báo cáo thí nghiệm hợp chất tự nhiên trong y sinh học buổi 1 tách chiết thu nhận và xác định hợp chất tự nhiên từ thực vật

Trong cây cam thảo có chứa các hợp chất tự nhiên thuộc nhóm alkaloid, polyphenol và terpenoid thực hiện các chức năng của chúng.. Trong bài này, nhóm thực hiện chiết xuất hợp chất bên tr

TONG LIEN DOAN LAO DONG VIET NAM TRUONG DAI HQC TON DUC THANG KHOA KHOA HOC UNG DUNG

Giảng viên hướng dân: TS VŨ HƯỲNH KIM LONG

Người thực hiện: Nguyễn Thành Tài 62101173

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH, NĂM 2024

TONG LIEN DOAN LAO DONG VIET NAM TRUONG DAI HQC TON DUC THANG KHOA KHOA HOC UNG DUNG

MUC LUC

MỤC LỤC .- Ơn HH nh nh nh ni nh HH iii

MUC LUC ANH ccsscccccssseccesscccesceceecceccceeeescceessceseessceeeees Vv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTT - - - << << cc << sec ceess vi

CHUONG 1 TONG QUAN cs:ccesssceseecesscnseeeeeeecesesenseeceneeees 1

CHƯƠNG2_ GIỚI THIỆU - << << << << c << se =s2 1

Z5 Carr thao all _ 1 2.2 Cac hop chat ty nhiên trong cam thảo 2-25 s+s22c+z+z si 3

2.2.2 POlYPNeNl PT " aa ă 3 2.2.3 TerpenOi -cc LH HH HH HH TH TH T TT TT TT K Tnhh nhe hy 3 2.3 Chiết xuất bằng phương pháp siêu âm ¿5-5222 S2 +z+e ca 4 2.4 Phương pháp định tính thành phần hóa học của rễ Cam thao 5 2.4.1 Định tính favonoid - SH nh xa 5 2.4.2 Phản ứng Shinoda - ST TS SSSSSnn ST Tnhh kh ky 6 2.5 Định tính Saponin băng phương pháp kiểm tra bọt (foaming test) 7 2.6 Định lượng phenolic trong rễ Cam thảo - +5: 52s 2zs+x+es+s5s2 7

CHƯƠNG3 QUY TRINH TACH CHIET, THU NHAN HOP CHAT

TỰ NHIÊN TU CAM THAO) cccssessececccecessssceceeceecceceeeeseesssescenens 9 3.1 Sơ đồ quy trình - 22.21 1S S21 21 18181 1111111 81115 1E tt 9

3.2 Các bước thực hiện .- Q1 HH nh nh cv ky 9

3.2.1 Siêu âm -2- 12121 E2 12122121221 2101211 ere 9

3.2.2 Ly tâm s 2222 12T HH Hee rêu 11

CHƯƠNG 4 XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHÁT TỰ NHIÊN TỪ CAM

THẢO - 5 nh HH ni 13

4.1 Định tính thành phần hóa học . 2 5225252 S2*2222+E+E£zxsxszsez 13

4.1.1 Định tính phenoli€ 2222122111511 1 S511 ky ky 13 4.1.2 Định tính saponin (foaming †€st) -SSSSSSSSsSSS se 15 4.2 _ Định lượng hảm lượng phenolie có trong cam thảo 16

4.2.1 Dựng đường chuẩn Gallie acid 5-2 22222 Ssszsecsxsecred 16

4.2.2 Thao tac thurc hién cc ccecccceececeeeeeeueeeeeeceeeu sensu eeeeeeeeeneeeenees 16

4.2.3 Kết quả thu được - - c2: 1212212111 2515111181815 xe 17 CHƯƠNG5_ KẾT LUẬN ccc Ăn sen se, 18 CHƯƠNG 6_ TÀI LIỆU THAM KHẢO s<< <<: 18

MUC LUC ANH

Hình 2.1 Cây cam thảo [͆] - - 0 1 2211111121111 111111 TH 11k Tnhh ket 1 Hình 2.2 Cơ chế chiết xuất bằng phương pháp siêu âm 5-5-5255 4

Hình 2.3 Vị trí gắn của ion sắt lên phenolic +25: + 2 +x+x xe rersre 5 Hình 2.4 Sản phẩm sắt két hợp flavonoid [4] - 552cc +zccxsxsszecse 6

Hình 2.5 Phản ứng Shinoda[5] -.- 0 2 222111112 11 ng key 6

Hình 2.6 Cấu trúc của thuốc thử F-C . Q2 221 1 1222221212111 re 7

Hình 2.7 Phản ứng oxy hóa khử của F-C với phenolic[6] - 8 Hình 3.1 Quy trình thực hiện chiết xuất hợp chát tự nhiên từ cam thảo 9

Hình 3.3 Cân 1 g bột cam thảo - 2-0000 HH n HH SH S SH HH ng ke 10

Hình 3.2 Vortex cam thảo và EtOH - 0 Q0 22H n S2 nh He, 10

Hình 3.4 Siêu âm dược liệu .- L Qnn ST TT TT HH KH Hy nga 11

Hình 3.5 Sau khi ly tâm L Q2 nn S2 HT TH nn HT ng T ket 11 Hình 3.6 Dịch chiết cam tảoO T111 SH n HT HT HH rệt 12 Hình 3.7 Phản dịch chiết cam thảo - 0 1011111111121 151111 1111 EEEEEkrere 12 Hình 4.1 Hình ảnh kết quả định tính hợp chát tự nhiên có trong cam thảo 13

