Nghiên cứu phát triển cây Sì to (Valeriana jatamansi Jone) làm thuốc an thần, giảm đau và antistress

 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU W¹X BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÂY SÌ TO (VALERIANA JATAMANSI JONES) LÀM THUỐC AN THẦN, GIẢM ĐAU VÀ ANTISTRESS Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN DUY THUẦN Cơ quan chủ trì đề tài : VIỆN DƯỢC LIỆU 7403 09/6/2009 Hà Nội - 2008 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU W¹X BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÂY SÌ TO (VALERIANA JATAMANSI JONES) LÀM THUỐC AN THẦN, GIẢM ĐAU VÀ ANTISTRESS Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Duy Thuần Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Dược Liệu Cấp quản lý : Bộ Y Tế Thời gian thực hiện : 30 tháng (6/2006 - 12/2008) Kinh phí thực hiện đề tài: 350 triệu đồng (SNKH)  BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: “Nghiên cứu phát triển cây sì to (Valeriana jatamansi Jones) làm thuốc an thần, giảm đau và antistress”. 1. Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Duy Thuần 2. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu 3. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế 4. Danh sách những người thực hiện chính: TT Họ và tên 1 TS. Nguyễn Duy Thuần 2. TS. Phạm Thanh Huyền 3 DS. Nguyễn Kim Phượng 4 DS. Nguyễn Kim Bích 5 ThS. Ngô Quốc Luật 6 TS. Ph ạm Văn Thanh 7 TS. Lê Kim Loan 8 KS. Đinh Văn Mỵ 9 ThS. Nguyễn Chiến Binh 10 ThS. Nguyễn Thị Phương 11 ThS. Ngô Đức Phương 12 ThS. Lê Thanh Sơn 13 ThS. Nguyễn Quỳnh Nga 14 KS. Vũ Thị Tuyết Mai 5. Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 6 năm 2006 đến 12 năm 2008. CÁC CHỮ VIẾT TẮT BTP Bán thành phẩm dd Dung dịch DĐVN Dược điển Việt Nam dl dược liệu PE Polyethylen SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TP Toàn phần MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 1 I. Tổng quan 3 1. Giới thiệu về chi Valeriana L. 3 2. Các nghiên cứu về hóa học 4 3. Các nghiên cứu về dược lý và chế phẩm 7 II. Nguyên vật liệu, địa điểm và phương pháp nghiên cứu 12 2.1. Nguyên liệu, địa điểm và thiết bị dùng trong nghiên cứu 12 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 12 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 12 2.1.3. Thiết bị, hóa chất và động vật dùng trong nghiên cứu 12 2.2. Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu nông học 14 2.2.2. Phương pháp định tính thành phần hóa hoc, chiết xuất và kiểm nghiệm 14 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính 17 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu dạng bào chế 24 2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả 24 III. Kết quả nghiên cứu 25 3.1. Kết quả nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu sì to (Valeriana jatamansi Jones) 25 3.1.1. Khả năng nhân giống bằng phương pháp nhân giống vô tính 25 3.1.2. Ảnh hưởng của mật độ, khoảng cách và phân bón đến sinh trưởng phát triển cây sì to 26 3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ, khoảng cách và phân bón đến các yếu tố cấu thành năng suất sì to 27 3.1.4. