Tổng hợp và thiết lập tạp chất Đối chiếu của allopurinol sử dụng trong kiểm nghiệm

Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản, allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc phát sinh các tạp chất liên quan có khả năng gây độc tính hoặc đột biến gen, ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu q

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Trình tự nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt hình 2.1

1.1 Tổng hợp và tinh chế các tạp chất A, B, C, D, E, F của allopurinol theo

1.2 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp bằng các phương pháp phổ nghiệm

UV-Vis; IR; HRMS; NMR

1.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện phản ứng đến hiệu suất tổng hợp các tạp

2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng HPLC-DAD theo ICH Q2(R1)

2.2 Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu A, B, C, D, E, F của allopurinol theo tiêu chuẩn quốc gia

3.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng LC-MS/MS theo ICH Q2(R2)

3.2 Ứng dụng chuẩn tạp và quy trình LC-MS/MS cho một số nguyên liệu và chế phẩm allopurinol trên thị trường

Hình 2 1 Trình tự các nội dung nghiên cứu

Mục tiêu 1: tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm mục: 1.1; 1.2; 1.3

Mục tiêu 2: xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol

A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia bao gồm mục: 2.1; 2.2

Mục tiêu 3: xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời

6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS bao gồm mục: 3.1; 3.2.

Đối tượng nghiên cứu

Gồm 6 tạp chất liên quan của allopurinol

Tạp A: 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxamid; 3-aminopyrazol-4-carboxamid Tạp B: 5-(Formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxamid

Tạp C: 5-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4-carboxamid

Tạp D: Ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat

Tạp E: Ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat

Tạp F: Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino-pyrazol-4-carboxylat

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng 5/2017 đến tháng 5/2023 Địa điểm: Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh

Cỡ mẫu của nghiên cứu

- Tạp A, B, C, D, E, F được tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm tối thiểu 2 g

- Nguyên liệu hoạt chất allopurinol 2000 g được cung cấp từ Honor Bio – Pharm (Trung Quốc) và nguyên liệu hóa chất cơ bản trong tổng hợp và phân tích.

Xác định các biến số độc lập và biến phụ thuộc

Biến độc lập: nguyên liệu tổng hợp, điều kiện phản ứng, điều kiện sắc ký, điều kiện khối phổ

Biến phụ thuộc: sản phẩm tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol đạt tiêu chuẩn quốc gia; quy trình định lượng đồng thời 6 tạp bằng phương pháp LC-MS/MS.

Phương pháp và công cụ đo lường thu thập số liệu

Luận án sử dụng các phương pháp tổng hợp và phân tích sau:

- Phương pháp tổng hợp hóa học bao gồm tổng hợp hoặc phân hủy từ nguyên liệu, khảo sát yếu tố ảnh hưởng hiệu suất phản: tỷ lệ mol, nhiệt độ và thời gian phản ứng

- Phương pháp xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng; DSC; nhiệt nóng chảy

- Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc bằng UV-Vis; IR; HRMS; NMR

- Phương pháp phân tích xác định độ tinh khiết và định lượng bằng kỹ thuật hiện đại HPLC – DAD; LC-MS/MS

2.6.2 Nguyên vật liệu thử nghiệm

Bảng 2 1 Một số nguyên liệu, chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Chuẩn Nguồn gốc Số lô HL (%)

Allopurinol Viện KNT TP.HCM QT269 020520 99,7

Tạp chuẩn A EDQM - Hội đồng châu Âu No3 Code: A0350010 100

Tạp chuẩn B EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350020 100

Tạp chuẩn C EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350030 100

Tạp chuẩn D EDQM - Hội đồng châu Âu No4 Code: A0350040 100

Tạp chuẩn E EDQM - Hội đồng châu Âu No1 Code: A0350050 100

Bảng 2 2 Một số dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nguồn gốc/Quốc giá Hàm lượng

1 Acid acetic Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%

3 Acid hydrocloric Xilong/Trung Quốc 35 – 38%

5 Acid sulfuric Xilong/Trung Quốc 95 – 98%

7 Allopurinol Honor Bio/Trung Quốc 99,07%

11 Ethyl acetat Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%

14 Natri hydrocarbonat Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%

15 Natri hydroxyd Xilong/Trung Quốc ≥ 99,5%

Thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn đạt yêu cầu mục đích sử dụng và quản lý theo quy định GLP và ISO/IEC 17025

Bảng 2 3 Một số trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Hãng Nước sản xuất

1 Bộ dụng cụ đun hồi lưu Bomex Trung Quốc

2 Buồng soi UV Vilber Lourmat Pháp

3 Bình cầu 250 ml Bomex Trung Quốc

4 Cân phân tích 5 số KERN Đức

5 Hệ thống nhiệt vi sai DSC TA Instrument Mỹ

6 Hệ thống HPLC – LC – 20A Shimadzu Nhật

7 Hệ thống HPLC – DAD Hitachi Nhật

8 Máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz Bruker Thụy sĩ

9 Máy cộng hưởng từ hạt nhân 400 MHz Bruker Thụy sĩ

10 Máy đo điểm chảy Mettler Toledo Thụy sĩ

11 Máy đo pH CONSORT Bỉ

12 Máy cô quay R-200 Buchi Nhật

13 Máy khuấy từ gia nhiệt HEIDOLPH MR Hei - TEC

Quy trình thu thập và cách phân tích số liệu

Trên cơ sở các tài liệu tham khảo8,9,40,64,66,69, khảo sát điều kiện ban đầu tổng hợp các tạp chất liên quan A, B, C, D, E, F của allopurinol

2.7.1 Tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol

2.7.1.1 Tổng hợp tạp A của allopurinol

Tiến hành khảo sát quá trình tổng hợp tạp A allopurinol bằng phản ứng phân hủy allopurinol trong các tác nhân kiềm hóa khác nhau dưới sự hỗ trợ của nhiệt độ

- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NaHCO3

Hòa tan allopurinol vào dung dịch NaHCO3, đun hồi lưu để tạo phức Để nguội, điều chỉnh pH = 6 rồi lọc Tiếp tục điều chỉnh pH = 2, để qua đêm và lọc để thu tủa Rửa tủa bằng nước lạnh rồi sấy khô ở 60℃.

Sơ đồ 2 1 Phân hủy allopurinol bằng NaHCO3

STT Thiết bị Hãng Nước sản xuất

14 Máy LC/MS IT-TOF Shimadzu Nhật

15 Máy lọc nước siêu sạch MERCK Đức

16 Máy quang phổ hồng ngoại Bruker Thụy sĩ

17 Máy quang phổ UV – Vis JASCO Nhật

18 Máy siêu âm POWERSONIC Hàn Quốc

19 Máy sắc ký lỏng UPLC – MS/MS Water Mỹ

- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NH3

Hòa tan 2,0 g allopurinol (14,7 mmol) vào 40 ml dung dịch NH3 Đun hồi lưu dung dịch ở nhiệt độ 140 ℃ trong 3 giờ Để nguội, sau đó điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 6 bằng dung dịch H2SO4 10%, lọc lấy dịch Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 2 bằng dung dịch H2SO4 10% Để dung dịch qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa Rửa tủa bằng nước lạnh (3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 ℃ đến không đổi để thu lấy sản phẩm

Sơ đồ 2 2 Phân hủy allopurinol bằng NH3

- Phân hủy allopurinol bằng dung dịch NaOH

Hòa tan allopurinol vào dung dịch NaOH, đun hồi lưu rồi điều chỉnh pH = 6 để kết tủa lần đầu Tiếp tục điều chỉnh pH = 2 để tạo tủa, lọc cẩn thận và rửa tủa nhiều lần bằng nước lạnh Sấy tủa ở 60℃ đến khối lượng không đổi để thu được sản phẩm.

Sơ đồ 2 3 Phân hủy allopurinol bằng NaOH

2.7.1.2 Tổng hợp tạp B của allopurinol

Tiến hành cân 0,5 g tạp A allopurinol dạng hemisulfat (2,85 mmol) cho vào 4 ml formamid, thờm tiếp vào 30 àl acid formic đun hỗn hợp trờn bếp cỏch thủy khoảng 95 o C trong 2 giờ, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau khi kết thúc phản ứng, cho vào hỗn hợp 20 ml nước cất khuấy đều, lọc lấy tủa Rửa tủa với nước cất (10 ml x 3 lần), sấy ở 60 o C đến khối lượng không đổi, thu lấy sản phẩm

Sơ đồ 2 4 Quy trình phản ứng tổng hợp tạp B

2.7.1.3 Tổng hợp tạp C của allopurinol

Phương pháp 1: tạp A allopurinol hemisulfat phản ứng với 1,2-diformylhydrazin

Cho 1,8 g tạp A allopurinol hemisulfat (0,01 mol) và 1,76 g 1,2- diformylhydrazin (0,02 mol) vào bình phản ứng Thêm vào bình dung dịch H2SO4

20% làm môi trường phản ứng Đun hỗn hợp trên hệ thống đun hồi lưu ở nhiệt độ

105 o C trong 5 giờ Cô cạn dịch sau phản ứng còn khoảng 20 - 30 ml Để nguội, khảo sát kết quả sản phẩm sau phản ứng

Sơ đồ 2 5 Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân 1,2-diformylhydrazin

Phương pháp 2: tạp A allopurinol hemisulfat phản ứng với acid formic và hydrazin

Cho hỗn hợp allopurinol hemisulfat (0,01 mol), acid formic (0,3 mol) và hydrazin hydrat 80% (0,1 mol) phản ứng trong 5 giờ ở 95 - 105 độ C Sau khi cô cạn, lọc bỏ tạp chất vô cơ, cô quay dịch lọc để kết tủa sản phẩm tạp C tổng hợp Lọc, sấy sản phẩm thu được ở 60 độ C cho tới khi khối lượng không đổi.

Sơ đồ 2 6 Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân acid formic và hydrazin

2.7.1.4 Tổng hợp tạp D của allopurinol

Lấy 0,005 mol ethyl (ethoxymethylen)cyanoacetat, thêm vào 20 ml ethanol

96 o Lắc đều cho tan, thêm vào 0,5 ml hydrazin hydrat 80% Đun hồi lưu Cô quay dịch sau phản ứng đến hết dung môi, hòa tan sản phẩm thu được với 10 ml diethyl ether, lọc và cô quay áp suất giảm thu được sản phẩm, tiếp tục sấy ở 60 °C đến khối lượng không đổi, cân sản phẩm thu được

Sơ đồ 2 7 Sơ đồ tổng hợp tạp D allopurinol

2.7.1.5 Tổng hợp tạp E của allopurinol

Phương pháp 1: Tạp D allopurinol phản ứng với triethyl orthoformat

Hòa tan 1,8 g tạp D trong 36 ml trietyl orthoformat và đun hồi lưu ở nhiệt độ khoảng 95ºC trong 4 giờ Sau đó, pha loãng dung dịch với 5 ml cồn 96º và 5 ml nước Tiếp tục bốc hơi dung dịch trên bếp cách thủy ở nhiệt độ khoảng 60ºC cho đến khi tinh thể bắt đầu xuất hiện Lọc và rửa tinh thể thu được với 3 lần 5 ml nước Cuối cùng, sấy sản phẩm ở 60ºC cho đến khi khối lượng không đổi.

