Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ trong cây và Đất trồng chè

Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ trong cây và Đất trồng chè

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu đất được thu tại 2 vùng trồng chè tại xã Hùng Sơn (Anh Sơn, Nghệ An) và xã Phú Thịnh (Đại Từ, Thái Nguyên)

- Chủng vi sinh vật phân giải lân hữu cơ (OP) được phân lập từ đất trồng chè

- Đất nông nghiệp khu vực thâm canh chè có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (OP)

Phạm vi nghiên cứu

- Khu vực đất trồng chè thuộc Hợp tác xã chè Minh Sáng, xã Hùng Sơn, huyện Anh Sơn, Nghệ An

- Khu vực đất trồng chè thuộc xã Phú Thịnh, huyện Đại Từ, Thái Nguyên

 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2021 đến tháng 8 năm 2022

Địa điểm phân tích mẫu đất và vi sinh vật (VSV) gồm có: Phòng thí nghiệm của Viện Môi trường Nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn; Phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Phòng thí nghiệm của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập và kế thừa số liệu

Tổng quan tài liệu có liên quan đến đề tài như TBVTV gốc lân hữu cơ, vi sinh vật phân giải lân hữu cơ, tình hình sử dụng TBVTV trên cây chè… từ các công trình nghiên cứu, các báo cáo, sách báo, tạp chí khoa học trong và ngoài nước liên quan đến vấn đề nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

2.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Thu mẫu đất hình ziczac, sâu 20cm tại 5 vị trí trên luống chè Trộn đều các mẫu và lấy 1 mẫu đại diện nặng 2kg Đóng gói mẫu bằng bao nylon màu nâu sẫm, ghi ký hiệu và trữ lạnh Tại phòng thí nghiệm, mẫu được chia thành nhiều phần nhỏ để làm giàu trên môi trường chứa vi khuẩn gốc lân hữu cơ phân hủy OP.

Sơ đồ lấy mẫu được lấy như hình 2.1 và 2.2; tọa độ lấy mẫu như Phụ lục 2

Hình 2.1 Sơ đồ lấy mẫu tại xã Anh Sơn, huyện Hùng Sơn, tỉnh Nghệ An

Hình 2.2 Sơ đồ lấy mẫu tại xã Phú Thịnh, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên

2.3.2.2 Phương pháp lấy mẫu chè

Trước khi tiến hành lấy mẫu chè, cần tiến hành rải đều chè trên bề mặt nền nhà với độ dày không quá 30cm Đối với lô chè có khối lượng dưới 1 tấn, lấy mẫu ở 5 vị trí cố định Trường hợp lô chè có khối lượng trên 1 tấn, số lượng vị trí lấy mẫu sẽ tăng lên từ 8 đến 9 vị trí.

Khi lấy mẫu phải bốc chè từ trên mặt đến nền, tổng khối lượng mẫu của 1 lô hàng không ít hơn 1 kg

Lượng mẫu trên được trộn và rải thành lớp phẳng hình vuông Chia mẫu theo hai đường chéo, lấy hai phần đối diện và tiếp tục làm như vậy cho đến khi lượng mẫu còn lại khoảng 200 g (hoặc 400 g nếu cần phải lưu mẫu)

QCVN 01 – 28: 2010/BNNPTNT: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia: chè – Quy trình lấy mẫu phân tích chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm [7]

2.3.2.3 Phương pháp bảo quản mẫu

Mẫu được bọc kín trong túi đen hoặc trong thùng xốp để tránh ánh nắng, tia UV và được bảo quản lạnh bằng đá trong quá trình vận chuyển

2.3.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải TBVTV gốc lân hữu cơ (OP)

Từ các mẫu đất nghiên cứu, tiến hành phân lập các vi sinh vật được thực hiện như sau:

+ Làm giàu mẫu đất: 5g mẫu đất được chuyển vào 95 mL môi trường MSM chứa TBVTV gốc lân hữu cơ (50 mg/L Chlorpyrifos) và lắc 120 rpm trong điều kiện nhiệt độ

+ Quá trình làm giàu lặp lại ít nhất 3 lần 5mL dịch nuôi cấy được bổ sung vào 95mL môi trường có chứa 50 mg/L Chlorpyrifos

