Theo khuyến cáo tổ chức thú y thế giới WOAH, các kỹ thuật chan đoán ASFV trong phòng thí nghiệm được phân loại thành xét nghiệm kháng nguyên bao gồm phân lập kết hợp HAD, phát hiện hệ ge
NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Độ đặc hiệu (SP) -2-22¿2222222222tEErztrrrrrrrrrrrrrrrr
Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện chính xác DNA của ASFV mà không nhầm lẫn với vật liệu di truyền của các sinh vật khác trong mẫu xét nghiệm Để xác định độ đặc hiệu, ba mẫu chuẩn âm với ASFV đã được phân tích, bao gồm các chủng vi sinh vật dương tính với PCV2, PRRSV, CSFV và hai mẫu dương tính với ASFV được xác định bằng phương pháp Real-time PCR từ phòng xét nghiệm bệnh viện Thú y - Đại học Nông Lâm Kết quả đã được kiểm tra đối chiếu tại phòng xét nghiệm của công ty Nam Khoa, và tiêu chuẩn được chấp thuận khi có kết quả dương tính trong mẫu.
Phan ứng thay đổi màu với SYBR Green I -2- 22522 5522s2zz2z>zz>sz 33 2.4 Tích hợp phản ứng RPA lên thiết bị vi lưu kỹ thuật số
SYBR Green I được sử dụng để làm cho kết quả RPA có thể nhìn thấy dưới ánh sáng tia cực tím và bằng mắt thường Nồng độ SYBR phù hợp cho phản ứng được xác định bằng cách pha loãng SYBR Green I thành 8 nồng độ từ 400X đến 50X và thử nghiệm với cùng cài đặt phản ứng RPA Sau khi khuếch đại RPA, 1 µL dung dịch SYBR Green I được thêm vào 20 µL dung dịch khuếch đại Kết quả xét nghiệm dương tính có thể được quan sát bằng mắt thường và dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 365 nm sau năm phút ở nhiệt độ phòng Tất cả hình ảnh được chụp bằng điện thoại thông minh hoặc máy ảnh.
2.4 Tích hợp phản ứng RPA lên thiết bị vi lưu kỹ thuật số
Thiết kế bảng điện cực -¿-5222221221221221221221221221212121212121 xe 34 2.4.2 Tối ưu nồng độ Tween-20 5+ 2+ 2222 2211221321111311421112.12.0.2.ce 36 Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN . s<âcôcceceeeeeeerreee 37 3.1 Tối ưu phản ứng khuếch đại dang nhiệt RPA 2 22552222+22z222z£2 37
Thiết bị bảng điện cực bao gồm 4 thành phần chính: (i) bảng điều khiển kết hợp với bộ chuyển đổi điện áp cao để thao tác với các điện cực; (ii) màng điện di cách điện làm từ PVDF-HFP (PolyK Technologies, Hoa Kỳ) dùng làm lớp điện di; (iii) bảng điện cực với 6 điện cực chứa kích thước 6 mm x 5 mm và 56 điện cực kích hoạt kích thước 2,5 mm x 2,5 mm; (iv) bên dưới bảng điện cực có gắn cảm biến nhiệt độ và tam phim gia nhiệt, toàn bộ bảng được phủ lớp lá mỏng chứa màng ky nước điện môi, và phía trên cùng là kính ITO.
ITO glass slide regulating FET
Bảng điều khiển là thành phần quan trọng trong thiết bị DMF, quản lý nguồn điện áp cao và phân phối điện áp đến bảng điện cực Hai thiết bị chính trong khối này là vi điều khiển Arduino và trình điều khiển điện áp thấp đến cao HV507, hoạt động phối hợp để kiểm soát việc đóng ngắt các điện cực Arduino đóng vai trò trung tâm, xử lý lệnh từ người dùng và ra lệnh cho HV507, một vi mạch tích hợp đặc biệt, thực hiện chuyển đổi lệnh để cung cấp điện áp đến bảng điện cực thông qua các chân đầu ra.
