Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.Tuyển chọn và đánh giá khả năng sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ (Hợp chất Parathion) trong đất trồng chè.
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung nghiên cứu luận văn “Tuyển chọn đánh giá khả sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu (Hợp chất Parathion) đất trồng chè” cơng trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2022 Học viên Lê Thị Hà Trang ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Phượng Minh đạo, hướng dẫn tận tình sâu sát, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, thầy cô Học Viện Khoa Học Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam môn Công nghệ Môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian tham gia học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh, chị Viện Môi trường nông nghiệp giúp đỡ nhiều sở vật chất, trang thiết bị thí nghiệm, kỹ thuật phân tích, kiến thức thực nghiệm,… để tơi hồn thành chương trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng Binh chủng Hóa học, Thủ trưởng Viện Hóa học Mơi trường qn sự, đồng nghiệp Phịng Cơng nghệ xử lý mơi trường/Viện Hóa học Mơi trường qn nơi công tác quan tâm, tạo điều kiện, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, bạn bè ln động viên mặt để tơi có động lực công việc nghiên cứu khoa học Mặc dù cố gắng trình thực luận văn trình độ kinh nghiệm cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận dẫn đóng góp thêm thầy cô bạn để rút kinh nghiệm hoàn chỉnh luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2022 Học viên Lê Thị Hà Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu 1.2 Tác động hóa chất BVTV gốc OP với môi trường, sinh vật người 1.2.1 Sự chuyển hóa hợp chất OP thể người sinh vật 1.2.2 Tác động tới người 1.2.3 Tác động tới môi trường hệ sinh thái 12 1.3 Hiện trạng sử dụng hóa chất BVTV giới Việt Nam 14 1.3.1 Hiện trạng sử dụng hóa chất BVTV giới 14 1.3.2 Tình hình sử dụng hóa chất BVTV Việt Nam 16 1.4 Tổng quan ứng dụng vai trò vi sinh vật nơng nghiệp 20 1.5 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng xử lý hóa chất BVTV nhóm OP giới Việt Nam 22 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 25 iv 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu [33] [36] 26 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng VSV 26 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy VSV 27 2.2.4 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 27 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả phân giải OP 27 2.2.6 Phương pháp xác định trình tự gen 16s rRNA 28 2.2.7 Phương pháp đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển VSV 29 2.2.8 Phương pháp đánh giá khả xử lý OP chủng VSV đất in vitro - phòng thí nghiệm 29 2.2.9 Phương pháp sắc kí khối phổ (GC-MS) 30 2.2.10 Phương pháp xử lý, phân tích thống kê số liệu 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Phân lập vi sinh vật có khả phân giải hóa chất BVTV gốc OP (Parathion) 31 3.2 Đánh giá khả phân giải OP 33 3.3 Xác định tên chủng VSV P1 35 3.4 Đặc điểm hình thái chủng Microbacterium paraoxydans P1 37 3.5 Đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 39 3.5.1 Đánh giá ảnh hưởng nguồn Cacbon 39 3.5.2 Đánh giá ảnh hưởng nguồn Nito 40 3.5.3 Đánh giá ảnh hưởng pH 41 3.5.4 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ 