THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ
TỔNG QUAN
Tổng quan về nguyên liệu lá tầm gửi
2.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, phân loại
Thực vật ký sinh là một nhóm chức năng có tầm quan trọng không những về mặt sinh thái mà còn đối với kinh tế Nhóm này chứa hơn 4500 loài từ 12 bộ đại diện cho nguồn gốc tiến hóa độc lập của ký sinh Thực vật ký sinh có mặt trên toàn thế giới, đặc biệt là trong các quần xã sinh vật lớn Cây tầm gửi là nhóm ký sinh chồi thực vật hạt kín chiếm ưu thế và được tìm thấy trong nhiều hệ sinh thái bao gồm - rừng phương bắc, rừng mưa nhiệt đới và rừng khô cằn (Norton and Carpenter, 1998)
Cây tầm gửi là một nhóm đa ngành gồm các loài ký sinh bắt buộc trên thân của cây chủ, gồm hơn 1300 loài thuộc 5 họ trong bộ Santales (Mis-odendronaceae, Eremolepidaceae, Santalaceae, Loranthaceae và Viscaceae) Trong đó thì tầm gửi kí sinh trên cây dâu tằm thuộc loại Loranthaceae Loranthaceae, họ tầm gửi lớn nhất (75 chi, khoảng 950–1000 loài), chủ yếu ở bán cầu nam và vùng nhiệt đới (Wilson và Calvin, 2006)
Hình 2 1: Cây tầm gửi dâu tằm
Cây tầm gửi phụ thuộc vào vật chủ để lấy nước và khoáng chất nhưng ở một mức độ nhất định chúng có khả năng tự quang hợp, nên chúng được coi là thực vật ký sinh Việc sử
6 dụng trực tiếp nguồn tài nguyên ký chủ và các hậu quả sinh lý do cây tầm gửi gây ra khiến chúng có khả năng gây hại cho cây ký chủ Bản chất gây hại của cây tầm gửi được chứng minh bằng thực tế là nồng độ các khoáng chất như kali, phốt pho và magie trong lá cây tầm gửi thường vượt quá mức trong vật chủ tương ứng của chúng Tuy nhiên, cũng có vài nghiên cứu cho thấy rằng sự phá hoại của cây tầm gửi cũng có thể mang lại lợi ích cho vật chủ của chúng ( Van Ommeren và Whitham, 2002)
Sự hiện diện và phong phú của cây tầm gửi trong một khu vực nhất định có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như sự phân bố của các loài ký chủ phù hợp, mức độ đặc hiệu của ký chủ, tác nhân phân tán, các loài thụ phấn, và tương tác hóa học giữa thực vật ký sinh và vật chủ (Yoder, 1999) Cây tầm gửi Loranthaceae được đại diện ở Châu Phi bởi 22 chi và gần 250 loài Ở Nam Phi có 13 chi và 34–37 loài (Visser, 1986) Dean và cộng sự (1994) nhận thấy rằng sự lựa chọn ký chủ của cây tầm gửi cho thấy sự phân bố không ngẫu nhiên ở Nam Phi Các chi ký chủ quan trọng nhất là Acacia, Combretum, Maytenus và Rhus, lưu trữ ít nhất 24, 14, 13 và 12 loài tầm gửi tương ứng
Cây tầm gửi là thuật ngữ chung để chỉ thực vật ký sinh trên thân gỗ ở một số họ thực vật, đặc biệt là Loranthaceae, Viscaceae và hầu hết các chi tầm gửi châu Phi đều thuộc họ Loranthaceae (Polhill và Wiens, 1998) Bảy chi của họ Loranthaceae-Helixanthera, Berhautia, Englerina, Globimetula, Agelanthus, Tapinanthus và Phragmanthera với khoảng năm chục loài trở lên được công nhận ở Tây Phi (Burkill, 1985) và thuật ngữ nhóm cây tầm gửi, được sử dụng cho tất cả các loài này Ngoài ra, cây ký chủ cũng được coi là quan trọng như cây tầm gửi vì sự phân biệt được thực hiện giữa các cây ký chủ chứ không phải giữa các cây tầm gửi, ngụ ý rằng sinh học của loài Loranthaceae chưa được hiểu rõ ràng
Cây tầm gửi được tìm thấy trên nhiều loại cây trồng có tầm quan trọng kinh tế bao gồm cây bơ hạt mỡ (Vitellaria Paradoxa Gaertn f.), các loài cây có múi, đặc biệt là cam ngọt (Citrus sinensis L.) và nho (Citrus paradisi L.), ca cao (Theobroma cacao L.) và cao su
(Hevea brasiliensis Muell Arg) (Bright và Okusanya, 1998) Nhiều loài cây bán ký sinh này mọc trên các cây kinh tế, cây làm thuốc và cây trồng khác như cây dâu tằm (Morus alba), cây cóc thái (Spondias mombin L.), cây diêm sinh (Morinda lucida Benth) Những phát hiện này dường như mang lại sự tin cậy và ủng hộ cho câu ngạn ngữ Yoruba cho rằng cây tầm gửi không có rễ nhưng chúng (cây tầm gửi) có liên quan đến tất cả các vật chủ trên cây Bên cạnh những mặt lợi thì cũng có vài mặt xấu về cây tầm gửi chẳng hạn như người nông dân
