hiện bệnh loét (canker) do nắm N dimidiatum gây ra trên cả hai loài Hylocereusundatus (ruột trắng) và H polyrhizus Britt & Rose (ruột đỏ) Kết quả phân lập trên môitrường PDA, quan sát hình thái và sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại với mỗi ITS1 vàITS4 và giải trình tự gene cho kết qua là nam gây hại tương đồng đến 99% với

Neoscytalidium dimidiatum (Penz.) Crous & Slippers.

Tại thành phố Conghua và Yunfu, tinh Quảng Đông (Trung Quốc) xuất hiệnmột loại bệnh hại mới trên cành thanh long đã được ghi nhận với một số đặc điểmnhư: cành bị bệnh có nhiều dém tròn nhỏ có màu nâu nhạt đỏ (Trung Quốc gọi là bệnhđốm nâu), vết bệnh phát triển rất nhanh chóng và gây loét rộng khắp cành Triệu

chứng bệnh cũng tương tự như trường hợp bệnh loét (N dimidiatum) đã từng xảy ra ở Đài Loan Tác nhân cũng được xác định là do N dimidiatum (Penz.) Crous & Slippers

gây ra (Lan và ctv, 2012) Mohd và ctv (2013) cũng đã ghi nhận bệnh loét cành

(canker) đã tấn công và gây hại thanh long (Hylocereus polyrhizus) ở 10 bang ởMalaysia năm 2008-2009 với tỷ lệ gây hai 2 - 42% Tương tự như ở Đài Loan vàTrung Quốc, nam N dimidiatum cũng được chứng minh là tác nhân gây bệnh loét

cảnh thanh long.

Ở Việt Nam, Viện cây ăn quả miền Nam đã thu nhiều mẫu bệnh (80 mẫu) tạiTiền Giang và Long An và mẫu từ Chi cục Bảo vệ thực vật Bình Thuận dé giam dinhtac nhân gây bệnh vào năm 2011 Kết qua phân lập tác nhân trên môi trường PDA,thông qua giám định hình thái và giải trình tự gen từ mẫu phân lập cho kết quả tươngđồng với nam Neoscytalidium dimidiatum đến 100%

5

1.2.3 Đặc điểm hình thái của nắm Neoscytalidium dimidiatum

Soi nâm có màu nâu đên nâu đậm, mịn, dày 2 — 8 pm Bảo tử có màu nâu dénnâu sam, mịn, không có vách ngăn, bào tử có hình trụ (kích thước 4 — 7 x 3 - 8 um)hoặc hình cau, bán cầu (đường kính 5 — 11 um) (Ellis, 1976)

Tan nam có màu trắng xám, xám hoặc nâu đen, không phát triển trên môitrường chọn lọc Sợi nắm phân nhánh có vách ngăn và không có bào tử đính Bào tử

có mau nâu hình chữ nhật, hình vuông, hình bầu dục, hình tròn hoặc hình que, kích

thước 3 —6 x 5 - l5 um Soi nam rộng 6 — 10 pm (Natrass, 1933).

1.2.4 Triệu chứng gây hại của nam Neoscytalidium dimidiatum trên thanh long

Vết bệnh ban đầu là chấm trắng nhỏ, hơi lõm trên bề mặt sau đó lồi lên, chuyểnsang nâu đỏ, liên kết lại thành khối làm hư bề mặt cành và trái thanh long (15 — 20ngày) Bệnh thường xuất hiện gây hại ở bộ phận như: cành non, cành bị thiếu vi lượng,trái non và trái gần chín 1,5 — 2 ngày sau khi mưa hay trời nhiều sương mù Bệnh còntạo điều kiện cho các nắm bệnh khác phát triển như: thối cành, thán thư cành và trái

Hình 1.2 Triệu chứng gây hại trên trái chín và trên cành non (Nguồn: Võ Thị Thu

Oanh, 2014)