Sơ đồ 2 8 Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và triethyl orthoformat

Phương pháp 2: Tạp D allopurinol phản ứng với acid formic

Hòa tan 1,8 g tạp D allopurinol (0,01 mol) trong lượng vừa đủ methanol Cho vào dung dịch 10 ml acid formic (0,265 mol) Đun hồi lưu trong bình cầu 2 cổ trong

3 giờ Lọc tủa, sấy tủa ở 60 o C đến khối lượng không đổi Đun hồi lưu Đun hồi lưu

Sơ đồ 2 9 Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và acid formic

2.7.1.6 Tổng hợp tạp F của allopurinol

Phương pháp 1: hòa tan 0,2 g tạp D allopurinol (1,1 mmol) trong 2 ml triethyl orthoformat (1,75 mmol) và 0,2 ml ethyl 2-cyanoacetat (1,8 mmol) Đun hồi lưu hỗn hợp (khoảng 95 o C) trong 4 giờ, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau khi kết thúc phản ứng, pha loãng dung dịch thu được với 5 ml ethanol 96 o , lắc đều Thêm tiếp 5 ml nước Bốc hơi dung dịch trên bếp cách thủy (khoảng 60 o C) đến khi tinh thể bắt đầu xuất hiện Lọc thu tinh thể Rửa tinh thể thu được với 15 ml nước (3 x 5 ml) Sấy sản phẩm ở 60 o C đến khối lượng không đổi

Sơ đồ 2 10 Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và triethylorthoformat

Phương pháp 2: cho 3,5 g nguyên liệu ethyl (ethoxymethylen)cyanoacetat vào

20 ml cồn tuyệt đối, hỗn hợp được khuấy từ gia nhiệt kết hợp gắn với sinh hàn Đợi đến khi nguyên liệu tan hoàn toàn thì cho hydrazin hydrat 50% vào Sau khoảng 10 phút thì thấy xuất hiện tủa trắng, lọc và rửa tủa với 10 ml nước cất Sấy sản phẩm ở

60 °C đến khối lượng không đổi và đem cân

Sơ đồ 2 11 Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và hydrazin hydrat 50%

2.7.2 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp

Thử sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng: khảo sát và lựa chọn ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm Sản phẩm là tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng khi sắc ký đồ của ba hệ dung môi khác nhau cho một vết gọn duy nhất

Sản phẩm sau khi đạt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng sẽ được thực hiện:

- Đo phổ UV-Vis để xác định cực đại hấp thu đặc trưng

- Đo phổ IR để xác định sự có mặt của các đỉnh đặc trưng cho các nhóm chức trong phân tử (so sánh với phổ IR của tạp chuẩn)

- Đo phổ MS phân giải cao để xác định số khối của phân tử, so sánh giá trị đo được với giá trị lý thuyết yêu cầu độ lệch khối nhỏ hơn 5 ppm

- Đo phổ 1 H NMR và 13 C NMR (so sánh với phổ NMR của tạp chuẩn hoặc phổ NMR của tài liệu tham khảo đã công bố) để xác định đúng cấu trúc phân tử của sản phẩm tổng hợp Trong trường hợp cần thiết có thể đo các phổ 2 chiều như DEPT; NOSEY…

2.7.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hướng đến nâng cao hiệu suất phản ứng

Khảo sát điều kiện tổng hợp

- Khảo sát tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng

- Khảo sát nhiệt độ phản ứng

- Khảo sát thời gian phản ứng

- Khảo sát quá trình tinh chế, loại tạp: có thế áp dụng các phương pháp tinh chế sau:

Quy trình tinh chế đầu tiên sử dụng dung môi ethanol 96 o kết hợp với nước nóng Đầu tiên, cho 1 gam sản phẩm tổng hợp vào cốc đựng mỏ có dung tích 100 ml Sau đó, đun sôi hỗn hợp ethanol 96 o và nước theo tỷ lệ 1:1 Khi hỗn hợp sôi, nhỏ từ từ vào cốc đựng sản phẩm cho đến khi tan hết Tiếp theo, để hỗn hợp qua đêm để tinh thể hình thành Cuối cùng, lọc để thu được tinh thể, rồi sấy ở nhiệt độ 60 ℃ để loại bỏ dung môi còn lại, thu được sản phẩm tinh chế.

Quy trình 2: sử dụng ethanol 96 o nóng Cho 1 g sản phẩm tổng hợp vào cốc có mỏ 100 ml, thêm từ từ cồn đun sôi vào cốc có mỏ đến khi sản phẩm tan hoàn toàn Để ethanol bay hơi ở nhiệt độ phòng (khoảng 2 - 3 ngày), thu được tinh thể, tiến hành lọc thu lấy tinh thể, sấy ở 60 o C thu được sản phẩm tinh chế

Phương pháp phân tích dữ liệu

Phần xử lý phân tích kết quả quy trình định lượng bằng HPLC-DAD sử dụng phần mềm Labsolution của Shimadzu và EZChrom Elite của Hitachi

Phần xử lý kết quả định lượng tạp chất tổng hợp bằng phần mềm excel của microsoft office 2021

Phần xử lý kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm bằng phần mềm SPSS 26.0

Phần xử lý kết quả quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phần mềm Masslynx cho hệ thống UPLC-MS/MS của Water.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tổng hợp và tinh chế tạp chất liên quan của allopurinol

3.1.1 Tổng hợp và tinh chế tạp A allopurinol

3.1.1.1 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp bằng sắc ký lớp mỏng

Phân hủy allopurinol bằng các tác nhân kiềm hóa khác nhau NaOH, NaHCO3,

NH3 đều cho sản phẩm tính chất giống nhau

Hòa tan sản phẩm tổng hợp trong methanol với nồng độ 1mg/ml triển khải trên

3 hệ dung môi pha động có độ phân cực khác nhau: (1): cloroform – aceton – methanol (9:1:1); (2): cloroform– ethyl acetat – methanol – acid formic (50:40:40:1); (3): cloroform – ethanol – acid formic (70:30:1) Chấm trên bản mỏng silicagel F254, khai triển sắc ký đến khi dung môi di chuyển được 10 cm, lấy bản mỏng ra và để khô trong tủ hút, quan sát bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm Kết quả vết mẫu sản phẩm tổng hợp ở 3 hệ dung môi đều cho 1 vết duy nhất trên SKLM có Rf tương ứng với 3 hệ dung môi là: 0,71; 0,48 và 0,22 (PL 1.1)

3.1.1.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp

Phổ UV-VIS (dung dịch NaOH 0,1 M): có 2 cực đại hấp thu 222,5 nm và 250 nm

Phổ IR (KBr, cm -1 ): 3444,3 và 3399,9 (𝑣 𝑁−𝐻 ; 𝑎𝑚𝑖𝑛); 1665,6 (𝑣 𝐶=𝑂 ; 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑦𝑙), 1462,7 (𝑣 𝐶=𝑁 ; pyrazol), 1119,7 (𝑣 𝑁−𝑁 ; pyrazol) (PL 1.1)

Phổ HRMS-ESI (+): m/z 127,06123 [M + H] + (tương ứng dạng base tạp A allopurinol) Phổ phân mảnh MS 1 của hệ thống máy khối phổ MS/MS cho tín hiệu [M + H] + 127,1 và [M + Na] + 149,1 (PL 1.1)

- Phổ 1 H NMR,  (DMSO-d 6; 500 MHz, ppm); 8,04 (s, 1H)

- Phổ 13 C NMR,  (DMSO-d 6; 125 MHz, ppm); 99,9 (C3); 150,3(C4); 133,9 (C5); 165,2 (C6) (PL 1.1)

Phản ứng hóa học gốc muối sulfat: có kết tủa trắng khi phản ứng BaCl2/H2SO4

Kết luận: các dữ liệu phổ UV-Vis, IR, HRMS, NMR, phản ứng hóa học của sản phẩm tổng hợp tương đồng và phù hợp với cấu trúc của tạp A allopurinol hemisulfat

3.1.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp Ảnh hưởng tác nhân kiềm hóa: NH 3, NaHCO 3 và NaOH

Cố định nguyên liệu allopurinol 2,0 g (14,7 mmol), thay đổi tác nhân kiềm hóa là NH3, NaHCO3 và NaOH

Trong quá trình tổng hợp tạp A allopurinol, việc lựa chọn tác nhân kiềm hóa đóng vai trò quan trọng Trong số ba tác nhân NaOH, NaHCO3 và NH3 cùng tỷ lệ mol, NaOH vượt trội hơn hẳn các tác nhân còn lại với hiệu suất tạo sản phẩm cao nhất (PL 1.1) Do đó, NaOH được lựa chọn là tác nhân tiếp tục nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ mol, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng, pH phản ứng và kết tinh đối với quá trình tổng hợp tạp A allopurinol.