7 hoặc người làm vườn coi cây tầm gửi là loài ký sinh khét tiếng và tàn phá, gây thiệt hại nghiêm trọng cho các cây có giá trị kinh tế như ca cao, cao su, hạt cola và các cây thuốc như cây nhàu (Morinda lucida) và ba gạc (Rauwolfia vomitoria) dù mọc trong rừng hoang hay vườn cây ăn quả ( Sridhar và Rao, 1978)
Hiện nay không có nhiều tài liệu về thành phần hóa học của nhiều loại cây tầm gửi
Có vài thông tin hóa học sẵn có bao gồm xác định cấu trúc của polysaccharide trong thành tế bào lá Phragmanthera Capitata được phân lập, tinh chế và nghiên cứu các hoạt động trao đổi chất của peptide từ lá tươi của Phragmanthera incana Thành phần đặc biệt nhất của hầu hết các cây tầm gửi châu Âu và châu Á là protein, viscotoxin, lectin và carbohydrate Các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ bao gồm flavonoid và phenylpropanoid thuộc các loại cấu trúc khác nhau và chúng góp phần tạo nên đặc tính chống oxy hóa của các chiết xuất
Loranthaceae khác nhau được kiểm tra Nhiều báo cáo về sự tồn tại của các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ hơn, alkaloid, flavonoid, tannin và các thành phần thực vật khác trong họ Loranthaceae chưa được chứng minh bằng cách phân lập và nhận dạng thích hợp
Do đó, còn rất nhiều điều cần được nghiên cứu để đánh giá đầy đủ thành phần hóa học của cây tầm gửi
Bảng 2 1: Thành phần hóa học của các loài tầm gửi
Các loài tầm gửi Thành phần hóa học Tài liệu tham khảo
Aboughe Angone và cộng sự, 2009
Glycoproteins; mistletoe lectins I, II, and III, proteins; viscotoxins and polysaccharides; galacturonan, arabinogalactan
Bốn flavonoid chống khối u rhamnopyranosides được xác định là rhamnetin 3-O-α-L-rhamnoside, quercetin
3-O-α-L-rhamnoside, rhamnocitrin 3-O-α-L- rhamnoside and kaempferol 3-O-α-L- rhamnoside
Hyperin and quercitrin với fatty acids, phytosterol and phytosterol glucoside
Fatty acids, phytosterol, Phytosterol glucoside, quercetin, avicularin and taxillusin; also quercitrin and hyperin
Chrysoeriol-4′-O-glucoside, fatty acids, phytosterol, oleanolic acid and phytosterol glucoside
Fukunaga và cộng sự, 1989 Đặc tính phenolic ở các loài cây tầm gửi rất khan hiếm vì thế các nghiên cứu đa phần chủ yếu tập trung vào đặc tính chống tăng sinh của terpen như acid moronic từ loài thực vật này Trong nghiên cứu phát hiện ra rằng acid phenolic dồi dào nhất được tìm thấy trong lá, thân và toàn bộ cây là acid ferulic và quinic Các chất chuyển hóa này đã được báo cáo là chất chống oxy hóa mạnh, thuốc chống viêm và tác nhân tiềm năng chống tăng cholesterol máu và tăng đường huyết Tuy nhiên, các hợp chất này dễ bị phân hủy trong quá trình tiêu hóa chủ yếu do điều kiện pH trong từng giai đoạn tiêu hóa, điều này có thể cản trở hoạt động sinh học của chúng Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng việc truyền cây tầm gửi vẫn có tác dụng ức chế lipase tuyến tụy sau khi trải qua quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm Trong trường hợp dịch truyền từ thân cây, hoạt tính ức chế lipase tăng từ 54,12% lên 78,49% khi kết thúc quá trình tiêu hóa Điều này có thể cho thấy sự hình thành các dẫn xuất mới trong quá trình tiêu hóa có thể làm tăng sự tương tác với lipase tuyến tụy, ngoài ra thì vấn đề chưa được công bố rõ và vẫn đang được đánh giá đầy đủ trong nghiên cứu thực nghiệm Hơn nữa, cần nhiều nghiên cứu hơn để đánh giá các thành phần flavonoid trong dịch truyền cây tầm gửi, xác định các phân tử hoạt động chống lại lipase tuyến tụy và chuyển sang nghiên cứu in vivo Ngoài ra, nghiên cứu này cho thấy cây tầm gửi có thể được sử dụng như một nguồn phenolics trong việc mở rộng phát triển một số thực phẩm chức năng có khả năng hạ đường huyết
Thành phần hóa học của Loranthus parasiticus Merr (cây tầm gửi kí sinh trên cây dâu tằm): người ta đã chứng minh rằng các loài Loranthus nói chung là nguồn giàu các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau Nghiên cứu thành phần chung của L parasiticus cho thấy nó chứa hàm lượng chất xơ thô rõ rệt lên tới 82,28% Nó cũng chứa 9,21% độ ẩm, 2,44% tro, 2,70% protein thô, 0,77% chất béo thô và 2,60% các thành phần khác (Chen và cộng sự, 2003)
