Nhóm 20 chẩn Đoán bệnh thực vật thứ 5 ca 3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI THÂN, XÌ MỦ TRÊN CÂY MÃNG CẦU TA Annona squamo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI THÂN, XÌ MỦ

TRÊN CÂY MÃNG CẦU TA (Annona squamosa) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP VI SINH KẾT HỢP PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC BẢNG i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu: 2

1.3 Nội dung thực hiện: 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Mãng cầu ta 3

2.1.1 Sơ lược về mãng cầu ta 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Phân bố 4

2.1.4 Tình hình nghiên cứu 4

2.2 Bệnh thối thân trên cây 6

2.2.1 Sơ lược về bệnh 6

2.2.2 Giới thiệu về Phytophthora spp 7

2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh thực vật 8

2.3.1 Thu mẫu 8

2.3.2 Phân lập và tái xâm nhiễm 8

2.3.3 Ly trích DNA 9

2.3.4 Phản ứng PCR 9

2.3.5 Giải trình tự gen 10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Phân lập, làm thuần và tái xâm nhiễm 13

3.2.2 Ly trích DNA bằng phương pháp SDS 15

3.2.3 Xây dựng phản ứng PCR 16

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN 18

4.1 Kết quả phân lập vi sinh 18

4.2 Kết quả ly trich DNA và PCR 18

4.3 Kết quả giải trình tự gen 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần môi trường phân lập nấm 13 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 16 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 16

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Mãng cầu ta (Annona squamosa) 3

Hình 2.2 Cây bị thối thân 6

Hình 2.3 Mô tả ly trích DNA 9

Hình 2.4 Mô tả quy trình PCR 10

Hình 2.5 Giải trình tự bằng phương pháp Sanger 12

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Từ lâu nền nông nghiệp Việt Nam luôn là ngành kinh tế trọng điểm, ảnh hưởngmạnh mẽ và trực tiếp đến sự ổn định và phát triển của Đất nước Trong tình hình hội nhậpquốc tế của Đất nước như hiện nay kết hợp với sự phát triển không ngừng của khoa họccông nghệ, với đặc điểm nền kinh tế mà nông nghiệp đóng vai trò chủ đạo thì việc ứngdụng khoa học công nghệ vào trong sản xuất nông nghiệp đã trở thành vấn đề cần thiết.Với bề dày lịch sử kết hợp với kinh nghiệm trồng trọt của nười dân Việt Nam, người ta đã

áp dụng những phương pháp canh tác tiên tiến để nâng cao năng suất, chất lượng và hiệuquả trong việc trồng cây ăn quả Theo đó, người ta đã ban hành và sử dụng các quy địnhtrong sản xuất nông nghiệp, tiêu biểu là VietGAP

Nền nông nghiệp cây ăn quả ở Việt Nam chiếm tổng diện tích 1.29 triệu hecta(2024) Trong đó các loài cây trồng có giá trị kinh tế cao như: vải, nhãn, cam, bưởi,chuối,… chiếm phần lớn diện tích Mãng cầu ta được trồng rộng rãi ở hai miền Bắc Namnước ta, đặc biệt Tây Ninh là nơi có diện tích trồng mãng cầu ta lớn nhất cả nước và trởthành đặc sản với tên gọi “mãng cầu Bà Đen” Mãng cầu ta phát triển tốt trong điều kiệnnhiệt đới, nhiệt độ thích hợp từ 25 – 30C, ưa sáng và cần lượng mưa phù hợp Tuy nhiênviệc tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của mãng cầu không đồng nghĩa với việccây mãng cầu sẽ luôn tươi tốt, nguyên nhân gây ra việc này là các loài sâu bệnh và dịchbệnh hại cây trồng