Cố định khối lượng allopurinol 2,0 g (14,7 mmol), khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol allopurinol/NaOH đến hiệu suất phản ứng

Hiệu suất phản ứng thay đổi đáng kể khi thay đổi tỷ lệ mol Trong đó tỷ lệ mol allopurinol : NaOH là 1 : 4,4 tương ứng với 50 ml NaOH 1M cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A cao nhất là 48,42% (PL 1.1) Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Cố định tỷ lệ mol allopurinol/NaOH là 1:4,4, khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất phản ứng Trong các giá trị khảo sát, nhiệt độ 180 o C cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A cao nhất là 49,68% (PL 1.1) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất Trong các khảo sát, thời gian phản ứng 5 giờ cho hiệu suất tổng hợp tạp A cao nhất là 50,33% (PL 1.1) Ảnh hưởng của pH loại tủa allopurinol chưa phản ứng pH 4 4,5 5 5,5 6

Giá trị pH dùng để kết tủa allopurinol còn lại sau phản ứng không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất phản ứng Trong các pH khảo sát, chọn giá trị pH = 5 loại tủa vì có hiệu suất tổng hợp sản phẩm cao nhất là 51,67% (PL 1.1) Ảnh hưởng của pH kết tinh tạp A allopurinol hemisulfat pH 1,40 1,45 1,50 1,55 1,60

Giá trị pH kết tinh tạp A allopurinol hemisulfat ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Trong đó giá trị pH = 1,5 cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A dạng muối hemisufat là cao nhất là 57,07% (PL 1.1)

3.1.1.4 Tinh chế sản phẩm tổng hợp

Khảo sát kết quả tinh chế trên khối lượng sản phẩm thô khoảng 1,3 g với 3 quy trình khác nhau được trình bày ở mục 2.7.3

Trong 3 quy trình tinh chế, quy trình 3 sử dụng dung môi cồn ethanol 96 o – nước (4:1) đã làm lạnh cho hiệu suất tinh chế cao nhất khoảng 83% Tiến hành thí

Hiệu suất (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Quy trình 3 84,48 83,29 82,28 83,35 nghiệm như trên lặp lại 6 lần (n = 6), khối lượng sản phẩm tạp A allopurinol hemisuflat thu được trước và sau tinh chế

Trước tinh chế (g) 1,3007 1,3126 1,3021 1,3162 1,3053 1,3001 Sau tinh chế (g) 1,0937 1,1366 1,1141 1,0857 1,0832 1,1117 Kết luận: Hiệu suất toàn bộ quy trình: 48,8%

Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat

Hòa tan 2,0 g allopurinol (14,7 mmol) vào 50 ml dung dịch NaOH 1 M (50 mmol) Đun hồi lưu dung dịch ở nhiệt độ 180 o C trong 5 giờ Để nguội, sau đó điều chỉnh pH của dung dịch đến giá trị pH = 5 bằng dung dịch H2SO4 10%, lọc lấy dịch Tiếp tục điều chỉnh pH dịch lọc thu được đến giá trị pH = 1,5 bằng dung dịch H2SO4

10% Để dung dịch qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc cẩn thận để thu lấy tủa Rửa tủa bằng nước cất lạnh (3 ml/lần x 3 lần) Sấy ở 60 o C để thu lấy sản phẩm Cho sản phẩm tổng hợp vào cốc có mỏ 100 ml, thêm khoảng 80 ml hỗn hợp cồn tuyệt đối – nước (4:1) đã làm lạnh, khuấy đều hỗn hợp khoảng 3 phút, sau đó lọc qua giấy lọc thu lấy sản phẩm Sấy sản phẩm ở 60 o C trong 4 giờ

Sơ đồ 3 1 Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat

3.1.2 Tổng hợp và tinh chế tạp B allopurinol

3.1.2.1 Xác định sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp bằng sắc ký lớp mỏng

Hòa tan sản phẩm tổng hợp trong methanol nồng độ 1 mg/ml triển khải trên 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau (1): cloroform – acid acetic – methanol (9:1:1); (2): cloroform – ethyl acetat – methanol (5:2:3); (3): ethyl acetat – methanol (4:7) Chấm mẫu trên bản mỏng silicagel F254,khai triển đến khi dung môi di chuyển được 10 cm, lấy bản mỏng và để khô trong tủ hút, quan sát bằng đèn UV tại bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy sản phẩm tổng hợp cho 1 vết duy nhất trên SKLM với Rf tương ứng với 3 hệ dung môi là 0,20; 0,51 và 0,79 chứng tỏ sản phẩm tổng hợp tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng (PL 1.2)

3.1.2.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp

Phổ UV-Vis (dung dịch NaOH 0,1 M) có 01 cực đại hấp thu 245,8 nm (PL 1.2) Phổ IR (KBr 1%, cm -1 ) của sản phẩm tổng hợp với các mũi đặc trưng cho các nhóm chức có trong cấu trúc: 3397,6 và 3204,7 (𝑣𝑁-𝐻, amin); 1704,6 (𝑣𝐶=𝑂, carbonyl), 1595,2 (𝑣𝐶=𝑁) và phù hợp với cấu trúc của tạp B (PL 1.2)

Phổ HRMS-ESI (+): m/z 177,0389 [M+Na] + phù hợp với khối lượng phân tử của tạp

- Phổ 1 H NMR,  (DMSO-d6; 400MHz, ppm); 13,05 (s, 1H); 12,76 (s,1H); 8,89 (d, 1H,J = 11.3, H); 8,20 (s, 1H) (PL 1.2)

- Phổ 13 C NMR,  (DMSO-d6; 100MHz, ppm); 165,2 (C6); 160,7 (C7); 147,4 (C5); 130,1 (C3); 102,6 (C4) (PL 1.2)

Kết luận: các dữ liệu phổ UV-Vis; IR, HRMS, NMR của sản phẩm tổng hợp tương đồng và phù hợp với cấu trúc của tạp B allopurinol

3.1.2.3 Khảo sát các yếu tố quả ảnh hưởng hiệu suất tổng hợp Ảnh hưởng tỷ lệ mol xúc tác acid formic và formamid

Trong các khảo sát tỷ lệ mol xúc tác acid formic/formamid 1:100 cho hiệu suất tổng hợp cao nhất là 55,6% Lựa chọn tỷ lệ mol acid formic/formamid 1:100 khảo sát tiếp các yếu tố ảnh hưởng hiệu suất tổng hợp (PL 1.2) Ảnh hưởng của tỷ lệ mol tạp A allopurinol hemisulfat và formamid

Cố định nguyên liệu tạp A allopurinol hemisulfat 2,5 g (14,27 mmol), tăng dần lượng formamid theo tỷ lệ mol khảo sát

Trong các kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ mol tạp A allopurinol hemisulfat và formamid là 1:35 tương ứng với 20 ml formamid (0,503 mol) cho hiệu suất phản ứng cao nhất 65,07% (PL 1.2) Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Cố định nguyên liệu tạp A 2,5 g allopurinol hemisulfat (14,27 mmol) và 20 ml formamid (0,503 mol), thay đổi nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất phản ứng Trong các giá trị nhiệt độ khảo sát, nhiệt độ phản ứng là 95 ℃ (đun hồi lưu) cho hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp B allopurinol cao nhất là 78,15% (PL 1.2) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Cố định các điều kiện tối ưu trên Khảo sát thời gian phản ứng

Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol

3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng các tạp chất đối chiếu của allopurinol

3.2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Trên cơ sở tài liệu tham khảo 17-19 , khảo sát điều kiện sắc ký và tiêu chuẩn đánh giá

- Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động, ưu tiên lựa chọn dung môi pha động là các chất dễ bay, không đóng muối như acetonitril, metanol, acid phosphoric, acid acetic, acid formic Khảo sát lựa chọn pH, tốc độ dòng và nhiệt độ cột thích hợp

- Tiêu chuẩn đánh giá khi các pic đáp ứng yêu cầu về hình dạnh pic, hệ số bất đối, hệ số phân giải, hệ số dung lượng theo ICH Q2(R1) Thời gian lưu ngắn

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp A allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: acetonitril – nước; acetonitril – acid phosphoric; acetonitril – acid formic; acetonitril – acid acetic; methanol – acid phosphoric

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp B allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: acetonitril – nước; acetonitril – acid phosphoric; acetonitril – acid formic; acetonitril – acid acetic; methanol – acid phosphoric

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp C allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: acetonitril – methanol; acetonitril – acid formic; acetonitril – acid phosphoric

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp D allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: Acetonitril – acid phosphoric; acetonitril – acid formic; acetonitril – acid acetic

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp E allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: acetonitril – nước; acetonitril – acid phosphoric; acetonitril – acid formic; methanol – acid phosphoric

Khảo sát điều kiện sắc ký tạp F allopurinol

Thành phần pha động khảo sát: Acetonitril – acid phosphoric; acetonitril – acid formic; acetonitril – acid acetic

Kết quả khảo sát được trình bày ở phụ lục PL 2.1; PL 2.2; PL 2.3; PL 2.4; PL 2.5; PL 2.6 và bảng 3.5 tóm tắt điều kiện sắc ký tối ưu trong các điều kiện khảo sát.

Bảng 3 1 Tóm tắt điều kiện sắc ký các quy trình định lượng các tạp allopurinol bằng phương pháp HPLC-DAD

(àg/ml) Pha tĩnh Pha động Nhiệt độ cột ( o C)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm mẫu (àl)

Tạp A allopurinol 50 Cột Gemini NX C18

Tạp B allopurinol 50 Cột Gemini NX C18

Cột Synergi 4u MAX RP 80R (250 x 4,6 mm; 4 àm)

Tạp D allopurinol 50 Cột Gemini NX C18

Tạp E allopurinol 50 Cột Gemini NX C18

Tạp F allopurinol 50 Cột Gemini NX C18

3.2.1.2 Thẩm định quy trình định lượng các tạp chất liên quan allopurinol

Tính phù hợp hệ thống

Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của 06 quy trình định lượng tạp allopurinol trình bày ở bảng 3.6 (PL 2.1, PL 2.2, PL 2.3, PL 2.4, PL 2.5, PL 2.6)

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n = 6)

Quy trình định lượng tạp t R

RSD % 0,84 1,12 1,90 1,92 t R : thời gian lưu, S: diện tích pic, A s : hệ số bất đối, N: số đĩa lý thuyết

Tiến hành sắc ký các mẫu: (1) dung môi pha mẫu (pha động), (2) mẫu thử tạp A; (3) hỗn hợp chuẩn tạp A allopurinol và allopurinol; (4) allopurinol nguyên liệu

Kết quả sắc ký đồ cho thấy tạp chất A tách hoàn toàn khỏi nguyên liệu allopurinol và không bị ảnh hưởng bởi dung môi pha mẫu Độ tinh khiết của tạp chất A đạt mức cao, với độ tinh khiết đỉnh là 1,000 Phổ 3D cũng xác nhận sản phẩm đạt độ tinh khiết cao.