42 v 3.6 Đánh giá khả phân giải Parathion chủng Microbacterium paraoxydans P1 đất in vitro 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ thực vật NN&PTNT : Nông nghiệp phát triển nông thôn LB : Luria-Bertani MSM : Minimal salt medium - Môi trường muối khoáng tối thiểu OD : Độ hấp thụ quang OP : Organophosphate - Lân hữu rpm : Revolutions per minute - Vòng phút VSV : Vi sinh vật vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại theo cơng thức hóa học chất BVTV nhóm OP [5] Bảng 2: LD50 số hợp chất OP [13] 11 Bảng 1: Vị trí chủng VSV sống mơi trường có chứa Parathion xuất mẫu đất 31 Bảng 2: Mật độ vi sinh vật theo thời gian 33 Bảng 3: Dư lượng Parathion sử dụng chủng VSV 33 Bảng 4: Độ tương đồng gen 16s rARN với chủng VSV 36 Bảng 5: Điều kiện nhân sinh khối chủng Microbacterium paraoxydans P1 43 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh số loại hóa chất BVTV Hình 2: Cơng thức hóa học hợp chất OP [4] Hình 3: Cơng thức hóa học parathion [5] Hình 4: Những đường hóa chất BVTV xâm nhập vào thể người [11] 10 Hình 5: Chu trình phát tán hóa chất BVTV hệ sinh thái [12] 12 Hình 6: Quy mơ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật số nước phát triển [21] 15 Hình 7: Hình ảnh phun thuốc trừ sâu chè 19 Hình 1: Vị trí lấy mẫu đất 32 Hình 2: Dư lượng Parathion mẫu sau khoảng thời gian 34 Hình 3: Hình thái khuẩn lạc mơi trường LB 37 Hình 4: Cây phát sinh chủng loại chủng Microbacterium paraoxydans P1 38 Hình 5: Chủng Microbacterium paraoxydans P1 quan sát kinh hiển vi điện tử 38 Hình 6: Ảnh hưởng nguồn Cacbon tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 39 Hình 7: Ảnh hưởng nguồn Nito tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 40 Hình 8: Ảnh hưởng pH đến tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 41 Hình 9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 42 Hình 10: Đánh giá dư lượng Parathion thay đổi mật độ VSV 44 MỞ ĐẦU Thuốc trừ sâu phần thiếu việc canh tác nông nghiệp tăng suất trồng, đóng vai trị quan trọng việc đáp ứng nhu cầu lương thực ngày tăng nhân loại Tuy nhiên, thời gian gần đây, việc đẩy mạnh sử dụng loại phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hoạt động nông nghiệp để giúp trồng phát triển nhanh, diệt trừ sâu bệnh nâng cao sản lượng khiến cho đất đai bị bạc màu, thối hóa, làm cân sinh thái đất, ảnh hưởng tiêu cực tới môi trường sức khỏe người Trong số loại hóa chất bảo vệ thực vật, hợp chất phốt hữu cơ, chất độc hại biết tới sử dụng nhiều sản xuất nông nghiệp Sau thời dài tiếp xúc, chất tích tụ mơ mỡ động vật tham gia vào chuỗi thức ăn, tích lũy sinh học Có thể thấy tác động nguy hại OP mắt xích cao chuỗi thức ăn, lồi chim săn mồi hay người OP nhiều nghiên cứu chứng minh loại chất độc nguy hiểm, khơng tác động đến số loại côn trùng, động vật hoang dã, mà mối nguy hại tiềm tàng sức khỏe người, đặc biệt trẻ nhỏ phụ nữ có thai Những tác động OP lên người hệ sinh thái nguyên nhân lý giải cho việc nhiều quốc gia giới, đặc biệt quốc gia phát triển việc sử dụng loại hóa chất BVTV ngày bị ngăn cấm Hầu hết quốc gia hạn chế cấm việc sản xuất sử dụng loại hóa chất Tại nhiều tỉnh, thành phố Việt Nam, chè dần trở thành loại công nghiệp phát triển ổn định, mang đến hiệu kinh tế cao, tạo nhiều việc làm mang đến nguồn thu nhập ổn định cho nhiều người dân Hiện nay, theo số liệu thống kê Hiệp hội