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sinh trưởng phát triển cây sì to 29 3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến năng suất dược liệu 31 3.1.6. Tình hình dịch bệnh ảnh hưởng đế năng suất dược liệu …………… ……… 32 3.1.7. Xây dựng quy trình kỹ thuật trồng sì to 32 3.1.8. Triển khai trồng si to từ 2006 – 2008 34 3.2. Kết quả nghiên cứu hóa học, chiết xuất và phân tích kiểm nghiệm … …… 36 3.2.1. Định tính các nhóm chất có trong thân rễ sì to 36 3.2.2. Kết quả định lượng và phân tích tinh dầu 37 3.2.3. Kết quả nghiên cứu về chiết xuất 39 3.2.4. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất BTP-bột “valeseda” … ………. 40 3.2.5. Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu và bột BTP “valeseda” 45 3.2.5.1. Định tính 45 3.2.5.2. Định lượng 46 3.2.5.3. Đánh giá phương pháp định lượng đã xây dựng 48 3.2.5.4. Xây dựng chỉ tiêu đánh giá định lượng của TCCS dược liệu và bột BTP “valeseda” 50 3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính 52 3.3.1. Nghiên cứu tác dụng an thần, giảm đau và antistress 52 3.3.1.1. Tác dụng ức chế hoạt động tự nhiên của chuột 52 3.3.1.2. Tác dụng kéo dài giấc ngủ của thuốc ngủ barbiturat 53 3.3.1.3. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bằng acid acetic 53 3.3.1.4. Tác dụng giảm đau bằng nghiệm pháp đo độ chịu đau bằng tấm nóng của sì to Việt Nam so sánh với bột Valeriane của Pháp 55 3.3.1.5. Tác dụng ức chế quá trình hình thành phản xạ có điều kiện 57 3.3.1.6. Nghiên cứu tác dụng antistress 58 3.3.2. Nghiên cứu độc tính 60 3.3.2.1. Xác định độc tính cấp LD 50 60 3.3.2.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 60 3.3.2.2.1. Kết quả sinh hóa và huyết học 60 3.3.2.2.2. Kết quả xét nghiệm mô học 66 3.4. Nghiên cứu bào chế viên nang Valeseda 72 3.4.1. Nghiên cứu quy trình bào chế 72 3.4.2.Theo dõi độ ổn định của thuốc 73 IV. Bàn luận 75 V. Kết luận và đề nghị 83 Tài liệu tham khảo 85 Phần phụ lục Phụ lục 1: TCCS thân rễ sì to Phụ lục 2: TCCS bột BTP “valeseda” Phụ lục 3: Quy trình bào chế viên nang valeseda 88 93 97  DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Tỷ lệ ra chồi mới của sì to trồng ở Sa Pa và Tam Đảo Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách, phân bón NPK đến sự sinh trưởng và phát triển của sì to sau 12 tháng trồng Bảng 3.3. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách và liều lượng phân bón đến các yếu tố cấu thành năng suất của sì to trồng ở Sa Pa và Tam Đảo Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thờ i vụ đến sinh trưởng phát triển và yếu tố cấu thành năng suất sì to sau 12 tháng trồng ở Sa Pa - Lào Cai Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời vụ đến sinh trưởng phát triển và yếu tố cấu thành năng suất sì to trồng ở Tam Đảo - Vĩnh Phúc Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến năng suất dược liệu sì to Bảng 3.7. Kết quả trồng sì to trong giai đoạ n 2006 - 2008 Bảng 3.8. Kết quả phân tích định tính thành phần hoá học (những nhóm chất chính). Bảng 3.9. Hàm lượng tinh dầu thân rễ sì to thu hoạch năm 2006 Bảng 3.10. Hàm lượng tinh dầu thân rễ sì to thu hoạch năm 2007 Bảng 3.11. Kết quả phân tích tinh dầu bằng phương pháp GC/MS. Bảng 3.12. Nghiên cứu xác định hiệu suất chiết xuất Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu khảo sát chiết xuất trong môi trường kiềm khác nhau Bảng 3.14. K ết quả khảo sát độ pH cần thiết khi trung hòa kiềm. Bảng 3.15. Khảo sát hiệu suất chiết xuất ở quy mô bán pilot Bảng 3.16. Chiết xuất ở quy mô 5kg / mẻ với dược liệu thu ở Sa Pa Bảng 3.17. Chiết xuất ở quy mô 5kg / mẻ với