1.2.5 Các điều kiện phát sinh, phát triển bệnh

Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa mưa, hại nặng trên cành, lây lan theo chiều ngọn

và gây thối cảnh do bội nhiễm khuẩn Bệnh lây lan trên trái làm giảm giá trị thươngphẩm Bệnh có thể lây lan theo chiều gió và nguồn nước Phát sinh nhiều ở nhữngvườn ít được vệ sinh thường xuyên, những vườn bón phân chuồng chưa hoai, dùngnước đọng đề tưới cho cây, những vườn thanh long bị thiếu vi lượng

Bệnh phát triển nhanh lúc trời có độ âm cao, mây mù và thời gian chiếu sáng ít.Lây nhiễm và biểu hiện ở bộ phận non và cảnh non vừa nhú Thời gian ủ bệnh từ 10 -

15 ngày Vết bệnh biéu hiện ra ngoài khi độ âm không khí > 85%, bề mặt cành va trái

có đọng nước và thời gian ủ tối > 4 tiếng

Nguồn lưu tồn: Neoscytalidium dimidiatum chang những có mặt trên thân,cành, lá, hoa, quả thực vật mà còn tôn tại cả trong đất

1.2.6 Biện pháp phòng trừ

Quy trình quan lý bệnh đốm nâu thanh long (Neoscytalidium dimidiatum) dựatrên nguyên tắc áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (Bộ NN & PTNT, 2018).1.2.6.1 Biện pháp giống

Khi có nhu cầu trồng mới, nên lựa chọn hom giống khỏe từ những vườn thanhlong không bị nhiễm bệnh hoặc mua từ những cơ sở, đơn vị sản xuất kinh doanh câygiống có uy tín

1.2.6.2 Biện pháp vệ sinh đồng ruộng

Thu gom và tiêu hủy triệt để các bộ phận cây bị nhiễm bệnh Tuyệt đối khôngđược vứt bỏ trên mặt líp hay quăng xuống mương nước do mầm bệnh có khả năng tồntai lâu dai trong môi trường tự nhiên và sẽ lây lan khi gặp điều kiện thuận lợi Ô bệnh(vết đồng xu) có khả năng sống xót đến 220 ngày nếu quăng trong vườn

1.2.6.3 Biện pháp canh tác

Vườn trồng phải có hệ thống tiêu thoát nước nhanh khi có mưa to, mực nướcmương nên cách lip ít nhất từ 40 — 50 cm, xẻ rãnh thoát nước tốt nhằm tránh ngập tngcục bộ đối với những vùng có địa hình không bằng phẳng Đối với những vườn trồngmới, cần chú ý đến yêu cầu kỹ thuật trong việc thiết kế vườn trồng để đảm bảo sự bềnvững về lâu đài

Cắt tỉa bớt cành già, cành vô hiệu bên trong tán để tạo điều kiện thông thoáng,giảm áp lực nguồn bệnh lây lan Mức độ cắt tỉa cành tùy thuộc vào tuôi cây và độ dàycủa tán cây, duy trì số lượng cành vừa đủ trên cây khoảng 180 — 220 cành/trụ (tươngứng với mức cắt tỉa 25 — 40% tán cây) (chừa 2 — 3 lớp cành/trụ) đối với vườn ở giaiđoạn kinh doanh ôn định (trên 5 năm tuổi) Tiến hành cắt tỉa cành ở thời điểm sau thuhoạch và trong mùa khô, phun khử trùng vết cắt bằng thuốc BVTV có chứa gốc đồng

Hạn chê việc giữ choi non trong mùa mưa vì bệnh thường tân công và gây hại ở

vị trí 0 — 20 em tính từ đỉnh chỗi trở vào

Tưới nước: không tưới nước cho cây lúc chiêu tôi và ban đêm Tránh sử dụng

nguồn nước ô nhiễm bệnh (quăng cành, quả nhiễm bệnh xuống kênh, ao) dé tưới trựctiếp lên tán cây (tưới qua gốc)