HV507 có 34 chân đầu ra tương ứng với từng điện cực trên mảng, cho phép điều khiển 64 điện cực cùng lúc khi kết hợp với Arduino Điều này giúp người dùng kiểm soát trực tiếp trạng thái đóng mở của các điện cực, từ đó điều khiển sự di chuyển của giọt chất lỏng trên bảng điện cực Màng PVDF-HFP được sử dụng làm lớp điện di, được rửa bằng cồn isopropyl và nước cất ở 60°C trước khi hong khô trong buồng sạch, sau đó được phủ lớp Fluoropel PFC 1601 V để tạo điều kiện cho chất lỏng di chuyển trên bề mặt Bảng điện cực gồm 64 điện cực, mỗi điện cực kết nối với một chân đầu ra của HV507, được thiết kế phù hợp với từng loại phản ứng và được gia công bằng vật liệu FR4 Các điện cực được phủ bằng vật liệu dẫn điện, bên dưới có gắn cảm biến nhiệt độ và một tấm phim gia nhiệt Để thực hiện thao tác tách giọt, thiết bị cần được gắn thêm một lớp kính.
Kính ITO có khả năng dẫn điện và quá trình gia công của nó tương tự như màng điện di Để làm sạch, kính ITO được rửa trong máy đánh siêu âm với nước cất và cồn isopropyl ở nhiệt độ 60°C trong 15 phút, sau đó được rửa lại với nước cất và hong khô ở 120°C trong buồng làm sạch Sau khi kính khô hoàn toàn, hai cạnh của nó được dán băng keo đồng dẫn điện để kết nối với hệ thống điện của thiết bị Cuối cùng, mặt dẫn điện của kính được phủ lớp Fluoropel PFC1601V để tạo ra lớp cách điện và tăng khả năng ky nước, hỗ trợ cho việc thao tác với giọt chất lỏng.
Lộ trình cho mỗi thuốc thử di chuyển trên bảng điện cực đã được thiết kế thành công với sự giao nhau tối thiểu giữa các sản phẩm RPA Trong thiết kế này, tất cả 8 giếng điện cực được sử dụng, bao gồm 4 giếng cho mẫu và 4 giếng còn lại dành cho hỗn hợp chính RPA Hỗn hợp chính này, bao gồm MgOAc để bắt đầu phản ứng và SYBR Green I để quan sát kết quả, đã được chuẩn bị trước với tất cả các thành phần và được bơm 1.5 µl vào mỗi giếng điện cực.
2.4.2 Tối ưu nồng độ Tween-20
Dung dịch phản ứng RPA có độ nhớt cao và không di chuyển trên chip DMF, do đó, Tween-20 đã được thêm vào bộ đệm phản ứng để tăng cường chuyển động của giọt bằng cách giảm sức căng bề mặt Các thí nghiệm trước đây cho thấy Tween-20 có thể ức chế phản ứng khuếch đại ở nồng độ cao Vì vậy, nồng độ Tween-20 1,5 HL với các nồng độ cuối cùng là 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 và 0,4% (v/v) đã được thử nghiệm Các giọt đệm phản ứng được rút ra từ bể chứa và xử lý theo trình tự vận chuyển thông thường với tín hiệu điều khiển 190V, 1 kHz Tốc độ di chuyển của giọt được ước tính bằng tỷ lệ thời gian chuyển tiếp At và khoảng cách giữa hai điện cực Các khung hình riêng lẻ được trích xuất từ video và phân tích bằng phần mềm Image J.
Trước khi tiến hành phản ứng RPA trên chip DMF, chức năng của ngăn gia nhiệt đã được kiểm tra Hỗn hợp phản ứng 25 uL RPA được chuẩn bị, trong đó 1,5 uL được bơm vào chip DMF Cả phản ứng trong ống và giọt được ủ ở 39°C trong 30 phút, vì vi thể tích phản ứng nhỏ có thể ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại DNA Cuối cùng, SYBR Green I được thêm vào, và kết quả được xác nhận bằng điện di trên gel agarose.