Một trong những bệnh gây ảnh hưởng đến mãng cầu nặng nề nhất chính là thốithân, xì mủ Bệnh bắt đầu từ gốc và thân cây với các triệu chứng đặc trưng như xuất hiệnvết thâm đen và chảy mủ làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng vận chuyển nước vàchất dinh dưỡng của cây khiến lá cây nhanh chóng vàng úa, rụng sớm, và quả không thểphát triển bình thường Năng suất của cây mắc bệnh suy giảm nghiêm trọng do quả nhỏhoặc chất lượng kém thậm chí rụng non Nếu không được phát hiện và xử lý kịp thời,nấm bệnh sẽ lây lan dần, phá hủy hoàn toàn hệ thống mạch dẫn, làm cây suy kiệt và chết.Ngoài ra, bệnh có khả năng lây lan rất nhanh thông qua đất, nước tưới hoặc các dụng cụlàm vườn bị nhiễm bào tử nấm, gây nguy cơ bùng phát trên diện rộng, đặc biệt ở nhữngkhu vực trồng tập trung Để phòng bệnh hiệu quả, cần áp dụng các biện pháp canh tác

hợp lý như trồng cây ở vùng đất cao, thoát nước tốt, tránh ngập úng, và cải thiện sức khỏeđất bằng cách bón phân hữu cơ hoặc chế phẩm sinh học Đồng thời, cần thường xuyên vệsinh đồng ruộng, loại bỏ lá rụng, cành khô và tàn dư cây bệnh để hạn chế nguồn lâynhiễm Trước khi trồng, nên sử dụng giống kháng bệnh hoặc xử lý hạt giống bằng thuốcdiệt nấm

1.2 Mục tiêu:

Xác định các tác nhân gây bệnh thối thân, xì mủ trên cây mãng cầu ta Phân lập vànhận diện các vi sinh vật gây ra bệnh, đồng thời phân tích mức độ thiệt hại mà các tácnhân gây bệnh này có thể gây ra đối với cây trồng, từ đó đánh giá sự nghiêm trọng củabệnh Từ kết quả nghiên cứu, có thể tiếp tục nghiên cứu các yếu tố canh tác có ảnh hưởngđến sự phát triển của bệnh đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh hiệu quả,giúp giảm thiểu thiệt hại cho cây mãng cầu ta

1.3 Nội dung thực hiện:

Nội dung 1: Thu thập mẫu vỏ cây bị thối, xì mủ ở thân cây

Nội dung 2: Phân lập, làm thuần và tái xâm nhiễm

Nội dung 3: Ly trích DNA

Nội dung 4: Phản ứng PCR

Nội dung 5: Giải trình tự gene

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Mãng cầu ta

2.1.1 Sơ lược về mãng cầu ta

Hình 2.1 Mãng cầu ta (Annona squamosa).

Loài: Annona squamosa

Tên nhận biết: Na, mãng cầu ta, mãng cầu na, mãng cầu dai, na dai, mãng cầu BàĐen,… Chi Annona thuộc họ Annonaceae, gồm khoaỏng 100 – 170 loài chủ yếu là cáccây hoặc bụi cây nhiệt đới có lá đơn, mọc so le, quả ăn được

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Mãng cầu ta là thực vật lưỡng bội (2n = 14) cây thân gỗ, rễ cọc, sống lâu năm, thâncao, thích hợp sống trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, có nhiều nhu cầu sinh dưỡng Thâncây thường cao khoảng 3 – 5 m chia làm hai kiểu: cây gỗ nhỏ và cây bụi Than câythường có màu nâu xám, nhẵn hoặc hơi nứt Lá cây là lá đơn màu xanh lục, mọc so le trêncành có dạng bầu dục thường dài khoảng 6 – 15 cm và rộng khoảng 3 – 5 cm, bề mặt lá

nhẵn và mềm Hoa lưỡng tính, có ba cánh, có thể dài đến 2.5 cm, màu xanh hoặc vàngxanh, có mùi thơm đặc trưng, mọc đơn lẻ theo chùm nhỏ ở nách lá Mãng cầu thường bắtđầu ra quả khi được 3 – 4 tuổi, quả có dạng hình cầu hoặc hình tim, lớp vỏ ngoài có cácmúi gồ ghề, khi chín quả có màu xanh hoặc vàng nhạt, thịt quả màu trắng Hạt màu nâusẫm đến đen, trong quả thường có khoảng 30 – 40 hạt (Safira và ctv, 2022).