Bón phân: tùy vào loại đất và giai đoạn sinh trưởng của cây nên có chế độ bónphân hop lý, cân đối N, P, K và trung vi lượng Liều lượng bón N, P, K theo công thứckhuyến cáo 750 N — 1250 P2O5 — 1250 K2O g/trụ/năm kết hợp phân hữu cơ hoai mục,hữu cơ vi sinh (>= 10/tân/ha/năm) Hạn chế bón quá nhiều phân đạm khi cây dang ra

chôi non.

Đầu mùa mưa, sử dụng vôi bột bón với lượng từ 0,5 — Ikg/trụ dé cải thiện pH.đồng thời giúp khử trùng đất

1.2.6.4 Biện pháp bao quả

Sử dụng túi nilong trang, túi bao quả chuyên dụng SOFRI DFB 1 và SOFRIDFB 2 để bao quả vào một trong các thời điểm: nụ bông đạt khoảng 14 ngày tuổi hoặc

ở thời điểm sau hoa nở 2 — 3 ngày (sau khi rút râu bông) dé bảo vệ qua trong mùa mưa

và tháo túi bao lúc 3 — 5 ngày trước thu hoạch Nên phun xịt thuốc trừ bệnh theokhuyến cáo trước khi tiễn hành bao quả

1.2.6.5 Biện pháp sinh học

Dé tiêu hủy triệt để cành nhiễm bệnh, có thé sử dụng máy dé băm cành thanhlong, gom thành đống và ủ hoai (ủ nóng trong khoảng 1 tháng đầu, sau đó tiếp tục ủvới Trichoderma, Bacillus amyloliquefaciens, ché phẩm Bio ADB) và tái sử dụng làm

phân hữu cơ.

Sử dụng chế phẩm nam Trichoderma dé xử lý hoai mục phân chuồng, đồng thờicung cấp nguồn vi sinh vật có lợi cho đất

1.2.6.6 Biện pháp hóa học

Thời điểm phòng trừ: thường xuyên kiểm tra vườn để phát hiện bệnh sớm vàphòng trừ kịp thời trong mùa mưa Bệnh thường gây hại nặng nhất vào tháng 8 — 9dương lịch hang năm và các giai đoạn man cảm nhât của cây đôi với bệnh là: dot non

(độ dài 0 — 20 em tính từ ngọn), nụ bông, hoa sau rút râu (quả 2 — 3 ngày tuổi tính từthời điểm rút râu) và quả gần thời điểm thu hoạch

Loại thuốc sử dụng: sử dụng luân phiên các hoạt chất có trong Danh mục thuốcBVTV được phép sử dụng trên cây ăn quả như: gốc đồng, Mancozeb, Propineb,Dimethomorph + Mancozeb, Metiram Complex (tiép xúc), Pyraclostrobin,

Difenonazole, Difenoconazole + Azoxystrobin (nội hap) dé han ché tinh khang thuéc.

Trong mùa mưa, khi cây ra dot non va giai đoạn nụ hoa 1 — 10 ngày tuổi có thé

sử dụng hoạt chất thuốc BVTV có cơ chế nội hấp, lưu dẫn Giai đoạn nụ hoa từ 10ngày tuổi trở về sau — trước thu hoạch, cần sử dụng thuốc có cơ chế tác dụng tiếp xúc,thuốc sinh học có thời gian cách ly ngắn (Propineb, acid ascorbic, acid + acid citric +acic lactic, ) dé đảm bảo an toàn thực phẩm

Liêu lượng, nông độ: theo hướng dân của nhà sản xuât và cân đảm bảo đủlượng nước thuốc khi phun phủ tán cây (300 L/ha)

Lưu ý: đối với vùng trồng thanh long xuất khâu phải tuân thủ theo quy định về

sử dung thuốc BVTV của quốc gia hoặc vùng lãnh thé nhập khẩu

1.2.7 Một số nghiên cứu về nắm Neoscytalidium dimidiatum

Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam (2011) cho rằng rằng bệnh đốm trắng

do Neoscytalidium dimidiatum gây ra Một số tên khác là Scytalidium dimidiatum,Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, Bệnh chủ yêu xuất hiện và tancông mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nắm phát triển từ 20 — 30°C Âm độ

cảng cao cảng tạo điêu kiện thuận lợi cho bệnh tân công và lây lan mạnh.

