Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa lactobacillus rhamnosus h1 và lactobacillus reuteri h2 nhằm nâng cao sức khoẻ Âm Đạo phụ nữ

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa lactobacillus rhamnosus h1 và lactobacillus reuteri h2 nhằm nâng cao sức khoẻ Âm Đạo phụ nữ

TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Probiotic và vai trò của probiotic

Probiotic là một loại lợi khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật sống, thường là vi khuẩn, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe Theo WHO với lượng là

10 8 đơn vị hay 100 triệu đơn vị tế bào lợi khuẩn được WHO quy định là liêu đầy đủ số lượng probiotic cho mỗi lần bổ sung, tùy thuộc vào tình trạng, mỗi người có thể sử dụng tới 10 11 đơn vị Vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bacillus thường được xem là những loại probiotic phổ biến Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm cả vi khuẩn có lợi và có hại Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể giúp kìm hãm các vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cũng như tăng cường khả năng miễn dịch Khi vi khuẩn có hại trong cơ thể lấn át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học để lấy lại sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể Probiotics là những chế phẩm có chứa các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là hệ tiêu hóa [57]

Theo khuyến cáo tối thiểu của WHO / FAO : Một probiotics được xem là “tốt” nếu đáp ứng 5 yếu tố sau:

- Chế phẩm chứa vi sinh vật sống

- Xác định cụ thể chi, loài, chủng và được phân lập tới chủng

- Đảm bảo liều lượng lợi khuẩn cho đến hết hạn sử dụng (tối thiểu 108 đơn vị)

- Hiệu quả đạt được chúng minh qua các nghiên cứu lâm sàng có đối chứng trên người

- Có bằng chứng về độ an toàn trên người

Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm cả vi khuẩn có lợi và có hại Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể giúp kìm hãm các vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hâp thu dinh dưỡng cũng như tăng cường khả năng miễn dịch Khi vi khuẩn có hại trong cơ thể lấn át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học để lấy lại sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể [27]

- Làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là:

Tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và chất diệt khuẩn Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH môi trường khoang ruột thông qua việc tạo ra các acid hữu cơ đặc biệt là acid lactic, cũng như một số acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate

- Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh

Tác động trên mô biểu bì ruột Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm gây ra do lây nhiễm vi khuẩn Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy [27]

Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột Cụ thể là đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón

Tác động đến vi khuẩn đường ruột Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột Sự sống sót của probiotic ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nếu sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn probiotic định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống Điêu này thì đúng cho tất cả các loại probiotic

Vi khuẩn probiotic điêu hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột Vi khuẩn probiotic cũng giúp làm tăng sự dung nạp đường lactose thông qua việc giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hâp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại

Một số vai trò khác đối với cơ thể

- Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như các vitamin (folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12) [27]

- Chống ung thư: nhiêu nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu [27]

- Làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao Ngoài ra còn giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh

Theo các nghiên cứu lâm sàng từ những năm 1990, các chế phẩm probiotics có thể có hiệu quả trong điều trị một số bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển của bệnh dị ứng ở trẻ em và điều trị cũng như phòng ngừa nhiễm trùng âm đạo và nhiễm trùng đường tiểu ở phụ nữ Việc sử dụng probiotic chứa các vi khuẩn đã được phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới, bao gồm cả sức khỏe âm đạo và bàng quang ở phụ nữ, cơ sở khoa học và dữ liệu khoa học lâm sàng cho ứng dụng này và nhiều ứng dụng khác đã chứng minh tính khả thi của ý tưởng này[42]

Mối liên hệ giữa probiotic và sức khỏe âm đạo chưa được nghiên cứu thật đầy đủ Tuy nhiên, probiotic được cho là có khả năng cung cấp cho cơ thể các vi khuẩn có lợi để chống lại vi khuẩn có hại, bao gồm cả vi khuẩn ở âm đạo Điều này có nghĩa rằng chế phẩm sinh học có thể giúp âm đạo của phụ nữ tránh được một số bệnh [42]

Hệ sinh thái âm đạo đạt được sự cân bằng nhờ các chủng vi khuẩn có lợi như

Lactobacillus sp Nhóm vi khuẩn này thường giữ độ pH âm đạo vào khoảng 4,2 để ngăn chặn sự xuât hiện và phát triển của các vi sinh vật có hại vì môi trường như vậy là quá axit để chúng có thể tồn tại Nếu độ pH âm đạo tăng lên, vi khuẩn sẽ rất mau phát triển và gây ra viêm âm đạo do vi khuẩn Trong khi đó, giảm độ pH âm đạo có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của nấm, đặc biệt là Candida albicans, gây nhiễm trùng nấm Sự sụt giảm pH có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm thuốc kháng sinh, thuốc diệt tinh trùng, thuốc tránh thai, thuốc steroid đường uống, quan hệ tình dục, kinh nguyệt và tiểu đường [42]

Do các đặc tính hữu ích của probiotic, sự cân bằng của hệ vi sinh sẽ được phục hồi, giúp phụ nữ chống lại nhiều bệnh, bao gồm viêm âm đạo do vi khuẩn, nhiễm nâm men và nhiễm trùng đường tiết niệu