chè Việt Nam, nước ta đứng thứ diện tích thứ sản lượng chè giới Tính đến năm 2020, nước có 34 tỉnh, thành phố trồng chè, tổng diện tích lên tới 123.000 Nhu cầu sử dụng sản phẩm từ chè giới lớn, Việt Nam quốc gia mạnh sản lượng chè Tuy nhiên, chất lượng vệ sinh, an toàn thực phẩm sản phẩm chè nước ta chưa đáp ứng yêu cầu chất lượng thị trường quốc tế, đặc biệt quốc gia phát triển Do trình trồng chăm sóc chè, bà lạm dụng hóa chất BVTV, khi, quy định dư lượng hóa chất BVTV chè thị trường lớn ngày nghiêm ngặt Hiện nay, việc ứng dụng khả phân huỷ sinh học VSV hóa chất BVTV trở thành phương án hữu ích để xử lý dư lượng hóa chất BVTV đất Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn đánh giá khả sử dụng chủng vi sinh vật xử lý dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu (Hợp chất Parathion) đất trồng chè” thực nhằm phân lập tuyển chọn chủng VSV có tác dụng phân giải chuyển hóa hóa chất BVTV gốc lân hữu cơ, giúp giảm thiểu ô nhiễm OP đất giúp nâng cao suất chất lượng trồng, cải thiện chất lượng đất Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả xử lý lượng hóa chất BVTV gốc lân hữu (Hợp chất Parathion) đất trồng chè, điều kiện cho sinh trưởng phát triển chủng khả sử dụng Nội dung nghiên cứu: - Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân giải hóa chất BVTV có chứa gốc lân hữu (hợp chất Parathion) - Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật - Đánh giá, xác định khả phân giải Parathion chủng VSV đất in vitro - phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học đề tài: Luận văn cung cấp thông tin, kết nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả xử lý dư lượng hóa chất BVTV gốc lân hữu đất trồng chè (Hợp chất Parathion) Nghệ An đánh giá tiềm ứng dụng chủng vi sinh vật để xử lý khu vực đất nhiễm OP 36 ACCCACTGCAGGCCCGAGGTTGAGCCTCGGGATTTCACAGCAGAC GCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGATA ACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGC CGGCGCTTTTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTAA AAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTTGC TGCATCAGGCTTCCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTC CCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACC CTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGACGCCTTGGTGAGCCATTACCTCA CCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGCCCATCCCCAACCGAAAAATCT TTCCAAACGCAGACCATGCGGTCACGTCACATATCCAGTATTAGAC GCCGTTTCCAGCGCTTATCCCAGAGTCAGGGGCAGGTTGCTCACGT GTTACTCACCCGTTCGCCACTGATCCCACAGAGCAA Dựa theo đoạn gen 16S rARN chủng VSV, kết hợp với liệu Ngân hàng GenBank, vị trí phân loại chủng VSV nghiên cứu xác định Bảng 4: Độ tương đồng gen 16s rARN với chủng VSV STT Mã Thông tin chung % tương đồng MK875470.1 Microbacterium paraoxydans AN2 99,2 MK559995.1 Microbacterium sp.5 98,5 KY565402.1 Microbacterium Pesticide resistant KX350116.1 Microbacterium sp.BAB-4338 97,1 KP780213.1 Microbacterium SMV195#22 paraoxydans 97,5 KJ854553.1 Microbacterium AO20b2 paraoxydans paraoxydans 98,6 97,3 37 Từ bảng 3.4 cho thấy, chủng VSV P1 có độ tương đồng gen 16s rARN 99,2% với chủng Microbacterium paraoxydans AN2 Do đó, đề tài đặt tên chủng VSV P1 Microbacterium paraoxydans P1 3.4 Đặc điểm hình thái chủng Microbacterium paraoxydans P1 Chủng vi sinh vật sau chọn lọc quan sát đặc điểm hình thái Đặc điểm quan sát sau 24 nuôi cấy môi trường