Nghiên cứu sự lưu hành và phân bố bệnh rickettsia Ở bệnh nhân sốt cấp tính tại các bệnh viện thuộc miền trung việt nam giai Đoạn 2018 2019

Nghiên cứu sự lưu hành và phân bố bệnh rickettsia Ở bệnh nhân sốt cấp tính tại các bệnh viện thuộc miền trung việt nam giai Đoạn 2018 2019

TỔNG QUAN

Tác nhân gây bệnh Rickettsia

1.1.1 Phân loại các vi khuẩn gây bệnh Rickettsia

Họ Rickettsiaceae gồm các vi khuẩn Gram âm, sống ký sinh nội bào bắt buộc ở động vật có xương sống Chúng thuộc bộ Rickettsiales, lớp Alphaproteobacteria, ngành Proteobacteria, giới Bacteria [32] Quá trình phân loại các vi khuẩn họ Rickettsiaceae đã trải qua nhiều thay đổi Đến nay, họ Rickettsiaceae được chia thành

2 chi là Rickettsia và Orientia Chúng có quan hệ họ hàng gần với các thành viên của họ Anaplasmataceae bao gồm các chi Ehrlichia, Neorickettsia, Wolbachia và Anaplasma Đây đều là những sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, truyền bệnh cho người theo nhiều phương thức khác nhau trong đó động vật chân đốt đóng vai trò vừa là vector truyền bệnh, vừa là ổ chứa [44]

Các vi khuẩn thuộc chi Rickettsia được Howard Ricketts mô tả lần đầu tiên vào năm 1909 Phân loại ban đầu dựa trên các đặc điểm sinh lý của chúng về khu trú nội bào, nhiệt độ phát triển tối ưu và phản ứng chéo với huyết thanh của một bệnh nhân bị nhiễm chủng Proteus [38] Theo đó Chi Rickettsia được phân thành 2 nhóm gồm (i) sốt dịch tễ (typhus group) và (ii) sốt phát ban (spotted fever group)

Nhóm sốt dịch tễ gồm hai loài R typhi (gây bệnh sốt do bọ chét chuột truyền) và R prowazekii (gây bệnh sốt do chấy rận) Cho đến nay, chỉ có hai loài được xếp vào nhóm này Rickettsia prowazekii được truyền bởi Pediculus humanus - loài rận trên cơ thể người R prowazekii được bài tiết qua phân của chấy rận và truyền cho con người thông qua vết cắn bị trầy xước Căn bệnh này thường liên quan đến điều kiện vệ sinh kém và dân cư quá đông đúc, điều này thúc đẩy sự lây lan của rận từ người này sang người khác R typhi được truyền bởi bọ chét chuột Xenopsylla cheopis, đôi khi là bọ chét mèo Ctenocephalides felis [62]

Nhóm sốt phát ban hiện có ít nhất 30 loài được tìm thấy trên khắp thế giới, trong đó có 21 loài được xác định là tác nhân gây bệnh cho người bao gồm: R rickettsii, R parkeri, R africae, R massiliae, R philipii, R conorii, R sibirica, R

2 slovaca, R raoultii, R monacensis, R aeschlimannii, R helvetica, R heilongjiangensis, R japonica, R honei, R tamurae, Candidatus Rickettsia kellyi, R australis, R mongolotimonae, R felis và R akari Chín loài không rõ khả năng gây bệnh: Candidatus Rickettsia asemboensis, R bellii, R montanensis, R peacockii, R rhipicephali, R monteiroi, R Tombii và R Argasii [31, 56] Khả năng gây bệnh chưa rõ, chủ yếu là do chúng chỉ được phân lập từ động vật chân đốt và chưa được phân lập hoặc phát hiện ở người

Một số loài gây bệnh điển hình trong nhóm này:

- Rickettsia rickettsii được truyền bởi bọ ve Dermacentor andersoni, gây bệnh sốt vùng Rocky Mountain (RMSF) - được đặt tên theo địa danh lần đầu phát hiện ra Đây là loài có độc tính cao nhất với tỷ lệ tử vong 70% trong số các trường hợp được ghi nhận [34]

- Rickettsia conorii, tác nhân gây bệnh sốt phát ban vùng Địa Trung Hải

(Mediterranean spotted fever - MSF) Một số loài được tìm thấy ở các khu vực địa lý khác nhau và đều truyền bệnh qua ve Rhipicephalus sanguineus, được xếp vào loài phụ của Rickettsia conorii Ví dụ: R conorii israelensis - tác nhân gây bệnh sốt đốm Israel (Israel spotted fever - ISF), R conorii caspia - tác nhân gây sốt Astrakhan ( Astrakhan - AF) và R conorii indica - tác nhân gây bệnh sốt phát ban do ve Ấn Độ, ( Indian tick typhus - ITT) Tỷ lệ tử vong do bệnh là cực kỳ hiếm, cao nhất là 2,5% Mức độ nghiêm trọng của bệnh được cho là sự nhạy cảm của vật chủ và độc lực của chủng lây nhiễm [9, 10]

- Rickettsia africae gây bệnh sốt ve châu Phi (African tick bite fever - ATBF)

Ve thuộc chi Amblyomma được báo cáo là vector chính Nhiễm R africae được cho là không có triệu chứng hoặc nhẹ, một vài biến chứng hiếm gặp như: sốt kéo dài, bệnh lý thần kinh bán cấp, mệt mỏi mãn tính và viêm cơ tim Không có trường hợp tử vong nào được báo cáo do nhiễm trùng [2]

R sibirica bao gồm hai phân loài là R sibirica sibirica và R sibirica mongolotimonae Cả hai đều được biết đến là tác nhân gây bệnh sốt phát ban Trong đó, R sibirica sibirica là nguyên nhân gây ra bệnh sốt phát ban do ve Siberia.

(Siberian tick typhus- STT) và R sibirica mongolotimonae là tác nhân gây bệnh Rickettsia liên quan đến viêm hạch bạch huyết [2]

- Rickettsia heilongjiangensis là tác nhân gây bệnh sốt phát ban vùng Viễn Đông- bệnh tương đối nhẹ, hầu hết các trường hợp quan sát được xảy ra ở người cao tuổi, chỉ có một trường hợp dưới 45 tuổi

Phân loại các thành viên mới của chi Rickettsia hiện đại dựa trên so sánh trình tự bộ gen với thông tin sẵn có về các chủng đã công bố Phân tích hệ gen đã phân loại một số loài trong chi này vào hai nhóm mới: Nhóm tổ tiên (AG) và Nhóm chuyển tiếp (TRG), dựa trên các đặc điểm di truyền phức tạp liên quan đến sự tiến hóa của chi Rickettsia.

- Nhóm chuyển tiếp gồm R akari, R australis và R felis, được tìm thấy trên khắp thế giới ở bọ chét mèo, bọ chét khác, người ốm và trong một số báo cáo, cả ở người khỏe mạnh và muỗi R akari gây bệnh Rickettsialpox Đây là một bệnh nhẹ, các ban xuất hiện ở dạng mụn nước giống như bệnh thủy đậu, truyền bệnh chủ yếu qua vector mò, mạt [47] R australis gây bệnh sốt ve Queensland và lây truyền qua bọ ve Ixodes holocyclus [84] R Felis gây bệnh sốt đốm do bọ chét truyền, ban đầu nó được mô tả do bọ chét mèo Ctenocephalides felis gây ra [21] Các nghiên cứu sau đó chỉ ra rằng R.felis có thể truyền qua muỗi và mọt sách (Booklice) [25, 100]

Nhóm tổ tiên Rickettsia bellii, được xác định năm 1983 từ ve cứng và ve mềm ở Hoa Kỳ, được cho là không gây bệnh cho động vật và con người nhưng có thể ảnh hưởng đến sinh thái học và dịch tễ học của các loài ve gây bệnh Trong khi đó, chủng Rickettsia canadensis 2678 được mô tả đầu tiên bởi McKiel và cộng sự, với các chủng H299 và CA410 được phát hiện sau đó ở Canada và California, Hoa Kỳ Bằng chứng huyết thanh học chỉ ra rằng R canadensis có thể gây bệnh sốt ở người.

Khi phân tích trình tự gen 16S rRNA, khoảng khác biệt giữa R tsutsugamushi và các vi khuẩn khác trong chi Rickettsia gần bằng khoảng khác biệt tiến hóa giữa các chi trong họ Rickettsiaceae Vì những lý do này, R tsutsugamushi được tách ra thành một chi riêng, mang tên Orientia vào năm 1995, còn gọi là nhóm sốt mò với loài đầu tiên được ghi nhận là O tsutsugamushi [41] Năm 2006, việc phát hiện ra một thành viên khác của chi Orientia (O chuto) đã nâng số thành viên của nó lên hai loài [42], với “chuto” là tên tiếng Nhật, có nghĩa là “Trung Đông”, chủng nguyên mẫu của loài này là chủng Dubai, được đặt tên theo địa điểm của bệnh nhân bị nhiễm bệnh Một số trường hợp sốt mò gần đây đã được báo cáo trên đảo Chiloé và các vùng khác của miền nam Chile - Nam Mỹ Dựa trên phân tích di truyền 18 mẫu DNA từ các mẫu lâm sàng, mầm bệnh được cho là khác biệt về mặt kiểu gen với O tsutsugamushi và O chuto, được đặt tên là O chiloensis [1] Như vậy tổng số loài trong nhóm sốt mò đến thời điểm hiện tại được nâng lên là 3 loài

1.1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae

1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc, đặc điểm bộ gen

Dịch tễ học các bệnh Rickettsia

1.2.1 Dịch tễ học các bệnh Rickettsia trên thế giới

Bệnh Rickettsia phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực Đông Nam Á là khu vực thường xuyên ghi nhận các trường hợp mắc bệnh do nhóm sốt mò và sốt dịch tễ gây ra.

22, 69] Hầu hết các loài Rickettsiace đều bị giới hạn theo khu vực do điều kiện khí hậu và các hạn chế về vector và vật chủ tự nhiên Cụ thể, đối với nhóm sốt dịch tễ, sốt bọ chét chuột truyền do R typhi là bệnh chủ yếu được báo cáo Các trường hợp sốt phát ban do chấy rận R prowazekii được ghi nhận với số lượng ít Đối với nhóm sốt mò, bệnh sốt mò do O tsutsugamushi được xem là vấn đề y tế công cộng khá nghiêm trọng tại khu vực châu Á – Thái Bình Dương khi hầu hết các quốc gia trong khu vực này đều nằm trong khu vực được xác định là “tam giác sốt mò” [99] Ngoài

15 ra, trong nhóm sốt phát ban, sốt vùng Rocky Mountain do R rickettsii là bệnh được biết đến nhiều hơn cả và phân bố chủ yếu ở châu Mĩ, bao gồm Mexico và Mĩ [8]

Sốt mò là bệnh quan trọng và phổ biến nhất trong số các bệnh Rickettsia Sự lưu hành của sốt mò trên thế giới từ lâu đã được nhấn mạnh trong khu vực địa lý có tên “tam giác sốt mò” (tsutsugamushi triangle) Tam giác này trải dài trên diện tích hơn 8 triệu km 2 từ vùng Viễn Đông nước Nga ở phía Bắc, tới phía Tây là Pakistan, phía Nam là Australia và phía Đông là Nhật Bản (Hình 1.5) [99]

Hình 1.5 Tam giác sốt mò (tsutsugamushi triangle) [99]

Tuy vậy, thuật ngữ “tam giác sốt mò” ở đây chỉ mang ý nghĩa là vùng tập trung và lưu hành phổ biến của bệnh sốt mò chứ không phải giới hạn có và không có sốt mò với phần còn lại của thế giới Thực tế cho thấy, một số ca bệnh sốt mò đã được ghi nhận ngoài tam giác trên như tại UAE, Bắc Mĩ và Kenya nhưng phần lớn do O chuto và Orientia spp gây ra - sau này được xác định là O chiloensis [1, 42, 97] Khu vực Đông Nam Á nằm trọn trong tam giác sốt mò, trong đó Thái Lan, Việt Nam và Indonesia là các quốc gia thường xuyên ghi nhận sự lưu hành của sốt mò [74]

Bệnh sốt mò chủ yếu hoành hành ở người trên 50 tuổi, chiếm hơn 50% các ca mắc bệnh Mặc dù không có sự chênh lệch đáng kể về giới tính, tuy nhiên một số nghiên cứu chỉ ra rằng nghề nghiệp có thể là yếu tố nguy cơ Nông dân và những người hoạt động ngoài trời thường có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn các đối tượng khác Thời điểm xuất hiện và đỉnh dịch của bệnh khác nhau tùy theo quốc gia Ở Hàn Quốc và Ấn Độ, bệnh thường xuất hiện từ tháng 10 đến tháng 12, còn ở Trung Quốc, bệnh có thể xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 11, với đỉnh điểm vào tháng 6 đến tháng 7.