Một số sản phẩm probiotics cho phụ khoa

1.3.1.Sản phẩm được thương mại trên thế giới

- Sản phẩm Probiotic Optibac tím của Anh, giúp điều trị các bệnh viêm, nhiễm phụ khoa, đặc biệt là viêm âm đạo và đường tiết niệu dành cho phụ nữ chứa 2.3 tỷ vi khuẩn, gồm 2 chủng Lactobacillus rhamnosus GR-1® và Lactobacillus reuteri RC-14 Hai loài vi khuẩn đặc hiệu này đã được thử nghiệm lâm sàng với hơn 2.500 phụ nữ trên khắp thế giới và cho kết quả tích cực Ban đầu chúng sống sót qua đường ruột và sau đó thành công trong việc định vị âm đạo và bàng quang Trong âm đạo và đường tiết niệu, sản phẩm Optibac tím này có nhiêu tác dụng tích cực trong đường ruột Ðiều đặc biệt, hai chủng vi khuẩn đặc hiệu GR-1 và RC-14 sống sót đến tận vùng kín phụ nữ, hạn chế khả năng gây ra bệnh nâm men giúp ngăn ngừa và điều trị những vấn đề viêm âm đạo và viêm tiết niệu Sản phẩm này được nhập nhiêu nhất về Việt Nam so với các sản phẩm probiotic khác dành cho phụ nữ với giá thành khoảng 400.000 hộp/30 viên

- Sản phẩm Fem-Dophilus® của Mỹ chứa hõn 1 tỷ vi khuẩn gồm 2 chủng Lactobacillus rhamnosus, GR-1® and Lactobacillus reuteri, RC-14®, 60 viên với giá thành $83,91, hỗ trợ sức khoẻ âm đạo, đường tiết niệu cho phụ nữ

- Sản phẩm Jarro-Dophilus Probiotics For Women của Mỹ gồm 60 viên, dạng uống, có giá thành $30,9 Sản phẩm chứa 5 tỷ vi khuẩn gồm 4 loài Lactobacilli thường có mặt trong âm đạo phụ nữ: L crispatus LbV 88, L gasseri LbV 150, L jensenii LbV 116, L rhamnosus LbV 96

Nhìn chung các sản phẩm đó đều có tác dụng duy trì khu hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh, giúp giảm bớt sự kết dính của vi khuẩn vào đường tiết niệu, giúp giảm tần suất viêm bàng quang tái phát và hỗ trợ hệ thống miễn dịch khỏe mạnh Các chế phẩm này đều là các chế phẩm nhập ngoại và hiện tại Việt Nam chưa có một dòng sản phẩm nào nghiên cứu và phát triển dành riêng cho phụ nữ

Dựa trên nhu cầu và tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu, tuyển chọn các chủng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ chính hệ tiêu hoá của phụ nữ khoẻ mạnh ở Việt Nam để phát triển các chế phẩm probiotic nhằm nâng cao sức khoẻ sinh sản cho phụ nữ

1.3.2.Sản phẩm thương mại trong nước

Trên thị trường hiện đang có hàng nghìn sản phẩm probiotic dùng cho người để tăng cường tiêu hoá và hỗ trợ điêu trị các bệnh liên quan tới tiêu hoá, tăng cường miễn dịch

Có thể kể đến một số sản phẩm probiotic trong nước dùng cho con người được thị trường quan tâm hiện nay như:

- BioLactoMen, Biolactovin do PGS.TS Đinh Duy Kháng và cộng sự tại Viện Công nghệ Sinh học nghiên cứu và chế tạo ở dạng dạng đông khô từ chủng vi khuẩn lactic có nồng độ Lactobacillus acidophilus 10 8 CFU/mg, với giá 55 nghìn/hộp (10 lọ), ngày uống

2 lọ để điều trị các bệnh rối loạn tiêu hóa, loạn khuẩn do sử dụng kháng sinh, ngộ độc thực phẩm, viêm đại tràng, táo bón…

Bio-acimin Gold do công ty dược phẩm Việt Đức sản xuất giúp bổ sung gồm nhiều chủng lợi khuẩn có lợi như Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis Ngoài ra, sản phẩm còn cung cấp chất xơ và 21 loại axit amin thiết yếu được chiết xuất từ men bia có tác dụng cải thiện tình trạng biếng ăn ở trẻ sau khoảng 2 tuần sử dụng, làm giảm các triệu chứng của bệnh rối loạn tiêu hóa do sử dụng thuốc kháng sinh kéo dài hoặc do ăn phải thức ăn kém vệ sinh, được bán với giá là 180.000 VNĐ/ hộp 30 gói

Như vậy có thể thấy rằng, mặc dù hiện nay đã có khá nhiều chế phẩm probiotic ở Việt Nam nhưng chưa có chế phẩm nào phát triển để phục vụ riêng cho việc chăm sóc sức khoẻ phụ nữ Chính vì thế, nghiên cứu này là hết sức cần thiết.

Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ nữ

H2O2 là một gốc oxi hoạt động (ROS) Các nghiên cứu đã cho thấy chất này cũng giống như các gốc ROS khác như O2 - hay OH - có khả năng gây tổn thương oxi hoá cao khi tham gia vào phản ứng Fenton Chúng gây tổn thương cấu trúc và chức năng các đại phân tử trong tế bào như protein, ADN, lipid…dẫn đến gây chết mạnh vi khuẩn [58] Một số chủng Lactobacillus được tìm thấy có tác dụng ức chế sự phát triển các mầm mống nhiễm khuẩn âm đạo trong ống nghiệm, bằng cách sản xuất tạo ra H2O2 Mastromarino và nhóm cộng sự đã nghiên cứu L salivarius FV2 và L gasseri 335 được phân lập từ âm đạo của người và phát hiện thây chúng có thể sản xuât ra một lượng lớn

H2O2 cũng như ức chế sự tăng trưởng của G vaginalis [50] McLean và Rosenstein

(2000) đã chứng minh L acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã sản xuât lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp.,

Prevotella bivia và G vaginalis được phân lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu chứng minh Lactobacilli sản xuất peroxide bảo vệ cho đường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng và cho rằng H2O2 là yếu tố kháng khuẩn chính được sản xuất bởi Lactobacillus vẫn là phổ biến nhất, tuy nhiên, một nghiên cứu in-vitro khác lại chứng minh rằng H2O2 được tạo ra do Lactobacillus không phải là nguyên nhân chính gây ức chế tác nhân gây bệnh Các Lactobacillus này sản xuất H2O2 có thể làm khả năng làm tăng hoạt động của các chuỗi peptide kháng khuẩn của vật chủ (muramidase và lactoferrin) cũng như hoạt tính kháng khuẩn của các tế bào biểu mô

Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạo của axit lactic được chứng minh rõ ràng Axit lactic ở nồng độ sinh lý (ví dụ: 110 mM) thậm chí ở pH 4,5 làm giảm 10 6 lần khả năng tồn tại của 17 loại vi khuẩn khác nhau gây viêm nhiễm âm trong khi đó lại không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của bốn loài Lactobacillus spp âm đạo trong nghiên cứu in-vitro Đáng chú ý là hoạt tính kháng khuẩn của axit lactic có cường độ lớn hơn các chất được axit hóa đến pH 4,5 như HCl hoặc với axit axetic [69] Ngoài ra, ở gần điều kiện ex-vivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ không kết hợp với bacteriocin vẫn có hiệu quả kháng vi khuẩn gây viêm nhiễm ở đường sinh dục nữ Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng axit lactic có tác dụng chính trong chống lại các bệnh do vi khuẩn gây ra bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections- STIs) chứ không phải là H2O2 Axit lactic sinh ra bởi L crispatus và L gasseri đã làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [37,53] và Neisseria gonorrhoeae [39] cũng như Escherichia coli Axit lactic sản xuất bởi L crispatus đã được chứng minh có tác dụng ức chế N gonorrhoeae và Gardnerella vaginalis trong mô hình niêm mạc âm đạo ở lợn [22] Tóm lại, những nghiên cứu in-vitro và ex-vivo đều cho thấy rằng axit lactic được sản sinh ở các chủng probiotic thuộc chi Lactobaciilus có khả năng duy trì hệ vi sinh vật âm đạo và bảo vệ vi khuẩn chống lại STIs

1.4.3.Tạo ra các chất kháng khuẩn

Việc sản xuất các bacteriocin, có bản chất là protein hoặc các chuỗi peptide được sản xuất bởi vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn cùng nhóm phân loại hoặc các chủng vi khuẩn có liên quan chăt chẽ với Lactobacillus Các chất này cũng đã được tìm thấy với vai trò ức chế tăng trưởng của G vaginalis Aroutcheva và nhóm cộng sự đã kiểm tra 22 chủng thuộc chi Lactobacillus và nhận thấy rằng 80% số chủng sản xuất một loại độc tố ức chế sự phát triển của G vaginalis [14] Trong một nghiên cứu khác, Simoes và cộng sự đã phát hiện thây sự tăng trưởng của 28 (78%) trong số 36 trường hợp lâm sàng nhiễm G vaginalis bị ức chế bởi vi khuẩn L acidophilus do các chủng này nhạy cảm với bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn này [60]

Các cơ chế nhờ đó mà các chủng vi khuẩn Lactobacillus hoạt động như một hệ thống phòng thủ chống nhiễm trùng vẫn chưa được thực hiện đầy đủ Như đã trình bày ở trên, điều này có thể liên quan đến việc sản xuất các yếu tố kháng khuẩn và duy trì độ pH âm đạo < 4,5 Cũng có thể là do các chất hoạt động bề mặt làm thay đổi sức căng bề mặt xung quanh và làm giảm khả năng bám của nhiều loại mầm bệnh Ngoài ra,

Lactobacillus đã được chứng minh là có khả năng liên kết (đông tụ) một số mầm bệnh và đây có thể là một phương tiện để ngăn chặn sự kết dính của chúng, tiêu diệt chúng thông qua việc sản xuât chất kháng khuẩn và ngăn chặn sự lây lan của chúng đến các khu vực khác của âm đạo

Con đường vận chuyển probiotic trực quan là thông qua việc đăt trực tiếp vào âm đạo phụ nữ, tác động trực tiếp và hiệu quả nhanh hơn so với đường uống Nhóm nghiên cứu hướng tới nghiên cứu sản phẩm tiện lợi và dễ dàng sử dụng cho chị em phụ nữ, nên sản phẩm probiotic sử dụng đường uống là không thể thiếu Hiện nay cơ chế lưu chuyển vi sinh vật từ đường ruột đến âm đạo còn chưa được nghiên cứu chuyên sâu nhưng theo như các nghiên cứu lâm sàng được thực hiện ở nước ngoài đã chứng minh được các chủng vi khuẩn Lactobacillus có thể được đưa vào môi trường âm đạo ngay cả khi sử dụng bằng đường uống, lượng lợi khuẩn trong âm đạo tăng lên rõ rệt và có khả năng ngăn ngừa sự tái nhiễm.