+ Dung dịch làm giàu lần cuối được pha loãng đến các nồng độ pha loãng khác nhau, sau đú hỳt 50àl ở cỏc nồng độ 10 -3 - 10 -5 cấy trờn cỏc đĩa mụi trường MSM chứa TBVTV lân hữu cơ (50 mg/L Chlorpyrifos) và không chứa TBVTV lân hữu cơ làm đối chứng Sau khi ủ 28 o C các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri chứa Chlorpyrifos mà không xuất hiện khuẩn lạc tương tự trên đĩa đối chứng thì được cấy ria tinh sạch trên môi trường MSM có chứa cơ chất OP cho tới khi các khuẩn lạc đồng nhất (có cùng hình dáng, màu sắc )

2.3.4 Phương pháp đánh giá khả năng phân giải lân hữu cơ (OP) của các chủng vi sinh vật Đánh giá khả năng phân giải OP của các chủng đã phân lập trên môi trường dịch thể Các bước thực hiện như sau:

1 Nhân nuôi sinh khối các chủng cần đánh giá trên môi trường giàu dinh dưỡng như

2 Thu hoạch tế bào ở cuối pha sinh trưởng (khoảng sau 48 giờ nuôi cấy), rửa tế bào

3 lần bằng môi trường MSM đã khử trùng [33]

3 Cho tế bào vi khuẩn sau khi rửa vào môi trường MSM chứa OP ở nồng độ 100 mg/L sao cho mật độ OD ban đầu đạt 0,5

4 Thu mẫu sau mỗi 24h để phân tích nồng độ OP trong mẫu bằng bản sắc ký bản mỏng TLC hoặc đo bước sóng tại 294nm (đối với Chlorpyrifos) Đồng thời đo mật độ quang học OD620 của mẫu để đánh giá khả năng tăng sinh của từng chủng nghiên cứu

 Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC với cơ chất chlorpyrifos

Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC với cơ chất chlorpyrifos được tiến hành theo nghiên cứu của Kim et al (2013) [44]

Mẫu dung dịch được chiết bằng dung môi dicloromenthan với tỉ lệ thể tích 1:1 (v/v) và được quay chõn khụng giảm thể tớch 2 àl mẫu được chấm lờn bản mỏng silicagel (Silica gel 60 F254, Merck Millipore, Đức) chạy với hệ dung môi chloroform: n-hexan (4:1, v/v) Sau đó, mẫu được nhuộm với thuốc thử palladium (II) chloride (Sigma-Aldrich, USA) Chlorpyrifos bắt mầu với thuốc thử tạo màu nâu

 Phương pháp đo phổ chlorpyrifos tại bước sóng 294nm

Phương pháp đo phổ Chlorpyrisfos tại bước sóng 294nm được tiến hành theo nghiên cứu của Zhao et al (2011) [75]

Dung dịch chứa chlorpyrifos được bổ sung 1 thể tích petroleum ether và chiết trong khoảng 1 phút Dịch nổi chứa chlorpyrifos được đo tại bước sóng A294nm

Hình 2.3 Biểu diễn nồng độ của chlorpyrifos ở bước sóng A294nm

 Phương pháp phân tích chlorpyrifos bằng HPLC

Các mẫu chứa chlorpyrifos được lắc với 5 mL acetonitrile và lọc qua màng 0,22

Mm Chlorpyrifos được phân tích bằng HPLC (high performance liquid chromatography) tại 300 nm Cột sử dụng là XDB-C18 (5 Mm, 4.6x250 mm) Pha động là hỗn hợp (80:20, v/v) acetonitrile và đệm (85% Pric acid/nước, 1:1000, v/v) Thời gian lưu của chlorpyrifos là 9,5 phút

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, hóa sinh của các chủng vi sinh vật

Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng VSV được xác định theo kit API20NE (đối với các chủng vi khuẩn Gram (-), không thuộc loại Enterobacter), kit API20E và kit API 50CHB để xác định vi khuẩn Gram (+) Định tên vi khuẩn dựa vào kết quả phân tích

M ật độ qua ng họ c mg/L

Nồng độ của chlorpyrifos ở bước sóng A294nm y = 0.004x + 0.068; R^2 = 0.991Linear (y = 0.004x + 0.068; R^2 = 0.991) của phần mềm APILAB PLUS 3.3.3 kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey

2.3.6 Phương pháp sinh học phân tử trong phân loại các chủng vi khuẩn

 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn

Quy trình tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp CTAB/NaCl của Ausubel et al., 1994 [18]

(1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa trong 1,5 ml nước khử trùng

(2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh trong ở tốc độ 5000 vòng/5 phút để thu sinh khối