Hiện nay thì con người ngày càng quan tâm đối với cây thuốc thảo dược có đặc tính chữa bệnh vì chúng có chứa chất phytochemical trong những cây này có thể là chất chống oxy hóa mới tiềm năng (Tawaha et al, 2007) Tác dụng tăng cường sức khỏe của chất chống oxy hóa từ thực vật được cho là phát sinh từ tác dụng bảo vệ của chúng bằng cách chống lại các loại oxy phản ứng Một số báo cáo chỉ ra rằng khả năng kháng oxy hóa của cây thuốc có thể liên quan đến nồng độ các hợp chất phenolic của chúng bao gồm axit phenolic, flavonoid, anthocyanin và tannin (Wong và cộng sự, 2006).c,teolin bị ảnh hưởng bởi sự tương tác của chúng với n
2.1.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng dược học
Cây tầm gửi là tên được đặt cho các nhóm loài thực vật ký sinh khác nhau, chủ yếu bao gồm năm họ thực vật Loranthaceae, Misodendraceae, Santalaceae, Amphorogynaceae và Viscaceae Các loài tầm gửi của Mỹ và Châu Âu đã được sử dụng trong y học cổ truyền nhằm chống lại bệnh ung thư như tác nhân hạ đường huyết và hạ huyết áp ( Freuding M., Keinki C và cộng sự, 2019) Các nghiên cứu dân tộc học đã chỉ ra rằng cây tầm gửi có đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, trị đái tháo đường, hạ huyết áp và kháng khuẩn(Kienle G.S., Kiene H và cộng sự, 2010) Những hoạt tính sinh học này có liên quan đến các chất hóa học thực vật như terpen, alkaloid và các hợp chất phenolic( Alonso-Castro A.J., và cộng sự, 2012)
Tổng quan các hợp chất Polyphenols và phương pháp trích ly Polyphenols
Polyphenols là các hợp chất được tổng hợp tự nhiên bởi quá trình trao đổi chất bậc hai của thực vật, đồng thời là chất kháng oxy hóa phổ biến nhất trong các loại trái cây, rau quả, chocolate và các sản phẩm nước uống như trà, cà phê, rượu,… (Araújo và cộng sự, 2021) Các hợp chất polyphenols trong thực phẩm có tác dụng tạo hương vị, màu sắc và tăng khả năng kháng oxy hóa cho thực phẩm, đồng thời giúp kéo dài thời gian bảo quản Một số
18 đặc tính của polyphenols đáng quan tâm bao gồm khả năng kháng oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống ung thư, chống lão hóa, chống viêm và kháng khuẩn (Arts và cộng sự, 2005) Hiện nay polyphenols được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược, mỹ phẩm hay ngành công nghệ thực phẩm và chúng dần trở thành hợp chất được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến bởi các hoạt tính đặc biệt của nó
❖ Phân loại các hợp chất Polyphenols
Các hợp chất polyphenols có nhiều trong thực phẩm, đặc biệt là ở các loài thực vật Cấu trúc chúng đa dạng nhờ vào số lượng vòng phenol và các phân tử liên kết với vòng, các nhóm polyphenols chính bao gồm: flavonoids, phenolic acids, phenolic alcohols, stilbenes và lignans (Archivio và cộng sự, 2007)
Flavonoid, một nhóm các chất tự nhiên có cấu trúc phenolic thay đổi, được tìm thấy trong trái cây, rau, ngũ cốc, vỏ cây, rễ, thân, hoa, trà và rượu vang Những sản phẩm tự nhiên này nổi tiếng vì tác dụng có lợi cho sức khỏe và những nỗ lực đang được thực hiện để cô lập các thành phần được gọi là flavonoid
Flavonoids là một nhóm polyphenols phổ biến có cấu trúc phenolic thay đổi, chúng thường được tìm thấy từ các nguồn thực phẩm trái cây, rau củ, ngũ cốc, vỏ cây, rễ, thân, hoa, trà và rượu vang vì chúng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu, tạo vị, tổng hợp các enzyme và vitamin, ức chế quá trình peroxy hóa lipid (Vuolo và cộng sự, 2019) Flavonoid hiện nay được coi là thành phần không thể thiếu trong nhiều ứng dụng dinh dưỡng, dược phẩm, y học và mỹ phẩm Do đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến và chống ung thư của chúng cùng với khả năng điều chỉnh chức năng enzyme quan trọng của tế bào (Panche và cộng sự, 2016)
Cấu trúc cơ bản của flavonoids là diphenylpropane, chứa hai vòng thơm (A và B) liên kết với một vòng dihydropuran Trong tự nhiên, flavonoids được chia thành sáu nhóm dựa vào sự khác biệt cấu trúc của vòng pyran, bao gồm: flavonol, flavone, flavanone, anthocyanins, isoflavones