LB 30oC + Hình thái khuẩn lạc mơi trường LB: Khuẩn lạc đặn, bóng, màu ngà vàng, đường kính khoảng - mm, khơng sinh sắc tố Hình 3: Hình thái khuẩn lạc mơi trường LB + Hình thái tế bào quan sát kính hiển vi điện tử: Tế bào có kích thước 0,5 x 1,0µm, dạng hình que, đứng đơn 38 Microbacterium huteolun IFO 15074 Microbacterium saperdae IFO 15038 Microbacterium maritypicum DSM 12512 Microbacterium oxxydans DSM 20578 Microbacterium paraoxydans P1 Microbacterium paraoxydans CF36 Microbacterium oleivorans DSM 16091 Microbacterium thalassium IFO 16060 Microbacterium yannicii G72 Microbacterium testaceum DSM 20166 Curtobacterium hiteum DSM 20542 Hình 4: Cây phát sinh chủng loại chủng Microbacterium paraoxydans P1 Hình 5: Chủng Microbacterium paraoxydans P1 quan sát kinh hiển vi điện tử 39 3.5 Đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 Từ kết sàng lọc, tuyển chọn từ chủng VSV lựa chọn, chủng VSV Microbacterium paraoxydans P1 xác định có khả phân giải Parathion tốt 3.5.1 Đánh giá ảnh hưởng nguồn Cacbon Nguồn Cacbon yếu tố có tác động đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật trình trình phân hủy Parathion Ở thí nghiệm này, sử dụng nguồn Cacbon từ chất: Glucozo, lactozo, mantozơ, saccharose Bổ sung loại đường tới nồng độ 1% vào môi trường MSM với 0,1% cao nấm men cung cấp yếu tố sinh trưởng, có sử dụng mẫu đối chứng Kết ảnh hưởng nguồn Cacbon lên trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 thể hình đây: 80000000 70000000 60000000 50000000 CFU/mL Không bổ sung Glucozo 40000000 Lactozo 30000000 Saccarozo 20000000 10000000 12h 24h 36h 48h Thời gian 60h 72h Hình 6: Ảnh hưởng nguồn Cacbon tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 Từ hình 3.6 nhận thấy, môi trường bổ sung Glucozo, Saccarozo, Mantozo tế bào bắt đầu trình sinh trưởng, phát triển nhanh sau 12 - 48 nuôi cấy, môi trường bổ sung Lactozo, tế bào phát triển nhanh sau 40 12 - 60 nuôi cấy, thể việc mật độ vi sinh vật tăng nhanh thời gian So sánh mật độ chủng Microbacterium paraoxydans P1 sau thêm nguồn Cacbon cho thấy, glucozo nguồn phù hợp cho trình phát triển chủng Tại thời điểm sau 48 giờ, mật độ chủng 7,3 x 107 CFU/mL (đối với nguồn Cacbon glucozo) Các nguồn Cacbon lại có mật độ vi sinh vật thấp thời điểm khác Sau thời gian 72 giờ, mật độ chủng vi sinh vật không tăng có xu hướng đạt đến trạng thái cân sau suy giảm Điều chất dinh dưỡng môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật giảm dần, đó, số tế bào quần thể giảm dần 3.5.2 Đánh giá ảnh hưởng nguồn Nito Để đánh giá vai trò nguồn Nito đến trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 sử dụng nguồn Nito sau: Pepton, cao chiết thịt, cao nấm mem Sử dụng nguồn nồng độ 0,5% mơi trường MSM có nguồn Cacbon glucozo 1%, có sử dụng mẫu đối chứng Kết trình khảo sát, đánh giá vai trị nguồn Nito trình bày hình đây: 90000000 80000000 70000000 60000000 CFU/mL 50000000 40000000 Không bổ sung Cao nấm men Cao chiết thịt 30000000 20000000 10000000 12h 24h 36h 48h Thời gian 60h 72h Hình 7: Ảnh hưởng nguồn Nito tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 41 Từ hình 3.7 nhận thấy, mật độ chủng Microbacterium paraoxydans P1 tăng nhanh sau thời gian từ 12 - 48 nuôi cấy So sánh 03 nguồn Nito cung cấp cho q trình ni cấy chủng mẫu đối chứng, nhận thấy, cao nấm men nguồn có tác dụng tốt cho trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 