2.1.3 Phân bố

Cây mãng cầu ta có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ vùng Caribe Hiện naymãng cầu ta được trồng nhiều ở các quốc gia có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong

đó có các vùng nông thôn Việt Nam Mãng cầu ta phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Nam

và miền Trung Việt Nam, nơi có khí hậu nhiệt đới, ẩm ướt, rất phù hợp cho sự phát triểncủa cây Tại miền Nam các tỉnh như Tiền Giang, Vĩnh Long, Bến Tre, Đồng Tháp, CầnThơ, Long An, Tây Ninh và Trà Vinh là những nơi trồng mãng cầu ta phổ biến, nhờ vàođất phù sa màu mỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho cây phát triển và cho năng suất cao Ởmiền Trung, một số tỉnh như Bình Định, Phú Yên cũng có trồng mãng cầu ta, mặc dùdiện tích không lớn như ở miền Nam Mãng cầu ta ít phổ biến ở miền Bắc do khí hậulạnh, nhưng một số khu vực có khí hậu ấm như vùng ven biển hay các khu vực thửnghiệm vẫn trồng được cây này Mãng cầu ta không chỉ được trồng để lấy quả mà cònđược trồng làm cây cảnh trong các vườn nhà và vườn cây ăn quả tạo thêm giá trị kinh tếcho người nông dân

2.1.4 Tình hình nghiên cứu

Trong giới khoa học, mãng cầu ta chủ yếu được xem như một cây dược liệu, có rấtnhiều nhà khoa học nghiên cứu về các hoạt chất có bên trong nó và áp dụng trong y sinh.Các nhà khoa học cho rằng tính chất chữa bệnh của cây dược liệu nằm ở sự hiện diện củacác chất chuyển hóa thứ cấp, từ đó họ đã chiết xuất các bộ phận khác nhau của mãng cầu

và phát hiện ra sự có mặt của ankaloid, flavonoid , phenol, carbohydrate, saponin, sterol

và tannin Ngoài ra họ còn thu được các hợp chất như: Annonastatin, asimicin,squamocin, β-farnesene, β-pirene, α-pirene, limorene ở hạt; Alkaloids, roemerine,norisocoryline, rhamnoside, quercetin-3-o-glucoside ở lá; Acetogenins, annoreticuline-

9, annosquamosins A,B cyclopeptides, squamone, squamotacin ở vỏ; Liriodenine,norcorydine, isocorydine, norushinsunine,… ở rễ; Diterpenes ở quả (Vyas và ctv, 2012).Một lần nữa vào năm 2017, Ma và ctv lần nữa khẳng định ứng dụng rộng rãi củamãng cầu khi tìm ra các hoạt chất như ankaloids, diterpene, acetogenin annonaceous,

cyclopeptide và tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây Diterpene phân bố trênnhiều bộ phận khác nhau của cây, trừ hạt và lá, có khoảng 34 diterpene thu được khi phânlập và thu được nhiều nhất là các ent-kaurane diterpene Tương tự, các nhà khoa họccũng thu được 19 loại ankaloids từ lá và thân cây cùng với hơn 100 loại annonaceousacetogenins và 13 loại cyclopeptide (Ma và ctv, 2017) Mãng cầu có thể chống ung thư

do có thể hình thành các gốc tự do và gây ra apoptosis, chống tiểu đường và hạ lipid máudựa trên các chiết xuất của lá mãng cầu và nhiều công dụng khác như chống oxy hóa,giảm viêm và đau, hạ lipid máu, hạ huyết áp, trị sốt rét…