dược liệu thu ở Tam Đảo Bảng 3.18. Xác định khoảng tuyến tính Bảng 3.19: Xác định độ lặp lại Bảng 3.20. Kết qu ả khảo sát định lượng Bảng 3.21. So sánh mức độ giảm hoạt động của các lô thử thuốc với lô đối chứng, với liều uống của các lô = 200 mg bột chiết/kg thể trọng Bảng 3.22. So sánh thời gian ngủ của bột Valeseda và bột "Valeriane" (liều 150 và 200mg bột/kg thể trọng) với lô đối chứng Bảng 3.23. So sánh tác dụng giảm đau của bột Valeseda với lô đối chứng, tham chiếu với bột "Valeriane" Bảng 3.24. So sánh mức độ giảm đau của bột Valeseda với với bột "Valeriane" (%) Bảng 3.25: Thời gian chịu nóng trung bình của chuột ( đ.v: giây) ở các thời điểm khác nhau B ảng 3.26: So sánh thời gian chịu nóng sau khi uống thuốc với trước khi uống thuốc giữa lô chứng với lô thử thuốc và lô tham chiếu Bảng 3.27. Nghiên cứu thời gian để hình thành phản xạ có điều kiện Bảng 3.28. Nghiên cứu thời gian để dập tắt phản xạ có điều kiện Bảng 3.29. Mật độ quang của các lô thử (D) Bảng 3.30. So sánh tác dụng antistress của Valeseda và Valeriane Bảng 3.31. Số chuột sống, chết trong các lô thí nghiệm Bảng 3.32. So sánh các chỉ số sinh hoá và huyết học sau khi uống 15 ngày, 30 ngày và sau khi ngừng uống 15 ngày với trước khi uống (lô uống bột Valeseda với liều 20 mg/kg) Bảng 3.33: So sánh các chỉ số sinh hoá và huyết học sau khi uống 15 ngày, 30 ngày và sau khi ngừng uống 15 ngày với trước khi uống (lô uống bột Valeseda với liều 200 mg/kg) Bảng 3.34. So sánh các chỉ số sinh hoá và huyết học sau khi uống 15 ngày, 30 ngày và sau khi ngừng uống 15 ngày v ới trước khi uống ( lô đối chứng - uống nước) Bảng 3.35. So sánh các chỉ số sinh hoá và huyết học giữa lô đối chứng và các lô thử Valeseda vào các thời điểm: sau khi uống 15 ngày, 30 ngày và sau khi ngừng uống 15 ngày Bảng 3.36. Ảnh hưởng của dược rã đến chất lượng viên nang. Bảng 3.37. Chất lượng viên sau thời gian bảo quản. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Ruộng thí nghiệm trồng sì to Hình 3.2. Thân rễ sì to Hình 3.3. Mầm giống tách từ khóm sau khi thu hoạch thân rễ Hình 3.4. Sắc ký đồ định tính dược liệu và sản phẩm BTP “valeseda” Hình 3.5. Sắc ký đồ định lượng dược liệu (DL), bán thành phẩm (BTP- bột “valeseda) Hình 3.6. Đồ thị xác định khoảng tuyến tính acid valerenic Hình 3.7. Sắc ký đồ đo mật độ (densitometry) tính theo diện tích pic của acid valerenic, bước sóng 500nm Hình 3.8. Sắc ký đồ đo mật độ (densitometry) tính theo di ện tích pic của dược liệu sì to, bước sóng 500nm Hình 3.8. Hình ảnh tế bào gan của thỏ lô chứng, sau 30 ngày uống nước Hình 3.9. Hình ảnh tế bào gan của thỏ lô uống valeseda (20 mg/kg), sau 30 ngày uống thuốc Hình 3.10. Hình ảnh tế bào gan của thỏ lô uống valeseda (200 mg/kg), sau 30 ngày uống thuốc Hình 3.11. Hình ảnh tế bào gan của thỏ lô uống valeseda (20 mg/kg) sau 15 ngày ngừng thuốc Hình 3.12. Hình ảnh tế bào gan của thỏ lô uống valeseda (200 mg/kg) sau 15 ngày ngừng Hình 3.13. Hình ảnh tế bào thận của th ỏ lô chứng, sau 30 ngày uống Hình 3.14. Hình ảnh tế bào thận của thỏ lô uống valeseda (20 mg/kg) sau 30 ngày uống thuốc Hình 3.15. Hình ảnh tế bào thận của thỏ uống valeseda 200 mg/ kg, sau 30 ngày uống thuốc Hình 3.16. Hình ảnh tế bào thận lô uống valeseda 20 mg/ kg, sau 15 ngày ngừng thuốc Hình 3.17. Hình ảnh tế bàothận thỏ lô uống valeseda 200 mg/ kg, sau 15 ngày ngừng