Các dạng bào chế probiotic

Việc sử dụng các vi sinh vật có lợi cho sức khỏe được giới thiệu vào đầu thế kỷ

20 Các chế phẩm sinh học từ các sinh vật có lợi này đại diện cho các tác nhân điều trị thay thế Các dạng bào chế được sử dụng phổ biến như viên nang, viên nén, dạng bột (trong gói) hoăc dạng dịch với liều lượng nhất định Để mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ, các chế phẩm sinh học được dùng bằng đường uống phải tồn tại trong các điều kiện tiêu hóa bất lợi và duy trì khả năng tồn tại khi chúng đến vị trí hoạt động Vì vậy, cần có những công thức bảo vệ vi khuẩn khỏi những điều kiện khắc nghiệt của dạ dày

Trước khi giới thiệu chế phẩm sinh học như các sản phẩm thuốc, cần phải đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các sản phẩm này, trước tiên bằng các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, sau đó với các mô hình động vật và thử nghiệm cuối cùng ở người Sau khi toàn bộ quá trình này hoàn thành, chế phẩm sinh học có thể được thương mại hóa như các sản phẩm thuốc

Các chủng probiotic phải có khả năng phát triển trong điều kiện công nghiệp và tồn tại và giữ được chức năng của chúng trong quá trình bảo quản Việc giảm thiểu các tế bào sống sót trong quá trình bảo quản, chế biến và đi qua đường tiêu hóa là một thách thức lớn trong việc xây dựng các dạng bào chế có chứa lợi khuẩn Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng liều uống cao hơn 10 9 CFU/g mỗi ngày là cần thiết để phục hồi và duy trì hệ thống vi khuẩn [68]

Một số sản phẩm probiotic có chứa các chủng probiotic cụ thể đã được phát triển trong các công thức như bột [67], viên nang [19], viên nén [61,45], thuốc đặt âm đạo [44]và các dạng bào chế khác [46,24,41]

1.5.1 Bào chế dạng viên nang

Viên nang là dạng bào chế rắn với vỏ cứng hoặc mềm làm từ gelatin hoặc từ vật liệu thích hợp khác (Eur Pharmacopeia 2008; USP31 2008) Có hai loại viên nang, cứng và mềm (một miếng) Viên nang cứng thường được ưu tiên sử dụng để bảo quản men vi sinh Viên nang gelatin dễ dàng hòa tan trong nước ở 37 °C Probiotics ở dạng bột cũng được sử dụng để làm thuốc viên nang Các công thức bột thường yêu cầu một số loại tá dược như chất độn, chât kết dính, hoặc thậm chí chất phân hủy

Vì các chế phẩm probiotic bao gồm các tá dược khác nhau, ngoài các chủng probiotic, nên chúng có ảnh hưởng tới đặc tính sinh học của các vi sinh vật được chọn

Vì lý do này, Zárate và Nader-Macias (2006) đã đánh giá tỷ lệ sống sót và các đặc tính lợi khuẩn của ba loại lactobacilli âm đạo người được đông khô bằng các tá dược khác nhau (lactose, sữa tách béo, axit ascorbic), và được bảo quản trong viên nang gelatin đặt trong các dây thủy tinh ở 5 °C dưới bóng tối trong 15 tháng Nghiên cứu này đã chứng minh rằng Lactobacillus spp duy trì khả năng tồn tại cao đến 12 tháng trong viên nang chứa axit ascorbic được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với lactose, sữa, hoặc cả hai, trong khi việc đông lạnh và bảo quản chỉ với lactose hoặc sữa tách béo làm giảm đáng kể khả năng sống sót của chúng [68]

Một nghiên cứu của Reid và Bruce (2006) đã chứng minh việc uống hàng ngày viên nang gelatin có chứa L rhamnosus GR-1 và L fermentum RC-14 dẫn đến tăng đáng kể số lượng lactobacillus trong âm đạo, kết hợp với giảm coliforms và nấm Ya và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tính hiệu quả của viên nang probiotic đặt âm đạo trong việc ngăn ngừa tái nhiễm trùng âm đạo do vi khuẩn (BV) và kết luận rằng điều trị bằng probiotic ngắn hạn được dung nạp tốt và giảm sự tái phát của BV và nguy cơ nhiễm G vaginalis trong 11 tháng sau điều trị [67]