Các bộ phận như lá, quả chưa chín, vỏ cây và rễ được sử dụng nhiều trong y học cổtruyền để điều trị bệnh Lá dùng chữa kiết lị, mụn nhọt, loét; bột quả chưa chín dùng đểdiệt sâu bọ, kí sinh trùng; hạt có vị chát và độc dùng để tiêu diệt chấy rận, làm thuốc trừsâu Vỏ cây có khả năng chống loét dạ dày nhờ chứa O-methylarmepavine, N-methylcorydaldine, isocorydine Vỏ quả chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cótính kháng oxy hóa, kháng khuẩn như flavanoids, glycoside, saponin, tannin, alkaloid,anonain, higenamine, roemerine, noreorydine, norisocorydine, isocorydine,glaucine Có 19 loại alkaloids được phân lập từ mãng cầu có hoạt tính chống tănghuyết áp, chống co thắt, kháng histamine, chống viêm Một số diterpene được phân lập

từ vỏ cây có khả năng chống lại các tế bào ung thư phổi và ung thư buồng trứng; hoạt tínhsinh học chính của annonaceous acetogenins có trong mãng cầu ta chống lại các tế bàoung thư (Trang và ctv, 2021)

Từ các nghiên cứu trên cho thấy mãng cầu không chỉ là một loại cây ăn quả mà còn

là một nguồn dược liệu quý giá với tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học nhờ chứa cáchợp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng Mãng cầu chứa các hợp chất hóa học phong phú,các bộ phận khác nhau của cây mãng cầu (hạt, lá, vỏ, rễ, quả) chứa nhiều nhóm hợp chấtnhư alkaloid, flavonoid, phenol, diterpene, acetogenin, cyclopeptide, và tinh dầu Cáchợp chất này là cơ sở cho các hoạt tính sinh học và tác dụng chữa bệnh của cây Mãng cầuthể hiện một loạt tác dụng sinh học quan trọng như: Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư nhờcác hợp chất như acetogenins, alkaloids, và diterpenes; Các acid hữu cơ và hoạt chấtkhác trong vỏ mãng cầu có khả năng điều chỉnh glucose thông qua con đường tín hiệuinsulin, mở ra tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường; Khả năng chống viêm,chống oxy hóa và giảm đau nhờ các hợp chất như flavonoids, tannin, saponin, vàalkaloid; Giúp phòng ngừa các bệnh tim mạch bằng cách hạ huyết áp và lipid máu; Hạt

mãng cầu chứa hợp chất độc dùng làm thuốc trừ sâu tự nhiên có thể ứng dụng trong diệtsâu bọ và ký sinh trùng Từ đó cung cấp cơ sở khoa học để phát triển các sản phẩm dượcliệu như chất điều chỉnh glucose, thuốc chống ung thư,…

2.2 Bệnh thối thân trên cây

2.2.1 Sơ lược về bệnh

Bệnh thối thân trên thực vật là một trong những bệnh lý phổ biến và nghiêm trọng,gây thiệt hại lớn cho năng suất và chất lượng của nhiều loại cây trồng Bệnh thường donấm ký sinh gây ra, các chi nấm thường gây những bệnh này ở Việt Nam là

Phytophthora, Pythium, Fusarium, Sclerotinia, Sclerotium, Rhizoctonia và Phoma.

Chúng thường tấn công cây qua các kẽ nứt trên thân, cành hoặc rễ hoặc thông qua cácloài côn trùng mang theo các tác nhân gây bệnh từ cây này sang cây khác, làm lây lanbệnh diện rộng trong vườn cây (Burgess và ctv, 2008; Agyemang và ctv, 2020) Khi visinh vật xâm nhập vào cây, chúng nhanh chóng phát triển và phá hủy các mô thực vật,làm cho chúng bị thối rữa, mềm và có mùi hôi khó chịu Triệu chứng bệnh xuất hiện dướidạng các vết thối nhão, có thể kèm theo mủ trắng hoặc vàng chảy ra từ các vết bệnh Cácvết thối này có thể lan rộng rất nhanh, làm cho cây trở nên yếu dần, mất khả năng sinhtrưởng và phát triển, thậm chí dẫn đến cây chết trong thời gian ngắn

Hình 2.2 Cây bị thối thân.