Hình 2 2: Cấu trúc tổng quan của flavonoids và cấu trúc phân tử của nhóm flavonoids
Phenolic acid trong tự nhiên thường được tìm thấy trong các loại hoa quả và rau củ, chúng được chia thành hai nhóm, nhóm có nguồn gốc từ hydroxybenzoic và nhóm có nguồn gốc từ hydrocinnamic
Nhóm phenolic acid có nguồn gốc từ hydroxybenzoic đặc trưng bởi nhóm carboxylic (COOH) Chúng thường ít được tìm thấy trong thực phẩm, một vài hydroxybenzoic acid điển hình là gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid Trong khi đó, một số ví dụ của nhóm hydrocinnamic acid bao gồm coumaric acid, caffeic acid, Ferulic acid (Araújo và cộng sự, 2021)
Hình 2 3: Cấu trúc của Phenolic acid
Tyrosol (4-hydroxyphenyl ethanol) và hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphenyl ethanol) là các phenolic alcohols chính Nó chủ yếu chứa trong dầu ô liu nguyên chất Tyrosol đồng thời còn có mặt trong các sản phẩm rượu vang đỏ, trắng và bia (Covas và cộng sự, 2003)
Hình 2 4: Cấu trúc của Tyrosol và Hydroxytyrosol
Stilbenes không phổ biến như các polyphenols khác, chúng chỉ chiếm một lượng nhỏ trong khẩu phần ăn của con người Hợp chất resveratrol là một stilbenes phổ biến thường có trong nho, quả mọng và đậu phộng Resveratrol tồn tại ở cả hai dạng đồng phân cấu trúc cis và trans (Archivio và cộng sự, 2007) Delmas và cộng sự (2006) đã tìm thấy các hợp chất stilbenes có khả năng chống viêm và điều trị nhiễm trùng bởi mầm bệnh hoặc các triệu chứng căng thẳng
Hình 2 5: Cấu trúc của Stilbenes
Lignans được tạo ra bởi quá trình đồng phân hóa hai phân tử phenylpropane, phản ứng này được xúc tác bởi enzyme oxy hóa và thường được kiểm soát bởi dirigent protein Lignans thường tồn tại ở trạng thái tự do và chủ yếu có trong hạt lanh và các loại ngũ cốc, rau họ cải Cho đến nay, lignans vẫn đang được nghiên cứu và phát triển nhờ vào tiềm năng điều trị các bệnh ung thư của chúng (Saleem và cộng sự, 2005)
Hình 2 6: Cấu trúc của Lignans
2.2.2 Các phương pháp trích ly polyphenols
Nhờ vào các hoạt tính sinh học nổi trội của polyphenols, vào những năm gần đây đã có nhiều sự quan tâm nghiên cứu để phát hiện và chiết tách polyphenols từ thực phẩm (Govindarajalu và cộng sự, 2019) Nhiều tác nhân có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách polyphenols từ thực vật Do bản chất không bền dưới các tác nhân cũng như sự đa dạng của chúng, với mỗi polyphenols từ những nguyên liệu thực vật khác nhau sẽ đưa ra các nghiên cứu điều kiện chiết tách khác nhau để đạt hiệu suất thu hồi tối ưu nhất Vì thế, điều kiện chiết tách là một kỹ thuật quan trọng ảnh hưởng đến khả năng thu hồi tối đa hợp chất polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa của thực vật Để có thể đưa ra điều kiện chiết tách tốt nhất cần khảo sát nhiều tác nhân, một trong số tác nhân quan trọng nhất là loại dung môi, tỷ lệ dung môi, thời gian và nhiệt độ chiết tách (Che Sulaiman và cộng sự, 2017)
Việc chiết tách cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân lập và tinh chế các hợp chất sinh học từ thực phẩm Các phương pháp chiết tách truyền thống và hiện đại đã được sử dụng để đánh giá hiệu suất thu hồi polyphenols từ thực phẩm, bao gồm phương pháp chiết tách Soxhlet, ngâm chiết, chiết tách sử dụng hỗ trợ vi sóng, chiết lỏng siêu tới hạn, chiết tách sử dụng hỗ trợ enzyme, chiết tách sử dụng kích thích xung điện trường (Pasrija và Anandharamakrishnan 2015)
Tất cả các kỹ thuật trên đều có những mục tiêu chung nhằm chiết xuất hợp chất sinh học từ các mẫu thực vật phức tạp, tăng sự lựa chọn cho các phương pháp phân tích, tăng độ nhạy của phương pháp bằng cách tăng nồng độ hợp chất phân tích, chuyển đổi các hợp chất sinh học thành dạng phù hợp hơn cho việc phát hiện và phân tách (Smith, 2003)
2.2.2.1 Các phương pháp trích ly truyền thống