Theo Võ Thị Thu Oanh và Nguyễn Tuấn Đạt (2014) khi so sánh trình tự vùnggen ITS — rRNA cho thấy các mẫu phân lập bệnh đốm nâu tương đồng rất cao vớitrình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được định danh về hình thái

Theo Sanan va ctv (2021), Bacillus subtilis kết hợp với Natri bicarbonate hanchế bệnh đốm nâu trên cành thanh long thông qua ức chế nam gây bệnh va tao ra các

cơ chế phản ứng phòng vệ

10

1.3 Nghiên cứu về Streptomyces

Theo Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006), xạ khuẩn thuộc lớpActinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 bộ, 35 ho, 110 chi, 1000 loài Riêngchi Streptomyces có hơn 478 loài đã được công bé và hơn 500 loài khác được xếp vàocác chi còn lại, được xếp vào nhóm vi khuẩn hiếm

Theo khóa phân loại Bergey (1974), xạ khuẩn được phân loại như sau:

Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả sản sinh geosmin trongquá trình chuyên hóa các chất Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biếtđến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces)

Hình 1.3 Cấu trúc của Streptomyces

11

1.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của Streptomyces trong nông nghiệp

1.3.1 Vai trò của Streptomyces

Streptomyces thường sông ở trong đất và có vai trò là vi sinh vật phân hủy ratquan trọng Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn Streptomyces làkhả năng hình thành kháng sinh Trong số 8.000 kháng sinh hiện nay trên thế giới thìhơn 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn cóphô kháng khá rộng; là kháng sinh có tinh chất chọn lọc

Khả năng kháng khuẩn của kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phânloại xạ khuẩn Nhiều chủng xạ khuan có khả năng tổng hợp đồng thời 2 hay nhiều

chất kháng sinh có cau trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh

tông hợp kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều chỉnh da gen, ngoài các gene chịutrách nhiệm tổng hợp kháng sinh, còn có các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp các

tiên chât và cofactor.

Một số chủng Streptomyces tiết ra các enzymes phân hủy thành tế bào nam gâybệnh hoặc các hợp chất kháng nắm, và bằng cách đó ức chế sinh trưởng của các nguồnnam bệnh (Nguyễn Thị Kim Cúc và ctv, 2014)

1.4.2 Trong nông nghiệp

Việc sử dụng kháng sinh trong trồng trọt nhằm mục đích như chống lại cácbệnh do nam gây ra trên rau quả và cây trồng, chống lại các bệnh do vi khuẩn gây ra,diệt côn trùng và cỏ dại kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất

So với thuốc hóa học, dùng các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật vừa cótác dụng nhanh, dé phân hủy, có tác dụng chon lọc cao, độ độc thấp không gây 6nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học.Chất kháng sinh và các dịch lên men của các chủng sinh kháng sinh còn dùng xử lýcác hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và bên trong hạt, diệtbệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất

12

Sự đối kháng giữa các vi sinh vật ở trong đất là cơ sở của biện pháp phòngchống bệnh cây Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắcbệnh của cây Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thé ức chế một vài loạinam gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thé ức chế nhiều tác nhân gâybệnh có trong đất.

Không phải tất cả các hoạt tính kháng nấm Jnvitro đều thé hiện trong đất(khoảng 4 — 5 %) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nam gây bệnh

và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là quy luật cân bằng sinh học trong

tự nhiên Nếu sự cân bằng mắt đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có sẵn mầm

gây bệnh.