Hình 3 2 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, mẫu thử tạp A allopurinol, hỗn hợp chuẩn tạp A và allopurinol, allopurinol nguyên liệu ở bước sóng 220 nm

Hình 3 3 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp A allopurinol

Tiến hành sắc ký các mẫu (1): dung môi pha mẫu, (2): dung môi pha động, (3) mẫu tạp B thử, (4): mẫu tạp A nguyên liệu, (5): mẫu hỗn hợp chuẩn tạp B và tạp A

Kết quả: trên sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic tạp A và pic tạp B trên sắc ký đồ mẫu thử Trên sắc ký đồ pic tạp B tách hoàn toàn khỏi pic tạp A Pic tạp B đạt độ tinh khiết cao (peak purity 1,000) Phổ 3D cho thấy sản phẩm tạp B tinh khiết

Hình 3 4 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tạp B allopurinol, mẫu thử tạp A allopurinol; hỗn hợp chuẩn tạp B và tạp A allopurinol ở bước sóng 220 nm

Hình 3 5 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp B allopurinol

Tiến hành sắc ký: (1): dung môi pha động, (2): mẫu allopurinol, (3): mẫu tạp

C phân hủy, (4): mẫu thử tạp C thêm chuẩn, (5): mẫu tạp C thử, (6): mẫu tạp C chuẩn, (7): mẫu tạp B, (8): mẫu tạp A, (9): mẫu hỗn hợp tạp A, B và C

Kết quả: trên sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic tạp C trên sắc ký đồ mẫu thử Trên sắc ký đồ mẫu hỗn hợp, pic tạp C tách hoàn toàn khỏi pic tạp B và tạp A Các pic của sản phẩm phân hủy không trùng thời gian lưu với pic tạp C Pic tạp C đạt độ tinh khiết cao (peak purity 1,000) Phổ 3D cho thấy sản phẩm tạp C tinh khiết

Hình 3 6 Sắc ký đồ dung môi pha động, allopurinol chuẩn, tạp C allopurinol phân hủy, tạp B allopurinol chuẩn, tạp A allopurinol nguyên liệu, hỗn hợp chuẩn tạp A,

B, C allopurinol chế độ UV 200 nm

Hình 3 7 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp C allopurinol

Tiến hành sắc ký các mẫu: dung môi pha mẫu (pha động), mẫu chuẩn tạp D allopurinol và mẫu thử tạp D allopurinol

Kết quả: mẫu thử tạp D allopurinol có thời gian lưu trùng mẫu chuẩn Pic tạp

D đạt độ tinh khiết cao (peak purity 0,999) Phổ 3D cho thấy sản phẩm tạp D tinh khiết

Hình 3 8 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp D allopurinol

Hình 3 9 Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp D allopurinol

Hình 3 10 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp D allopurinol

Tiến hành sắc ký các mẫu: dung môi pha mẫu (pha động), mẫu chuẩn tạp E allopurinol và mẫu thử tạp E allopurinol

Kết quả: mẫu thử tạp E có thời gian lưu trùng mẫu chuẩn Pic tạp E đạt độ tinh khiết cao (peak purity 0,999) Phổ 3D cho thấy sản phẩm tạp E tinh khiết

Hình 3 11 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp E allopurinol

Hình 3 12 Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp E allopurinol

Hình 3 13 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp E allopurinol

Tiến hành sắc ký các mẫu: (1): dung môi pha mẫu, (2): dung môi pha động; (3): nguyên liệu tổng hợp (NLTH); (4): tạp D allopurinol chuẩn; (5): tạp F thử; (6): hỗn hợp chuẩn tạp F, nguyên liệu và tạp D allopurinol

Kết quả: trên sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất hiện pic có thời gian lưu trùng thời gian lưu của tạp F Pic mẫu thử tạp F allopurinol có thời gian lưu trùng thời gian lưu của mẫu chuẩn Pic tạp F đạt độ tinh khiết cao (peak purity 1,000) Phổ 3D cho thấy sản phẩm tạp F tinh khiết

Hình 3 14 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp D, nguyên liệu tổng hợp; tạp F thử và hỗn hợp chuẩn tạp F

Hình 3 15 Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp F allopurinol

Miền giá trị, độ đúng, độ chính xác

Miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của các quy trình định lượng các tạp chất được trình bày ở bảng 3.7 (PL 2.1; PL 2.2; PL 2.3; PL 2.4; PL 2.5; PL 2.6)

Bảng 3 3 Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của các quy trình định lượng các tạp chất

Tạp A allopurinol Tạp B allopurinol Tạp C allopurinol Tạp D allopurinol Tạp E allopurinol Tạp F allopurinol

(àg/ml) 30 - 70 30 - 70 25 - 100 30 - 70 30 - 70 35 - 65 Độ lặp lại

RSD (%) (n = 6) 0,23 0,08 0,08 0,15 0,14 0,10 Độ chính xác trung gian

Từ kết quả thẩm định độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, hàm lượng các tạp chất của allopuirnool được trình bày ở bảng 3.8

Bảng 3 4 Kết quả xác định hàm lượng (%) tính theo chế phẩm nguyên trạng của các tạp chất allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tên sản phẩm Hàm lượng (%) RSD (%)

3.2.2 Đánh giá và thiết lập tạp chất đối chiếu tạp chất liên quan allopurinol 3.2.2.1 Đánh giá chất lượng 6 tạp chất allopurinol

Bảng 3 5 Kết quả đánh giá chất lượng tạp A allopurinol Chỉ tiêu Phương pháp Mức chất lượng Kết quả

Cảm quan Bột màu trắng Độ tan Tan trong nước, tan tốt trong Đạt methanol, DMSO Định tính

Phổ UV λmax (NaOH 0,1 M): 222 nm,

3444,33 và 3399,99 cm -1 (-NH- amin), 1665,53 cm -1 (-C=O amid), 1462,71 cm -1 (C=N), 1119,67 cm -1 (N-N pyrazol)

Phổ NMR Phổ 13 C NMR, 1 H NMR

(xem PL 1.1) Điểm chảy DSC 237 – 238 o C Đạt (237,4 o C)

Hàm ẩm Mất khối lượng do làm khô ≤ 0,5% Đạt (0,1%) Định lượng HPLC ≥ 95% Đạt (99,8%)

Bảng 3 6 Kết quả đánh giá chất lượng tạp B allopurinol Chỉ tiêu Phương pháp Mức chất lượng Kết quả

Cảm quan Bột màu trắng Độ tan Tan trong nước, methanol, Đạt

Phổ UV λmax (NaOH 0,1M) 245,8 nm Đúng

(xem PL 1.2) Điểm chảy Máy đo điểm chảy 284 - 285 °C Đạt (285,5 o C)

Bảng 3 7 Kết quả đánh giá chất lượng tạp C allopurinol

Chỉ tiêu Phương pháp Mức chất lượng Kết quả

Cảm quan Bột màu trắng Độ tan Ít tan trong nước, tan tốt trong Đạt methanol, DMSO Định tính

Phổ UV λmax (NaOH 0,1M): 200 nm Đúng

(xem PL 1.3) Điểm chảy Máy đo điểm chảy 231 – 233 o C Đạt

Hàm ẩm Mất khối lượng do làm khô ≤ 0,5% Đạt (0,1%) Định lượng HPLC ≥ 95% Đạt

Bảng 3 8 Kết quả đánh giá chất lượng tạp D allopurinol Chỉ tiêu Phương pháp Mức chất lượng Kết quả

Tính chất Cảm quan Bột màu trắng Độ tan Tan trong methanol, DMSO Đạt Định tính

Phổ UV λmax (MeOH) 224 nm và 257 nm Đúng

(xem PL 1.4) Điểm chảy DSC 106 – 108 o C Đạt (107,3 o C)

Bảng 3 9 Kết quả đánh giá chất lượng tạp E allopurinol

Cảm quan Bột hoặc tinh thể màu trắng, không mùi Đạt Độ tan Không tan trong nước, tan trong

MeOH, cloroform, DMSO Định tính

Phổ UV λmax (MeOH): 208 nm, 233 nm, 247 nm Đúng

Phổ IR 1607,77 (-NHCHO), 3217,78 (-NH- thơm), 1664,85 (-C=O)

Phổ MS ESI-MS(+) m/z 6,15395 [M+Na] +

Phổ NMR Phổ 1 H NMR và 13 C NMR

(xem PL 1.5) Điểm chảy DSC 198  1 o C Đạt (197,8 o C)

Bảng 3 10 Kết quả đánh giá chất lượng tạp F allopurinol

Cảm quan Bột màu trắng Độ tan Ít tan trong nước, tan tốt trong Đạt

Chloroform, DMSO, ethanol 96 o Định tính

Phổ UV λmax (NaOH 0,1 M) 254 nm; 295 nm Đúng

Phổ IR (KBr, cm-1): 3438,7 (-NH-); 2235,5

Phổ MS ESI-MS(+) m/z 01,09189 [M+Na] + Phổ NMR Phổ 13 C NMR; 1 H NMR (PL 1.6) Điểm chảy Máy đo điểm chảy 247-248 °C Đạt

3.2.2.2 Thiết lập chất đối chiếu Đóng gói

Chất khảo sát được đóng trong các lọ thủy tinh màu nâu, khối lượng đóng lọ và tổng số lọ đóng được tóm tắt ở bảng 3.15

Bảng 3 11 Khối lượng chất khảo sát đóng trong 1 lọ và số lọ đóng được

STT Tên chất đối chiếu Khối lượng/lọ (mg) Tổng số (lọ)

Các lọ được bảo quản ở 2 – 8 o C và tiến hành đánh giá độ đồng nhất

Bảng 3 12 Kết quả đánh giá đồng nhất lọ sau khi đóng gói

Giá trị trung bình giữa 2 lần phân tích (%)

Tạp A Tạp B Tạp C Tạp D Tạp E Tạp F

Kết quả được phân tích thống kê ANOVA một yếu tố đều cho thấy Ftn < Ftc

Kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Giá trị ấn định và giá trị công bố

Bảng 3 13 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp A allopurinol (n = 18)

Chu kỳ 0 Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3

DL gốc (%) xi-x* xi*1 xi*2 xi*3 x*-δ 99,53 99,53 99,53 99,53 x*+δ 99,95 99,92 99,92 99,92 x* 99,74 99,72 99,72 99,72 s* 0,14 0,13 0,13 0,13 δ 0,21 0,19 0,19 0,19

Sau ba lần thay đổi, s* = 0,13 không thay đổi, khi đó x* được chọn là 99,72%

Xử lý thống kê theo hướng dẫn ASEAN để xác định giá trị ấn định

Bảng 3 14 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp B allopurinol (n = 18)

Bảng 3 15 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp C allopurinol (n = 18)

Bảng 3 16 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp D allopurinol (n = 18)

Bảng 3 17 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp E allopurinol (n = 18)

Bảng 3 18 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp F allopurinol (n = 18)

Bảng 3 19 Tóm tắt kết quả xác định giá trị ấn định và công bố các tạp đối chiếu

6 Tạp F allopurinol 99,53 0,15 0,050 99,53 Tất cả các tạp chất đối chiếu đều có độ tinh khiết sắc ký trên 99% tính theo nguyên trạng, đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia Đánh giá chất lượng tạp tổng hợp (PL 3.1; PL3.2; PL3.3; PL3.4; PL3.5; PL 3.6)

Bảng 3 20 Tóm tắt kết quả đánh giá các tạp allopurinol tổng hợp

Tạp allopurinol Tính chất Định tính

Tạp A allopurinol Đạt Đúng Đạt (237,4) Đạt (0,1) Đạt (99,8) Tạp B allopurinol Đạt Đúng Đạt (285,8) Đạt (0,1) Đạt (99,8) Tạp C allopurinol Đạt Đúng Đạt (232,5) Đạt (0,1) Đạt (99,7) Tạp D allopurinol Đạt Đúng Đạt (107,3) Đạt (0,1) Đạt (99,8) Tạp E allopurinol Đạt Đúng Đạt (197,8) Đạt (0,1) Đạt (99,8) Tạp F allopurinol Đạt Đúng Đạt (247,5) Đạt (0,1) Đạt (99,6)

Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS

B, C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS

3.3.1 Điều kiện khối phổ tối ưu

Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn tạp (1) và dung dịch chuẩn allopurinol (2) vào hệ thống MS, xác định hai ion phân mãnh ứng với mỗi chất Ion có tín hiệu lớn và ổn định là ion định lượng (đl), ion còn lại định tính (đt) Mỗi chất gồm 1 ion phân tử ban đầu và 02 ion phân mãnh đặc trưng, đáp ứng 4 điểm IP Kết quả các thông số khối phổ tối ưu hóa ở chế độ auto tune và được trình bày trong bảng 3.25

Bảng 3 21 Điều kiện khối phổ tối ưu quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phương pháp LC/MS/MS

Nhiệt độ khí hoá hơi ( o C)

Tốc độ khí hoá hơi (L/h)

Năng lượng buồng khí va chạm (V)

3.3.2 Điều kiện sắc ký tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự rửa giải, hình dạng pic: pha động, tỷ lệ pha động, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ cột Kết quả điều kiện sắc ký đáp ứng cho cả mẫu 06 tạp allopurinol và mẫu allopurinol

Pha tĩnh: Cột Gemini – NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm)

Pha động: acetonitril – acid formic 0,05%

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Điều kiện pha động: chương trình gradient

3.3.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol theo ICH Q2(R2)

3.4.3.1 Tính tương thích hệ thống

Tính tương thích hệ thống được đánh giá bằng cách tiêm 6 lần liên tiếp các mẫu dung dịch chuẩn tạp (1); dung dịch chuẩn allopurinol (2); mẫu giả lập nguyên liệu; mẫu giả lập thành phẩm theo mục 2.7.7

Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD các thông số thời gian lưu và diện tích pic Kết quả được trình bày trong bảng 3.26, bảng 3.27 (PL 5.2)

Bảng 3 22 Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (n = 6)

Bảng 3 23 Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử

Thông số Giá trị Tạp A Tạp B Tạp C Tạp D Tạp E Tạp F

Mẫu thử giả lập nguyên liệu (n = 6) tR (phút) TB 2,59 2,66 2,54 3,34 3,41 4,45

Mẫu thử giả lập thành phẩm (n=6) tR (phút) TB 2,60 2,67 2,53 3,36 3,38 4,44

TB 5380 2800 1441 4932 1996 5277 RSD (%) 1,11 1,89 1,75 1,11 1,26 1,44 Nhận xét: kết quả cho thấy thông số thời gian lưu, diện tích pic có RSD < 2%

Hình 3 16 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, hỗn hợp chuẩn tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol Nhận xét: kết quả độ đặc hiệu sắc ký đồ cho thấy các chất phân tích có hình dạng pic cân đối, tín hiệu pic cao, không bị ảnh hưởng của đường nền và đặc trưng riêng cho từng chất

3.4.3.3 Khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy

Phương trình hồi quy xây dựng trên nền mẫu trắng để loại trừ ảnh hưởng nhiễu nền Pha dung dịch chuẩn tạp A, B, C, D, E, F và mẫu chuẩn allopurinol như mục

2.7.6.1 Xây dựng đường chuẩn trên phần mềm Masslynx 4.1 hệ thống LC-MS/MS Kết quả khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy và hệ số tương quan 6 tạp allopurinol trình bày trong bảng 3.28

Bảng 3 24 Phương trình tuyến tính của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS Chất phân tích

Nhận xét: kết quả cho thấy cả 6 tạp allopurinol đều có phương trình tuyến tính với hệ số tương quan R 2 ≥ 0,995; phù hợp với yêu cầu thẩm định

3.4.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Kết quả LOD, LOQ của 6 tạp chất và allopurinol được trình bày trong bảng 3.29 và phụ lục PL 5.2

Bảng 3 25 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các tạp allopurinol

(ppb) Tạp A Tạp B Tạp C Tạp D Tạp E Tạp F Allopurinol

Các giới hạn định lượng (LOQ) thấp được thiết lập cho tất cả các chất, đáp ứng được tỷ lệ tín hiệu nhiễu Do đó, quy trình có được độ nhạy cao, cho phép phân tích định lượng các tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm allopurinol.

3.4.3.5 Độ chính xác và độ chính xác trung gian

Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian mẫu giả lập nguyên liệu và thành phẩm allopurinol được trình bày ở bảng 3.30 và bảng 3.31

Bảng 3 26 Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong mẫu giả lập nguyên liệu allopurinol Mẫu thử

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 tR Spic tR Spic tR Spic phút RSD% Spic RSD% phút RSD% Spic RSD% phút RSD% Spic RSD% Tạp A

Bảng 3 27 Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong mẫu giả lập thành phẩm allopurinol

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 tR Spic tR Spic tR Spic phút RSD% Spic RSD% phút RSD% Spic RSD% phút RSD% Spic RSD% Tạp A

Kết quả độ đúng được trình bày ở bảng 3.32 (PL 5.2)

Bảng 3 28 Kết quả độ đúng của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong nền mẫu giả lập thành phẩm và giả lập nguyên liệu allopurinol

Chất Mẫu Mẫu giả lập thành phẩm Mẫu giả lập nguyên liệu

3.3.4 Ứng dụng quy trình để định lượng đồng thời tạp A, B, C, D, E, F trong mẫu nguyên liệu và thành phẩm allopurinol trên thị trường

Quy trình phân tích được áp dụng để phân tích ba mẫu nguyên liệu allopurinol và mười mẫu thành phẩm trong đó hai mẫu nhập khẩu và tám mẫu sản xuất trong nước Kết quả được trình bày trong bảng 3.33 (PL5.3)

Bảng 3 29 Kết quả định lượng tạp trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS

BÀN LUẬN

Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế 6 tạp của allopurinol

4.1.1 Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế tạp A allopurinol

Các công trình nghiên cứu của Roland K Robins (1956); Ronal M Cresswell (1972); Haruo Tanaka (1973) đều tổng hợp dạng base tạp A của allopurinol là 3- aminopyrazol-4-carboxamid; chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A allopurinol dạng muối hemisulfat theo chuẩn USP-NF 2023 Các công trình nghiên đều chưa công bố về độ tinh khiết cũng như quá trình rửa tạp hoặc tinh chế 11,57,60

Bàn về lựa chọn tác nhân tham gia phản ứng

Tác nhân kiềm hóa được ưu tiên lựa chọn trong phản ứng phân hủy allopurinol vì phản ứng chỉ qua 1 giai đoạn và sản phẩm tạo thành dễ tinh chế so với các công trình nghiên cứu khác phải qua nhiều giai đoạn và nguy cơ nhiễm chéo cao 57-59 Thực hiện phản ứng phân hủy sau 3 giờ, tiến hành kiểm tra sơ bộ sự có mặt của sản phẩm mới tạo thành bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi cloroform– ethyl acetat – methanol – acid formic (50:40:40:1), quan sát vết sản phẩm bằng đèn UV 254 nm, kết quả cho thấy dung dịch sau phản ứng của allopurinol với NH3, NaHCO3 và NaOH đều hiển thị 2 vết trên sắc ký lớp mỏng, trong đó vết đậm có Rf = 0,48 trùng với Rf của vết allopurinol chuẩn và vết nhạt hình thành có Rf = 0,35 trùng với Rf của tạp A allopurinol chuẩn Sản phẩm mới tạo thành phân cực hơn nguyên liệu allopurinol trên sắc ký lớp mỏng, phù hợp với tính chất của tạp A allopurinol

Tiếp tục thủy phân allopurinol bằng các tác nhân kiềm khác nhau với cùng nồng độ đương lượng OH - , thực nghiệm cho thấy tác nhân kiềm hóa khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất sản phẩm tạo thành Tác nhân NaOH cho hiệu suất khảo sát ban đầu cao nhất khoảng 16,03%; tác nhân NaHCO3 là 5,50% và thấp nhất là NH3 cho hiệu suất tạo thành 4,15% (PL 1.1) Nguyên nhân do phản ứng thủy phân, NaOH là kiềm mạnh, quá trình phân ly trong nước xảy ra hoàn toàn, nồng độ OH - cao tấn công vào vị trí C(1) trên vòng pyrimidin của allopurinol để mở vòng tạo tạp A theo cơ chế phản ứng được minh hoạ ở hình 4.1 Còn NaHCO3 và NH3 là các tác nhân kiềm yếu, quá trình phân ly trong nước tạo ion OH - xảy ra yếu hơn so với NaOH nên phản ứng thủy phân mở vòng allopurinol không đủ lớn để đạt được hiệu suất cao như NaOH

Hình 4 1 Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat

Bàn về xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp

So sánh phổ hồng ngoại của sản phẩm tổng hợp với phổ chuẩn tạp A allopurinol hemisulfat cho thấy các dãy hấp thụ đặc trưng tương ứng với các nhóm chức trong cấu trúc phân tử.

Hình 4 2 Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn

Sơ đồ 4 1 Sự phân mảnh của tạp A allopurinol

Phổ MS 1 cho mảnh có số khối 127,1 phù hợp với khối lượng phân tử của tạp

A Các mảnh con thu được từ mảnh mẹ 127,1 là 42,9; 68,9; 81,9 và 110,0 phù hợp với các phân mảnh của tạp A (sơ đồ 4.1) Độ lệch giữa giá trị thực nghiệm và giá trị lý thuyết phổ HRMS: Độ lệch m/z = (m/z thực nghiệm – m/z H – m/z lý thuyết)/ m/z lý thuyết x 1000000 = (127,1249 – 1,00794 – 126,1170)/126,1170 x 1000000 = 0,3171 ppm < 5 ppm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Bảng 4 1 Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn

Sản phẩm tổng hợp (DMSO-d 6; 125/500 MHz)

Tạp A allopurinol hemisulat chuẩn (DMSO-d 6 ; 100/400 MHz)

Công thức cấu tạo tạp A allopurinol hemisulfat

- Phổ 13 C NMR của tạp A tổng hợp có 4 tín hiệu C có độ dời hóa học phù hợp với 4 nguyên tử C có trong cấu trúc tạp A

- Phổ DEPT cho 3 tín hiệu C bậc 4, 1 tín hiệu C bậc 3 phù hợp với cấu trúc tạp A

- Phổ 1 H NMR cho tín hiệu H trong –CH= (8,039 ppm) rõ Do tạp A tổng hợp được ở dạng muối nên tín hiệu của nước bị dịch chuyển đến khoảng 𝛿 = 7,5 ppm, lẫn với các tín hiệu của -NH và -NH2 trong cấu trúc tạp A

Phản ứng định tính nhóm hemisulfat

Nghiên cứu sử dụng H2SO4 10% trong quá trình kết tinh tạp A tại pH 1,5 tạo muối hemisulfat Cân chính xác khoảng 1 g tạp A hòa tan trong 100 ml nước (dung dịch tạp A) Lấy 5 ml dung dịch tạp A cho vào ống nghiệm, thêm vào 5 ml dung dịch BaCl2 0,1 N thì thấy có kết tủa trắng không tan trong dung dịch HCl (hình 4.3)

Phản ứng định lượng nhóm hemisulfat

Hút chính xác 20 ml dung dịch A vào bình nón 100 ml, thêm 2 – 3 giọt phenolphtalein, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1M đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây Lặp lại quá trình chuẩn độ 3 lần và lấy kết quả trung bình.