1.5.2 Bào chế dạng viên nén

Viên nén là dạng bào chế rắn thường thu được bằng cách nén khối lượng đồng nhất của các hạt (Eur Pharmacopeia 2008) Viên nén là dạng bào chế dược phẩm được sử dụng rộng rãi nhât Viên nén chứa probiotics được sản xuất bằng quá trình trực tiếp nén hỗn hợp tá dược và men vi sinh đông khô) Những nghiên cứu cho thấy rằng viên nén được sản xuất bằng cách nén trực tiếp hỗn hợp B longum HA-135 và S β-LG tăng cường khả năng sống sót của vi khuẩn trong điều kiện dạ dày và cho thấy sự ổn định tốt sau khi bảo quản ở 4 °C trong 3 tháng Cần đặc biệt chú ý đến thiết kế và các dạng bào chế dược phẩm, dành cho các tế bào sống của âm đạo, vì huyền phù vi khuẩn cho thấy sự kém ổn định và dễ dàng bị trôi sau khi bôi âm đạo Các loại công thức khác nhau dùng cho việc cung câp men vi sinh qua đường âm đạo ngày nay được thương mại hóa trên thị trường quốc tế Tuy nhiên, nhóm công thức probiotic dành cho âm đạo lớn nhât bao gồm chế phẩm sinh học đông khô được nén thành viên nén hoăc viên nang gelatin

[29] Một công thức probiotic âm đạo cần có thời gian lưu giữ dài để tối đa hóa việc sản xuât chế phẩm sinh học, để quá trình xâm nhập x ảy ra ở các bộ phận khác nhau của âm đạo sẽ không làm tổn thương niêm mạc âm đạo, phương pháp sử dụng dễ dàng, và không gây khó chịu cho người bệnh

Lactobacillus là vi sinh vật chiếm ưu thế trong hệ sinh thái âm đạo khỏe mạnh của con người [48] Do đó, điều quan trọng là phải biết các đặc tính của Lactobacillus và khả năng sinh sôi nảy nở hoặc duy trì khả năng tồn tại của chúng trong môi trường âm đạo Một số nghiên cứu về men vi sinh đối với nhiễm trùng âm đạo đã được báo cáo [34,30,36] Hầu hết các chế phẩm probiotic để sử dụng trong âm đạo bao gồm một hoăc nhiều các loài Lactobacillus [32] Ví dụ, các nghiên cứu sử dụng L rhamnosus GR1 được dùng đường âm đạo kết hợp với L reuteri B54 hoặc RC 14 đã chỉ ra rằng sự xâm nhập vào âm đạo có thể đạt được [55] Nghiên cứu của Mastromarino và cộng sự (2009) đã xác định hiệu quả của viên đặt âm đạo có chứa Lactobacillus spp trong điều trị BV và trong việc phục hồi vùng âm đạo khỏe mạnh cho thấy khi sử dụng các chủng ngoại sinh được chọn lọc trong âm đạo, Lactobacillus có thể khôi phục hệ vi sinh vật âm đạo bình thường và cũng được sử dụng trong điều trị BV

Viên đặt là một cách phân phối thuốc dạng rắn được điều chỉnh để đưa vào trực tràng (thuốc đặt trực tràng), âm đạo (thuốc đăt âm đạo), hoặc niệu đạo (thuốc đặt niệu đạo) Thuốc đặt thường tan chảy, mềm ra hoặc tan ở nhiệt độ cơ thể [62] Từ thuốc đặt (suppository) bắt nguồn từ thuật ngữ tiếng La tinh là suppositorium, dường như đến từ sự kết hợp của các từ supositum (vị trí thấp) + torus (hình xuyến), do đó các gốc từ nguyên của nó gợi ý một dạng dược phẩm rắn để đưa vào phần cơ thể phía dưới (trực tràng, âm đạo, niệu đạo) [54] Thuốc đặt âm đạo có những ưu điểm nhất định so với các dạng bào chế khác, dễ dàng dùng cho âm đạo mà không gây kích ứng Các nghiên cứu trước đó liên quan đến việc sử dụng men vi sinh đặt âm đạo đã có từ những năm 1990 của thế kỷ 20 Nghiên cứu của Reid và cộng sự (1992) đã kiểm tra việc tái phát nhiễm trùng đường tiết niệu (UTIs) ở những phụ nữ đã dùng thuốc đặt âm đạo có chứa probiotics, và sau đó sử dụng thuốc đặt âm đạo, chỉ 21% phụ nữ bị nhiễm trùng tiểu tái phát, so với 47% được quan sát thấy ở những phụ nữ được cho dùng giả dược Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hiệu quả và an toàn của những phương pháp điều trị như vậy Trong một nghiên cứu của Uehara và cộng sự (2006), các tác giả chỉ ra rằng thuốc đặt âm đạo với L crispatus GAI 98332 có thể giảm đáng kể sự tái phát của UTI mà không gây ra những biến chứng bât lợi trong quá trình điêu trị Trong nghiên cứu này, thuốc đặt âm đạo có chứa 1 × 10 8 CFU/g đã được dùng cho mỗi bệnh nhân, hai lần một ngày, trong suốt 1 năm Lý do tại sao nghiên cứu này đã được chứng minh là rất hứa hẹn có liên quan đến việc lựa chọn một dòng ổn định hơn, được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh, được biết đến với khả năng sản xuất hydrogen peroxide, cũng như khả năng dính vào biểu mô âm đạo Ba công thức thuốc đặt âm đạo được điều chế bằng kỹ thuật đúc, lần lượt chứa bơ ca cao, gelatin đã được glyxirin hóa, và PEG 1000 Thuốc đặt âm đạo gelatin được glycerin hóa có các đặc tính vật lý hài lòng nhất Tương tự, các nghiên cứu với các công thức khác nhau của viên đặt âm đạo có chứa các chủng vi khuẩn khác nhau đã được chứng minh là có triển vọng trong việc vận chuyển men vi sinh [50] Nghiên cứu của Kaewsrichan và cộng sự (2007) điều chế hai công thức âm đạo, cụ thể là viên nén sủi bọt và dựa trên thuốc đặt PEG loại rỗng, có chứa