Xa khuân chong nam ngoài việc tiệt kháng sinh còn tác dụng lên khu hệ vi sinh

vật thông qua các enzyme phân giải Ngoài ra nhiều xạ khuẩn còn tiết ra chất sinhtrưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ vi sinh vật có lợi trong vùng rễ

Năm 2002 tai An Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khảnăng sinh kháng sinh mới là z — methylheptyl iso — nicotinate, chất kháng sinh này

có khả năng kháng được nhiều loại nam gây bệnh như Furasium oxysporum,

Furasium solani

Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm khang sinh trong BVTV nhập khâu

từ Trung Quốc, Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năngchống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum gây bệnh thôi rễ ở thực vật.Tuy nhiên việc sử dụng chat kháng sinh trong lĩnh vực BVTV ở nước ta vẫn còn mức

độ rất thấp do tập quán canh tác đã quen dùng một số hóa chất BVTV nhất định

Kasugamycin (C¡4H2sCÏIN:O¡o) là chất kháng sinh của Streptomyceskasugaensis có khả năng phòng trừ bệnh phấn trắng, bệnh thối dưa chuột, dưa hấu,một số bệnh vi khuẩn và nắm hại chè, cam, chanh, ca chua, khoai tây, đạo ôn, đốmsọc, vi khuẩn hại lúa (Vũ Triệu Mân, 1998)

Năm 2016, Hà Thi Thúy và cộng sự thuộc Viện Môi trường Nông nghiệp dựa

trên phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa đã tìm ra 2 chủng vi sinh vật có khả năng

13

ức chế Neoscytalidium dimidiatum đô là Streptomyces fradiae va Bacillus

polyfermenticus.

Nguyễn Nhu Nhứt va ctv (2019) đã tìm ra một số chủng Trichoderma spp.,Bacillus spp va Streptomyces spp có khả năng đôi kháng với N dimidiatum bang kỹthuật nuôi cấy kép trên môi trường thạch khoai tây

Seham va ctv (2021) đã tim được 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces trong 47chủng được phân lập từ đất vùng rễ của cây phượng vĩ ở Các Tiểu vương quốc Ả RậpThống nhất (UAE) có khả năng đối kháng cao với nam Neoscytalidium

dimidiatum trong điều kiện in vitro.

14

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2022 đến tháng 09/2022 tại phòng thí nghiệm

và nhà lưới Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM và vườn thanh long tại xã Tân Thành, huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An.

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng hạn chế nam Neoscytalidium dimidiatum của Streptomyces

Nguồn nam Neoscytalidium dimidiatum được cung cấp từ phòng Sinh học ứng

dụng thực vật (nguồn nam Neoscytalidium dimidiatum được thu thập tai các vườn

thanh long 6 Tién Giang)

Xa khuẩn Streptomyces sp (7 chủng) được cung cấp từ phòng Sinh học ứng dụng

thực vật.

Giống thanh long: ruột trắng, ruột đỏ, ruột tím hồng

15

Vườn thanh long ruột tím hồng 4 năm tuổi ở xã Tân Thành, huyện Thủ Thừa,

tỉnh Long An.

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm, pipette,

Thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm, máy lắc định ôn, nồi hấp khử trùng, tủ sấy,cân điện tử, tủ cay

2.3.3 Môi trường sử dung nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy nắm PDA (Potato Dextrose Agar) khoai tây 200 g, D —glucose 20 g, agar 20 g, nước cất vừa đủ 1000 ml, hap khử trùng ở 121°C, | atm,

20 phút.

Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:

King B gồm peptone 20 g, glycerol 10 ml, KzHPO¿ 1,5 g, MgSO4.7H20 1,5 g,agar 20 g, nước cat đủ 1000ml hap khử trùng ở 121°C, | atm, 25 phút

Môi trường Gause I long (g/l): tinh bột tan 20 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4.7H2O0,5 g; NaCl 0,5 g; KNO3 0,5 g; FeSO4 0,01 g; nước cat du 1 lit; pH = 7,4

2.4 Phương pháp tiến hành

2.4.1 Khảo sát khả năng ức chế của các chủng xạ khuẩn Streptomyces sp với namNeoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Nam Neoscytalidium dimidiatum được nuôi trên môi trường PDA 2 ngày

Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn Streptomyces sp.: xạ khuân Streptomyces sp được nuôi

trên môi trường King B 48 gio.

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bé trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 7chủng xạ khuan (BT02, BT03, BT08, BT09, BT11, BT13, PB01), mỗi chủng là 1nghiệm thức và 1 nghiệm thức đối chứng không xử lý chỉ chứa nam Neoscytalidiumdimidiatum, 3 lần lặp lại với mỗi lần lặp lại là 3 dia petri

16

2.4.1.1 Phương pháp cấy kép (dual-culture assay)

Theo Huang và ctv (2014): sử dụng que cấy, vạch xạ khuẩn thành 2 đường thắngsong song và cách tâm đĩa 2,5 cm vào đĩa petri có sẵn môi trường PDA Sau đó tiếnhành cấy thạch nam (đường kính 5 mm) vào tâm đĩa petri U ở 28°C, ghi nhận kết qua

sau 24 giờ.

Nêu xạ khuân có kha năng ức chê nam bệnh sẽ thay vùng xung quanh xạ khuânsợi nắm không sinh trưởng hoặc sinh trưởng yếu Còn nếu xạ khuẩn không có khảnăng ức chế sự phát triển của nắm sẽ thấy nắm phát triển bình thường

Xa khuẩn Nam Neoscytalidium

Streptomyces dimidiatum

Hình 2.1 Phương pháp cấy kép (dual-culture assay)

Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nam ở các thời điểm 24, 48, 72 giờ sau cấy

và tính hiệu suất đối kháng theo Vincent (1947)

AE (%) = ((C - T)/C)x 100

Trong đó: AE (antagonistic efficacy) là hiệu suất đối khang, C là đường kính tan

nam ở nghiệm thức đối chứng chỉ chứa nam Neoscytalidium dimidiatum (mm), T là

duong kinh tan nam ở nghiệm thức có chủng xa khuẩn (mm)

Theo đánh giá của Soytong (1988) dựa vào hiệu suất đối kháng đánh giá khảnăng đối kháng như sau: Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng rất cao,hiệu suất đối kháng từ 61 — 75%: có khả năng đối kháng cao, hiệu suất đối kháng 51 —

17

60%: có khả năng đối kháng trung bình, hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đốikháng thấp.

2.4.1.2 Phương pháp đo vòng vô khuẩn trên môi trường thạch (Agar dish

uL dich xạ khuẩn cho vào các giếng trên đĩa nuôi cấy nam

Sau 48 giờ nuôi trong tủ 4m 30°C, xác định vòng ức chế sinh trưởng nam Từ đólựa chọn được chủng xạ khuẩn có hiệu quả ức chế nắm Neoscytalidium dimidiatum

AD = D1 — D2 (mm)

Trong đó: DI: đường kính vòng kháng khuan (mm)

D2: đường kính lỗ (mm)2.4.2 Định danh xạ khuẩn Streptomyces

Từ kết quả chọn lọc xạ khuẩn bằng phương pháp đồng nuôi cấy và đo vòng vôkhuẩn trên môi trường thạch, tiến hành định danh các chủng xạ khuẩn có hiệu quả ứcchế nắm Neoscytalidium dimidiatum,

Dinh danh cac chung xa khuẩn dựa vào trình tự gen 16S-rRNA DNA tông sốcủa xạ khuẩn được tách theo phương pháp của Sambrook và Rusell (2001), đoạngen 16S-rRNA được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp primer 27F và 1492R (Li và

Bang 2.2 Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR

Số chu kì Nhiệt độ (C) Thời gian

công cụ BLAST (www.ncbi.mh.gov) và 16S-based ID (https://www.ezbiocloud.net ).