Ba 2+ + SO4 2- → BaSO4 (kết tủa trắng)

V1 = 5,70 ml; V2 = 5,75 ml; V3 = 5,70 ml; VTB = 5,72 ml Nồng độ của dung dịch A:

Số mol của dung dịch A: 0,0572 x 0,1 = 0,00572 mol Khối lượng phân tử của tạp A: 0,00572 1 = 174,8 ≈ 175 phù hợp với công thức tạp A dạng muối hemisulfat

Hình 4 3 Kết tủa trắng BaSO4trong phản ứng gốc muối hemisulfat của tạp A allopurinol Như vậy tạp A tạo thành sau phản ứng có dạng muối hemisulfat C4H6N4O.1/2H2SO4

Bàn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat

Tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp Nồng độ NaOH 1 M, thể tích 50 ml (0,05 mol) cho hiệu suất cao nhất khi tỷ lệ mol allopurinol: NaOH là 1:4,4 Khi lượng NaOH tăng, hiệu suất tổng hợp giảm dần Nguyên nhân là vì ở nồng độ NaOH cao và nhiệt độ cao, độ nhớt của hỗn hợp tăng, thời gian phản ứng kéo dài, dẫn đến hỗn hợp sau phản ứng trở nên dạng gel Tỷ lệ mol NaOH tăng làm tăng lượng tạp hình thành do kiềm cao tiếp tục thủy phân nhóm amid (-CO-NH2) thành nhóm carboxyl (-COO-), khiến sản phẩm tạo thành không kết tinh được hoặc có màu vàng lẫn tạp chất.

Hình 4 4 Sản phẩm tạp A tạo thành khi dư NaOH

Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất tổng hợp allopurinol Khi nhiệt độ thấp hơn 180°C, lượng nhiệt cung cấp không đủ khiến hiệu suất phản ứng thấp và cần thêm thời gian phản ứng Tuy nhiên, khi nhiệt độ cao hơn 180°C, tạp chất A tạo thành trong dung dịch có thể bị phân hủy do nhiệt độ cao làm phản ứng thủy phân nhóm amid (-CO-NH2-) thành acid (-COOH) Điều này dẫn đến việc hiệu suất tổng hợp tạp chất A giảm dần Vì vậy, nhiệt độ 180°C là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp allopurinol (PL 1.1.).

Về ảnh hưởng của thời gian phản ứng: thời gian phản ứng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất Khi tăng thời gian phản ứng từ 3 giờ đến 5 giờ hiệu suất tăng khoảng 5 lần, hiệu suất bắt đầu giảm nhanh khi kéo dài phản ứng hơn 6 giờ Khi thời gian phản ứng kéo dài sản phẩm tạo thành bị phân hủy nên giảm hiệu suất tổng hợp Thời gian 5 giờ là thời gian thích hợp để tổng hợp tạp A (PL 1.1)

Về ảnh hưởng của pH dùng để loại allopurinol nguyên liệu dư chưa phản ứng: tại giá trị pH ≈ 5, allopurinol còn dư bị tủa lại trong dung dịch, kết hợp với các tài liệu tham khảo cho thấy pH ≈ 5 là pH đẳng điện của allopurinol, 97 thích hợp để loại bỏ allopurinol còn tồn dư trong dung dịch Khảo sát ở các pH khác nhau cho thấy ảnh hưởng của pH dùng loại tủa allopurinol dư ít ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp tạp

A allopurinol Khi thay đổi giá trị pH lần lượt trong khoảng từ 4 đến 6, hiệu suất chỉ tăng hoặc giảm từ 1 - 2% Nguyên nhân do sản phẩm tạp A cần tổng hợp kết tinh ở pH cách xa pH kết tủa của allopurinol Vì vậy giá trị pH ≈ 5 là pH phù hợp nhất trong điều kiện khảo sát để loại tủa allopurinol còn lại sau phản ứng (PL 1.1)

Về ảnh hưởng của pH kết tinh tạp A dạng muối hemisulfat: pH kết tinh tạp A hemisulfat ảnh hưởng đến hiệu suất Tại giá trị pH 1,5 hiệu suất tổng hợp cao nhất, khi tăng hoặc giảm giá trị pH ảnh hưởng làm thay đổi hiệu suất từ 5 – 10% do pH 1,5 là giá trị pH đẳng điện phù hợp để kết tinh tạp A allopurinol dạng muối hemisufat 97

Như vậy các kết quả cho thấy đã tìm được quy trình thích hợp tổng hợp tạp A bằng phương pháp phân hủy allopurinol Hiệu suất tạp A dạng muối hemisulfat tạo thành trên 48%, sản phẩm có độ tinh khiết cao và chưa có công trình công bố đầy đủ về tổng hợp tạp A dạng muối hemisufat của allopurinol theo chuẩn USP-NF 2023

Bàn luận về xây dựng và đánh giá tạp chất đối chiếu của allopurinol

4.2.1 Về xây dựng quy trình định lượng sản phẩm tổng hợp các tạp của allopurinol

Dược điển Việt Nam V; BP 2023 và USP-NF-2023 có các quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan A, B, C, D, E, F của allopurinol, tuy nhiên các quy trình chỉ dừng lại ở xác định phần trăm tạp chất so với nguyên liệu allopurinol 1,7,33 với diện tích pic các chất A, B, C, D, E, F thấp (không quá 0,2% so với allopurinol), dẫn đến quy trình chưa phù hợp để định lượng và xác định độ tinh khiết sản phẩm tổng hợp tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol Hiện chưa có công trình công bố về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các tạp A, B, C, D, E, F bằng HPLC đầu dò dãi diod quang (DAD) theo hướng dẫn của ICH Q2(R1)

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình định lượng các tạp tổng hợp allopurinol đều sử dụng pha động là các dung môi dễ bay hơi như acid formic hay acid phosphoric, acetonitril giúp quá trình vận hành và bảo quản hệ thống sắc ký lỏng không bị đóng muối so với DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023 và các tài liệu tham khảo đều sử dụng đệm phosphat tuy thuận lợi trong phân tích, tuy nhiên dễ làm tắt hệ thống, giảm tuổi thọ thiết bị và tăng thời gian rửa cột làm tăng chi phí Pha tĩnh sử dụng cột Phenomenex Gemini NX có khả năng chịu được khoảng pH rộng (từ 1-12) trong các điều kiện pha động là acid pH thấp Riêng tạp C allopurinol sử dụng cột dài

Phenomenex Synergi 4 àm MAX-RP 80R với pha đảo chịu được khoảng pH rộng đồng thời kớch thước hạt 4 àm và chiều dài cột tăng lờn 25 cm làm tăng số đĩa lý thuyết giúp tăng hệ số phân giải để thuận lợi trong xác định độ đặc hiệu tạp C mà không ảnh hưởng bởi tạp B có khả năng xuất hiện vì tính chất tạp C và B có độ phân cực gần nhau dẫn đến hệ số phân giải kém 15-17

Về quy trình định lượng tạp A allopurinol

Thành phần pha động khảo sát ban đầu là các hệ (1) acetonitril – nước; (2) acetonitril - acid formic đều làm cho pic bị kéo đuôi, hệ số bất đối 1,7 lớn hơn quy ước 1,5 không đạt theo USP-NF 2023 do chất phân tích chưa chuyển dạng hoàn toàn về dạng phân tử Hệ (3) acetonitril – acid acetic nhiễu đường nền cao do pH pha động acid acetic không ổn định Khi giảm độ phân cực pha động ở hệ (4) methanol – acid phosphoric làm cho chất phân tích được rửa giải nhanh hơn, tuy nhiên pic tạp A ra sớm trùng thời gian lưu pic dung môi đồng thời độ tinh khiết pic impurity < 0,995 dẫn đến không đảm bảo tính đặc hiệu của quy trình Hệ acetonitril – dung dịch acid phosphoric làm giảm độ rộng cho pic tạp A, giúp làm tăng chiều cao pic do chất phân tích chuyển về dạng phân tử dẫn đến hệ số bất đối nhỏ hơn 1,2 phù hợp với quy định trong Dược điển Việt Nam V và USP-NF 2023 Khảo sát pH dung dịch acid phosphoric từ 1,5 đến 3,0 trong vùng đệm của acid phosphoric 128 để lựa chọn điều kiện tốt nhất về thông số sắc ký của pic tạp A allopurinol Ở giá trị pH ≤ 2 cho thấy sự chuyển dạng chưa hoàn toàn và pic dung môi không tách khỏi pic tạp A Ở giá trị pH 2,5 (tương ứng nồng độ H3PO4 là 0,01 M) pic tạp A tách rời pic dung môi đồng thời hệ số bất đối As là 1,1 đạt yêu cầu Tốc độ dòng ảnh hưởng đến độ phân giải giữa pic tạp A và pic dung môi cũng như hệ số bất đối của pic tạp A Tốc độ dòng 1 ml/phút pic tạp A được rửa giải nhanh trong khi thời gian lưu pic dung môi ít thay đổi dẫn đến pic tạp A bị trùng với pic dung môi Tốc độ dòng < 0,5 ml/phút làm cho thời gian phân tích kéo dài đồng thời làm tăng hệ số bất đối (As > 1,2) Tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho pic tạp A đạt hệ số bất đối và độ phân giải Nhiệt độ cột được khảo sát để tăng độ nhạy và hệ số bất đối của chất phân tích, tuy nhiên kết quả cho thấy, nhiệt độ cột ít ảnh hưởng Lựa chọn nhiệt độ 25 o C là nhiệt độ phòng thuận lợi cho quá trình phân tích