Lactobacillus, nhằm mục đích duy trì tế bào sống ở mức cao, có đặc tính probiotic thích hợp càng tốt Các tác giả này đã chuẩn bị thuốc đặt âm đạo theo phương pháp thông thường và theo phương pháp kiểu rỗng Phương pháp kiểu rỗng được phát triển bởi Watanabe and Matsumoto (1986) để nghiên cứu hiệu quả của các chât hoạt tính khi quản lý bằng đường trực tràng Thuốc đặt âm đạo có tá dược cơ bản được sử dụng là hỗn hợp của PEG và phương pháp điều chế là phương pháp kiểu rỗng đã được chứng minh là thích hợp nhất để sử dụng Lactobacillus âm đạo, liên quan đến việc phát tán nhanh chóng và sự ổn định vi sinh Các phương pháp kiểu rỗng có thể loại bỏ nhược điểm của hệ thống sưởi về sự tồn tại của lactobacillus trong quá trình chuẩn bị và cả tương tác giữa những vi sinh vật này và tá dược của thuốc đặt Gần đây hơn, nghiên cứu của Rodrigues (2011) đã phát triển hai công thức thuốc đặt âm đạo với PEGs và Witepsol H12 cho việc kiểm soát L acidophilus trong âm đạo Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng sự kết hợp của vi khuẩn đông khô trên tá dược không làm mất đi đáng kể lượng vi khuẩn sống, làm nảy sinh ý tưởng rằng những viên đặt âm đạo này có đặc tính tốt để thúc đẩy sự thay thế của vi khuẩn âm đạo trong tình huống nhiễm trùng tiểu

1.5.4 Các tiêu chí lựa chọn viên nang, ống nhựa và công thức phối trộn trong chế phẩm

Sản phẩm dạng viên nang hay dạng ống uống được nhiều người lựa chọn vì dễ sử dụng, dễ bảo quản mà vẫn mang lại hiệu quả cao

Hiện nay việc nhiều sản phẩm probiotic từ các chủng Lactobacillus trên Thế giới đã có sẵn trên thị trường Dựa vào những ưu điểm và đặc tính của các sản phẩm đó, nhóm nghiên cứu sau nhiều lần thử nghiệm đã lựa chọn vỏ nang cứng gelatin số 0 có màu trắng ngà vì loại vỏ nang có màu sắc săc sỡ thường cho người sử dụng có cảm giác đang dùng thuốc kháng sinh Bên cạnh đó, với viên đặt phụ khoa nhìn chung càng không nên sử dụng các vỏ nang có màu vì sẽ gây nhầm tưởng về bệnh tật khi dịch âm đạo có màu sắc Về kích cỡ, vỏ nang số 0 được lựa chọn do kích cỡ này được dùng phổ biến cho hầu hết các thực phẩm chức năng dạng viên nang cứng có khối lượng 500 mg Không những vậy viên nang số 0 còn có thời gian bảo quản cao từ 3-5 năm, thời gian tan rã nhanh từ 5-10 phút, phù hợp với sản phẩm dạng đặt Để bảo quản được chủng Lactobacillus sp, nhóm nghiên cứu đã mất rất nhiều thời gian, từ tìm chât bảo vệ trộn trước quá trình đông khô đến các tá dược giúp nâng cao độ bền của sản phẩm Đông khô là phương pháp được sử dụng rộng rãi để bảo quản và lưu trữ các mẫu sinh học dài hạn Tuy nhiên, trong quá trình đông khô, các tế bào vi khuẩn phải đối măt với các điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ thâp cũng như hoạt độ nước thấp gây nên tổn thương câu trúc và sinh lý cho các tế bào vi khuẩn dẫn đến mất khả năng sống sót của nhiều loài Do đó, để ngăn ngừa hoặc giảm các tác dụng phụ không mong muốn này, các chất bảo vệ thường được thêm vào các mẫu trước khi đông lạnh hoặc đông khô Hơn nữa, mật độ sống sót của các chủng vi khuẩn chắc chắn sẽ giảm theo thời gian nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng Do vậy việc tìm được công thức phối trộn phù hợp để mật độ vi khuẩn sống cao sau khi đông khô là điều vô cùng quan trọng.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu

- 2 chủng lợi khuẩn Lactobacillus rhamnosus H1 và Lactobacillus reuteri H2 đã được phân lập tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ và mẫu dịch âm đạo phụ nữ Việt Nam

- Chủng đối chứng Lactobacillus reuteri VTCC 910087 của phòng thí nghiệm Các chủng vi sinh vật được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh Vật học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

- Tá dược: lactose, ascorbic acid, maltodextrin, skimmilk, NaCl,

- Vỏ nang cỡ ∅0 đóng 500mg, hộp thủy tinh,

*Hóa chất và môi trường nghiên cứu

Các hóa chất được sử dụng là các hóa chất chuẩn của các hãng Merck (Đức), Nhật và Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam có độ tinh khiết cao đảm bảo trong nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất chế phẩm