(3) Cặn tế bào hũa trong 567 àl TE, 5 àl lyzozym mix đều ủ 37 o C trong 20 phỳt

(4) Bổ sung 3 àl proteaza K, 30 àl SDS 10 % vào dung dịch trờn mix đều ủ 37 o C trong

(5) Sau đú bổ sung 100 àl NaCl 5 M, mix đều, bổ sung tiếp 80 àl dung dịch CTAB/NaCl (10% cetyltrimethylammoium bromide, 0.7 M NaCl) mix đều ủ 65 oC/10 phút

(6) Chiết 1 V hỗn hợp chloroform: isoamyl (24:1), vortex

(7) Ly tâm 12000 vòng/phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung môi hai lần)

(8) Bổ sung 10 àl Na-acetat 3 M, mix đều, bổ sung tiếp 2 V cồn 100 % (lạnh) hoặc 0,7

(9) Để lạnh ở -20 o C ít nhất 4 giờ

(10) Ly tâm 12000 vòng/20 phút thu cặn

(11) Rửa tủa bằng 500 àl cồn 70 o , ly tõm 12000 vũng/10 phỳt, thu cặn

(13) Hũa cặn trong 40 ữ 60 àl TE - ARNaza, ủ ở 37 o C/ 1 giờ

(14) Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm và

280 nm CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là mẫu sạch

(15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza 0.8 %, điện thế 100 V Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1 %/ 10 phút

 Nhân bản đoạn ADN thuộc gen 16S rRNA bằng PCR

Thu nhận đoạn gen 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Pr16F và Pr16R (Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT)

PCR được tiến hành với tổng thể tớch 25 àl/ mẫu: ADN tổng số (1 àl), 16F (1 àl), 16R (1 àl), dNTPs 10 mM (2 àl), Taq polymeraza (0,25 àl), đệm Taq polymeraza 10 X (5 àl), nước khử ion

Chu trình nhiệt: (1) 94 o C - 3 phút, (2) 94 o C - 1 phút, (3) 55 o C – 1 phút, (4) 72 o C -

Lặp lại chu kỳ tăng giảm nhiệt độ 30 lần theo thứ tự: 95 độ C - 2 phút; 55 độ C - 30 giây; 72 độ C - 7 phút Duy trì nhiệt độ 4 độ C Sau phản ứng PCR, tiến hành điện di 5μl sản phẩm trên gel agarose 0,8% với điện áp 100V trong 30 phút để kiểm tra.

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR: Các chủng dương tính được tinh sạch bằng bộ kít Gel jet extraction kit (fermentas)

- Thờm 25àl Binding bufer theo tỷ lệ 1:1 với 25 àl DNA, mix đều

- Chuyển hỗn hợp dungdịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 12000 vòng/phút trong

1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

- Tiếp tục bổ sung 300àl cồn 70º hoặc 500 àl đệm rửa WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột Chuyển cột sang ống Eppendorf mới Mở nắp cho bay hơi cồn

- Bổ sung 20 àl nước khử ion khử trựng, để ở nhiệt độ phũng 1 phỳt và ly tõm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA

 Phương pháp xác định trình tự gen 16s rRNA

(1) Trình tự ADN được xác định bằng kit Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm được phân tích trên máy đọc trình tự tự động ABI 377 (Perkin-Elmer, Mỹ)

(2) Chuỗi nucleoit được xử lý bằng chương trình Bioedit

(3) Truy cập dữ liệu ngân hàng gen EMBL (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh bằng chương trình GENDOC 2.5 (Nicholas, 1999) [46] [54] [68]

(4) Sử dụng chương trình phân tích phả hệ và tiến hóa MEGA 2.1 để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng phân tích

2.3.7 Phương pháp đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật

+ Dựa trên vị trí phân loại và danh mục theo hướng dẫn số 90/679/EWG vào ngày 26/11/1990 của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, độ an toàn tương đối của các chủng VSV được xác định

+ Độ an toàn của các chủng VSV được xác định dựa trên độc lực và khả năng gây bệnh trên động vật của các chủng VSV có lợi sử dụng cho cây trồng theo phương pháp của Cater (1984) [23] Cụ thể, vi khuẩn được cấy chuyển vào môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 18-20 giờ, tiêm 0,5ml canh trùng/chuột nhắt trắng với đường tiêm phúc xoang (PX) và 0,2ml canh trùng/chuột nhắt trắng với đường tiêm tĩnh mạch đuôi (TM) Theo dõi chuột sau 4-10 ngày

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng xử lý OP của các chủng VSV trong đất in vitro – phòng thí nghiệm