Giá trị mật độ vi sinh vật cao 8,1 x 107 CFU/mL, thời điểm sau 48 nuôi cấy (đối với nguồn Nito cao nấm men) Sau 48 giờ, trình phát triển chủng chậm lại bắt đầu có xu hướng đạt đến trạng thái cân suy giảm 3.5.3 Đánh giá ảnh hưởng pH Để đánh giá, xác định giá trị pH phù hợp cho trình nhân sinh khối chủng Microbacterium paraoxydans P1 có khả phân hủy Parathion, tiến hành đánh giá giá trị pH = 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 mơi trường MSM có bổ sung nguồn Nito từ cao nấm men nồng độ 0,5%, nguồn Cacbon từ glucozo 1% Kết trình khảo sát, đánh giá trình bày hình đây: 90000000 80000000 70000000 CFU/mL 60000000 50000000 40000000 pH = 6,0 30000000 pH = 6,5 20000000 pH = 7,0 pH = 7,5 10000000 12h 24h 36h 48h Thời gian 60h 72h Hình 8: Ảnh hưởng pH đến tới sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 42 Từ bảng 3.8 nhận thấy, thời gian từ 12 - 48 sau nuôi cấy, mật độ chủng VSV tăng nhanh Qua đánh giá, so sánh mật độ chủng Microbacterium paraoxydans P1 giá trị nhận thấy, pH = 6,5 giá trị phù hợp cho trình sinh trưởng phát triển chủng Tại giá trị pH = 6,0; pH = 7,0 pH = 7,5, trình sinh trưởng phát triển chủng chậm 3.5.4 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ Để xác định nhiệt độ tối ưu cho trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu, tiến hành đánh giá khoảng nhiệt độ từ 25 - 40oC khoảng thời gian khác môi trường MSM có bổ sung nguồn Nito từ cao nấm men nồng độ 0,5%, nguồn Cacbon từ glucozo 1%, pH = 6,5 Kết trình khảo sát, đánh giá trình bày hình đây: 90000000 80000000 70000000 CFU/mL 60000000 50000000 40000000 25 oC 30 oC 30000000 35 oC 20000000 40 oC 10000000 12h 24h 36h 48h Thời gian 60h 72h Hình 9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 Từ hình 3.9 cho thấy, nhiệt độ tốt cho trình sinh trưởng phát triển chủng Microbacterium paraoxydans P1 phân hủy Parathion 43 25oC Khi nhiệt độ tăng cao, trình sinh trưởng phát triển chủng giảm Như vậy, điều kiện nhân sinh khối củng chủng Microbacterium paraoxydans P1 trình bày bảng Bảng 5: Điều kiện nhân sinh khối chủng Microbacterium paraoxydans P1 Chủng Microbacterium STT Điều kiện nhân sinh khối Nguồn Cacbon Glucozo Nguồn Nito Cao nấm men pH môi trường 6,5 Nhiệt độ môi trường 25oC paraoxydans P1 3.6 Đánh giá khả phân giải Parathion chủng Microbacterium paraoxydans P1 đất in vitro Chủng Microbacterium paraoxydans P1 sau lựa chọn lên men mơi trường MSM có bổ sung nguồn Nito từ cao nấm men nồng độ 0,5%, nguồn Cacbon từ glucozo 1%, pH = 6,5, nhiệt độ 25oC 48 giờ, thu sinh khối, mật độ vi sinh vật đạt lúc khoảng 107 CFU/mL Tưới 100g, 10g, 1g sinh khối vào 900g, 990g 999g đất vô trùng bổ sung chất Parathion với liều lượng tương đương 100 mg/kg đất, mật độ vi sinh đất lúc 106 CFU/g, 105 CFU/g, 104 CFU/g Kết thử nghiệm thể hình đây: 44 120 Hàm lượng Parathion (mg/kg) 100 80 y = -10,5x + 114,4 R² = 0,9006 60 y = -21,15x + 124,25 R² = 0,9777 40 y = -17,38x + 123,2 R² = 0,9263 M6 M5 20 M4 ĐC Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Hình 10: Đánh giá dư lượng Parathion thay đổi mật độ VSV Ghi chú: M6: Mẫu đất bổ sung chủng Microbacterium paraoxydans P1 mật độ 106 CFU/g M5: Mẫu đất bổ sung chủng Microbacterium paraoxydans P1 mật độ 105 CFU/g M4: Mẫu đất bổ sung chủng Microbacterium paraoxydans P1 mật độ 104 CFU/g ĐC: Mẫu đối chứng không bổ sung chủng Microbacterium