Môi trường MRS nuôi cấy các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus

Môi trường MRS agar (môi trường thạch):

Thành phần Khối lượng/Thể tích Đường 20 g

Chuẩn pH 6,0 - 6,2 Khử trùng ướt môi trường 110 o C trong 20 phút

Môi trường MRS broth (MRSB): giống như trên nhưng không có CaCO3 và agar

Thiết bị

*Thiết bị phòng thí nghiệm

Các thiết bị trong phòng thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu, tối ưu quy trình và kiểm định chất lượng được sử dụng theo như liệt kê dưới đây

Tên và model của thiết bị Xuất xứ

1 Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB –

2 Bình khí N2 pure và dây dẫn khí để tạo môi trường kỵ khí (Model: Tornado LS/B –He)

3 Cân điện tử để xác định trọng lượng các thành phần của môi trường (Model: Precisa 310M)

4 Box cấy kỵ khí (Model: Whitley VA 500 workstation)

5 Tủ ổn nhiệt (Imperia III) Anh

6 Máy đo OD để xác định khả năng sinh trưởng của vi Mỹ sinh vật (Model: Biomate 3; Serial No: 2KBK 138001)

7 Máy PCR (Mastercycler, Eppendorf) Đức

8 Hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik) Pháp

9 Máy FEI Nova NanoSEM 450 Nhật

10 Kính hiển vi quang học Olympus Nhật

*Thiết bị sản xuất lên men sinh khối vi khuẩn

Các thiết bị sản xuât lên men sinh khối vi sinh được sử dụng theo như liệt kê dưới đây:

Tên thiết bị Thông số kỹ thuật

1.Hệ thống lên men 125L (cho

Inox 125L; tự động điêu khiển nhiệt độ 30-110 o C và vòng cánh khuấy 50-300 vòng/phút Áp suât hoạt động tối đa: 50 psi ở 300 o F Áp suât hoạt động tối thiểu: 15 psi ở 300 o F

2.Máy ly tâm rổ Thùng quay inox có thể tích 250 lít, tốc độ quay

4.Máy hút chân không đóng gói nguyên liệu

* Thiết bị sản xuất viên nang

Dung tích bình: 2,5 kg Hiệu suất: 2kg/ 24 giờ Nhiệt độ ngưng đá: 55℃

Kích thước mẫu (rộng x cao x Dày): 315 x 345 x

460 mm Cân năng: 28 kg Điện áp : 220 V Công suất : 1,2 Kw Trọng lượng : 25 kg Chiều dài thanh hàn : 300mm

Các thiết bị sản xuât Lacvagin hồng và Lacvagin tím đêu có xuất xứ từ Trung Quốc và Việt Nam, được sử dụng theo như liệt kê dưới đây:

Tên thiết bị Thông số kỹ thuật

1 Máy phối trộn Buồng trộn hình bát giác chất liệu inox SUS304, dày 2,5 mm Công suất: 150kg/mẻ

2 Máy đóng nang Năng suất: 10.000-20.000 nang/giờ

Kích cỡ nang:∅00- ∅5; ∅A- ∅E Độ chính xác đóng nang >98% Độ chân không tách nang: -0.04- -0.08 Mpa

3 Máy lau nang Độ ồn < 65dB(A)

Công suất: 2.9kWNgoại áp suất tĩnh: 240PaLưu lượng khí: 400 m3/giờNguồn điện: 2200V/ph/50Hz7.000 nang/phút

4 Thiết bị đóng lọ Độ ồn < 65dB(A)

Công suất: 2.9kW Ngoại áp suất tĩnh: 240Pa Lưu lượng khí: 400 m3/giờ Nguồn điện: 2200V/ph/50Hz 3.000 viên/giờ

5 Thiết bị in date trên vỏ hộp Năng suất 200 nhãn/phút

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định tính chất sinh lý sinh hoá của 2 chủng Lactobacillus sp được tuyển chọn

Các chủng Lactobacillus sp được tuyển chọn và các chủng chuẩn, tham chiếu (tạm gọi là các chủng đối chứng) được nuôi tĩnh trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH ~ 6), nhiệt độ 37 o C, dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường MRS lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0.2, tương đương 10 6 CFU/mL) và tiếp tục nuôi lắc Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫu bằng máy đo quang phổ ở OD620 và vẽ đường cong sinh trưởng tại các mốc thời gian

*Khả năng sinh axit lactic

Thí nghiệm này được thực hiện song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng Sau khi tiếp giống, chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng tiếp tục được nuôi tĩnh ở 37 o C trong môi trường MRS chuẩn pH ~6 Tại mỗi mốc thời gian, hút ra

10 mL dịch nuôi lắc, ly tâm và cho vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 20 mL nước cât và 1-2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90 o ) Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuât hiện màu hồng nhạt bên trong 30 giây thì dừng lại Ghi lại thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ Độ axit tính theo độ Therner: o T = VNaOH tiêu tốn x 10,

% axit lactic = o T x 0,009; trong đó: o T là độ Therner, 1 o T tương ứng với 9 mg axit lactic [6]