KET QUA VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tối ưu phản ứng khuếch đại dang nhiệt RPA
Để xác minh khả năng phát hiện ASFV trong phản ứng RPA, hai cặp mồi đã được thiết kế nhằm khuếch đại gen p30 thông qua Primer-BLAST, với các vị trí mồi được thể hiện ở Hình 3.1 Mỗi đoạn mồi thuận được thiết kế phải có khả năng bắt cặp với cả hai đoạn mồi ngược, đồng thời khuếch đại cùng một đoạn gen mục tiêu mà không nhất thiết phải chồng lên nhau Kết quả từ Primer-BLAST cho thấy không có hai cặp mồi nào đáp ứng yêu cầu, do đó một cặp mồi được chọn từ kết quả và cặp còn lại được lựa chọn thủ công Cặp mồi đầu tiên được căn chỉnh trên trình tự gen p30 bằng phần mềm BioEdit, và cặp mồi thứ hai được chọn liền kề với cặp đầu tiên Cặp thứ hai sau đó được kiểm tra lại qua Primer-BLAST để đảm bảo độ đặc hiệu, tỷ lệ % GC và điểm số tự bổ sung Tỷ lệ % GC nên nằm trong khoảng 30-60% và điểm tự bổ sung không được vượt quá 4 Bảng 3 trình bày trình tự của các mồi đã chọn cùng với chiều dài và hàm lượng GC của chúng.
BpuEL BbvCL Tatl Scat Accl BstZ171 ‘Smit Nspl Earl Bpu101 BseRI Xmal BspHI
† 320 ACGAGTCATGACAATTCATACTATAACACTTTAGACGAGTATATATACGTCCCGTTCCCATATGACTTGTAGTCCGAGTTCTTCTTACCTTATACTAAGACGTACACGACAAACTTCTCCTCTGTCTTAGGAGTCGTAGTAGCCTTTCGTAAGTACTTTT vn NAROR AAATGATAATGAAACCAATGAATGCACATCCTCCTTTGAAACATTGTTTGAGCAAGAGCCCTCATCAGAGGAACCTAAAGACTCCAAGCTGTATATGCTTGCACAAAAGACTGTGCAACATATT GAACAATATGGAAAGGCACCTGATTTTAACAAGGTT
Hình 3.1 Vị trí cặp môi phát hiện đoạn gen CP204L mã hóa cho protein p30.
Bang 3.1 Kết quả thiết kế môi.
Tên Trình tự nueleotide (5° -> 3°) Chiều GC% dài AF3 GATAATGAAACCAATGAATGCACATCCTCCTTTG 34 38.4%
Bồn đoạn môi được thiết lập từ các môi trong Bảng 3.1, với độ dai sản phẩm của bốn cặp môi được trình bày trong Bảng 3.2 Ba trong bốn cặp sản phẩm tạo ra có độ dài từ 100bp đến 200bp, nằm trong phạm vi kích thước sản phẩm tối ưu theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
Bang 3.2 Độ dài của sản phẩm khuếch đại theo từng cặp mồi.
Cặp mồi Độ dài khuếch đại
AF3-AR3 154bp AF3-AR4 195bp AF4-AR3 98bp
Sau khi ủ ở 39°C trong 30 phút, sản phẩm Sul đã được sử dụng để điện di trên gel Sản phẩm 289bp của chứng dương xuất hiện rõ ràng ở giếng 1, cho thấy bộ RPA hoạt động bình thường Không có sự khuếch đại nào ở sản phẩm của cặp AF3-AR4, trong khi ba cặp khác tạo ra sự khuếch đại gen mục tiêu Cặp AF3-AR3 cho thấy vùng sản phẩm khác biệt nhất so với các cặp còn lại (Hình 3.2), vì vậy cặp AF3-AR3 đã được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.2 Kết qua chọn loc mỗi cho phản ứng RPA.