Bệnh sốt bọ chét chuột truyền do R typhi gây ra Bệnh lưu hành trên khắp các khu vực thế giới bao gồm Đông Nam Á, Bắc Mĩ, Địa Trung Hải và Bắc Phi [12, 24,

92] Bệnh phân bố theo mùa, chủ yếu rơi vào các tháng có nhiệt độ cao, thời tiết ấm áp Một nghiên cứu hệ thống khác lại chỉ ra rằng, số các ca bệnh ở nông thôn chiếm phần lớn trong tổng số các ca bệnh [92] Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu tại Texas,

Mĩ [19, 24] hay Đông Nam Á [79, 87, 93] lại cho thấy yếu tố thành thị có mối liên quan mật thiết tới sự phân bố của bệnh Tại các khu vực này, tình trạng dân cư đông đúc, y tế công cộng kém phát triển và điều kiện vệ sinh nghèo nàn là những điều kiện thuận lợi để lây truyền bệnh Ngoài ra, sự gia tăng tỷ lệ dân cư, khiến quỹ đất ngày càng bị thu hẹp do đô thị hóa và xây dựng, làm cho quần thể chuột dễ dàng gia tăng số lượng và tiếp xúc với con người Một nghiên cứu về sự gia tăng lượng kháng thể chống bệnh Rickettsia trên người đã được ghi nhận tại một quốc gia phát triển rất nhanh, đó là Malaysia [79]

Sốt chấy rận do R prowazekii là bệnh hiếm gặp, một số ít trường hợp khách du lịch mắc bệnh đã được ghi nhận Ngoài ra, bệnh cũng được báo cáo gây dịch trên một số quần thể người tị nạn Các vụ dịch này xuất hiện vào các tháng mùa đông [7]

Nhóm sốt phát ban bao gồm rất nhiều loài Trong đó, R rickettsii là loài gây bệnh cho người phổ biến nhất R rickettsii gây bệnh sốt vùng Rocky Mountain, lưu hành chủ yếu ở châu Mĩ, đặc biệt là nước Mĩ Một báo cáo dựa trên số liệu từ hệ thống giám sát quốc gia cho thấy từ năm 2000 – 2007, nước Mĩ có 11.531 ca sốt vùng Rocky Mountain được báo cáo Bệnh lưu hành ở 46 bang của nước Mĩ, xuất hiện quanh năm nhưng đạt đỉnh vào tháng 6 – 7 Tỷ lệ mắc của nam giới cao hơn nữ giới nhưng không đáng kể Tỷ lệ mắc tăng theo tuổi, trong đó nhóm từ 50 – 59 tuổi và 60 – 69 tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất, lần lượt là 6,9/triệu người và 7,0/triệu người [66]

R conorii gây dịch tại khu vực Địa Trung Hải thuộc châu Âu và Bắc Phi, đồng thời cũng được báo cáo tại khu vực cận hoang mạc Sahara, châu Phi Hầu hết các ca bệnh được ghi nhận vào các tháng có thời tiết ấm áp Trong những năm gần đây, ngày càng nhiều trường hợp tử vong do sốt đốm vùng Địa Trung Hải được báo cáo [69]

R conorii israelensis được tìm thấy ở Bồ Đào Nha và Sicily R conorii caspia được phát hiện đầu tiên vào năm 1972 tại Astrakhan, Nga, rồi ở Kosovo và Chad trên loài ve Rh Pumilio R conorii indica được phân lập đầu tiên ở Ấn Độ vào năm 1950, sau đó xuất hiện ở Thái Lan và Lào.

Rickettsia africae lưu hành ở vùng nông thôn châu Phi cận Sahara và vùng

Caribe Các trường hợp đầu tiên được ghi nhận có từ đầu thế kỷ 20 ở Mozambique và Nam Phi Ve thuộc chi Amblyomma đã được báo cáo là vector chính Sự lây truyền của R africae bởi A hebraeum ở miền Nam châu Phi và A variegatum ở Tây, Trung và Đông Phi đã được ghi nhận đầy đủ Amblyomma variegatum cũng là vector truyền bệnh cho R africae ở Caribe [2]

R sibirica sibirica lần đầu tiên được ghi nhận ở Nga vào những năm 1930 Kể từ đó, nó đã được tìm thấy ở nhiều vùng khác nhau của Bắc Á với các trường hợp được ghi nhận ở Kazakhstan, Kyrgyzstan, Mông Cổ và Trung Quốc Vector ve cho tác nhân gây bệnh bao gồm: Demacentor nuttali, Dermacentor marginatus, Haemaphysalis concinna và Dermacentor silvarum Sự hiện diện của R sibirica

Các phương pháp chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh Rickettsia rất khó nếu không có phương pháp chẩn đoán phù hợp Trước khi có phương pháp chẩn đoán hiện đại, việc chẩn đoán phụ thuộc rất nhiều vào trình độ của bác sĩ như xác định sự có mặt của vector truyền bệnh hoặc vết đốt Chẩn đoán ban đầu rất dễ nhầm lẫn với nhiễm Sởi, Dengue, cúm… Một vài trường hợp bệnh nhân sốt cấp tính ở thể nặng và có thể gây tử vong nếu không được điều trị [51, 94] Do đó, chẩn đoán bệnh bằng các xét nghiệm chính xác và kịp thời sẽ hỗ trợ rất nhiều các bác sĩ trong việc điều trị bệnh Rickettsia

Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh Rickettsia gồm: Huyết thanh học, nuôi cấy, sinh học phân tử, malditof (Hình 1.7) Huyết thanh học vẫn là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để chẩn đoán các bệnh Rickettsia trên toàn thế giới Tuy nhiên, cần bổ sung nhiều loại kháng nguyên của các chủng từ các khu vực khác nhau để cải thiện hiệu suất chẩn đoán và tránh phản ứng chéo giữa các chủng của mỗi nhóm Phương pháp Sinh học Phân tử bổ sung cho Huyết thanh học và rất hữu ích cho chẩn đoán bệnh trong giai đoạn cấp tính Tuy nhiên, hiện nay, kỹ thuật Sinh học Phân tử chủ yếu được sử dụng trong các phòng thí nghiệm tham chiếu về Rickettsia Công nghệ khối phổ Malditoff, không nhiều phòng thí nghiệm có, và cũng hạn chế về dữ liệu của các loài Rickettsia trong thư viện

Hình 1.7 Các loại mẫu thu từ bệnh nhân/động vật và các phương pháp chẩn đoán tương ứng [4]

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học

Một trong những kỹ thuật được phát triển sớm nhất để chẩn đoán bệnh Rickettsia là Weil-Felix Ban đầu, thử nghiệm được dùng để phát hiện các kháng thể

Proteus, dựa trên nguyên tắc phản ứng chéo giữa kháng thể kháng Rickettsial với các kháng nguyên dòng OX (OX19, OX2, OXK) của các loài Proteus Kháng nguyên

OX2 của P vulgaris phản ứng mạnh với kháng thể kháng nhóm SFG (trừ R Rickettsii) Kháng nguyên OX-19 của P Vulgaris phản ứng mạnh với nhóm TG và

R Rickettsii Kháng nguyên OX-K của Proteus mirabilis phản ứng với nhóm sốt mò

Phản ứng Weil-Felix là xét nghiệm ngưng kết để tìm kháng thể trong huyết thanh, thường thực hiện từ 5-10 ngày sau khi có các triệu chứng bệnh Tuy nhiên, xét nghiệm này không áp dụng được cho những bệnh nhân mắc bệnh Brill-Zinsser hoặc nhiễm R akari do các kháng thể không có khả năng ngưng kết với kháng nguyên.

Do độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, phương pháp chẩn đoán Weil-Felix hiện không còn được sử dụng phổ biến, chỉ còn áp dụng tại một số phòng xét nghiệm thô sơ hoặc hạn chế về kỹ thuật Thay vào đó, các phương pháp huyết thanh học khác như xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA) và xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) đã dần trở nên phổ biến hơn Trong đó, xét nghiệm IFA được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh.

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence Assay)

Năm 1978, Philip đã đề nghị sử dụng các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IFA) để phát hiện Rickettsiaceae thay thế cho phương pháp Weil-Felix [70] Hiện nay phương pháp này được áp dụng rộng rãi, nhằm chẩn đoán nhanh chóng cho nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae

IFA sử dụng kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện liên hợp kháng thể của bệnh nhân với kháng nguyên Rickettsia được cố định trên phiến kính Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn trong họ Rickettsiaceae khó phân biệt do có phản ứng liên kết chéo kháng thể Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí nghiệm tham chiếu Rickettsiaceae của Úc

24 đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả Vì vậy, IFA đang được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán huyết thanh học [3]

Phân lập Rickettsiaceae là kỹ thuật phức tạp và hữu dụng hạn chế trong chẩn đoán Do nguy hiểm, phân lập phải thực hiện tại phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức 3 Nhiễm Rickettsiae trên động vật đã được thay thế bằng nuôi cấy tế bào, có khả năng phân lập hầu hết các chủng Rickettsiaceae Mẫu bệnh phẩm sử dụng gồm huyết tương, lớp bạch cầu (buffy coat) và tổn thương da, đặc biệt tại vết đốt Sau nuôi cấy, chẩn đoán xác định được thực hiện bằng Sinh học phân tử hoặc nhuộm miễn dịch huỳnh quang.