Về quy trình xác định độ tinh khiết tạp B allopurinol

Khảo sát thành phần pha động tương tự như khảo sát ở tạp A allopurinol hemisulfat với khởi đầu là hệ (1) acetonitril – acid acetic và (2) acetonitril – acid formic, kết quả đường nền bị nhiễu cao do pH pha động không ổn định trong quá trình sắc ký Với hệ (3) methanol – acid phosphoric thì pic tạp B được rửa giải quá sớm, trùng với pic dung môi Hệ (4) acetnotril – acid phosphoric có độ phân cực vừa phải và khả năng tự tạo thành hệ đệm acid H3PO4 – H2PO4 - ở vùng pH thấp nên các pic cân đối và được lựa chọn để tiếp tục khảo sát tiếp theo Khảo sát pH pha động từ 1,5 đến 3 cho thấy pH dường như không ảnh hưởng quá lớn đến quy trình định lượng tạp B Lựa chọn pH 2,0 gần tương đồng với quy trình định lượng tạp A allopurinol hemisulfat để tăng khả năng phân tích và ứng dụng và rút ngắn thời gian phân tích Tốc độ dòng không ảnh hưởng nhiều đến độ phân giải giữa pic tạp B nhưng có ảnh hưởng đến hình dạng pic và thời gian phân tích Tốc độ dòng ≤ 0,8 ml/phút kéo dài thời gian phân tích Tốc độ dòng ≥ 1,2 ml/phút làm cho pic tạp B được rửa giải nhanh, tuy nhiên tốc độ dòng cao cũng làm tăng áp suất hệ thống dẫn đến quá trình sắc ký phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động diễn ra không hoàn toàn, hình thành hiện tượng chuyển khối, làm tăng hệ số kéo đuôi của tạp B allopurinol Lựa chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho pic tạp B đạt yêu cầu về các thông số sắc ký

Về quy trình định lượng tạp C allopurinol

Quy trình định lượng tạp chất C allopurinol đảm bảo độ đặc hiệu, tách hoàn toàn tạp chất C khỏi tạp chất A và B, khắc phục giới hạn phân giải của Dược điển Việt Nam V, BP 2023 và USP-NF 2023 Tạp chất C được tổng hợp từ nguyên liệu là tạp chất A allopurinol hemisulfat Để đạt độ phân giải tối ưu, hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng với cột C12 Phenomenex Synergi 4 µm MAX-RP 80R, pha động acetonitril - acid phosphoric, tốc độ dòng 1,0 ml/phút và bước sóng phân tích 200 nm Hệ thống này cho phép tách biệt hoàn toàn các tạp chất A, B và C, đáp ứng các thông số sắc ký theo tiêu chuẩn.

Về quy trình định lượng tạp D allopurinol

Thành phần pha động được khảo sát trong đó hệ acetonitril – methanol làm cho hình dạng pic bị kéo đuôi vì các chất phân tích không được chuyển dạng hoàn toàn trong quá trình rửa giải 128 Hệ acetonitril – dung dịch acid phosphoric cho hệ số kéo đuôi 1,3 nhỏ hơn 1,5 phù hợp do các phân tử tạp D allopurinol đã chuyển thành dạng ion có độ phân cực cao hơn nhiều so với nguyên liệu tổng hợp Khi tăng lượng acetonitril thì tạp D được rửa giải nhanh, thời gian lưu rút ngắn trong khi thời gian lưu pic dung môi thay đổi ít hơn dẫn đến pic tạp D có thể chồng lên pic dung môi Khi giảm tỷ lệ acetonitril pic tạp D tách khỏi pic dung môi nhưng nguyên liệu sẽ bị lưu giữ lâu trên cột, làm tăng thời gian phân tích Tỷ lệ acetonitril – acid phosphoric là 30:70 phù hợp cho quá trình phân tích Khảo sát pH pha động từ 1,5 đến 3 cho thấy pH ảnh hưởng đến hệ số bất đối của pic và ổn định của đường nền; pH ≤ 1,5 đường nền dao động và có khả năng ảnh hưởng đến pha tĩnh làm tan chảy nhóm silinol của pha tĩnh pH > 3, sự chuyển dạng chưa hoàn toàn nên dẫn đến hệ số bất đối không lớn hơn 1,5 Kết quả cho thấy pH pha động thích hợp là 2,5 Nhiệt độ cột được chọn

40 °C vì hình dạng pic gọn và cao hơn ở nhiệt độ 25 °C Ở nhiệt độ 50 °C cho hình dạng pic tương tự ở nhiệt độ 40 °C Nhiệt độ cao giúp pha động di chuyển dễ dàng qua pha tĩnh làm tăng số đĩa lý thuyết, giúp tăng hệ số phân giải, pic cao và chiều rộng pic hẹp 128 Tuy nhiên nhiệt độ pha tĩnh cao trên 60 o C có thể làm bay hơi dung môi sôi lên trong hệ thống áp suất cao, tạo bọt khí và làm giảm tính ổn định của quy trình phân tích

Về quy trình định lượng tạp E allopurinol

Tạp E được tổng hợp từ tạp D và acid formic, tạp E có độ phân cực cao hơn tạp D do hình thành liên kết amid (-NH-C=O-) khi tăng tỷ lệ acetonitril trên 10% có thể rút ngắn thời gian lưu của tạp E do được rửa giải nhanh hơn, tuy nhiên pic tạp E không tách hoàn toàn khỏi pic tạp D Khi giảm lượng acetonitril pic tạp E tách khỏi pic tạp D nhưng đồng thời làm tăng thời gian lưu tạp Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ phù hợp của acetonitril và acid phosphoric là 10:90 pic tạp E tách hoàn toàn Quy trình xác định độ tinh khiết tạp E sử dụng pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH = 3 với chương trình đẳng dòng đã rửa giải tốt tạp E đồng thời đảm bảo tuổi thọ cột được kéo dài hơn, thời gian phân tích ngắn, các thông số sắc ký đạt theo quy định Khi tiến hành sắc ký dung dịch tạp E với thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của tạp E đều không thấy xuất hiện pic lạ và khi xem sắc ký đồ trong không gian

3 chiều với bước sóng từ 200 – 800 nm đều cho thấy chỉ có 1 pic là tạp E Khi sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic tạp E bằng cách so sánh phổ UV-Vis tại thời gian lưu với phổ UV-Vis tại một điểm bất kỳ trên pic, đều cho thấy có sự tương hợp về phổ trên 99% Chứng tỏ pic tạp E không bị ảnh hưởng bởi các pic tạp ở cùng thời gian lưu, quy trình định lượng tạp E đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH

Về quy trình định lượng tạp F allopurinol

Tạp F có quy trình tổng hợp từ nguyên liệu là ethyl (ethoxymethyl)cyanocacetat và hydrazin hydrat 50% có thành phần tông hợp giống tạp D allopurinol nhưng khác với tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng Tạp F có độ phân cực kém hơn tạp D và nguyên liệu ethyl (ethoxymethyl)cyanocacetat dẫn đến dễ lưu lại trên pha tĩnh, làm tăng thời gian rửa giải Kết quả khảo sát cho thấy pha động với lượng acetonitril dưới 30%, tạp F sẽ bị lưu giữ trên cột lâu hơn Khi tăng tỷ lệ acetonitril trên 40%, các chất bị rửa giải nhanh dẫn đến pic tạp F không tách rời khỏi pic nguyên liệu Tỷ lệ acetonitril – acid formic (35:65) là phù hợp vì đảm bảo được các thông số sắc ký và thời gian lưu không qua kéo dài So sánh với các quy trình DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023 và công trình nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy kết quả thời gian phân tích quy trình định lượng tạp F đã được rút ngắn trên 50% (khoảng 15 phút so với 25 phút trong Dược điển), giúp tiết kiệm dung môi làm tăng hiệu quả kinh tế

4.2.2 Về đánh giá và thiết lập chất đối chiếu của allopurinol

Về quy trình thiết lập tạp chất chuẩn đối chiếu các tạp của allopurinol

Quy trình thiết lập chuẩn tạp A, B, C, D, E, F theo theo USP-NF 2023 được thực hiện theo đúng thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh cũng như quy trình thiết lập một chất chuẩn DĐVN V Các nguyên liệu thiết lập chuẩn được kiểm tra chất lượng và đều đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn Toàn bộ quá trình sản xuất chuẩn đã được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt, đóng chuẩn trong điều kiện khí nitơ (99,99%), độ ẩm ≤ 2%, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 °C để đảm bảo chất chuẩn ổn định trong một thời gian dài Sau khi đóng ống xong tiến hành kiểm tra sự đồng nhất của các lô sản xuất với chỉ tiêu hàm lượng, kết quả các giá trị RSD của các kết quả hàm lượng đều nhỏ hơn 2,0% do đó hàm lượng đồng nhất và quá trình đóng chuẩn ổn định Đánh giá liên phòng thí nghiệm được tiến hành độc lập tại 3 phòng kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO-IEC 17025 hoặc GLP của Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh là Khoa thiết lập chất chuẩn, chất đối chiếu; Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Khoa Nghiên cứu và phát triển Phân tích kết quả xử lý số liệu bằng SPSS tuân thủ đúng theo qui định về xử lý thống kê Do so sánh kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm nên lựa chọn phân tích Anova một yếu tố phù hợp hơn so với sử dụng thống kê T-test vì T-test áp dụng phù hợp hơn trong trường hợp so sánh 2 PTN Để có thể áp dụng được phân tích ANOVA một yếu tố cần kiểm định Levene test bằng phần mềm SPSS 26.0 đánh giá phương sai của 3 phòng thí nghiệm, trường hợp đồng nhất thì mới áp dụng kiểm định F test dựa vào giá trị Ftn <

Trong trường hợp phương sai của ba nhóm thí nghiệm không đồng nhất, có thể sử dụng kiểm định Robust để so sánh giá trị trung bình Kiểm định Levene không được hỗ trợ trong phần mềm Excel, do đó có thể sử dụng SPSS 26.0 để phân tích.

Bảng 4 7 Bảng so sánh Lenene - Test Mẫu phân tích Giá trị Lenene Test Sig Đánh giá Giá trị so sánh

Kết quả có thể sử dụng phân tích ANOVA một yếu tố và phép kiểm F-test cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các phòng thí nghiệm, từ đó các giá trị kết quả của 3 phòng thí nghiệm đều được sử dụng để tính giá trị hàm lượng công bố cho các sản phẩm tạp chuẩn được thiết lập Khi xác định hàm lượng của các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn đều sử dụng tạp chuẩn allopurinol đạt tiêu chuẩn theo USP-NF 2023 và EP 2023 và được xử lý thống kê để đưa ra giá trị hàm lượng công bố đảm bảo tính khách quan và tin cậy So sánh với các chất chuẩn đối chiếu có giá thành hiện nay trên thị trường gần 2500 USD / 100 mg thì chất chuẩn tạp A, B, C, D,

E, F của allopurinol khi được thiết lập tại Việt Nam giá thành sẽ giảm đi rất nhiều và góp phần chủ động về tạp chuẩn cho công tác kiểm tra chất lượng thuốc cũng như cho các nghiên cứu về phương pháp phân tích và nghiên cứu phát triển sản phẩm

Về tiêu chuẩn các chất chuẩn tạp allopurninol tổng hợp

Bàn luận về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời

Phương pháp LC–MS/MS có độ nhạy và đặc hiệu rất cao, phù hợp các nghiên cứu về định lượng các tạp với hàm lượng rất nhỏ trong nguyên liệu cũng như thành phẩm ở mức độ nanogam (ppb) và nhạy hơn nhiều rất nhiều lần với các phương pháp LC-UV-Vis với độ nhạy là microgam (ppm)