paraoxydans P1 Từ kết hình 3.10 nhận thấy, chủng Microbacterium paraoxydans P1 có tiềm phân giải Parathion ứng dụng xử lý Parathion môi trường đất Ở mật độ vi sinh vật 106 CFU/g, Parathion bị phân hủy nhanh nhiều so với mật độ lại Với mật độ này, phương trình đường chuẩn cho giá trị R2 lớn (R2 = 0,9777) Khi mật độ vi sinh vật tưới vào đất giảm, trình phân hủy Parathion giảm Lượng Parathion đất bị phân giải đạt khoảng 64% sau 10 ngày kể từ nuôi cấy môi trường đất (Đối với mẫu đất bổ sung chủng Microbacterium paraoxydans P1 mật độ 106 CFU/g) Trong đó, mẫu đối chứng, lượng Parathion bị phân hủy sau thời gian 10 ngày đạt khoảng 10% 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ mẫu đất thu thập đất trồng chè, đề tài tiến hành phân lập xác định 03 chủng VSV P1, P2, P3 sinh trưởng phát triển môi trường chứa Parathion với khả phân hủy Parathion từ 50 - 60% thời gian 10 ngày Chủng VSV có khả phân giải tốt lựa chọn chủng P1 với khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có chứa Parathion - Chủng P1 định danh tên chủng Microbacterium paraoxydans sau sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự 16s rARN, với tỉ lệ tương đồng 99,2% - Chủng Microbacterium paraoxydans P1 có điều kiện sinh trưởng phát triển phù hợp là: + Nguồn Cabon: Glucozo; + Nguồn Nito: Cao nấm men; + pH môi trường: 6,5; + Nhiệt độ nuôi cấy: 25oC - Đánh giá khả phân giải Parathion chủng Microbacterium paraoxydans P1 cho thấy, chủng có mặt với mật độ 106 CFU/g đất in vitro chủng có với khả phân hủy đạt khoảng 64% lượng Parathion ban đầu 4.2 Kiến nghị Việc sử dụng vi sinh vật để phân giải lân hữu (Parathion) nhằm mục đích xử lý dư lượng hóa chất BVTV mơi trường đất có nhiều ưu điểm: Khơng gây hại cho người động vật, thân thiện với mơi trường, sử dụng nguồn VSV có sẵn từ đất phù hợp đặc điểm loại trồng, giúp trì nơng nghiệp bền vững Tuy nhiên, q trình tiến hành thí nghiệm, nghiên cứu cịn gặp phải nhiều khó khăn, hạn chế: 46 - Nghiên cứu áp dụng phạm vi hẹp, địa phương loại trồng - Quá trình khảo sát khảo sát số nhiều loại hóa chất BVTV thuộc nhóm lân hữu - Số lượng chủng VSV phân lập chưa đa dạng, phát 01 chủng có khả phân giải Parathion Do vậy, để tăng tính ứng dụng nghiên cứu này, số kiến nghị đưa để tiếp tục trình nghiên cứu, gồm: - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu khả phân giải chủng Microbacterium paraoxydans P1 với loại hóa chất BVTV khác Tìm điều kiện tối ưu khác để nâng cao hiệu xử lý chủng - Tiến hành nghiên cứu nhiều loại trồng nhiều loại đất khác 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cảnh Kỳ, 2021, Vùng ĐBSCL sử dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật mức, Báo Tiền phong [2] Shardendu Kumar & Garima Kaushik & Juan Francisco Villarreal-Chiu, 2016, Scenario of organophosphate pollution and toxicity in India: A review, Environ Sci Pollut Res [3] WHO, Organophophorus insecticides: a general introduction [4] Lucio G.Costa, 2006, Current issues in organophosphate toxicology, Clinica Chimica Acta 366, tr 1- 13 [5] Ramesh C.Gupta, 2006, Toxicologyof Organophosphate and Carbamate Compounds, chapter 2: Classification and Uses of Organophosphates and Carbamates [6] Lê Huy Bá, 2006, Độc học môi trường - Chương 2: Độc học thuốc bảo vệ thực vật, tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [7] Bộ Tài ngun Mơi trường, 2010, Báo cáo Môi trường