Vi khuẩn thuộc chi Orientia là các vi khuẩn ký sinh bắt buộc trong tế bào vật chủ Ngoài ra, đây là vi khuẩn có tên trong danh sách các vi sinh vật liên quan đến vũ khí sinh học Do đó, nuôi cấy các vi khuẩn này sẽ phải thực hiện trong phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3 trở lên Trong quá trình nhân lên, vi khuẩn nhân lên thành hai tế bào con bằng quá trình nảy chồi Trong quá trình nảy chồi, vi khuẩn tích tụ trên bề mặt tế bào vật chủ, đặc điểm khác biệt so với các vi khuẩn khác Một chu kỳ nảy chồi hoàn chỉnh mất từ 9 đến 18 giờ Orientia được nuôi cấy và phân lập trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng phương pháp nuôi cấy tế bào, tương tự như nuôi cấy và phân lập vi rút Orientia có thể được phát hiện sau khi nuôi cấy tế bào khoảng từ 48-72 giờ Một số nghiên cứu cho thấy, O tsutsugamushi ký sinh tại tế bào bạch cầu đơn nhân Vì 10 - 30% tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) là bạch cầu đơn nhân nên để nuôi cấy Orientia, mẫu máu của bệnh nhân sẽ được thu thập vào ống chứa chất chống đông EDTA, sau đó, lớp PBMC được tách ra PBMC được nuôi cấy vi khuẩn trong túi lòng đỏ phôi gà hoặc trên một số dòng tế bào như Vero, MRC

5, tế bào nguyên bào sợi của chuột BHK21, L929 Tế bào Vero hoặc L929 cho phép

Orientia nhân lên tốt hơn và nhanh hơn Nuôi cấy được thực hiện trong khoảng 4

25 tuần Hiện nay chỉ một số ít phòng xét nghiệm trên thế giới nuôi cấy được vi khuẩn này [2]

Vi khuẩn chi Rickettsia là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Có thể được nuôi cấy trong túi noãn hoàng của phôi trứng gà Nhiệt độ phát triển tối ưu cho nhóm Sốt phát ban (SFG) là 32 - 34°C Phôi bị chết sớm trong quá trình lây nhiễm nhưng vi khuẩn trong nhóm SFG vẫn tiếp tục nhân lên trong 2 - 3 ngày tiếp theo Ngược lại, các vi khuẩn nhóm Sốt dịch tễ (TG) phát triển tốt hơn ở 35°C Hiệu giá đỉnh của nhóm Sốt dịch tễ (TG) đạt được ngay trước khi phôi chết, sau đó khả năng sống của chúng giảm nhanh chóng Sản lượng nhóm Sốt dịch tễ (TG) từ túi noãn hoàng là rất cao, trong khi nuôi cấy mô thích hợp hơn cho sự phát triển dồi dào của Rickettsia nhóm SFG Rickettsia có thể được phát triển trong nguyên bào sợi sơ cấp của gà hoặc tế bào HUVECs, tế bào thận khỉ xanh Vero, nguyên bào sợi chuột L929, tế bào RAW264.6, HMEC-1, ESV40 và tế bào nội mô của người EA.hy 926 [2]

1.3.3 Sử dụng công nghệ khối phổ protein

MALDI-TOF MS sử dụng công nghệ khối phổ protein, định danh vi sinh vật bằng cách so sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của hơn 8000 chủng vi sinh vật khác nhau Phân tích MALDI-TOF MS cho phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, Công nghệ này cho phép định danh vi sinh vật trực tiếp từ môi trường thạch hoặc mẫu bệnh phẩm trong thời gian

30 phút với số lượng mẫu là 96 mẫu/lần phân tích Công nghệ còn có ưu điểm là cho kết quả chẩn đoán nhanh với độ chính xác cao; dữ liệu được quản lý, cập nhật thường xuyên từ ngân hàng vi sinh vật thế giới, kết quả có giá trị khoa học cao

Một vài nghiên cứu đã sử dụng MALDI-TOF MS để chẩn đoán nhiễm

Rickettsia bằng cách tách chiết Protein từ chân của một loài ve, đưa lên hệ thống MALDI-TOF MS để định danh loài ve và xác định xem chúng có bị nhiễm Rickettsiaceae hay không, thông qua việc so sánh phổ protein để phát hiện ra những thay đổi trong cấu hình protein ở những loài nhiễm hoặc không nhiễm Rickettsiaceae

Bằng phương pháp này, nghiên cứu đã chỉ ra loài ve Rhipicephalus sanguineus có chứa Rickettsia conorii và loài ve Dermacentor marginatus có chứa Rickettsia slovaca [4] Tuy nhiên, cần đưa thêm các dữ liệu về phổ protein của các loài

Rickettsiaceae, cũng như vector truyền bệnh của chúng vào trong thư viện của hệ thống MALDI-TOFF MS

1.3.4 Phương pháp khuếch đại chuỗi gen

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN ĐANG ĐƯỢC ÁP DỤNG TẠI VIỆT NAM HIỆN NAY

Do hạn chế về kiến thức lâm sàng và khả năng chẩn đoán trong phòng thí nghiệm, bệnh sốt cấp tính do Rickettsiaceae thường không được chẩn đoán tại bệnh viện Điều này một phần do bệnh Rickettsia chủ yếu lưu hành ở vùng nông thôn, nơi bệnh nhân ít tìm đến các bệnh viện Bên cạnh đó, năng lực xét nghiệm chẩn đoán bệnh Rickettsia tại các bệnh viện tuyến tỉnh và tuyến huyện ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, khiến việc chẩn đoán xác định trở nên khó khăn.

Do PCR và xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) đắt đỏ và đòi hỏi đào tạo, trang thiết bị, nên ở Việt Nam chỉ có các phòng xét nghiệm lớn mới được trang bị hệ thống PCR nhưng không phải đơn vị nào cũng thực hiện chẩn đoán bệnh Rickettsia Một số bệnh viện sử dụng test nhanh nhưng độ nhạy, đặc hiệu thấp, khó phát hiện bệnh giai đoạn đầu Các loại test nhanh cũng mới chỉ tập trung vào sốt mò, chưa phát triển chẩn đoán trên sốt phát ban và sốt dịch tễ Nguyên nhân này làm chậm trễ chẩn đoán sốt phát ban ở đa số phòng khám và bệnh viện, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao ở Việt Nam và toàn cầu, đặc biệt ở các nước thu nhập thấp và trung bình do hạn chế về cơ sở xét nghiệm chẩn đoán.

Hiểu biết về bệnh Rickettsia tại Việt Nam được biết tới thông qua một số nghiên cứu đã được triển khai Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu chủ yếu là Huyết thanh học (IFA, ELISA) và PCR/Realtime PCR [9], [10], [11], [13], [107],

[108] Tuy nhiên, các nghiên cứu báo cáo về các nhóm bệnh đơn lẻ chưa bao quát được toàn bộ các nhóm tác nhân gây bệnh Rickettsia, và thường chỉ áp dụng cho đơn vị triển khai nghiên cứu, chưa mở rộng triển khai chẩn đoán tại các tuyến tỉnh, tuyến huyện trên cả nước Đó là một trong các lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu, với một trong các mục tiêu là xây dựng được quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia, hướng tới phát triển thành các bộ kít thương mại có thể phân loại được các nhóm bệnh Rickettsia và áp dụng được cho tất cả các bệnh viện ở các tuyến trong cả nước Điều này có tính khả thi rất cao, do đã có 34 bệnh viện tuyến tỉnh được trang bị hệ thống Realtime PCR trong chương trình nâng cao năng lực phòng xét nghiệm COVID-19 của Việt Nam (cập nhật đến ngày 20/01/2020)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Các bệnh nhân sốt cấp tính đến khám và điều trị tại

12 bệnh viện thuộc 9 tỉnh thành của miền Trung Việt Nam

- Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân với 1 trong 3 nhóm triệu chứng lâm sàng:

(1) sốt và có vết loét đặc trưng;

(2) Sau khi nhập viện, đã làm tất cả các xét nghiệm loại trừ mà bệnh viện có thể thực hiện như sốt xuất huyết, sốt rét, sởi, cúm, rubella, cấy máu,… nhưng chưa tìm được nguyên nhân sau 48 giờ nằm viện Hoặc có ít nhất một trong các biểu hiện: nổi ban, đau đầu, đau cơ, xung huyết kết mạc, hạch to, gan to, lách to;

(3) Sốt và nghi ngờ Rickettsia, đang trong tình trạng nặng/nguy kịch như: suy hô hấp, suy tuần hoàn, suy gan, suy thận, viêm não – màng não, viêm cơ tim, rối loạn đông máu, hạ tiểu cầu dưới 100.000

(4) Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

1 Bệnh nhân sốt có kết quả xét nghiệm dương tính với ký sinh trùng sốt rét, virus Dengue, sởi, cúm, rubella và có biểu hiện lâm sàng, xét nghiệm, X- quang của viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu hoặc các nhiễm trùng khác do căn nguyên vi sinh vật khác đã được xác định

2 Đã điều trị kháng sinh đặc hiệu Chloramphenicol, Doxycyclin và Azithromycin ≥ 2 ngày

3 Bệnh nhân không đồng ý tham gia vào nghiên cứu tại bất cứ thời điểm nào.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại các khoa Truyền nhiễm/Bệnh nhiệt đới/Nội/Cấp cứu/Hồi sức tích cực của 12 bệnh viện tại 9 tỉnh thành của miền Trung Đây đều là những bệnh viện tuyến tỉnh, tuyến cuối, có số lượng bệnh nhân COVID-19 điều trị nhiều nhất trong khu vực.

31 các bệnh viện tuyến cuối (tỉnh/trung ương) nằm trên địa bàn các tỉnh thuộc khu vực miền Trung Việt Nam Các bệnh viện tỉnh (hay các tỉnh) tham gia nghiên cứu được lựa chọn dựa theo các tiêu chí bao gồm: (1) ưu tiên các bệnh viện tuyến trung ương là bệnh viện tuyến cuối tiếp nhận bệnh nhân của chính tỉnh đó và các tỉnh lân cận (Bệnh viện Trung ương Huế); (2) các tỉnh không tiếp giáp nhau; (3) số lượng các tỉnh được lựa chọn chiếm khoảng một nửa tổng số tỉnh của miền Trung Trong một số ít trường hợp, nếu (bệnh viện) tỉnh được lựa chọn tham gia nhưng phản hồi không đủ nhân lực để triển khai nghiên cứu sẽ được thay thế bởi (bệnh viện) tỉnh khác, dựa theo các tiêu chí kể trên

- Thời gian thu tuyển bệnh nhân: Từ tháng 5/2018 đến tháng 10/2019.

Thiết kế nghiên cứu

- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang.

Chọn mẫu và cỡ mẫu

- Chọn mẫu: Chọn mẫu theo phương pháp chọn mẫu có chủ đích, tất cả bệnh nhân sốt cấp tính đến khám và điều trị tại khoa Truyền nhiễm/Bệnh nhiệt đới/Nội/Cấp cứu/Hồi sức tích cực thuộc 12 bệnh viện nói trên nếu đáp ứng các tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu đều được đưa vào nghiên cứu

- Cỡ mẫu: Tổng số cỡ mẫu thu thập được là 634 bệnh nhân (Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu được đính kèm trong Phụ lục 2).

Phương pháp và công cụ thu thập thông tin

- Phương pháp thu thập thông tin: Các thông tin của bệnh nhân được thu thập thông qua việc hỏi bệnh trực tiếp bệnh nhân và các thông tin từ hồ sơ bệnh án bắt đầu từ khi bệnh nhân vào nghiên cứu cho tới khi kết thúc điều trị

- Công cụ thu thập thông tin: Các thông tin của đối tượng nghiên cứu được thu thập vào phiếu thu thập thông tin do dự án thiết kế Phụ lục 3: Phiếu thu thập thông tin (CRF) Việc thu thập thông tin bệnh nhân vào CRF được thực hiện bởi các bác sĩ nghiên cứu tại các bệnh viện

- Quy trình nghiên cứu: Bác sĩ nghiên cứu mời bệnh nhân tham gia nghiên cứu nếu xác định bệnh nhân đáp ứng đủ các tiêu chuẩn về lâm sàng Bệnh nhân (và/hoặc người nhà bệnh nhân) nếu đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ ký phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu (ICF) Bác sĩ nghiên cứu sau đó sẽ hỏi bệnh, thăm khám để thu thập các thông tin về nhân khẩu học, tiền sử, bệnh sử và triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân, đồng thời, chỉ định y tá của nghiên cứu lấy máu của bệnh nhân để làm các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Rickettsia Các kết quả xét nghiệm khác của bệnh nhân (nếu có) sẽ được thu thập từ bệnh án vào các ngày: ngày vào viện, ngày vào nghiên cứu, ngày thứ 3 sau khi vào nghiên cứu và ngày ra viện Mẫu máu của bệnh nhân sẽ được tách chiết và xử lý bước đầu tại khoa Xét nghiệm/Vi sinh của bệnh viện Sau đó, mẫu bệnh phẩm này định kỳ được vận chuyển (lạnh) về Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Đại học Y Hà Nội để xét nghiệm theo sơ đồ:

Nghiên cứu viên và bác sĩ của dự án tiến hành giám sát định kỳ các bệnh viện tham gia nghiên cứu để đảm bảo chất lượng thu tuyển bệnh nhân vào nghiên cứu cũng như thu CRF về văn phòng dự án.

Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia

2.6.1 Hóa chất, vật tư, trang thiết bị

- Kit tách chiết DNA của Qiagen (QIAamp DNA Mini Kit, của Đức)

- Nước cất (hấp khử trùng) Các cặp mồi và probe dNTP

- Sequecing clean up kit của hãng Zymo Reseach

- Ống eppendorf loại 1,5 ml đã khử trùng và không chứa RNase

- Tủ an toàn sinh học cấp II

- Máy Realtime PCR 7500 của ABI hoặc CFX 96 Biorad

Trình tự các cặp mồi và mẫu dò

Cặp mồi và mẫu dò được tham khảo từ các nghiên cứu trước đây [40, 43, 45] Nhóm nghiên cứu kế thừa và xây dựng lại quy trình chẩn đoán trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam Với mục tiêu, đưa ra một quy trình chẩn đoán phổ thông, có thể áp dụng ở tất cả các phòng xét nghiệm tại Việt Nam

Quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR (qPCR), sử dụng các cặp mồi và mẫu dò cho phát hiện 3 nhóm gây bệnh chính: Sốt mò, Sốt phát ban, Sốt dịch tễ Nhóm tổ tiên và chuyển tiếp, sử dụng chung cặp mồi trong nhóm sốt phát ban

Quy trình xác định các loài trong nhóm sốt phát ban được thực hiện bằng kỹ thuật phân tích trình tự đa điểm theo phương pháp giải trình tự gen (Mutilocus Sequence Typing - MLST), thông qua việc khuếch đại tối thiểu 5 gen, bao gồm cả các gen mã hóa protein bằng phản ứng PCR/ Nested PCR [29] Nhằm xác định hiện diện của các loài chưa từng được ghi nhận tại Việt Nam trước đây

- Sử dụng chứng dương tổng hợp cho kỹ thuật Realtime PCR (qPCR)

- Chứng dương sử dụng cho tối ưu kỹ thuật MLST là mẫu DNA được tách chiết từ chủng R Coronii, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm của Trung tâm Y học Hải quân (NMRC), Hoa Kỳ

2.6.2 Thiết lập bộ mẫu chuẩn quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR

Chứng dương sử dụng cho tối ưu kỹ thuật qPCR là đoạn trình tự DNA chứa vùng gen mã hóa cho các protein đặc trưng của các nhóm bệnh, được gắn vào Plasmid pIDTSmart (Amp) và được tổng hợp bởi IDT (Coralville, IA)

Chứng dương được đo nồng độ và tính ra số bản sao/μl theo công thức:

X: nồng độ mole của plasmid được tổng hợp

N: Chiều dài của plasmid được tổng hợp

660 g/mole: Khối lượng trung bình của 1 cặp bazơ

Các ống chứng dương được đóng gói ở dạng đông khô sẽ được hoàn nguyên bằng dung dịch TE, sau đó được pha loãng ở các nồng độ pha loãng khác nhau với tỷ lệ pha loãng 1:10 Dung dịch được sử dụng để pha loãng là nước và PBMC của người bình thường (không chứa tác nhân Rickettsial) Chứng pha loãng được sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện (LoD), chất lượng của quy trình chẩn đoán Để đảm bảo chất lượng, mỗi nồng độ pha loãng được chia trong các ống nhỏ, đủ cho 2-3 lần sự dụng, tránh rã đông nhiều lần có thể ảnh hưởng đến chất lượng đường chuẩn Khi thao tác cần thực hiện trên khay đã lạnh và phải được bảo quản đúng điều kiện sau khi sử dụng xong Đánh giá tính chính xác của việc chuẩn bị các bộ mẫu chuẩn bằng cách đánh giá độ tuyến tính các nồng độ trong bộ mẫu chuẩn thông qua việc xây dựng đường chuẩn trong phản ứng qPCR

2.6.3 Tối ưu quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR 2.6.3.1 Tối ưu các điều kiện của phản ứng Realtime PCR

Tối ưu hóa quy trình dựa vào việc tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng PCR/Realtime PCR như: tối ưu nồng độ mồi, mẫu dò, nồng độ MgSO4, nhiệt độ của phản ứng Tối ưu các điều kiện của phản ứng sẽ được thực hiện theo nguyên tắc Gradient nhiệt độ/nồng độ

Dựa vào nhiệt độ của mẫu dò và các cặp mồi đã được thiết kế, tiến hành tối ưu nhiệt độ của phản ứng nhằm tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho sự bắt cặp của Taqman mẫu dò mà không ảnh hưởng đến sự bắt cặp của mồi Các dải nhiệt độ lần lượt được thử là: 54 o C, 56 o C, 58 o C và 60 o C

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong hóa chất dùng để khuếch đại - Buffer PCR đã bao gồm Mg 2+ ở nồng độ cuối cùng là 3 mM, nồng độ này là cần thiết cho hầu hết các tác nhân đích Tuy nhiên, trong từng đối tượng cụ thể có thể tối ưu nồng độ Mg 2+ trong ngưỡng từ 3 - 7 mM Các dải nồng độ được dùng để tôi tối ưu nồng độ

Mg 2+ lần lượt là 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM và 7 mM

Nồng độ mồi, mẫu dò là một trong các thành phần quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất của và ngưỡng phát hiện của quy trình chẩn đoán Nồng độ mồi và mẫu dò lần lượt được thử trong kỹ thuật Realtime PCR là 200 nM, 300 nM, 400 nM và 500 nM

Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng được thử nghiệm trên bộ mẫu chuẩn đã thiết kế và thực hiện trên hệ thống máy Realtime PCR 7500 của ABI

2.6.3.2 Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia

Sau khi xác định được các điều kiện tối ưu, xây dựng quy trình chẩn đoán tương ứng với các điều kiện đã được tối ưu và xác định độ nhạy- ngưỡng phát hiện của quy trình

Các bước xác định ngưỡng phát hiện (LoD) gồm:

- Pha loãng chứng dương làm nhiều ống theo hệ số pha loãng là 1:10, bắt đầu từ 1000 copies/phản ứng

- Thực hiện phản ứng Realtime PCR theo quy trình đã tối ưu, mỗi nồng độ lặp

3 lần Tất cả các nồng độ được đánh giá trong 10 lần chạy và được ghi chép lại kết quả để tính toán Ví dụ:

Nồng độ đầu vào Tỉ lệ dương tính/số lần chạy

- Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất (số copies/phản ứng) mà tại đó trên 95% tổng số lần chạy còn cho tín hiệu

2.6.3.3 Xác định độ đặc hiệu của các cặp mồi

Cặp mồi được thiết kế theo Jiang và cộng sự, đã được đánh giá trên các chủng có dữ liệu di truyền gần với tác nhân cần chẩn đoán Độ đặc hiệu của các cặp mồi lần lượt là 100% [40, 43, 45] Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi không tiến hành đánh giá lại độ đặc hiệu của cặp mồi

2.6.3.4 Xác định độ lặp lại và độ chính xác quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia

Sử dụng bộ mẫu chuẩn đã được chuẩn bị trước đó, tiến hành đánh giá độ lặp lại bằng cách: mỗi nồng độ trong bộ một mẫu chuẩn được lặp lại 2 lần Độ lặp lại của quy trình được đánh giá qua giá trị delta Ct giữa các lần lặp lại ở các nồng độ khác nhau Delta Ct càng nhỏ độ lặp lại của quy trình càng tốt Độ chính xác được phân tích các chỉ số SD, CV, thông qua việc lặp lại quy trình trên 2 bộ mẫu chuẩn khác nhau Độ chính xác của quy trình được phản ánh qua giá trị CV (Hệ số biến thiên),

CV càng nhỏ độ chính xác của quy trình càng cao (CV≤ 0,05)

2.6.3.5 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu trên lâm sàng của quy trình chẩn đoán Độ nhạy của các cặp mồi cũng đã được đánh giá trên lâm sàng trong các nghiên cứu trước đây Tuy nhiên, độ nhạy có thể thay đổi bởi nhiều yếu tố: hóa chất sinh phẩm, trang thiết bị sử dụng, người thực hiện hay điều kiện phòng thí nghiệm… Khi kế thừa lại các cặp mồi này, nghiên cứu đã xây dựng quy trình mới và sẽ tiến hành đánh giá độ nhạy của quy trình trên các mẫu lâm sàng Để thực hiện điều này, chúng tôi sử dụng các mẫu đã được khẳng định dương tính trong nghiên cứu của Nguyễn

Quy trình sàng lọc bệnh nhân nhiễm bệnh Rickettsia

Tất cả bệnh nhân sốt cấp tính nghi nhiễm Rickettsia phải thực hiện xét nghiệm máu để phát hiện mầm bệnh theo sơ đồ nghiên cứu được đề ra.

2.7.1 Hóa chất, vật tư, trang thiết bị

2.7.2 Quy trình thu nhận, xử lý mẫu, lưu bệnh phẩm

- Mẫu máu của tất cả các bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn tại mục 2.1 sẽ được tiến hành thu thập mẫu

- Mẫu bệnh phẩm sẽ được lấy càng sớm càng tốt sau khi bệnh nhân nhập viện để xử lý

Xử lý mẫu bệnh phẩm

Vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae là những vi khuẩn sống kí sinh nội bào bắt buộc, chúng nhân lên ở trong tế bào nội mô của vật chủ Do vậy số lượng lưu hành trong máu rất thấp Để thu được tối đa lượng vi khuẩn có trong máu, cần tiến hành tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC), sau đó tiến hành tách chiết DNA tổng số trực tiếp từ lớp PBMC DNA tổng số sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng Realtime PCR

- Tách lớp PBMC theo nguyên lý gradient trọng lượng: các phân tử có trọng lượng cao sẽ lắng xuống dưới cùng, sau đó sẽ đến các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn

Quy trình tách lớp PBMC

- Mẫu máu toàn phần được lấy vào ống EDTA, sau đó tiến hành thu PBMC

Hút nhẹ nhàng 4 ml máu toàn phần bằng pipet và thả vào 2 ml dung dịch Ficoll Paque Plus theo tỷ lệ 1:1 Chú ý giữ cho máu toàn phần nằm trên bề mặt dung dịch Ficoll.

- Ly tâm hỗn hợp trên ở 1800 rmp/15 phút

- Sau ly tâm, hỗn hợp trên sẽ tách thành 4 lớp: lớp trên cùng là plasma, lớp thứ hai là PBMC (1 lớp mảng mỏng, màu trắng đục), lớp thứ 3 là Ficoll và cuối cùng là hồng cầu và các thành phần máu khác

- Hút lớp Plasma sang một ống lưu mẫu khác (hạn chế chạm vào lớp PBMC)

- Hút lớp PBMC ra ống cryotube đã được dán sẵn mã nghiên cứu Bảo quản và vận chuyển mẫu ở nhiệt độ âm

- Các mẫu PBMC được lưu giữ trong tủ -80 0 C

- Ghi chép nhiệt độ của tủ lưu mẫu hằng ngày.