Quy định giới hạn nồng độ các tạp giữa USP-NF 2023 so với Dược điển Việt Nam V và BP 2023 có khác nhau Nghiên cứu lựa chọn nồng độ thấp nhất trong các quy định để xây dựng phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu các Dược điển, trong đó nồng độ tạp A, F là 0,2%, nồng độ tạp tạp B, C, D, E thấp nhất là 0,1% so với quy định giới hạn trong nguyên liệu và thành phẩm allopurinol

4.3.1 Bàn về điều kiện khối phổ

Các thông số như điện thế mao quản, thế cone, nhiệt độ dòng khí hóa hơi, dung môi pha động, tốc độ dòng khí hóa hơi và năng lượng va đập rất quan trọng trong kỹ thuật khối phổ ba tứ cực để tối ưu tín hiệu của các ion phân tử ban đầu và các ion phân mảnh đặc trưng Hệ thống LC-MS/MS được tích hợp chế độ Auto-tune giúp thuận lợi tìm điều kiện khối phổ tối ưu và các mảnh con của từng tạp Các mảnh con có tín hiệu lớn, ổn định được sử dụng cho mục đích định lượng, trong khi các mảnh con có tín hiệu nhỏ hơn được dùng cho mục đích định tính Với cấu trúc chủ yếu là dị vòng chứa nitơ có độ phân cực từ trung bình đến phân cực cao, kỹ thuật ion hóa điện phun ESI với chế độ bắn phá ion dương và kỹ thuật ghi phổ MRM được lựa chọn để định lượng allopurinol và các tạp chất của nó.

Hình 4 11 Phân mảnh ion định lượng của 6 tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol

Về các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu khối phổ

Dung môi pha mẫu: dung môi pha mẫu được lựa chọn là pha động vừa có khả năng hòa tan tốt chất phân tích, vừa làm tăng tín hiệu của mẫu trên đầu dò khối phổ vì làm tăng khả năng bay hơi pha động Dung môi pha động được chọn là acetonitril và acid formic vì cho khả năng ion hóa tốt và phù hợp với chương trình gradient do acid formic cung cấp nhiều proton giúp tăng quá trình ion hóa

Thể tích phun: thể tích phun cũng ảnh hưởng lớn đến tín hiệu các pic Việc tăng thể tích phun làm tăng tín hiệu dễ dàng được nhận biết trên thực nghiệm, tuy nhiên khi thể tích phun quá cao, việc bay hơi dung môi để ion hóa không đáp ứng kịp thời sẽ làm giảm tín hiệu của các chất phân tích Kết quả nghiên cứu cho thấy thể tích phun là 5 àl/phỳt Điều này vừa đỏp ứng việc thu nhận được tớn hiệu cao, vừa hạn chế làm bẩn hệ thống

Thế mao quản (capilary voltage): thế mao quản ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình ion hóa các chất phân tích Sử dụng thế mao quản quá cao thì nhiệt độ cao từ thế mao quản làm tăng quá trình oxy hoá khử thành phần trong mẫu dẫn đến mao quản dễ bị ăn mòn và lão hoá Sử dụng thế mao quản quá thấp thì không ion hóa hết các chất phân tích dẫn đến tín hiệu thấp Vì vậy, kết quả thế mao quản trong nghiên cứu là 4 kV cho kết quả tối ưu về tín hiệu đồng thời kéo dài tuổi thọ thiết bị

Nhiệt độ hóa hơi và tốc độ dòng khí hóa hơi: được khảo sát cùng lúc để tránh việc đọng lại dung môi do không hóa hơi kịp thời Luồng khí nitơ được đặt đồng trục với mao quản giúp hình thành những giọt nhỏ ở đầu mao quản và giúp những giọt này co lại dần trong giao diện ESI Do đó nhiệt độ hóa hơi và tốc độ dòng khí hóa hơi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả ion hóa Về cơ bản, đối với một tốc độ rửa giải nhất định, tốc độ dòng khí phun phải được tối ưu hóa Việc lựa chọn giá trị của tốc độ dòng khí và nhiệt độ hóa hơi phải phù hợp dựa trên các thông số khác

Thế cone: kết quả cho thấy thế cone 8 – 26 V và riêng cho từng tạp được sử dụng để hướng các ion phân tích vào tứ cực, tách các ion từ vùng áp suất khí quyển của nguồn ion vào vùng chân không sâu Vì vậy, giá trị của thế cone đặc biệt quan trọng trong tối ưu tín hiệu ion Thế cone tăng lên sẽ dẫn đến vận tốc ion tăng và xảy ra va chạm với các khí khác (hơi dung môi, dòng khí hóa hơi) dẫn đến phân mảnh Kết quả tìm được thế cone là phù hợp, làm tăng tín hiệu chất phân tích

Năng lượng va chạm là thông số quan trọng giúp tối ưu tín hiệu trong phân tích MRM Kết quả nghiên cứu cho thấy năng lượng va chạm hiệu quả dao động trong khoảng 12 – 25 V tuỳ từng tạp chất Ion phân mảnh có khối lượng lớn cho tín hiệu ổn định hơn ion khối lượng nhỏ do năng lượng va chạm lớn giúp ion mẹ dễ vỡ tạo ion con Tuy nhiên, năng lượng va chạm quá cao khiến ion mẹ vỡ nhỏ tạo nhiều mảnh ion con dẫn đến khó xác định cấu trúc phân mảnh ion.

4.3.2 Bàn về điều kiện sắc ký

Quá trình phân tích bằng LC-MS/MS bao gồm hai bước chính: bước tách chất bằng hệ thống sắc ký lỏng pha đảo ngược (LC) và bước xác định chất bằng đầu dò chọn lọc khối phổ MS/MS Trong nghiên cứu này, hệ thống LC sử dụng pha tĩnh là cột Phenomenex Gemini.

NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 àm) cú khả năng chịu được pH rộng từ 1-12, cú thể khảo sỏt thành phần pha động cú pH thấp Bờn cạnh đú với kớch thước hạt 5 àm được sử dụng vì không gây hiện tưởng quá tải cột như so với các pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ dẫn đến thuận lợi trong quá trình rửa giải và không làm tắt nghẽn cột cũng như tăng áp suất hệ thống phân tích, có thể ứg dụng cho các hệ thống khối phổ khác nhau

Trong quá trình khảo sát pha động, hệ acetonitril hoặc hỗn hợp acetonitril – methanol – nước đều cho thấy các tạp allopurinol được rửa giải có hình dạng pic không đối xứng, đỉnh tù và pic kéo dài về phần đuôi, nguyên nhân có thể do quá trình phân bố trong pha tĩnh, các tạp chất allopurinol không chuyển hoàn toàn thành dạng muối hay dạng base dẫn đến hiện tượng chuyển khối trong sắc ký Dạng muối sẽ di chuyển nhanh hơn dạng base dẫn đến pic bị kéo đuôi Hệ pha động là acetonitril - acid formic với nồng độ acid formic thấp 0,05% (pH ≈ 3) cho tín hiệu 6 pic A, B, C,

D, E, F trong mẫu phân tích đều gọn, không bị chẻ và hình dạng đối xứng Nguyên nhân do acid formic giúp quá trình ion hóa mẫu phân tích làm tăng tín hiệu pic trong đầu dò khối phổ, đồng thời môi trường có tính acid chuyển chất phân tích về dạng muối hạn chế hiện tượng kéo đuôi Tuy nhiên khi nồng độ acid formic cao sẽ làm tăng khả năng dung môi đi buồng ion khối phổ cạnh tranh với chất phân tích là giảm tín hiệu chất phân tích

Tốc độ dòng: tốc độ dòng được lựa chọn phân tích là 0,8 ml/phút để rút ngắn thời gian phân tích, đồng thời làm pic xuất hiện gọn đẹp Nghiên cứu cho thấy trong phân tích bằng khối phổ, mỗi tạp khi được ion hoá, có thể tạo thành nhiều loại ion khác nhau tuỳ thuộc vào kỹ thuật và chế độ ion hóa Đề tài sử dụng kỹ thuật ion hoá ESI, chế độ ion dương thông thường tạo được ion phân tử là [M+H] + và một số ion khác Mỗi ion phân tử khi đi qua tứ cực thứ hai lại được bắn phá để tạo thành các ion sản phẩm, hai ion được lựa chọn là hai ion có cường độ cao nhất và tỷ lệ giữa 2 ion này là đặc hiệu cho mỗi chất Do đó vấn đề liệu các chất có tách với nhau trên sắc ký lỏng hay không không còn quá quan trọng như khi sử dụng đầu dò là UV-Vis, DAD, điều này được chứng minh trong hướng dẫn mới nhất của ICH tại Q2(R2) (2024) 118 về độ đặc hiệu - chọn lọc các chất trong phân tích tạp 118 Đối với các phân tích thường quy, yêu cầu các chất phải tách khỏi nhau trên sắc ký đồ thì mới có thể phát triển phương pháp Còn đối với các thiết bị khối phổ, các chất có thể không tách trên LC nhưng khi qua MS đều đã tách hoàn toàn về tín hiệu dựa vào số khối, đây là một trong những điểm ưu việt của MS so với các phương pháp khác

4.3.3 Bàn luận về thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E,

Bàn về tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là ưu điểm nổi bậc của phương pháp LC-MS/MS được thực hiện theo hướng dẫn mới Q2(R2) của ICH trong quy trình định lượng tạp Sắc ký đồ khi phân tích từng tạp đều cho thấy không xuất hiện tín hiệu các chất còn lại (PL 5.1), chứng tỏ quy trình đạt độ đặc hiệu cao Nguyên nhân là do các chất được tách lần đầu qua hệ thống sắc ký lỏng và được chọn lọc ion đặc trưng của từng chất để phân tích trong hệ thống đầu dò khối phổ tứ cực Kết hợp với kỹ thuật ghi phổ MRM, các mãnh ion đặc trưng định lượng tiếp tục được chọn lọc phân tích củng cố thêm cho tính đặc hiệu của quy trình Do đó dù thời gian lưu các tạp không tách ra nhau hoàn toàn nhưng với hệ thống phân tích LC-MS/MS, vẫn đảm bảo tính đặc hiệu-chọn lọc cho phương pháp phân tích theo ICH Q2(R2) (2024) 118

Bàn về ảnh hưởng của nền mẫu

Tiêu đề	Tổng hợp và Thiết lập Tạp chất Đối chiếu của Allopurinol Sử dụng trong Kiểm Nghiệm
Tác giả	Lữ Thiện Phúc
Người hướng dẫn	PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền, PGS.TS. Trần Việt Hùng
Trường học	Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Luận án Tiến sĩ Dược học
Năm xuất bản	2024
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	333
Dung lượng	19,61 MB