thuốc  1  ĐẶT VẤN ĐỀ Valeriana L. là một chi khá lớn, gồm khoảng hơn 200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới ấm và cận nhiệt đới châu Á (Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Thái Lan, Hàn Quốc, Lào ), châu Âu (Đức, Pháp, Áo, Anh, Thụy Sĩ ) và châu Mỹ. Một số loài thuộc chi này đã được sử dụng làm thuốc cách đây ít nhất 2000 năm. Chúng được phát hiện và được sử dụng như là một thuốc an thần, chống co thắt, ch ống co giật cơ bắp, hạ sốt. Valeriana officinalis L. là loài cây thuốc được quan tâm nghiên cứu chi tiết hơn cả. Trong nhiều năm qua, Valeriana officinalis L. luôn là một trong 10 thảo dược có doanh thu cao nhất trên thị trường thế giới, ví dụ: riêng tại Pháp người ta ước tính hàng năm tiêu thụ được khoảng 50 tấn Valeriana officinalis L Bên cạnh đó, ở Trung Quốc, Nhật Bản, Java, Boelman và Ấn Độ, nước sắc từ rễ của hai loài V. hardwickii Wall. và V. jatamansi Jones cũng có tác dụng dược lý tương tự như loài V. officinalis L. ở châu Âu. Hiện nay, các chế phẩm từ V. officinalis L. đang được sử dụng rộng rãi, đặc biệt ở một số nước châu Âu. Các chế phẩm từ Valeriana được đánh giá là thuốc an thần, gây ngủ an toàn và hiệu quả, không gây nghiện và đã được đưa vào Dược Điển của nhiều nước trên thế giới như Đức, Pháp, Anh, Mỹ, Áo, Italy, Thụy Sĩ, Ấn Độ, Nga, Trung Quốc,… Ở Việt Nam có hai loài gồm V. hardwickii Wall. được gọi là "Nữ lang"; và loài V. jatamansi Jones gọi là "Sì to", chúng đều được dùng làm thuốc an thần, giảm đau trong trường hợp trẻ em bị sốt cao, quấy khóc, chữa đau họng, chống co thắt, chữa bệnh tim và dùng cho phụ nữ sau khi sinh. Do trữ lượng ít, phân bố hạn hẹp, nên trong nhiều năm nay hai loài cây này được đưa vào Sách đỏ Vi ệt Nam và đối tượng ưu tiên cần bảo tồn. [...]... một thời gian nghiên cứu bảo tồn và phát triển, loài sì to (V jatamansi Jones) đã được chúng tôi lựa chọn để triển khai các nghiên cứu phát triển thuốc mới với tên đề tài "Nghiên cứu phát triển cây sì to (Valeriana jatamansi Jones) làm thuốc an thần, giảm đau và antistress" Với mục tiêu: - Nghiên cứu trồng cây sì to - Valeriana jatamansi Jones, phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc - Nghiên cứu phân... phẩm chiết được - Nghiên cứu chứng minh tác dụng an thần, giảm đau, antistress và tính an to n của nhóm hoạt chất chiết được từ cây sì to - Valeriana jatamansi Jones 2      I TỔNG QUAN 1 Giới thiệu về chi Valeriana L 1.1 Nghiên cứu về thực vật Chi Valeriana L thuộc họ Valerianaceae, là một chi khá lớn, gồm hơn 200 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm và cận nhiệt đới châu Á, châu Âu và châu Mỹ [8],... Valeriana L., cụ thể ở nước ta hiện nay có hai loài phổ biến là loài Valeriana jatamansi Jones và Valeriana hardwickii Wall Trong phạm vi nghiên cứu của để tài này, chúng tôi nghiên cứu phát triển to n diện về loài Valeriana jatamansi Jones để làm thuốc 11      II NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, địa điểm và thiết bị dùng trong nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu - Cây giống... dụng phần mềm Microsoft Excel và chương trình IRRISTAT 4.0 trong Windows 24      III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu sì to (Valeriana jatamansi Jones) Trong giai đoạn 2006-2008, đã tiến hành đánh giá khả năng nhân giống bằng hạt sì to, nhưng kết quả cho thấy hạt