Quy trình xét nghiệm

2.8.1 Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Rickettsiaceae

Mẫu bệnh phẩm sử dụng là: PBMC, hoặc thấm dịch từ vết loét

Bước 1: Ly tâm ống PBMC 10 phút ở tốc độ 14000 vòng/phút Hút bỏ dịch nổi, để lại trong ống ~400àl

Bước 2: Votex đều, hỳt 200 àl mẫu PBMC vào ống effedorf chứa 20 àl proteinase K

Bước 3: Thờm tiếp 20 àl IC nồng độ 10 1 và 200 àl Lysis buffer AL vào ống eppendorf Không thêm trực tiếp Lysis buffer AL vào proteinase K

Bước 4: Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 56°C trong vòng 10 phút

Bước 5: Bổ sung thờm 200 àl ethanol (96-100%), trộn đều bằng votex trong vòng 15 giây, ly tâm nhanh

Bước 6: Chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 5 lên cột Đóng nắp, ly tâm tốc độ

8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch thay bằng ống hứng mới

Bước 7: Thờm 500 àl dung dịch Wash buffer AW1 vào cột để rửa Ly tõm cột ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch trong ống hứng, tái lại ống hứng này cho lần rửa tiếp theo bằng cách làm khô ống bằng giấy thấm

Bước 8: Thờm 500 àl dung dịch Wash buffer AW2 Ly tõm cột ở tốc độ 14000 vòng/3 phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới

Bước 9: Ly tâm khô ở 14000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 10: Đặt cột lọc vào ống eppendorf 1,5 ml mới và bỏ ống hứng ở bước 9 Mở nắp cột lọc, thêm 80 μl đệm AE, đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút.

DNA thu được sau khi tách chiết được bảo quản ở -20℃ dùng để thực hiện các xét nghiệm tiếp theo

2.8.2 Thực hiện phản ứng realtime PCR xác định bệnh do Rickettsia

- Thành phần phản ứng được tính toán và mix theo quy trình đã tối ưu

- Số lượng ống PCR cần cho một mẻ chạy PCR theo công thức sau:

Số lượng ống = Số bệnh phẩm + 2 (1 chứng dương, 1 chứng âm)

- Chứng dương: là plasmid chứa đoạn DNA mã hóa cho gen 47 kDa, 17 kDa, ompB được cung cấp từ phòng thí nghiệm Rickettsia, Trung tâm nghiên cứu y sinh Naval – Mỹ để phát hiện 3 nhóm vi khuẩn Rickettsiaceae gây bệnh sốt cấp tính

- Chứng âm: Nước cất được sử dụng

Trong trường hợp chứng dương âm tính, chứng âm dương tính tiến hành lại toàn bộ mẻ thí nghiệm từ khâu pha Mix Đọc kết quả PCR theo ngưỡng phát hiện đã được tối ưu ở trên.

Kết quả PCR Kết luận

Gen 47k-Da Dương tính > Kết luận sốt mò

Gen 17K-Da Dương tính > Test lại bằng gen ompB

Dương tính > Sốt do bọ chét Âm tính > Thực hiện kỹ thuật MLST xác định loài

2.8.3 Thực hiện kỹ thuật MLST xác định loài gây bệnh của nhóm sốt phát ban

Thực hiện phản ứng PCR

- Thành phần phản ứng được tính toán và mix theo quy trình đã tối ưu

- Số lượng ống PCR cần cho một mẻ chạy PCR theo công thức sau:

Số lượng ống = Số bệnh phẩm +2 (1 chứng dương, 1 chứng âm)

Kiểm tra sản phẩm PCR của các gen trên gel Agarose 1.5%

- Chuẩn bị Agarose 1,5%: cân 1.5 gram bột Agarose pha với 100 ml TAE 1X Đun nóng chảy dung dịch agarose 1.5% bằng lò vi sóng (2 - 3 phút), để nguội đến 55

- 60 o C Cho 10 àl thuốc nhuộm Gelred đổ vào khuụn đó cài sẵn lược

- Để gel đông sau khoảng 20 phút, đặt bản gel vào bể điện di đã bổ sung dung dịch đệm TAE 1x và sau đó tiến hành điện di:

- Thành phần 1 giếng điện di như sau:

- 5 àl sản phẩm PCR (hoặc Maker) +1 àl Loading Dye

- Trộn đều và tra lần lượt mẫu vào các giếng

- Điện di với cường độ dòng điện 100 V trong 30 phút

- Đọc và phân tích kết quả điện di trên máy chup ảnh gel

- Mẫu lên band kích thước theo Bảng 2.2

Giải trình tự MLST được thực hiện theo phương pháp giải trình tự gen Sanger

Phản ứng PCR gồm các thành phần chính: Bigdye (Taq DNA polymerase, dNTPs và ddNTPs huỳnh quang khuyết nhóm OH), mồi, khuôn ADN và nước Tỷ lệ dNTPs:ddNTPs tối ưu là 100:1, tạo điều kiện để mỗi lần gắn nucleotide vào sợi ADN là một cơ hội gắn ddNTP Ví dụ, tại vị trí Guanine trên sợi xuôi, polymerase có thể gắn dCTP hoặc ddCTP huỳnh quang, từ đó kết thúc phản ứng kéo dài sợi ADN Quá trình lặp lại chu kỳ PCR tạo ra dải sản phẩm ADN có chiều dài khác nhau, từ mồi cộng thêm một nucleotide đến mồi cộng thêm tất cả các nucleotide, và các sản phẩm này được đánh dấu bằng các loại ddNTP huỳnh quang khác nhau.

43 màu huỳnh quang khác nhau, trình tự sợi ADN tính từ đầu 3’ được xác định bằng cách phân tách các đoạn sản phẩm trên gel acrylamide (chứa trong các capillary) và quét trên máy đọc huỳnh quang (sử dụng tia UV laser) để phát hiện các ddNTP gắn huỳnh quang trên sợi ADN (Adenine - màu xanh lá cây, Thimine - màu đỏ, Guanine

- màu đen và Cytocine - màu xanh da trời)

Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR sau khi điện di có thể tinh sạch bằng bộ kit ExoSAP-IT™ PCR của hãng Affymetrix

Quy trình được thực hiện như sau:

+ 5μl sản phẩm PCR + 2μl ExoSap IT PCR cleanup reagent, ủ ở 37°C trong 15 phút Sau đó nâng nhiệt độ lên 80°C trong vòng 15 phút Sản phẩm sau tinh sạch có thể bảo quản ở -20°C

Thực hiện phản ứng PCR Sequencing

Sử dụng bộ sinh phẩm BigDye® Terminator V3.1 Cycle sequencing để thực hiện phản ứng PCR

Sản phẩm PCR sau tinh sạch 1 àl

Chu trình nhiệt: 96 o C- 1’;( 96 o C-10’’; 50 o C- 5’’; 60 o C-4’) 25 chu kỳ

Tinh sạch sản phẩm PCR Sequencing

Sử dụng kit tinh sạch sản phẩm PCR (Sequecing clean up kit) của hãng Zymo Reseach Quy trình:

- Thêm 200 μl Sequencing Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR sequecing Chuyển toàn bộ dịch lên cột lọc

- Ly tâm ở 13000rpm/1 phút Bỏ ống hứng chứa dung dịch ở dưới Thay ống hứng mới

- Thêm 300 μl Sequecing Wash Buffer, ly tâm ở 13000rpm/1 phút Bỏ ống hứng có chứa dung dịch ở dưới Đặt cột lọc lên ống eppendorf 1,5 ml mới

- Thêm 20 μl Water Dnase, Rnase Free , ly tâm ở 13000/1 phút Thu dung dịch trong ống Eppendorf 1.5 ml

Giải trình tự gen bằng máy 3130 ABI

- Pha loãng Running Buffer 10x xuống 1x Kiểm tra và bổ sung đệm 1x, H2O và polyacrylamide gel vào các ống thích hợp trên máy sequencing

- Đặt plate (hoặc tube) chứa các sản phẩm đã được tinh sạch vào vị trí đọc trên máy sequencing

Phân tích kết quả giải trình tự gen

- Kết quả chạy sequencing sẽ tự động lưu lại trong thư mục đã chọn, file dữ liệu này được copy ra đĩa CD và mở bằng phần mềm của AB Applied Biosystem hoặc Bioedit

- Kết quả đọc sequencing phải có tín hiệu tốt (màu xanh lá cây – tín hiệu rất tốt, màu xanh da trời – tín hiệu tốt)

- Kết quả giải trình tự gen được phân tích, xử lý bằng phần mềm Bioedit và xác định loài thông qua dựng cây phân loài

2.8.4 Xây dựng cây phân loại xác định loài trong nhóm sốt phát ban

Các bước xây dựng cây phân loài được tóm tắt như hình 2.1

Hình 2.1 Các bước xây dựng cây phân loài và xác định loài gây bệnh

Xác định chính xác loài gây bệnh trong nhóm sốt phát ban đòi hỏi phải so sánh trình tự di truyền thu được với các chủng đã biết Quá trình này giúp xác định mối quan hệ giữa chủng mới và các chủng đã biết, cũng như xác định liệu chủng mới có phải là loài mới không Phân loại tại các cấp độ khác nhau như chi, nhóm và loài có thể dựa trên các tiêu chí của Fournier et al [29].

Phương pháp quản lý và phân tích số liệu

Phương pháp quản lý số liệu: Số liệu được nhập bằng phần mềm Epidata 3.2 (The EpiData Association, Odense, Denmark)

Phương pháp phân tích số liệu:

- Số liệu được phân tích bằng phần mềm STATA 12.0 (StataCorp, Texas, USA)

- Các bản đồ phân bố được vẽ bởi phần mềm ArcGIS Pro 2.8 (Esri, US)

Đạo đức nghiên cứu

Đề tài này là một phần trong nghiên cứu tại bệnh viện của dự án “Nghiên cứu điều tra bệnh Rickettsia, sốt mò và sốt Q tại bệnh viện và cộng đồng trên toàn quốc” Giai đoạn nghiên cứu tại bệnh viện của dự án đã được thông qua Hội đồng đạo đức Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương theo quyết định số 24/HĐĐĐ-NĐTƯ và Hội đồng đạo đức trường Đại học Y Hà Nội theo quyết định số 129/GCN-HĐĐĐNCYSH- ĐHYHN

Các đối tượng ≥ 18 tuổi được cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên cứu và ký giấy chấp thuận nếu tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu (Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu được đính kèm trong Phụ lục 4) Đối tượng 0,99 cho thấy việc chuẩn bị các bộ mẫu chuẩn đạt kết quả tốt Bên cạnh đó, hiệu suất của các phản ứng Realtime PCR hay E% ( Efficiency) đều > 95%, cho thấy hiệu quả khuếch đại của cặp mồi trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam Để đảm bảo hiệu quả hoạt động của bộ mẫu

49 chuẩn, mỗi nồng độ mẫu chuẩn được pha loãng và chia trong các ống nhỏ, đủ cho 2

- 3 lần sử dụng, tránh rã đông nhiều lần có thể ảnh hưởng lựa chọn điều kiện phù hợp nhất trong quá trình tối ưu phản ứng Realtime PCR và các thử nghiệm về tìm giới hạn phát hiện, cũng như xác định độ lặp lại và độ chính xác của quy trình Bộ mẫu chuẩn sẽ tiếp tục được sử dụng để đánh giá các chỉ tiêu chất lượng khác của quy trình

3.1.2 Kết quả tối ưu các loại nồng độ của phản ứng Realtime PCR

Chọn 1 trong các nồng độ mẫu chuẩn đã chuẩn bị, sử dụng để tiến hành tối ưu các điều kiện của phản ứng Realtime PCR Các thông số cần tối ưu bao gồm: nồng độ mồi, nồng độ Mg 2+ , nhiệt độ bắt cặp của mồi và mẫu dò Nồng độ mồi, mẫu dò,

Mg 2+ của từng nhóm tác nhân gây bệnh lần lượt được thể hiện trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả tối ưu các loại nồng độ của phản ứng Realtime PCR

Tên hóa chất Nồng độ sử dụng

Nồng độ phản ứng yêu cầu Thể tích cho mỗi phản ứng (ul)

MgCl2 25mM 5 mM 5 mM 6 mM 2/3 dNTPs 10mM 0,2 àM 0,2 àM 0,2 àM 0,5

17 Probe 10 àM 0,5 àM 1,25 ompB-F 10 àM 0.4 àM 1 ompB- R 10 àM 0.4 àM 1 ompB Probe 10 àM 0.4 àM 1

Hotstart taq 5U/l 1,25 U/pư 1,25 U/pư 1,25 U/pư 0,25 Nước

DNA tách chiết 5 ul 5 ul 5 ul

Các mẫu bệnh phẩm, mẫu chứng nội được trộn riêng từng nhóm tác nhân, phát hiện bằng kênh màu gắn trên đầu dò Tối ưu nồng độ mồi, đầu dò, Mg2+ cho từng nhóm tác nhân và cho kết quả tốt nhất: Sốt mò (mồi/đầu dò: 0,3μM, Mg2+: 5mM), Sốt phát ban (mồi/đầu dò: 0,5μM, Mg2+: 5mM), Sốt dịch tễ (mồi/đầu dò: 0,4μM, Mg2+: 6mM).