quốc gia năm 2010, Tổng quan môi trường Việt Nam - Chương 3: Môi trường đất, Hà Nội [8] Nguyễn Thị Phương Anh, Ngô Thị Tường Châu, Tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả phân huỷ thuốc bảo vệ thực vật từ đất trồng rau tỉnh thừa thiên huế, Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr 1389-1394 [9] Phạm Văn Toàn, 2013, Thực trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật số giải pháp giảm thiểu việc sử dụng thuốc không hợp lý sản xuất lúa đồng sơng cửu long, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (28), tr 47-53 [10] ILO, 2000, Safe and health in used chemical agriculture, Labuor Publish Geneva [11] Kaushal Jyoti; Khatri Madhu; Arya Shailendra Kumar, 2021, A treatise on Organophosphate pesticide pollution: Current strategies and advancements in their environmental degradation and elimination, Ecotoxicology and Environmental Safety 48 [12] Tổng cục Môi trường, 2015, Hiện trạng nhiễm mơi trường hóa chất bảo vệ thực vật tồn lưu thuộc nhóm chất hữu có khó phân hủy Việt Nam, Hà Nội [13] Stoytcheva, Margarita, 2011, Pesticides - Strategies for Pesticides Analysis: Organophosphorous Compounds - Toxicity and Detection Approach, Chapter 13 [14] Jason R.Richardson, 2005, Encyclopedia of Toxicology (Second Edition), pp 331-333 [15] Lucio G Costa, 2018, Organophosphorus Compounds at 80: Some Old and New Issues, Toxicological Sciences, 162(1), pp 24-35 [16] Saxena, Gaurav; Bharagava, Ram Naresh, 2020, Bioremediation of Industrial Waste for Environmental Safety (Volume I: Industrial Waste and Its Management): Organophosphate Pesticides: Impact on Environment, Toxicity, and Their Degradation, Chapter 13), pp 265–290 [17] Harsimran Kaur Gill, Harsh Garg, 2014, Pesticides: Environmental Impacts and Management Strategies, pp.187-230 [18] Maurya, P.K., Malik, D.S., 2016, Bioaccumulation of xenobiotics compound of pesticides in riverine system and its control technique: a critical review, Journal of Industrial Pollution Control, 32 (2) [19] Sidhu Gurpreet Kaur, Singh Simranjeet, Kumar Vijay, Dhanjal Daljeet Singh, Datta Shivika, Singh Joginder, 2019, Toxicity, monitoring and biodegradation of organophosphate pesticides: A review, Critical Reviews in Environmental Science and Technology [20] Danh Nguyen Tan, 2021, Current situation and awareness of pesticide abuse in agriculture in Vietnam, ICIES 2020 [21] Policy Department, Directorate-General for External Policies, 2021, The use of pesticides in developing countries and their impact on health and the right to food [22] Sharma Anket, Kumar Vinod, Shahzad Babar, Tanveer Mohsin, Sidhu Gagan Preet Singh, Handa Neha, Kohli Sukhmeen Kaur, Yadav Poonam, Bali Aditi Shreeya, Parihar Ripu Daman, Dar Owias Iqbal, Singh Kirpal, Jasrotia Shivam, Bakshi Palak, Ramakrishnan M., Kumar Sandeep, Bhardwaj Renu, 49 Thukral Ashwani Kumar, 2019, Worldwide pesticide usage and its impacts on ecosystem, SN Applied Sciences, 1(11) [23] Phong Nguyễn, 2020, Trên 100.000 thuốc bảo vệ thực vật nhập năm: Có kiểm sốt chất lượng, Báo Lao động [24] World bank, 2017, An Overview of Agricultural Pollution in Vietnam: The Crops Sector [25] Chau Nguyen Dang Giang, Dang Bao Chau Le, Van Hop Nguyen, Thai Long Hoang, Thi Van Thi Tran, Thi Phuong Linh Huynh, Thi Quynh Trang Nguyen, 2022, Assessment of pesticide use and pesticide residues in