L: DNA marker; Giéng 1: chứng dương của RPA kit; Giếng 2: AF3-AR3;Giéng 3: AF3-AR4; Giéng 4: AF4-AR3; Giéng 5: AF4-AR4
Tối ưu nhiệt độ phản ứng 2: 222222222E++EE+2E+£EE2EE2EESEEEEESEErrrrerrees 39 5.1.5 TÔI tĩúi KHÔI (BÌNH Ẵ, sec nh thư gi go ng HHEUgu-nggpt20606.niEg001 4007 40 3.1.4 Gidi han phat hién (LOD) 7 Ả
Phản ứng RPA được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau để xác định nhiệt độ tối ưu cho phản ứng Sau khi điện di gel và quan sát dưới ánh sáng UV, dải khuếch đại mục tiêu 154bp rõ ràng xuất hiện ở giếng 2 và giếng 3, trong khi giếng 1 không có dấu hiệu khuếch đại Dải ở giếng 2 sáng hơn một chút so với giếng 3 Do đó, 39°C được chọn làm nhiệt độ ủ tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này.
Hình 3.3 Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA.
L: DNA marker; Giếng 1: 37°C; Giếng 2: 39°C; Giéng 3: 41°C.
Sau khi ủ sản phẩm khuếch đại trong 15, 20, 25 và 30 phút, kết quả phân tích bằng điện di trên gel cho thấy sản phẩm mục tiêu có kích thước 154bp xuất hiện rõ ràng ở cả 4 giếng Thời gian phát hiện ngắn nhất là 15 phút, với các giếng thể hiện kết quả dương tính rõ ràng, như minh họa trong Hình 3.4 Vì vậy, 15 phút được xác định là thời gian ủ tối ưu.
Hình 3.4 Kết quả phản ứng RPA ở nhiệt độ ủ khác nhau.
L: DNA marker; Giéng 1: 15 phút; Giéng 2: 20 phút; Giéng 3: 25 phút; Giếng 4:
3.1.4 Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (LOD) của phản ứng RPA được xác định thông qua việc thực hiện phản ứng RPA pha loãng 10 lần của plasmid pGEM-T easy, chứa DNA p30 của ASEV, với nồng độ từ 10^7 bản sao/uL đến 1 bản sao/uL Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ này có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp phát hiện.
Sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện ở nồng độ 10 bản sao/uL, trong khi ở nồng độ 1 bản sao/uL thì không thấy xuất hiện sản phẩm này Nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được của phản ứng RPA là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của phương pháp này.
Hình 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phản ứng RPA.
Giéng 1: Đối chứng âm; giếng 2-9: Nông độ pha loãng log 10 của plasmid chứa 10” bản sao/uL đến một bản sao/uL Từ 107 đến 10 ban sao/ uL xuất hiện band trong khoảng 154bp Tại một ban sao/ uL, không thấy xuất hiện band.
Kết quả xác định độ đặc hiệu của thuốc thử bằng cách xét nghiệm phát hiện ASFV
Trong nghiên cứu, 5 mẫu huyết thanh heo được phân tích, trong đó 3 mẫu cho kết quả dương tính với PCV2, PRRSV và CSFV, nhưng âm tính với ASFV Đồng thời, 2 mẫu khác dương tính với ASFV Kết quả chi tiết được trình bày trong Hình 3.6, cho thấy các mẫu dương tính với ASFV đều có band rõ ràng trong phản ứng RPA, trong khi các mẫu âm tính không ghi nhận band nào.
Kết quả kiểm tra độ chính xác của phản ứng RPA cho thấy khả năng phát hiện mầm bệnh hiệu quả, với hình ảnh minh họa rõ ràng Cụ thể, phần a trình bày kết quả phát hiện mầm bệnh từ phản ứng RPA, trong khi phần b thể hiện kết quả xét nghiệm mầm bệnh qua phương pháp Realtime-PCR.
3.1.6 Phan ứng thay đỗi màu với SYBR Green I a (-) 400X 350X 300X 250X 200X 150X 100X 50X ae pF me 1 = wf
Hình 3.7 minh họa quá trình tối ưu nồng độ SYBR Green I và xác định giới hạn phát hiện (LOD) của phản ứng RPA kết hợp với SYBR Green I Trong đó, phản ứng RPA được áp dụng cho điện di, trong khi phần còn lại được xử lý để thu được kết quả chính xác hơn.
Phát hiện 42 mẫu bằng SYBR Green I với nồng độ 300X cho thấy khả năng phát hiện DNA mục tiêu ở nồng độ thấp tới 10 bản sao/uL qua phản ứng RPA Kết quả từ điện di trên gel và SYBR Green I khẳng định hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện DNA với độ nhạy cao.