Có sự khác biệt về nồng độ của mồi, mẫu dò và Mg 2+ so với nồng độ trong nghiên cứu gốc: nồng độ mồi của nhóm sốt mò và sốt dịch tễ thấp hơn nồng độ mẫu dò trong khi nồng độ mồi của nhóm sốt phát ban cao hơn nồng độ mẫu dò Điều này cũng có thể giải thích do nghiên cứu gốc sử dụng bộ sinh phẩm hóa chất khác cho phát triển quy trình (Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen)) [40,

Ngoài ra, lựa chọn enzyme tổng hợp trình cặp mồi và mẫu dò cũng ảnh hưởng đến nồng độ cuối cùng sử dụng trong phản ứng Realtime PCR vì công nghệ tổng hợp và tinh sạch trình tự được tổng hợp là khác nhau Nồng độ Mg2+ bổ sung trong phản ứng sẽ phụ thuộc vào nồng độ Mg2+ có sẵn trong bộ sinh phẩm và nhu cầu cơ chất xúc tác của từng phản ứng.

3.1.3 Kết quả tối ưu nhiệt độ của phản ứng Realtime PCR

Chương trình luân nhiệt máy Real-time PCR dùng taqman mẫu dò, thường trải qua các giai đoạn nhiệt độ là: biến tính 94 - 95°C trong 15-30 giây, kế đó là giai đoạn vừa bắt cặp vừa kéo dài ở 50 - 60°C trong 30 - 60 giây và thiết bị thu tín hiệu huỳnh quang sẽ hoạt động ở bước này Ở giai đoạn nhiệt độ 50 - 60°C thì mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trước vì đây là nhiệt độ bắt cặp tối hảo của mẫu dò (thấp hơn Tm của mẫu dò là 65 - 70°C, nhưng cao hơn hoặc bằng Tm của mồi là (55 - 60°C) rồi sau đó mồi mới bắt cặp vào Chính nhờ vậy mà khi Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung, enzyme này mới có cơ hội thuỷ giải mẫu dò cản đầu nó Nếu mồi bắt cặp trước vào

Với Tm mẫu đích là 51oC, mẫu dò sẽ không thể bắt cặp với mẫu đích và do đó không bị thủy giải khi enzyme Taq polymerase kéo dài quá trình tổng hợp chuỗi bổ sung Điều này giải thích lý do tại sao phải thiết kế mồi có Tm khoảng 55 - 60oC, thấp hơn Tm của mẫu dò.

5 - 10°C Vì vậy, tối ưu nhiệt độ của phản ứng sẽ phải đảm bảo điều kiện để mẫu dò và mồi cùng thực hiện được chức năng của chúng Nghiên cứu đã tối ưu điều kiện nhiệt độ trong dải 54 - 60°C, đảm bảo mồi và mẫu dò có thể hoạt động tốt Nhiệt độ bắt cặp của mồi, mẫu dò cho các nhóm tác nhân lần lượt được thử là 54 o C, 56 o C, 58 o C và 60 o C Kết quả Hình 3.3 cho thấy, tại các dải nhiệt độ trên, đều cho đường biểu diễn khuếch đại của nhóm Sốt mò cho kết quả Ct tương đương nhau Tuy nhiên, đường biểu diễn khuếch đại ở nhiệt độ 60°C cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn và đường curve đẹp hơn nên được lựa chọn để đưa vào quy trình chẩn đoán nhóm Sốt mò Kết quả tương tự đối với nhiệt độ mẫu dò của 2 nhóm tác nhân còn lại Đây cũng là nhiệt độ bắt cặp phổ biến của hầu hết các quy trình chẩn đoán tác nhân gây bệnh sử dụng kỹ thuật Realtime PCR với công nghệ Tapman probe

Như vậy, quy trình nhiệt được sử dụng trong chẩn đoán cho 3 nhóm tác nhân là: 1x 15’- 95 0 C; 40x (30’’- 94 0 C, 30’’ – 60) – 5’- 72 0 C, Hold Kênh màu phát hiện cho từng nhóm tác nhân sẽ tương ứng: Gen 47: Fam - Tamra; Gen IC: Hex - Tamra; Gen 17: Fam - Tamra; Gen ompB: Fam - BHQ1

Hình 3.3 Kết quả tối ưu nhiệt độ của phản ứng Realtime PCR

3.1.4 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện quy trình chẩn đoán bệnh Rickettsia

Ngưỡng phát hiện của quy trình (LoD) là giá trị nhỏ nhất mà tại đó còn phát hiện được nồng độ của tác nhân các tác nhân gây bệnh Sau khi xác định được các điều kiện tối ưu, quy trình chẩn đoán được thiết lập tương ứng với các điều kiện đã tối ưu, sử dụng các bộ mẫu chuẩn đã chuẩn bị trước đó để tìm giới hạn phát hiện của quy trình Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2

Các mẫu chuẩn trong Bảng 3.2 được khuếch đại bằng phản ứng Realtime PCR theo quy trình tối ưu đã đề cập trước đó Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần và thực hiện 10 lần Ngưỡng phát hiện được xác định như sau: nhóm sốt mò là 16,8 bản sao/µL, nhóm sốt phát ban và nhóm sốt dịch tễ đều là 8,4 bản sao/µL, với độ tin cậy đạt 97% (29/30 lần lặp đều cho kết quả dương tính).

Ngưỡng phát hiện cho kết quả thống nhất trên cả 2 bộ mẫu chuẩn đã chuẩn bị và có chất lượng ổn định trong các lần chạy khác nhau

Bảng 3.2 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của quy trình chẩn đoán

Nồng độ đầu vào (bản sao/phản ứng) Số lần Dương tính/số lần thực hiện L-Otr47 L-Rick17b L-R-typhi L-Otr47 L-Rick17b L-R-typhi

Kết quả tối ưu các loại nồng độ và nhiệt độ của kỹ thuật MLST

Nhóm sốt phát ban là nhóm có số lượng loài đông đảo và đa dạng về mặt dịch tễ nhất Trước khi nhóm tổ tiên và nhóm chuyển tiếp được tách ra, nhóm sốt phát ban có tới hơn 30 loài Trong đó, có hơn 21 loài đã được ghi nhận gây bệnh cho con người Xây dựng quy trình xác định loài trong nhóm sốt phát ban đang hiện diện tại Việt Nam sẽ cung cấp cái nhìn bao quát về bức tranh các loài vi khuẩn trong họ Rickettsiaceae xuất hiện tại đây, có thể làm thay đổi các hiểu biết về dịch tễ học của các loài đã được ghi nhận

Hiện nay cũng có các nghiên cứu đã báo cáo về việc thiết kế được cặp mồi cho chẩn đoán một số loài trong nhóm Sốt phát ban Tuy nhiên, do các loài có phân bố địa lý đa dạng, một vài loài chỉ phân bố ở một số vùng nhất định nên việc thiết kế mồi riêng lẻ chỉ hữu ích cho phát hiện loài phân bố tại vùng đó Để phát hiện được sự đa dạng của các loài và các chủng, kỹ thuật MLST thường được sử dụng để phân loại các loài trong nhóm

Tối ưu quy trình khuếch đại 5 gen mục tiêu thông qua tối ưu các loại nồng độ và nhiệt độ với bộ sinh phẩm 2X PCR Master mix- Intron, Hàn Quốc Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả tối ưu nồng độ và nhiệt độ của kỹ thuật LMST

Gen mục tiêu Tên mồi

Kích thước sản phẩm khuếch đại

Nồng độ mồi sử dụng

Sản phẩm khuếch đại các gen mục tiêu được thực hiện bằng kỹ thuật PCR, Nested PCR hoặc Semi Nested PCR Nhiệt độ tối ưu cho các gen được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR dao động từ 50-54°C thấp hơn nhiệt độ khi thực hiện khuếch đại bằng kỹ thuật Nested PCR hoặc Semi Nested PCR 52 - 58°C (Bảng 3.6) Sản phẩm khuếch đại lần 2 của các gen ompA và Sca4 có nhiệt độ gắn mồi thấp hơn và bằng với nhiệt độ gắn mồi của lần khuếch đại đầu Nồng độ mồi sử dụng cho các phản ứng khuếch đại 5 gen đều là 0,3 àM Nồng độ Mg 2+ cho gen R17K và ompB là 2 mM, gen gltA và ompA là 3 mM, gen Sca4 là 4 mM

Điện di các gen ompA, R17K, gltA, ompB và Sca4 trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ tối ưu cho kích thước sản phẩm khuếch đại theo thứ tự là: 632 bp, 434 bp, 382 bp, 743 bp và 899 bp Khi so sánh với thang chuẩn, cả 5 gen đều có 1 băng sáng, rõ nét, đúng với kích thước theo thiết kế của mồi Quy trình xác định loài trong nhóm Rickettsia đã được thiết lập với các thông số kỹ thuật trong Bảng 3.6.

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại 5 gen trong kỹ thuật MLST

Tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia tại khu vực Miền Trung Việt Nam giai đoạn 2018 - 2019

Hình 3.5 Tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia ở các bệnh nhân sốt cấp tính

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu 614 bệnh nhân sốt cấp tính đến khám và điều trị tại 12 bệnh viện thuộc 9 tỉnh thành của miền Trung Việt Nam Kết quả cho thấy sốt mò là bệnh chiếm ưu thế hơn cả với 196 ca (89,1%), tiếp theo là sốt do bọ chét chuột truyền với 17 ca (7,7%) và cuối cùng là sốt phát ban với 3 ca (1,4%) Có 4 trường hợp đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban chiếm tỷ lệ 1,8% Trong nhóm sốt mò, ghi nhận 196 bệnh nhân mắc sốt mò do O tsutsugamushi Đối với nhóm sốt dịch tễ, toàn bộ các ca bệnh thuộc nhóm này đều là các ca bệnh sốt do bọ chét chuột truyền Nhóm sốt phát ban ghi nhận 7 bệnh nhân (gồm cả 4 ca đồng nhiễm) Tuy nhiên, không xác định được chính xác loài gây bệnh trong nhóm này Thứ tự phổ biến của các bệnh Rickettsia trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với đa số thống kê và nghiên cứu khác trong nước và trên thế giới Cụ thể, sốt mò là bệnh thường gặp nhất tại khu vực châu Mĩ, châu Á Một nghiên cứu tổng quan về gánh nặng bệnh tật do sốt mò gây ra đã khẳng định sốt mò là bệnh phổ biến và quan trọng

220 qPCR Rickettsia âm tính qPCR Rickettsia dương tính Sốt mò

Sốt bọ chét chuột truyềnSốt phát ban do Rickettsia Đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban do Rickettsia