Nguyên liệu dùng để ngâm chiết và phân lập các hợp chất polyphenols là các loại thực phẩm, thực vật, đồ uống với số lượng nhỏ, vì vậy cần có nhiều phương pháp ngâm chiết để phù hợp với tính chất nguyên liệu Các phương pháp ngâm chiết truyền thống bao gồm phương pháp ngấm kiệt (Percolation),phương pháp ngâm dầm (Maceration), chiết xuất sử dụng nhiệt, chiết Soxhlet Việc lựa chọn phương pháp ngâm chiết phụ thuộc vào tính chất và thành phần của mẫu nguyên liệu (Sridhar và cộng sự, 2021)
❖ Phương pháp ngấm kiệt (Percolation)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Lá tầm gửi (Loranthus parasiticus (L.) Merr) được thu hái tại tỉnh An Giang, Việt Nam vào tháng 1 năm 2024 Đối tượng nghiên cứu là lá của cây tầm gửi mọc trên cây dâu tằm Sau khi thu hoạch, lá tầm gửi sẽ được tiến hành phân loại, rửa, sấy khô, nghiền mịn và bảo quản kín
Mẫu được lưu trữ tại tủ đông ở nhiệt độ - 18 o C tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh tới khi sử dụng làm thí nghiệm.
Hóa chất và thiết bị dùng để nguyên cứu
Bảng 3 1: Dụng cụ được sử dụng nghiên cứu
STT Dụng cụ Xuất xứ
3 Bình xịt nước cất Mỹ
8 Giá ống nghiệm Việt Nam
10 Ống nghiệm thủy tinh Đức
12 Ống ly tâm nhựa Việt Nam
Bảng 3 2: Hóa chất được sử dụng nghiên cứu
STT Hóa chất Độ tinh khiết Xuất xứ
6 Folin – Ciocalteu ( C10H5NaO5S) >99% Trung Quốc
8 Methanol (CH3OH) >99% Trung Quốc
Bảng 3 3: Thiết bị được sử dụng nghiên cứu
STT Thiết bị Hãng sản xuất Xuất xứ
1 Cân phân tích 2 số Precisa Thụy Sỹ
2 Cân phân tích 4 số Precisa Thụy Sỹ
3 Lò vi sóng Electrolux Thụy Điển
4 Máy đo quang phổ UV-VIS Optima Nhật Bản
5 Máy ly tâm Hermle Z366 Hermle Đức
6 Bộ xử lý siêu âm UP100H Hielscher –
7 Thiết bị lắc ổn định nhiệt
Incubated Shaker Fcombio Trung Quốc
Thiết kế thí nghiệm
3.3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết tách truyền thống đến hiệu suất thu hồi hoạt chất
Dịch chiết lá tầm gửi
1 Xác định hàm lượng chất khô tổng
2 Xác định hàm lượng polyphenols tổng
3 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 3 1: Sơ đồ phương pháp trích ly truyền thống
15 phút Kích thước hạt: 0.25-0.5mm
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến hiệu suất chiết tách
Bột lá tầm gửi sẽ được ngâm chiết lần lượt trong các dung môi acetone, ethyl acetate và ethanol 96%, ethanol 70% và nước với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (g/mL), ở nhiệt độ phòng trong 120 phút Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu suất chiết tách
Bột lá tầm gửi (1g) sẽ được ngâm chiết với nồng độ dung môi thích hợp xác định được ở thí nghiệm trên với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lần lượt là 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/mL) với điều kiện nhiệt độ phòng trong 120 phút Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tách đến hiệu suất chiết tách
Bột lá tầm gửi (1g) sẽ được ngâm chiết với nồng độ dung thích hợp xác định được ở thí nghiệm trên với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (g/mL) ở các nhiệt độ chiết tách lần lượt là nhiệt độ phòng, 50, 60, 70 và 80 0 C trong 120 phút Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols tổng và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết tách đến hiệu suất chiết tách
Bột là tầm gửi (1g) sẽ được ngâm chiết với nồng độ dung môi thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trên với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (g/mL) ở nhiệt độ phòng trong thời gian chiết tách lần lượt là 60, 120, 180, 240 phút và 300 phút Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được
3.3.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chiết tách sử dụng hỗ trợ siêu âm và vi sóng đến hiệu suất thu hồi hoạt chất
Ngâm chiết hỗ trợ sóng siêu âm
Ngâm chiết hỗ trợ vi sóng
Dịch chiết là tầm gửi
1 Xác định hàm lượng chất khô tổng
2 Xác định hàm lượng polyphenols tổng
3 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Dịch chiết lá tầm gửi
1 Xác định hàm lượng chất khô tổng
2 Xác định hàm lượng polyphenols tổng
3 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu:
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 40:1 (mL/g)
Hình 3 2: Sơ đồ phương pháp trích ly hiện đại
- Phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng (MAE)