Phân tích quan hệ di truyền bằng phần mềm MEGAX (Kumar và ctv, 2018)

Các chủng xạ khuẩn Streptomyces sp có hiệu qua ức chế namNeoscytalidium dimidiatum cao sẽ được sử dụng dé thực hiện các thí nghiệm trongnhà lưới và ngoài đồng ruộng

2.4.3 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh đốm nâu Neoscytalidium dimidiatum bangStreptomyces BT02 trên 3 giống thanh long trong điều kiện nhà lưới

2.4.3.1 Phương pháp thực hiện

Hom thanh long ruột đỏ, ruột trắng, ruột tím hồng sạch bệnh giâm trong chậu

đã có cành non đài 20 - 30 em (mỗi chậu 2 cành) Xạ khuẩn BT02 kế thừa từ thí

nghiệm trong phòng thí nghiệm.

Phun 30 ul dd bào tử nam N dimidiatum mật số 10° CFU/ml lên từng cànhthanh long ở từng nghiệm thức vào buổi chiều tối

Sau 1 ngày, phun xạ khuân BT02 với mật số 108 CFU/ml (xem dung dich xạkhuẩn BT02 với nồng độ 108 CFU/ml là 100%, sau đó tiến hành pha loãng dé được cácdung dịch phun 1%, 2% và 4%) và chế pham sinh học Mikcide 1.5AS (Tetramycin)với nồng độ 0,2% lên từng nghiệm thức tương ứng Khi phun bồ sung thêm chất phụgia Visilon dé tăng khả năng bám dính lên bề mặt cành thanh long

19

Các nghiệm thức:

NTI: ruột đỏ nhiễm nắm bệnh

NT2: ruột đỏ nhiễm bệnh phun BT02 1%

NT3: ruột đỏ nhiễm bệnh phun BT02 2%

NT4: ruột đỏ nhiễm bệnh phun BT02 4%

NTõ5: ruột đỏ nhiễm bệnh phun Tetramycin 0.2%

NT6: ruột trắng nhiễm nắm bệnh

NT7: ruột trắng nhiễm bệnh phun BT02 1%

NTS: ruột trắng nhiễm bệnh phun BT02 2%

NT9: ruột trắng nhiễm bệnh phun BT02 4%

NT10: ruột trắng nhiễm bệnh phun Tetramycin 0.2%

NTI1: ruột tím hồng nhiễm nam bệnh

NT12: ruột tím hồng nhiễm bệnh phun BT02 1%

NT13: ruột tím hồng nhiễm bệnh phun BT02 2%

NT14: ruột tím hồng nhiễm bệnh phun BT02 4%

NTI5: ruột tím hồng nhiễm bệnh phun Tetramycin 0.2%

Bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố, gồm

15 nghiệm thức và 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 chậu

Thời điểm phun: phun vào chiều mát, phun ướt đều các mặt của cành thanh long

Xử lý 3 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày

2.4.3.2 Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi tat cả các cành: tỉ lệ bệnh, chỉ số bệnh và chiều dai cảnh thanh long củatừng nghiệm thức ở 7, 14, 21, 28 ngày sau phun (cành bệnh khi số vết bệnh >= 5 vết)

Tỉ lệ bệnh:

Số cành bị bệnh Tổng số cành điều tra 20

Ti lệ bệnh (%) = x 100

Thí nghiệm được bồ trí diện hẹp theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên 1yêu tố, 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức 5 trụ thanh long.