64 nhất trong số các bệnh Rickettsia với khoảng 1 triệu ca sốt mò và khoảng 1 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh hàng năm trên toàn thế giới [95] Bệnh sốt do bọ chét chuột truyền tuy ít phổ biến hơn nhưng được coi là vấn đề y tế công cộng mới nổi hoặc tái nổi ở một số khu vực [19, 23, 53, 76] Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam cũng chỉ ra rằng bệnh Rickettsia là một trong những căn nguyên phổ biến nhất ở các bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân Trong đó, sốt mò là bệnh thường gặp nhất, theo sau là sốt do bọ chét chuột truyền [9], [10], [15] Đối với nhóm sốt phát ban, tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu báo cáo về sự lưu hành huyết thanh của nhóm bệnh này trên đối tượng bệnh nhân và người khỏe mạnh [22]

Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện được 4 ca bệnh đồng nhiễm nhóm sốt mò và sốt phát ban Các ca bệnh về mắc cùng lúc 2 tác nhân gây bệnh đã từng được ghi nhận trước đây Năm 2018 tại Nhật Bản, ghi nhận trường hợp bệnh nhân nhiễm đồng thời O tsutsugamushi và R japonica R japonica được biết đến là một trong các căn nguyên tử vong cao khi mắc phải Ngoài ra, các ca đồng nhiễm giữa O Tsutsugamushi và R.typhi (nhóm dịch tễ), cũng từng được ghi nhận tại Trung Quốc và Lào trước đó [77] Tại Việt Nam, một nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Quảng Nam cũng đã nghi nhận ca bệnh đồng nhiễm 2 kiểu gen của O tsutsugamushi Do bệnh Rickettsia truyền cho người thông qua động vật chân đốt, nên một loại vector có thể chứa cùng lúc nhiều tác nhân Rickettsia và truyền cho con người [5] Việc nhiễm đồng thời 2 tác nhân Rickettsia, có khả năng làm tăng diễn biến bệnh, người bệnh có nguy cơ tử vong cao hơn nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời

Xác định các nhóm tác nhân gây bệnh trên quy trình mới xây dựng, cũng cho phép định lượng nồng độ tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm ban đầu, thông qua giá trị Ct của các mẫu và biểu đồ đường chuẩn trong mỗi mẻ chạy, để tính toán nồng độ của các tác nhân với đơn vị tính là copies/ml máu toàn phần Theo đó, nồng độ trung bình của các nhóm tác nhân khi thực hiện bằng phản qPCR và quy đổi từ công thức tính sẽ dao động trong khoảng: Nhóm sốt mò có Ct từ 28 đến 38, tương đương 4,02 x10 6 - 5,72x10 3 bản sao/ml máu toàn phần; Nhóm sốt phát ban có Ct từ

35 đến 37, tương đương 1,7x10 3 - 8,2x10 2 bản sao/ml máu toàn phần; Nhóm sốt dịch

65 tễ có Ct từ 29 đến 36, tương đương 6,8x10 5 - 7,6x10 3 bản sao/ml máu toàn phần Như vậy, nồng độ các tác nhân gây bệnh Rickettsia trong máu bệnh nhân được xác định trong nghiên cứu này thấp nhất là 8,2x10 2 số bản sao/ml máu toàn phần và cao nhất là 4,02 x10 6 số bản sao/ml máu toàn phần

Một trong các hạn chế của nghiên cứu là mới chỉ tập trung thu tuyển các bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân tại khoa Truyền nhiễm/Bệnh nhiệt đới ở các bệnh viện Việc mở rộng thu tuyển bệnh nhân tại các khoa khác như Nội, Nhi, Hồi sức tích cực, Cấp cứu cũng được tiến hành nhưng không đồng nhất ở tất cả các bệnh viện do phụ thuộc vào cách thức tổ chức và thực hành lâm sàng ở các bệnh viện là khác nhau Điều này có thể dẫn đến tình trạng bỏ sót những bệnh nhân vì lý do nào đó mà được điều trị ở một khoa khác nên có thể sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia chung của nghiên cứu Ngoài ra, tiêu chuẩn loại trừ trong nghiên cứu của chúng tôi là khi bệnh nhân đã điều trị kháng sinh đặc hiệu Chloramphenicol, Doxycyclin và Azithromycin ≥ 2 ngày Điều này là cần thiết để tránh gây làm thấp đi tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia thực sự ở các bệnh nhân tham gia nghiên cứu trong trường hợp các bệnh nhân đã nhiễm bệnh Rickettsia nhưng do ảnh hưởng của điều trị, kết quả xét nghiệm lại âm tính Tuy nhiên, ở một phương diện khác, việc làm trên cũng có thể gây ra các sai lệch về tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia thực sự trong nghiên cứu.

Kết quả xác định các loài gây bệnh trong nhóm Sốt phát ban

Ba ca dương tính với nhóm sốt phát ban, và bốn ca đồng nhiễm với sốt mò và sốt phát ban được được khuếch đại với cặp mồi và thực hiện theo điều kiện đã tối ưu tại Bảng 3.6 Trong 7 mẫu được khuếch đại với năm gen bằng kỹ thuật MLST, chỉ có một mẫu cho sản phẩm khuếch đại với ba gen: gltA, ompB, omp A Tuy nhiên, sản phẩm khuếch đại mờ, bị nhiễu nên kết quả giải trình tự cho tín hiệu xấu, không phân tích được trình tự Kiểm tra nồng độ các mẫu này trong phản ứng qPCR cho thấy giá trị Ct của các mẫu này thấp (~36) tương đương với nồng độ quy đổi trong mẫu ban đầu 8,2x10 2 bản sao/ml máu toàn phần Đây là nồng độ thấp, rất khó cho các thử nghiệm sâu hơn Trên thực tế, các mẫu bệnh phẩm được chẩn đoán nhiễm Rickettsia

66 thuộc nhóm sốt phát ban ở nồng độ thấp, sẽ được nuôi cấy, sau đó thực đó thực hiện kỹ thuật MLST để xác định loài Tuy nhiên tại Việt Nam, điều kiện và năng lực Phòng thí nghiệm chưa đủ để triển khai kỹ thuật này nên việc định danh chỉ dừng lại ở việc phân loại thuộc nhóm bệnh nào.

Đặc điểm dịch tễ của các bệnh nhân nhiễm Rickettsia tại mười hai bệnh viện miền Trung, Việt Nam năm 2018 - 2019

3.5.1 Phân bố của các bệnh nhân nhiễm Rickettsia theo tuổi và giới

Bảng 3.7 Phân bố bệnh Rickettsia theo tuổi và giới Đặc điểm Sốt mò

Sốt bọ chét chuột truyền (n)

Nhóm sốt phát ban (n=3) Đồng nhiễm (n=4)

Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có tuổi dao động từ 4 - 89 tuổi, trung bình là 48 tuổi Cụ thể đối với nhóm sốt mò, sốt do bọ chét chuột truyền, sốt phát ban và nhóm đồng nhiễm, tuổi trung bình lần lượt là 49 tuổi; 45 tuổi; 22 tuổi và 38.5 tuổi

Nghiên cứu ghi nhận các ca bệnh Rickettsia ở các độ tuổi khác nhau, bao gồm cả trẻ em Các nghiên cứu về bệnh Rickettsia trong nước chủ yếu tập trung vào nhóm bệnh nhân từ 15 hoặc 18 tuổi trở lên Tuổi trung bình của bệnh nhân nhóm sốt mò, sốt do bọ chét chuột truyền và sốt phát ban lần lượt là 48,4 tuổi; 41,6 tuổi và 22,7 tuổi Như vậy, sốt mò là nhóm có tuổi trung bình cao nhất trong 3 nhóm Tuổi của 3 bệnh nhân sốt phát ban thấp hơn đáng kể (dao động từ 18 - 22 tuổi) so với tuổi của 2 nhóm còn lại Đối với sốt mò, tuổi cao được chứng minh là một trong các yếu tố nguy cơ cao của bệnh, trong đó nhóm tuổi từ 60 - 69 tuổi là nhóm có nguy cơ cao nhất Khác biệt về tuổi trung bình giữa nhóm sốt mò và sốt do bọ chét chuột truyền không

67 có ý nghĩa thống kê Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân sốt mò và sốt do bọ chét chuột truyền trong nghiên cứu của chúng tôi tương tự với các nghiên cứu khác, mặc dù tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân tham gia các nghiên cứu này bao chỉ bao gồm trẻ em từ 15 - 17 tuổi hoặc người trưởng thành [15] Đối với nhóm sốt phát ban, tùy thuộc bệnh cụ thể nhưng nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng các bệnh nhân sốt phát ban có tuổi rất trẻ Ở châu Phi, nghiên cứu tại Senegal và Kenya ghi nhận các bệnh nhân nhiễm R felis (thuộc nhóm SFGR) có tuổi trung bình và min - max lần lượt là 15 (2 - 57) và 29 ( 7 - 47) [14] Tại Mĩ, nghiên cứu trên 727 bệnh nhân sốt Rocky Mountain tại 6 bang cho thấy 58% bệnh nhân nhỏ hơn 20 tuổi [39] Trong 510 ca bệnh sốt Rocky Mountain được báo cáo tại Sonora, Mexico giai đoạn 2015 - 2018, độ tuổi ghi nhận nhiều ca bệnh nhất (174; 34,0%) là 8 - 18 tuổi [79] Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về tuổi của bệnh nhân sốt phát ban khá tương đồng so với các nghiên cứu trên thế giới

Về giới tính, nhìn chung, nữ giới (132; 60,8%) mắc bệnh Rickettsia nhiều hơn nam giới (85; 39,2%) Tỷ lệ nam/nữ chung chịu ảnh hưởng lớn bởi tỷ lệ nam/nữ trong nhóm sốt mò do phần lớn các ca chẩn đoán xác định nhiễm Rickettsia thuộc nhóm này Khác với phân bố chung, nhóm sốt do bọ chét chuột truyền và nhóm đồng nhiễm có tỷ lệ nam giới tương đương với nữ giới (8,50%) Ngoài ra, cả 3 bệnh nhân nhóm sốt phát ban đều là nam Tỷ lệ nam/nữ mà chúng tôi thống kê được trong nhóm sốt mò tuy đối lập với nghiên cứu tại Thái Lan nhưng lại tương đồng với nghiên cứu tại Hàn Quốc [99] và hầu hết nghiên cứu trong nước khác [10], [13] Điều này được giải thích do sự tham gia của người phụ nữ trong công việc đồng ruộng và nương rẫy nổi trội hơn so với đàn ông, mà yếu tố nghề nghiệp này được nhiều nghiên cứu chứng minh là có liên quan đến bệnh Rickettsia Ở nhóm sốt phát ban, sự khác biệt về giới trong nghiên cứu của chúng tôi tương đương với kết quả ghi nhận trong một nghiên cứu trên 2074 bệnh nhân sốt do bọ chét chuột truyền tại 33 quốc gia thuộc hầu khắp các châu lục trên thế giới [92] Tuy cả 3 bệnh nhân sốt phát ban trong nghiên cứu đều là nam nhưng các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy sốt phát ban gặp ở cả nam và nữ với các tỷ lệ khác nhau [79], [98]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành so sánh các giá trị trung bình và tỷ lệ giữa nhóm sốt mò và sốt do bọ chét chuột truyền mà không đề cập đến nhóm sốt phát ban do số ca quá ít để thực hiện các phép kiểm định Theo đó, chúng tôi không ghi nhận sự khác biệt về tuổi hay giới giữa nhóm sốt mò và sốt do bọ chét chuột truyền Kết quả này tương đồng với kết quả được công bố trong các nghiên cứu trước đó [99]

3.5.2 Phân bố của các bệnh nhân nhiễm Rickettsia theo nghề nghiệp

Hình 3.6 Phân bố bệnh Rickettsia theo nghề nghiệp (n!9)

Nghề nghiệp thường gặp nhất ở nhóm bệnh nhân mắc bệnh do bọ chét là làm ruộng: 132/196 ca sốt rét, 12/17 ca sốt do bọ chét chuột, 3/3 ca sốt phát ban và 3/4 ca đồng nhiễm sốt rét và sốt phát ban Ngoài làm ruộng, đối với sốt rét, một số lượng lớn bệnh nhân (30) đã nghỉ hưu hoặc trên 60 tuổi Các nghề như hành chính/sự nghiệp, nội trợ, kinh doanh, dịch vụ, công nhân hoặc nghề khác cũng được ghi nhận nhưng số lượng không nhiều.