Cách thực hiện: Nguyên liệu được sử dụng trong quy trình chiết tách là lá tầm gửi đã qua xử lý Mỗi mẻ trích ly được thực hiện với lượng mẫu cân chính xác 1 ± 0,01 g trộn với
40 mL dung môi (ethanol 70%) trong bình tam giác 250 mL (tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/40 (g/ml)) dựa trên kết quả tối ưu hóa từ khảo sát sơ bộ)
Dựa trên nghiên cứu của Chuyen và các cộng sự (2017), thí nghiệm này được thiết kế với phương pháp chiết tách gián đoạn để kiểm soát nhiệt độ dung môi Trong quá trình hỗ trợ bằng vi sóng, nhiệt độ dung môi thường tăng nhanh và dễ đạt đến nhiệt độ sôi Do đó, quá trình chiết sử dụng chu kỳ gián đoạn gồm 15 giây gia nhiệt và 45 giây không gia nhiệt xen kẽ để tránh quá nóng cho dịch chiết mẫu Thí nghiệm được tiến hành trong 2, 4, 6, 8, 10,
12 phút với công suất vi sóng thấp nhất Phương pháp chiết gián đoạn giúp kiểm soát nhiệt độ hiệu quả, tránh làm hư hỏng các hợp chất trong mẫu do gia nhiệt quá mức Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được Thí nghiệm được lặp lại ba lần Phương pháp phân tích phương sai một chiều (one-way ANOVA) được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa các mức yếu tố với α = 0,05
- Phương pháp trích ly hỗ trợ sóng siêu âm ( UAE)
Cách thực hiện: Ngâm 1g bột lá tầm gửi với 40mL dung môi ethanol 70% Đặt đầu phát sóng siêu âm tần số 30kHz, công suất 100W vào cốc đong thủy tinh 100 ml, tiến hành chiết tách Nhiệt độ ngâm chiết ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10, 20, 30, 40 phút Hỗn hợp chiết tách được ly tâm, lọc và pha loãng đến nồng độ thích hợp để phân tích chất khô tổng số, hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa trong các dịch chiết thu được.
Phương pháp xác định chỉ tiêu kiểm tra
3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số
Cách tiến hành: Chuẩn bị đĩa petri, sấy và cân đĩa, ghi nhận khối lượng (m1) Ngâm 1g bột lá tầm gửi với dung môi, tiến hành ngâm chiết Hút 10mL dịch chiết cho vào đĩa petri Đặt đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và tiến hành sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 0 C Sau khi lấy mẫu ra khỏi tủ sấy đặt vào bình hút ẩm để làm nguội đến nhiệt độ phòng và cân, ghi nhận khối lượng (m2)
Hàm lượng chất khô tổng số của mẫu được xác định theo công thức:
E: Hàm lượng chất khô tổng số của mẫu (mg/g) m1: khối lượng đĩa petri chứa mẫu sau khi sấy (mg) m2: khối lượng đĩa petri đã sấy ban đầu (mg) n: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
V: thể tích dịch chiết mẫu; V = 10mL
3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenols tổng
Nguyên tắc: Để đánh giá giá trị sinh học của cây trồng, giá trị TPC có thể là một chỉ số quan trọng (Khomdram và Singh, 2011) Các yếu tố bao gồm thể tích chiết, lựa chọn thuốc thử, thời gian phản ứng, nhiệt độ phát triển màu, bước sóng đo và chất tham chiếu có thể ảnh hưởng đến giá trị TPC (Abdelkader và cộng sự, 2014) Nguyên lý đo TPC trong nguyên liệu thực vật dựa trên phản ứng thay đổi màu sắc giữa polyphenol và thuốc thử Folin- Ciocalteu (FCR), chất này có thể tạo thành phức hợp màu xanh lam sau đó có thể được định lượng bằng các thiết bị như máy đọc đĩa quang phổ (Abdelkader và cộng sự 2014; Agbor, và cộng sự, 2014) Như Agbor và cộng sự (2014) đã đề cập trong nghiên cứu của họ, phức hợp màu xanh lam là phức hợp phosphotungstic-phosphomolypden Và do dung dịch kiềm và nồng độ của các hợp chất polyphenols, độ hấp thụ của nền này sẽ khác nhau, điều này làm cho việc định lượng nồng độ hợp chất polyphenols trở nên dễ dàng (Blainski và cộng sự, 2013) FCR là một phương pháp rất nhạy và chính xác đã được một số nhà khoa học chứng minh rằng nó có thể cung cấp dữ liệu chính xác và cụ thể cho phép đo TPC vì phản ứng màu sắc là phổ biến và trực quan(Agbor và cộng sự, 2014)
Hình 3 3: Nguyên lý của phương pháp Folin–Ciocalteu