*Khả năng chịu muối mật

Dựa theo phương pháp của Todorov và đồng tác giả (2011); Colombo và đồng tác giả

(2018), phương pháp thử khả năng chịu muối mật của chủng tuyển chọn được thực hiện như sau: Nuôi tĩnh chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng chuẩn pH ~ 6, nhiệt độ 37 o C, dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ

Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường muối mật 0.3% và 3% lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (mật độ tế bào 3.10 7 CFU/mL) và tiếp tục nuôi với điều kiện như trên Chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS không chứa muối mật được dùng làm đối chứng Đo OD620 và đếm mật độ tế bào tại thời điểm 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc ở 37 o C để xác định khả năng chịu muối mật của chủng vi khuẩn được tuyển chọn

Nuôi tĩnh chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (pH

~ 6), nhiệt độ 37 o C, dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ Sau đó tiếp giống (10%) sang các bình chứa môi trường MRS đã chuẩn pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và

6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M) sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~0,2) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên Đo OD620 và đếm mật độ tế bào tại 0 giờ và sau 3 giờ để xác định khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [21,26]

2.3.2.Phương pháp đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng Lactobacillus sp được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro

Các chủng phân lập được sẽ được nuôi cấy trong môi trường thạch MRS hay LB có bổ sung thờm 250àg/mL 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine (Sigma-Aldrich, USA) và 0,01 mg/mL horse radish peroxidase (Sigma-Aldrich, USA) Với các chủng kỵ khí, nuôi trong bình kỵ khí ở 37 o C, 48 giờ, sau đó bỏ ra ngoài hiếu khí 30 phút Đối với các chủng hiếu khí, nuôi trong tủ 37 o C, ở 48 giờ sau đó cho vào tủ lạnh Sau đó, quan sát màu xanh dương xuất hiện trên đường cấy Thí nghiệm được lặp lại 3 lần [21,50] Cường độ màu xanh dương tỷ lệ với khả năng sinh H2O2, được trình bày chi tiết ở Bảng 2.1 và Hình 2.1

Bảng 2.1: Kí hiệu thể hiện cường độ màu và khả năng sinh H 2 O 2

+++ Sinh ra lượng lớn H 2 O 2 (xanh dương nhiêu, đậm) ++ Sinh ra lượng trung bình H 2 O 2 (xanh dương đậm) + Sinh ra ít H 2 O 2 (xanh dương nhạt)

- Không sinh H 2 O 2 (màu giữ nguyên)

Hình 2.1: Phản ứng tạo màu xanh dương phản ánh sinh H 2 O 2 của các mẫu

*Khả năng tạo màng biofilm

Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điêu kiện nuôi cây tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể hay bề mặt môi trường thạch nuôi cây [49,70] Đối với các chủng Lactobacillus sp việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng biofilm được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v), với các bước như sau:

Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật probiotics sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cây kích hoạt trong bình tam giác chứa 10 ml môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37 o C (hiếu khí & kỵ khí tùy chủng) sao cho mật độ tế bào OD620 ~0,2, tương đương 10 6 CFU/mL

Hút 100 l dịch nuôi cấy vi khuẩn đã nuôi lắc bổ sung vào 700 l MRSB trong các ống eppendorf 1,5 ml đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37 0 C

Sau 24 giờ, các dịch nuôi cây được loại bỏ khỏi các ống eppendorf Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo OD620 của dịch nuôi cấy vi khuẩn

Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật theo các bước sau:

+ Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng

+ Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng

+ Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh

+ Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1ml ethanol 70 o Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD570

*Khả năng sinh các chất kháng khuẩn ức chế các vi sinh vật gây bệnh

Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nâm có hại bằng phương pháp đục lỗ thạch: sau khi nuôi các chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở 37 o C trong môi trường thạch MRS pH 6,0 hay LB pH 7,0 rồi nhỏ 150 àL dịch nuụi lắc vào mỗi lỗ thạch trờn đĩa mụi trường đã được cấy trải các chủng chuẩn gây bệnh: S aureus ATCC 25923, E coli ATCC 25922 và nâm C albicans JCM 2070 Quan sát đĩa thạch sau 24 đến 48 giờ và đo đường kính vòng ức chế xung quanh lỗ thạch nếu có (D – d, mm; trong đó: D là đường kính vòng ức chế, mm; d là đường kính lỗ thạch, mm) [3]

2.3.3.Nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng Lactobacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm, tạo probiotic dạng bột và bảo quản

* So sánh sinh khối tế bào ở 2 chế độ nuôi lắc và nuôi tĩnh của các chủng

- Chuẩn bị môi trường MRS lỏng đã khử trùng, sau đó cấy các chủng vi khuẩn từ bình giống cấp 1 (với cùng lượng OD đầu vào ~0,2, tương đương 10 6 CFU/mL) vào môi trường và để ở 2 điều kiện trong 24 giờ: Điều kiện 1: Vi khuẩn nuôi kỵ khí trong điều kiện tĩnh, ở 37 o C Điều kiện 2: Vi khuẩn nuôi kỵ khí trong điều kiện lắc 100 rpm ở 37 o C

- Đo OD bước sóng 620 nm và đếm số lượng tế bào sau 24 giờ ở các điều kiện và nhận xét sự chênh lệch

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

* Khảo sát khả năng phát triển của các chủng Lactobacillus sp ở các nhiệt độ khác nhau