NT 6: phun chế phẩm Streptomyces lydicus 1% w/w SP (Actinovate) 0.072%

2.4.4.2 Phuong phap tién hanh thi nghiém (TCCS 162:2016/BVTV)

Phun lần đầu khi bệnh chớm xuất hiện, phun 6 lần vào buổi sáng hoặc chiềumát, định kỳ 7 ngay/lan

Phun ướt đều trên bề mặt cành thanh long

Chỉ tiêu bệnh hại

Mỗi nghiệm thức theo dõi 3 trụ, mỗi trụ cô định 8 cành theo 4 hướng (mỗi

hướng hai cảnh dài 30 cm trở lên, được tính từ đỉnh cành trở vào) Quan sát và phân

cấp mức độ bệnh trên cả 3 mặt của đoạn cành (điều tra 7 lần, theo đõi và ghi nhận 7ngày/lần tình hình bệnh hai)

Số cành bị bệnh Tổng số cành điều tra

Bảng 2.4 Phân cấp bệnh đốm nâu trên đoạn cành thanh long (TCCS 162:2016/BVTV)

thang lớn và ngược lại, AUDPC được tính bởi công thức:

n=1

du m >, () (ti+1 — ti)

i=1

Trong do: yi: mức độ bệnh ở lân quan trac thứ 1.

yitl: mức độ bệnh ở lần quan trắc thứ i+1

t1-t: thời gian (ngày) giữa hai lần quan trắc liên tiếp

Hiệu lực phòng trừ được tính theo công thức Henderson — Tilton dựa trên chi sốbệnh mới phát sinh so với chỉ số bệnh trước xử lý:

Tax Cb.

TbxCa

E(%) = (1— )x100

Trong đó: E: hiệu lực phòng trừ.

Ta: chỉ số bệnh ở nghiệm thức xử lý thuốc tại thời điểm sau xử lý

Tb: chỉ số bệnh nghiệm thức thức xử lý thuốc tại thời điểm trước xử lý.Ca: chỉ số bệnh ở nghiệm thức đối chứng tại thời điểm sau xử lý

Cb: chỉ số bệnh ở nghiệm thức đối chứng tại thời điểm trước xử lý

23

2.5 Phương pháp xử lí số liệu

Các giá trị trung bình được tính bằng phần mềm Microsoft Excel và xử lý thống

kê ANOVA bằng phần mềm SAS 9.4 Số liệu được chuyền đổi theo quy định trướckhi xử lý thống kê (Gomez và Gomez, 1984)

24

Chương 3

KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng hạn chế nam Neoscytalidium dimidiatum của các chủng xạ khuẩn

trong phòng thí nghiệm

3.1.1 Phương pháp đồng nuôi cấy

Thí nghiệm khảo sát trên 7 chủng xạ khuân, kết quả cho thấy tất cả 7 dòng đều cókhả năng ức chế nam Neoscytalidium dimidiatum từ 54 — 70% (Bảng 3.1)

Bang 3.1 Khả năng ức chế nam Neoscytalidium dimidiatum của 7 chủng xạ khuẩn

1 NSC 2 NSC 3 NSC

Ching

DKTN(cm) HS(%) DKTIN(cm) HS(%) DKTN (cm) HS (%) BT02 = 2,22a+0,32 18 2,70b+0,09 65 2,70b + 0,09 70

PBO1 2,37a+0,45 8 4,17a+0,49 46 4,17a + 0,49 54

ĐKTN: đường kinh tản nam; HS: hiệu suất doi kháng Khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Một ngày sau cấy, đường kính tản nam ở các nghiệm thức đều thấp hơn đườngkính tản nam đối chứng nhưng không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức Sang ngàythứ 2, đường kính tản nấm chủng BT02, BT03, BT09, BT13 có sự khác biệt với chủng

PBO1 Ba ngày sau cấy, các chủng BT02, B103, B109, BT11, BT13 có hiệu suất ức chếcao từ 65% trở lên và khác biệt có ý nghĩa so với chủng PBO1.

25