- Xây dựng đường chuẩn acid gallic: Pha 0,025g acid gallic trong methanol rồi định mức lên 50mL Sau đó pha ra các nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70 𝜇g/mL Lấy 0,5 mL dung dịch acid gallic với các nồng độ trên cho lần lượt vào các ống nghiệm, bổ sung 2,5 mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó cho thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5% Lắc ống nghiệm để trộn đều hỗn hợp sau đó để phản ứng xảy ra trong phòng tối 30 phút Sau phản ứng, độ hấp thụ màu của dung dịch được đo ở 765 nm bằng máy đo hấp thụ quang phổ Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hấp thụ
Hình 3 4: Đồ thị đường chuẩn acid gallic
- Xác định tổng hàm lượng polyphenols trong mẫu: Lấy 0,5mL dịch trích vào ống nghiệm, bổ sung 2,5mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó cho thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5% Lắc ống nghiệm và để phản ứng xảy ra trong phòng tối 30 phút Sau phản ứng, độ hấp thụ màu của dung dịch được đo ở bước sóng 765nm bằng máy đo hấp phụ quang phổ UV-Vis Lặp lại thí nghiệm 3 lần Hàm lượng polyphenols tổng số được tính bằng mg acid gallic tương đương (mg GAE/g chất khô nguyên liệu) (Singleton và cộng sự, 1999)
Hàm lượng polyphenols tổng số của dịch chiết lá tầm gửi được tính theo công thức:
X: hàm lượng polyphenols tổng số tương đương hàm lượng acid gallic (mg GAE/g chất khô (CK) nguyên liệu)
C: nồng độ acid gallic tương đương tính được dựa vào phương trình đường chuẩn (μg/ml) n: hệ số pha loãng mẫu
V: thể tích dung môi chiết mẫu (ml) y = 0.0107x + 0.0099 R² = 0.9982
0 10 20 30 40 50 60 70 80 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 765nm
Nồng độ acid gallic (àg/mL)
(3.2) (mg GAE/g CK nguyên liệu)
3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Nguyên tắc : Hoạt tính kháng oxy hóa của lá tầm gửi trong nghiên cứu này được xác định bởi phương pháp xác định khả năng ức chế gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) Thử nghiệm DPPH là phương pháp thử nghiệm hoạt động ức chế gốc tự do
Cơ chế phản ứng với chất khỏng oxy húa là sự thay đổi màu từ màu tớm đậm (DPPHã) sang màu vàng nhạt (DPPH) sau phản ứng với gốc peroxyl ROOã (Benzie và Strain 1999) DPPHã tồn tại dưới dạng monome ở cả trạng thái rắn và lỏng, có khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như methanol và ethanol để phản ứng với các gốc tự do không tan trong nước Như Staško và cộng sự (2007), nghiên cứu rằng hàm lượng nước cần được kiểm soát dưới 60% để duy trì khả năng hòa tan tốt của các gốc tự do Gốc DPPH được trung hòa sau khi nhận electron từ chất kháng oxy hóa và do sự thay đổi màu sắc trong quá trình này nên khả năng kháng oxy hóa có thể được định lượng ở bước sóng 515 nm
Cách tiến hành: Chúng tôi sử dụng phương pháp của Candrawinata và cộng sự (2014) để đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng DPPH
- Chuẩn bị dung dịch DPPH: Hòa tan 0,024g thuốc thử DPPH với methanol, định mức lên 100ml, dung dịch được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, nhiệt độ -20 0 C Pha dung dịch DPPH làm việc bằng cách hút 10ml DPPH và pha loãng với 45ml methanol sao cho dung dịch có độ hấp thụ quang đạt 1,1÷0,02 tại bước sóng 515nm
- Chuẩn bị dung dịch Trolox (0.2mg/ml): Cân 0.01g ± 0.1 Trolox cho vào bình định mức 50ml và định mức lên 50ml bằng methanol Dung dịch này có thể bảo quản trong 2 tuần ở nhiệt độ 4 0 C
❖ Dựng đường chuẩn Trolox: Từ dung dịch Trolox chuẩn pha ra các nồng độ: 0.01, 0.02, 0.025, 0.05, 0.1 mg/mL Lấy 0,2 mL dung dịch Trolox với các nồng độ trên cho lần lượt vào các ống nghiệm, bổ sung 3.8 mL dung dịch DPPH làm việc, lắc đều Để yên mẫu trong 1,5h ở điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Tiến hành đo mẫu ở bước sóng 515nm bằng máy đo quang phổ
Hình 3 5: Đồ thị đường chuẩn Trolox
❖ Cách đo độ hấp thụ của mẫu: Các mẫu dịch trích lá tầm gửi được pha loãng ra các nồng độ thích hợp Lấy 0,2ml dịch trích với các nồng độ pha loãng cho lần lượt vào từng ống nghiệm, bổ sung 3,8ml dung dịch DPPH làm việc, lắc đều Để yên mẫu trong 1,5h ở điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Tiến hành đo mẫu ở bước sóng 515nm bằng máy đo quang phổ Mẫu đối chứng cũng được thực hiện như mẫu dịch chiết nhưng thay dịch chiết bằng dung môi ngâm chiết