Phản ứng RPA đã được khảo sát với độ nhạy (LOD) đạt 25 pL, trong đó 1 pL được dùng cho điện di và phần còn lại được phát hiện bằng SYBR Green I với nồng độ 300X Kết quả từ điện di trên gel và SYBR Green I cho thấy phản ứng RPA có khả năng phát hiện DNA mục tiêu ở nồng độ thấp tới 10 bản sao/uL Nồng độ cao của SYBR Green I được sử dụng để đảm bảo phát hiện màu sắc trong thể tích phản ứng nhỏ Tiếp theo, nghiên cứu sẽ tích hợp phản ứng RPA lên thiết bị vi lưu kỹ thuật số.
3.2.1 Thiết kế đường di chuyển của chat long trên bảng điện cực
Bảng điện cực cho phản ứng RPA được thiết kế để tối ưu hóa quy trình, trong đó RPA MasterMix được phân phối vào điện cực chứa mẫu từ giếng chứa, đồng thời tiếp xúc với các giọt mẫu Sau đó, MgOAc được thêm vào để khởi động phản ứng RPA Các giọt phản ứng được trộn liên tục bằng cách di chuyển qua lại, trong khi nhiệt độ trên bảng điện cực được duy trì ở 39°C trong 30 phút để ủ Cuối cùng, khi phản ứng kết thúc, các giọt SYBR Green I được phân phối vào từng giọt phản ứng để quan sát kết quả Đường dẫn giọt được thiết kế thủ công nhằm đảm bảo hiệu quả cho quá trình phản ứng.
Trong nghiên cứu của Hoàng và cộng sự (2020), 43 phản ứng được phân tách bằng khoảng cách tối thiểu hai điện cực để tránh va chạm và nhiễm chéo giữa các giọt Tất cả 8 điện cực chứa mẫu DNA, RPA MasterMix, MgOAc để khởi động phản ứng và SYBR Green I 300X để quan sát kết quả (Hình 3.7) Bảng điện cực được thiết kế để thực hiện năm phản ứng đồng thời, bao gồm một phản ứng chứng âm nhằm kiểm soát tình trạng nhiễm chéo.
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ Tween-20 đến khả năng di chuyển của giọt
Để cải thiện khả năng di chuyển của giọt nước trong đệm phản ứng RPA có độ nhớt cao, Tween-20 đã được bổ sung với nồng độ từ 0% đến 0,4%.
Hình 3.9 Đánh giá tốc độ giọt được tinh theo khung hình mỗi lần đối với các mẫu tương ứng với nồng độ Tween-20.
Dưới tác dụng của dòng điện kích hoạt, giọt không có Tween-20 chỉ có thể di chuyển quanh điện cực do độ nhớt cao, với tốc độ 0 mm/s Tuy nhiên, khi nồng độ Tween-20 tăng, độ linh động của giọt cũng tăng theo Cụ thể, với 0,05% Tween, tốc độ di chuyển đạt 2,220 mm/s, cho phép giọt di chuyển giữa các điện cực Tại một thời điểm, giọt nước có thể ngừng di chuyển trong vài giây Khi chuyển đổi từ 0,05% lên 0,1% Tween, tốc độ tăng mạnh lên khoảng 9,529 mm/s.
Nồng độ 44 độ Tween-20 đủ cao để làm cho giọt di chuyển nhanh hơn, trong khi tình trạng mắc kẹt không còn được quan sát thấy ở mẫu 0,05% so với mẫu 0,1% Giọt nước có thể di chuyển theo bất kỳ hướng nào theo chỉ dẫn, và tốc độ di chuyển không thay đổi nhiều từ 0,1% đến 0,4% nồng độ Tween-20, mặc dù có một số biến động nhỏ Do đó, nồng độ 0,1% Tween-20 được chọn để hỗ trợ phản ứng RPA, vì nó có thể tăng cường chuyển động của giọt trong khi vẫn giữ tỷ lệ các thành phần RPA MasterMix gần nhất với phản ứng trong ống.