sì to thường bị lép và không nảy mầm Chính vì vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi thực hiện... của loài Valeriana jatamansi) là 6-methylapigenin và 2S (-)- hesperidin [29] Ở Việt Nam, trong nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của nữ lang và sì to đã cho thấy, trong rễ nữ lang (Valeriana hardwickii Wall.) có tinh dầu, flavonoid, alcaloid, coumarin, saponin, phytosterol Trong thân rễ sì to, ngoài các thành phần như của loài nữ lang còn có tanin Đã xác định hàm lượng các chất tan trong dầu, lần... [23] Valeriana hardwickii Wall được nhân dân Ấn Độ dùng làm thuốc khá phổ biến dưới tên biệt dược là Taggar, thuốc này có tác dụng tương tự như thuốc làm từ Valeriana jatamansi Jones, trong thành phần của thuốc chứa 1% tinh dầu (chủ yếu valerenic acid), 3,13% tanin [32] Một tài liệu khác đã công bố dịch chiết methanol của rễ cây V fauriei (Japanese Valerian) cũng được dùng làm thuốc giảm đau [31] Đã... Thời gian chịu nóng sau 30 phút uống thuốc T2 = Thời gian chịu nóng sau 60 phút uống thuốc T3 = Thời gian chịu nóng sau 90 phút uống thuốc T4 = Thời gian chịu nóng sau 120 phút uống thuốc 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu bào chế - Nghiên cứu bào chế viên nang Valeseda bằng phương pháp xát hạt ướt với ethanol 50% [2], [3], [4] - Đóng nang bằng máy đóng nang thủ công - Kiểm tra độ rã của viên nghiên cứu bằng... nghiên cứu kiểm nghiệm, dược lý và bào chế thuốc 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu + Địa điểm nghiên cứu về trồng trọt: - Xã Bản Khoang và thị trấn Sa Pa (huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai) - Trại nghiên cứu trồng cây thuốc Tam Đảo - Viện Dược liệu (Vĩnh Phúc) + Nghiên cứu về hóa học, dược lý và bào chế: Khoa Hóa thực vật, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Khoa Dược lý - Sinh hóa và Khoa Bào chế - Viện Dược liệu, 3B Quang... giống sì to được thu mua từ địa phương (Sa Pa – Lào Cai) tháng 8/2006 và từ các ruộng trồng nghiên cứu tại Sa Pa và Tam Đảo vào tháng 8-9 các năm 2007 và 2008 (được tách từ các khóm cây đến mùa thu hoạch) - Thân rễ của cây 1 năm tuổi thu vào tháng 8 của các năm 2007 và 2008, dùng cho nghiên cứu hóa học, chiết xuất, phân tich kiểm nghiệm và bào chế - Bột "valeseda" bán thành phẩm (BTP): cung cấp cho nghiên. .. dụng làm thuốc như: Valeriana celtica L., V dioica L., V montana L., V officinalis L., V saliunca All., V jatamasi Jones, V hardwickii Wall., V ceratophylla H.B.K., V capensis Thunb… [32] Ở Việt Nam, theo các tài liệu hiện có hai loài là Valeriana hardwickii Wall được gọi là "Nữ lang" và Valeriana jatamansi Jones gọi là "Sì to" Cả hai loài đều được dùng làm thuốc giảm đau, an thần trong trường hợp trẻ . nghiên cứu 12 2. 1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 12 2. 1 .2. Địa điểm nghiên cứu 12 2. 1.3. Thiết bị, hóa chất và động vật dùng trong nghiên cứu 12 2. 2. Phương pháp nghiên cứu 14 2. 2.1. Các phương. 58 3.3 .2. Nghiên cứu độc tính 60 3.3 .2. 1. Xác định độc tính cấp LD 50 60 3.3 .2. 2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 60 3.3 .2. 2.1. Kết quả sinh hóa và huyết học 60 3.3 .2. 2 .2. Kết quả. 14 2. 2 .2. Phương pháp định tính thành phần hóa hoc, chiết xuất và kiểm nghiệm 14 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính 17 2. 2.4. Phương pháp nghiên cứu dạng bào chế 24