- Phần trăm ức chế gốc tự do của DPPH của mẫu được xác định theo công thức:
Khả năng ức chế DPPH (%) = ( 𝐴 0 −𝐴 1
Trong đó: A0 và A1 là độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng và mẫu dịch chiết tương ứng ở bước sóng 515nm
- Hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số của mẫu thử, E biểu thị bằng mg đương lượng Trolox trên 1g mẫu (mg TE/g chất khô nguyên liệu) theo công thức:
𝑎×𝑚× 𝑛 × 𝑣 (mg TE/g CK nguyên liệu) Trong đó: c là khả năng ức chế DPPH của mẫu(%) y = 611.98x + 2.9326 R² = 0.9967
Nồng độ Trolox (mg/mL)
45 a, b là hệ số của phương trình y = ax+b ( phương trình đường chuẩn Trolox) m là khối lượng mẫu đem đi trích ly (g) n là hệ số pha loãng mẫu v là thể trích dung môi chiết mẫu (ml)
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm được tính toán và phân tích của số liệu các nghiệm thức được lặp lại 3 lần Kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± SD bằng phần mềm Microsoft Excel Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị được thực hiện đánh giá bằng phương pháp xử lý thống kê ANOVA 1 biến (α = 5%) trên phần mềm Minitab 20
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly
4.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số
Hình 4 1: Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả chiết tách chất khô tổng số Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về thống kê (p ethyl acetate Loại dung môi có polyphenols tổng số cao nhất là ethanol 70% ( 166,81 ± 2,26 mg GAE/g CK nguyên liệu) và thất nhất là ethyl acetate (46,43 ± 5,85mg GAE/g CK nguyên liệu) Sự khác biệt trên có thể chủ yếu do ái lực cao hơn của các hợp chất polyphenols đối với dung môi phân cực, nhưng các yếu tố khác như sự suy yếu của tương tác chất tan-môi trường chất rắn xung quanh và sự trương nở của nguyên liệu thực vật cũng có thể liên quan Như đã biết, hiện tượng trương nở là do sự hấp phụ của các phân tử dung môi lên các nhóm chức năng cụ thể của các thành phần sinh khối (Obataya và Gril, 2005) Hiện tượng này dẫn đến sự giãn nở của nguyên liệu thực vật, tạo điều kiện cho dung môi thâm nhập và chiết xuất polyphenols liên kết với môi trường rắn Các dung môi phân b c d a b
Nước cất Acetone Ethyl acetate Ethanol 70% Ethanol 96%
Polyphenols tổng số (mg GAE/g CK nguyên liệu)
49 cực có khối lượng phân tử thấp điển hình như nước, ethanol và aceton là những chất kích thích trương nở hiệu quả (El Seoud, 2009) Do đó, có thể đưa ra giả thuyết rằng các hiệu ứng dung môi quan sát được ít nhất một phần là do sự trương nở của mô thực vật
Bên cạnh đó thì (Thurkmen và cộng sự, 2006) cũng có báo cáo rằng dung môi có độ phân cực khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenols và hoạt tính kháng oxy hóa ở hàm lượng cao hơn trong các dung môi phân cực hơn (Siddhuraju và cộng sự, 2003; Sultana và cộng sự, 2007) Các hợp chất polyphenols thường tồn tại trong trạng thái liên kết với đa dạng các phân tử sinh học, bao gồm polysaccharide, protein, terpenoid, chlorophyll và các hợp chất vô cơ,… Do đó, việc lựa chọn dung môi chiết xuất phù hợp đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân lập và thu nhận hiệu quả của các hợp chất mục tiêu này Nghiên cứu được thực hiện bởi Jayaprakash và cộng sự (2001) đã xác nhận tính kém hiệu quả của acetone, methanol và nước trong việc chiết phenol tổng số trong hạt nho (Vitis vinifera) Tuy nhiên, ethanol/nước hoặc acetone/nước là dung môi tốt hơn so với ethanol hoặc acetone (Kallithraka và cộng sự, 1995) Từ những chính minh trên thì có thể suy ra rằng dung môi ethanol 70% cho ra kết quả hàm lượng polyphenols tổng số cao nhất là có tính khả thi trong thí nghiệm của chúng tôi
4.1.3 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hình 4 3: Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính kháng oxy hóa
Ghi chú: Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có nghĩa về thống kê (p