Thối thân thường xuất hiện ở nơi có điều kiện thời tiết ẩm ướt, nhiệt độ ấm và môitrường canh tác không được vệ sinh tốt, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn sinh sôi vàlây lan Bệnh có thể gây hại nghiêm trọng đối với nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai

tây, dưa hấu, ớt,… cây ăn quả như táo, lê và các loại hoa màu khác Tác hại không chỉ ảnhhưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng sản phẩm, khiến giá trị sản phẩm củacây trồng giảm Để phòng ngừa và kiểm soát bệnh thối thân, xì mủ, các biện pháp phòngtrừ cần được thực hiện cùng lúc và kịp thời Một số biện pháp phòng bệnh hiệu quảthường được sử dụng như: Lựa chọn giống cây trồng kháng bệnh, mật độ cây trồng hợp

lý, cung cấp nước cho cây vừa đủ và đảm bảo thông thoáng cho đất trồng Ngoài ra, việc

vệ sinh dụng cụ nông nghiệp, khử trùng hạt giống và xử lý cây bị bệnh bằng thuốc bảo vệthực vật cũng rất quan trọng trong việc hạn chế sự lây lan của bệnh Cần tránh tưới nướctrực tiếp lên thân cây, đặc biệt vào buổi tối, để giảm độ ẩm xung quanh cây Khi cây bịnhiễm bệnh, cần nhanh chóng cắt tỉa các phần bị hỏng, tiêu hủy và xử lý khu vực bịnhiễm để ngừng sự lây lan Các biện pháp sinh học như sử dụng vi sinh vật có lợi hoặcthuốc bảo vệ thực vật an toàn cũng có thể được áp dụng để hỗ trợ kiểm soát bệnh

2.2.2 Giới thiệu về Phytophthora spp.

Tình trạng bệnh thối thân, xì mủ trên cây mãng cầu ở Tây Ninh được cho là do

Phytophthora spp gây ra Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về vấn

đề này cho nên nó vẫn là bệnh “lạ” đối với nông dân Phytophthora là một chi nấm nước

thuộc lớp Oomycota, gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng, đặc biệt trong nông

nghiệp và lâm nghiệp Dù thường được gọi là nấm, Phytophthora thực chất thuộc nhóm

sinh vật giống nấm và có họ hàng gần với tảo hơn Chi này nổi bật với cấu trúc sợi nấmkhông vách ngăn và khả năng sinh sản bằng bào tử di động (zoospore) trong môi trường

nước hoặc đất ẩm Phytophthora gây ra các bệnh phổ biến như thối rễ, thối thân, thối quả, cháy lá và chết cây con Một số loài đáng chú ý gồm P infestans (gây bệnh mốc sương trên khoai tây và cà chua), P sojae (thối rễ trên đậu nành), P palmivora (thối đen trên ca cao) và P cinnamomi (gây chết cây hàng loạt trong các hệ sinh thái rừng)

(O’Brien và ctv, 2009)

Phytophthora lây lan chủ yếu qua sự di chuyển của đất, nước bị nhiễm, dụng cụnông nghiệp hoặc cây giống, gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp toàn cầu Đặc biệt gây hạinhư một nguồn lây nhiễm là những cây bị nhiễm bệnh nhưng không biểu hiện các dấuhiệu triệu chứng vì bệnh vẫn chưa tiến triển đến giai đoạn mà các triệu chứng rõ ràng,hoặc do sự ức chế phát triển các triệu chứng bằng cách sử dụng thuốc diệt nấm Để ngăn

chặn sự lây lan của Phytophthora có thể áp dụng các biện pháp như sử dụng giống kháng

bệnh, cải thiện thoát nước, luân canh cây trồng, dùng thuốc trừ nấm (metalaxyl,