vegetables from two provinces in Central Vietnam, Plos One [26] Phúc Ngun, 2016, Vẫn cịn tình trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật sản xuất chè, Thời báo Tài [27] Sở Khoa học cơng nghệ TPHCM, Trung tâm Thông tin khoa học công nghệ, 2017, Xu hướng nghiên cứu sử dụng phân bón hệ [28] Sở Khoa học công nghệ TPHCM, Trung tâm Thông tin khoa học công nghệ, 2017, Sử dụng chế phẩm sinh học canh tác trồng [29] Kumar Shardendu, Kaushik Garima, Dar Mohd Ashraf, Nimesh Surendra, López-Chuken Ulrico Javier, Villarreal-Chiu Juan Francisco, 2018, Microbial Degradation of Organophosphate Pesticides: A Review, Pedosphere, 28(2), pp 190-208 [30] Yaghoob Tahery, Farshid Kafilzadeh, Mehdi Dehdashi, Amir Ashkan Mahjoor, Siamak Mahmoodi Sivand and Hazandy Abdul, 2010, Isolation and identification of Diazinon Degrading bacteria from fresh water: a case stydy on the sediments of lake Parishan in Iran, World Journal of Fish and Marine Sciences, 2(3), pp 240-245 [31] Chitrambalam Sasikala, Sonia Jiwal, Pallabi Rout, Mohandass Ramya, 2012, Biodegradation of chlorpyrifos by bacterial consortium isolated from agriculture soil, World J Microbiol Biotechnol, 28(3), pp.1301-1308 [32] M Mahiudddin, A N M Fakhruddin, Abdullah-Al-Mahin, M A Z Chowdhury, M A Rahman, M K Alam, 2014, Degradation of the organophosphorus insecticide diazinon by soil bacterial isolate, The International Journal of Biotechnology, pp.12-23 50 [33] Lê Thị Trinh, 2013, Bước đầu nghiên cứu chủng vi sinh vật đất cát pha nhiều mùn có khả tham gia trình phân hủy thuốc trừ sâu phốt chứa hoạt chất Diazinon, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, (15), tr 47-50 [34] Nguyễn Văn Lẹ, Dương Minh Viễn, Đỗ Thị Xuân, 2015, Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu diazinon đất chuyên màu số tỉnh đồng sông Cửu Long, Nông nghiệp phát triển nơng thơn, kỳ 2, tr 56-61 [35] Đồn Thị Mộng Thắm, Trần Trung Hiếu, Lương Thị Mỹ Ngân, 2017, Phân lập vi khuẩn phân giải chlorpyrifos từ đất nơng nghiệp, Tạp chí Khoa học trường ĐHSP TPHCM, 14(12), tr 127-138 [36] Trương Quốc Tất, Dương Minh Viễn, 2020, Tuyển chọn đánh giá đa dạng quần xã vi khuẩn hiếu khí phân hủy Chlorpyrifos ethyl đất canh tác nông nghiệp Đồng sông Cửu Long, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2020, tr 390-395 [37] Vaseeharan, B and Ramasamy, P (2003), Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon, Letters in applied microbiology, 36(2), 83 - 87 [38] TCVN 4884-2:2015 - Tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia vi sinh vật chuỗi thực phẩm - Đếm khuẩn lạc 300C cấy bề mặt [39] FM Ausubel, R Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K Struhl, Wiley CJ, RD Allison, M Bittner, S Blackshaw, 2003, Unit 2.4 Basic protocol - Preparation of Genomic DNA from Bacteria - Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons [40] Pailan Santanu, Gupta Debdoot, Apte Snehal, Krishnamurthi Srinivasan, Saha Pradipta, 2015, Degradation of organophosphate insecticide by a novel Bacillus aryabhattai strain SanPS1, isolated from soil of agricultural field in Burdwan, West Bengal, India International Biodeterioration & Biodegradation, 103, pp 191-195 [41] Thi Hue Le, Quang Cuong Hoang, Dinh Duy Vu and Thi Hoai Thu Vo, 2021, Biodegradation of organophosphorus insecticide methyl parathion by soil microorganisms, E3S Web of Conferences