Y tế Nội trợ Làm ruộng Nghỉ hưu/≥60 tuổi

Học sinh cấp 3, sinh viên

Sốt do bọ chét chuột truyền 1 1 0 1 0 0 12 0 1 0 0

Sốt phát ban do Rickettsia 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 Đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban do Rickettsia 0 0 0 0 0 0 3 0 0 1 0

Sốt mòSốt do bọ chét chuột truyền

69 sốt do bọ chét chuột truyền, chỉ có thông tin về nghề nghiệp của 16/17 bệnh nhân được thu thập Ngoài 12 bệnh nhân làm ruộng kể trên, 1 trong 4 bệnh nhân còn lại hoặc làm nghề kinh doanh, dịch vụ/hành chính, sự nghiệp/nghề khác hoặc đã nghỉ hưu/> 60 tuổi Toàn bộ bệnh nhân mắc sốt phát ban đều có nghề nghiệp là làm ruộng Nhóm đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban có 3 trường hợp làm ruộng, 1 trường hợp là sinh viên Bệnh Rikettsia không lây trực tiếp từ người này sang người khác, chỉ được truyền bởi các vector Môi trường sống, tập tính cá nhân, hoạt động nông nghiệp, các hoạt động tiếp xúc đất/cát/đất, cỏ, bụi rậm và các biện pháp bảo hộ khi hoạt động ngoài trời là những yếu tố quan trọng làm lây nhiễm bệnh trong cộng đồng tại các vùng lưu hành bệnh Chúng thường liên quan chặt chẽ tới tính chất nghề nghiệp và hoạt động cá nhân Trong một nghiên cứu ở Ấn Độ, tỷ lệ nhiễm bệnh Rickettsia phần lớn đến từ hoạt động liên quan đến nông nghiệp, bao gồm vào rừng đốn gỗ, chăn thả gia súc, làm việc trên các cánh đồng rau hoặc nấu ăn ngoài trời Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy làm ruộng là công việc chính của cả 3 nhóm bệnh nhân Rickettsia

3.5.3 Phân bố địa lý của các bệnh nhân nhiễm Rickettsia

Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả 12 bệnh viện đều ghi nhận các ca bệnh Rickettsia, tuy nhiên số lượng ca bệnh không đồng đều giữa các bệnh viện Bệnh viện Đa khoa (BVĐK) tỉnh Thanh Hóa và Bệnh viện Hữu nghị Đa khoa Nghệ An là hai đơn vị thu tuyển được số bệnh nhân cao nhất với 68 và 42 bệnh nhân, theo sau đó là BVĐK tỉnh Hà Tĩnh (37 bệnh nhân), BVĐK tỉnh Đắk Lắk (21 bệnh nhân), BVĐK tỉnh Kon Tum (17 bệnh nhân), BVĐK tỉnh Phú Yên (13 bệnh nhân), BVĐK tỉnh Bình Thuận (7 bệnh nhân), Bệnh viện Trung ương Huế (4 bệnh nhân), BV Bệnh nhiệt đới Khánh Hòa cùng BVĐK Trung ương Quảng Nam (3 bệnh nhân), cuối cùng là BVĐK khu vực miền núi phía Bắc Quảng Nam và BVĐK khu vực Ninh Hòa (1 bệnh nhân) Trong khi bệnh nhân mắc sốt mò được thu tuyển ở cả 11 bệnh viện, bệnh nhân mắc sốt do bọ chét chuột truyền và sốt phát ban chỉ xuất hiện lần lượt ở 6 và 3 trong tổng số 12 bệnh viện Có 4 bệnh viện xuất hiện các ca đồng nhiễm nhóm sốt mò và sốt

70 phát ban là BVĐK tỉnh Thanh Hóa, BVĐK khu vực Ninh Hòa, BVĐK tỉnh Kon Tum, BVĐK tỉnh Đắk Lắk Mỗi bệnh viện có một ca bệnh (Bảng 3.8)

Bảng 3.8 Phân bố bệnh Rickettsia theo bệnh viện (n"0)

Tên bệnh viện Sốt mò

Sốt do bọ chét chuột truyền (n (%))

Nhóm sốt phát ban (n (%)) Đồng nhiễm (n (%))

BV Hữu nghị ĐK Nghệ An 42 (21,4) 0 0 0 42 (19,1)

Bệnh viện Trung ương Huế 4 (2,0) 0 0 0 4 (1,8)

BVĐK khu vực miền núi phía Bắc Quảng Nam

BV Bệnh nhiệt đới Khánh

BVĐK khu vực Ninh Hòa 0 0 0 1

Do phần lớn các ca bệnh chuyển lên tuyến tỉnh đều là các ca bệnh Rickettsia chưa được chẩn đoán xác định hoặc chuyển nặng Các ca bệnh được chẩn đoán và điều trị thành công tại các tuyến huyện hoặc xã đều không được nhắc đến ở đây, phần nào làm hạn chế nhận định về số lượng mắc và nhập viện thật sự trên phạm vi tỉnh thành Trong khi các nghiên cứu về sự lưu hành và phân bố của bệnh Rickettsia tại Việt Nam nói chung và miền Trung nói riêng còn rất hạn chế, việc ghi nhận các ca bệnh Rickettsia tại cả 12 bệnh viện trong nghiên cứu là thông tin có giá trị đối với các bác sĩ lâm sàng, giúp bác sĩ có căn cứ để nghĩ đến hướng chẩn đoán bệnh Rickettsia trên các bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân, qua đó tiến hành thăm khám, chỉ định các xét nghiệm phù hợp hoặc điều trị thử để khẳng định chẩn đoán

Hình 3.7 Phân bố bệnh sốt mò tỉnh thành (n6)

Các trường hợp bệnh nhân sốt mò có mặt ở 16 tỉnh/thành phố thuộc 3 khu vực của Miền Trung, Việt Nam Trong đó, các ca bệnh tập trung chủ yếu ở khu vực Duyên hải Bắc Trung Bộ gồm: Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh là 3 tỉnh ghi nhận nhiều ca bệnh sốt mò nhất với số ca lần lượt 66, 39 và 38 Các tỉnh còn lại của khu vực này là Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế ghi nhận số ca tương ứng là 2 ca và 1 ca Một số lượng đáng kể các ca bệnh sốt mò cũng được báo cáo tại khu vực Tây Nguyên gồm: Kon Tum (16 ca) và Đắk Lắk (14 ca), Đắk Nông (4 ca), Gia Lai, Lâm Đồng (1 ca) Các ca sốt mò ở khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ chủ yếu tập trung tại Phú Yên (9 ca) và ở các tỉnh thành: Khánh Hòa, Bình Phước, Bình Thuận, Quảng Nam (mỗi tỉnh 1 ca) Tỉnh không ghi nhận ca chuẩn đoán xác định sốt mò là Quảng Ngãi, Bình Định, Đà Nẵng

Hình 3.8 Phân bố bệnh sốt do bọ chét chuột truyền theo tỉnh thành (n)

17 ca sốt do bọ chét chuột truyền phân bố ở 7 tỉnh của miền Trung, trong đó tập trung chủ yếu ở khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ Bình Thuận là tỉnh có số ca nhiễm cao nhất với 5 ca Phú Yên ghi nhận 3 ca sốt do bọ chét chuột truyền Quảng Nam và Khánh Hòa, mỗi tỉnh 2 ca, 1 ca còn lại đến từ Quảng Ngãi Khu vực Duyên hải Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên lần lượt có số ca mắc là 3 và 1 tương ứng với các tỉnh Hà Tĩnh và Kon Tum

Hình 3.9 Phân bố bệnh sốt phát ban theo tỉnh thành (n=3)

Ba bệnh nhân nhiễm sốt phát ban được xác định đến từ 3 tỉnh: Thanh Hóa, Kon Tum và Lâm Đồng Trong đó, Lâm Đồng là tỉnh duy nhất không có bệnh viện tham gia thu tuyển bệnh nhân vào nghiên cứu

Hình 3.10 Phân bố các ca bệnh đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban theo tỉnh thành

Các ca đồng nhiễm sốt mò và sốt phát ban phân bố ở cả 3 khu vực thuộc Miền Trung, Việt Nam Khu vực Tây Nguyên ghi nhận 2 ca bệnh ở các tỉnh Kon Tum, Đắk Lắk 2 ca bệnh còn lại phân bố ở khu vực Duyên hải Bắc Trung Bộ và Duyên hải Nam Trung Bộ thuộc các tỉnh Thanh Hóa và Khánh Hòa, mỗi tỉnh 1 ca

Trong số 220 bệnh nhân được nhập viện và điều trị tại 12 bệnh viện thuộc 9 tỉnh thành, có 14/19 tỉnh/thành miền Trung với địa danh cụ thể là Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận là nơi xuất phát của các bệnh nhân này.

75 ương Huế thu nhận bệnh nhân đến từ nhiều tỉnh thành khác nhau của miền Trung Việc không ghi nhận ca bệnh Rickettsia tại 5 tỉnh còn lại không có nghĩa là các tỉnh thành này không phải vùng lưu hành của bệnh Rickettsia Cụ thể như đối với Quảng Nam, chúng tôi không ghi nhận ca bệnh nào đến từ tỉnh này Tuy nhiên, Lê Viết Nhiệm và cộng sự trước đó đã tiến hành nhiều nghiên cứu về bệnh Rickettsia tại các bệnh viện lớn ở Quảng Nam, bao gồm Bệnh viện Đa khoa Trung ương Quảng Nam, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Nam và Bệnh viện Đa khoa khu vực miền núi phía Bắc Quảng Nam Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy sốt mò là bệnh khá phổ biến trong số các bệnh nhân sốt không rõ nguyên nhân thu tuyển tại các bệnh viện kể trên Số ca bệnh sốt do bọ chét chuột truyền cũng được ghi nhận với một số lượng đáng kể Đáng chú ý, nghiên cứu bệnh chứng của Lê Viết Nhiệm và cộng sự trên 378 bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân và 384 bệnh nhân nhóm chứng phát hiện 3 bệnh nhân đầu tiên nhiễm R felis tại Việt Nam bằng phương pháp PCR Do nguồn lực có hạn nên nghiên cứu của chúng tôi chỉ được triển khai trên một số bệnh viện nhất định trong số rất nhiều bệnh viện tuyến huyện, tỉnh và trung ương ở miền Trung Dựa trên phân tuyến bệnh viện và quy định về chuyển tuyến khám chữa bệnh bảo hiểm y tế tại Việt Nam, việc triển khai nghiên cứu tại các bệnh viện tuyến đầu của các tỉnh thành nhằm làm tăng khả năng bắt gặp bệnh nhân sốt chưa rõ nguyên nhân, trong đó có bệnh nhân nhiễm Rickettsia Do vậy, kết quả nghiên cứu phản ánh một cách tương đối về sự lưu hành, phân bố của bệnh do Rickettsia ở miền Trung Qua đó, giúp củng cố hiểu biết về đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsia tại khu vực này

Hình 3.11 Phân bố bệnh Rickettsia theo khu vực thành thị, nông thôn