Hình 4.2 Trước và sau khi thực hiện phản ứng Shinoda - 14

Hình 4.3 Đánh giá saponin qua các mốc thời gian -5scscsc+ccssa 15

Hình 4.4 Đường chuân phenoliC - - + 52 22c SE E222 2121251151221 2xe 16

Hình 4.5 Thực hiện định lượng phenolic - - 5-5 5-S+2<<<s<cc+ss 17

Hình 4.6 Két qua do OD của mẫu và mẫu trắng .-. -: cccsc sec: 17

vi

DANH MUC TU VIET TAT

F-C : Folin-Ciocalteu

EtOH : Ethanol

CHUONG 1 TONG QUAN

Cay cam thao la mét loai duoc liéu quy duee biét co nhiéu céng dungjj chữa bénh va thanh loc co thé Trong cây cam thảo có chứa các hợp chất tự nhiên thuộc nhóm alkaloid, polyphenol và terpenoid thực hiện các chức năng của chúng Trong bài này, nhóm thực hiện chiết xuất hợp chất bên trong rễ cam thảo băng phương pháp siêu âm, thu dịch chiết băng phương pháp ly tâm và thực hiện định tính xem

có sự xuất hiện phenolic bên trong dịch chiết bằng việc sử dung ion sắt, chì Sau đó định tính Cyanidin bằng phương pháp Shinoda Đối vơiss Saponin có trong dịch chiết sử dụng foaming test, và cuối cùng là định lượng phenolic có trong cam thảo

thuốc đăng dé để uống hơn [1]

Hinh 2.1 Cay cam thao [1]

Cây cam thảo còn có thên gọi khác như Quốc lao, sinh cam thao, thudc ho

đậu (Fabaceae) hoặc Cánh bướm [1]

Đặc điểm, tùy vào loại cam thảo đó là gì thì có những đặc điểm khác nhau,

nhìn chung thi cam thảo có đặc điểm như sau:

— Cây cam thảo là cây lâu năm, thân ngầm dưới đất có thể đâm ngang đến 2 mét

— Lá cây là lá kép, hình bầu dục, dài khoảng 2 — 2.5 em, mặt lá khá nhãn

—_ Hoa của cam thảo khá bắt mắt, hình cánh bướm, phớt tím ở phần đuôi

cánh hoa

— Quả cam thảo có hình cong như lưỡi liêm, có nhiêu lông và màu nâu

Về phân bố và nguồn gốc, cam thảo bắc có nguồn gốc từ Trung Quốc, về sau thì cây đã di thực về Việt Nam và mọc hoang tại nhiều tỉnh trung du và miền núi như Sơn La, Điện Biên, Hà Giang, Quảng Ninh, [ 1]

Cam thảo có những hợp chất tự nhiên đáng kế đến như: Glycyrrhizin, Neo- liquiritin, Isoliquiritigenin, Liquiritin, Isoliquiritin, Licurazid, Liquiritigenin Từ đó cho thây cam thảo có tính kháng khuẩn nhờ vào Glycyrrhizin, ngoài ra Glycyrrhizin còn có khả năng điều trị viêm gan C trong việc giải độc, bảo vệ gan; chữa viêm loét

dạ dày nhờ vào hoạt tính chống oxy hóa của glabridin và glabrene có trong rễ cam

thao.[2]

Cam thảo được dùng bằng cách sắc uống, nhai trực tiếp hoặc dùng cao lỏng,

người ta có thê chế biến thành kẹo, trà để sử dụng [2]

Việc hấp thụ quá nhiều cam thảo có thê khiến nồng độ Kali trong co thé giảm dẫn đến huyết áp cao, Suy tim sung huyết, nhịp tim bất thường, xuất hiện hội chứng co giật [2]

Ngoài ra, phụ nữ có thai cũng không nên dùng cam thảo vì Glycyrrhizin có thê ảnh hưởng đến sự phát triển của não ộ thai nhi Ngoài ra đối tượng lợi tiểu trừ thấp, đầy hơi, phù trướng cũng không nên dùng để tránh các tác dụng phụ không

mong muốn [2]

2.2 Cac hgp chat tu nhién trong cam thao

2.2.1 Cac Alkaloid

Alkaloid là một nhóm hợp chất nitơ hữu cơ có tính base mạnh Chúng có tác dụng sinh lý mạnh mẽ và thường được sử dụng làm thuốc Một số alkaloid quan trọng trong cam thảo bao gồm:

— Glycyrrhizin: Đây là hợp chất chính cho vị ngọt của cam thảo Nó cũng có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư

— Glabridin: Hợp chất này có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan

—_ Isoliquiritipenin: Hợp chất này có tác dụng chống viêm và chống vi

khuan [3]

2.2.2 Polyphenol

Polyphenol là một nhóm hợp chất thực vật có cấu trúc phenol Chúng có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ và có thê giúp bảo vệ cơ thê khỏi tác hại của các gốc

tự do Một số polyphenol quan trọng trong cam thảo bao gồm:

— Acid glycyrrhizinic: Hop chat nay có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư

—_ Acid ferulic: Hợp chất này có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV

— Acid chlorogenic: Hợp chất này có tác dụng chống oxy hóa và giúp hạ huyết áp.[3]

2.2.3 Terpenoid

Terpenoid là một nhóm hợp chất hữu cơ được tông hợp từ isoprene Chúng

có nhiều chức năng khác nhau, bao gồm hương vị, mùi thơm và tác dụng sinh lý Một số terpenoid quan trọng trong cam thảo bao gồm:

— Glycyrrhetinic acid: Hop chat nay có tác dụng chống viêm, chỗng oxy hóa và chống ung thư

— Licorice isoflavone: Hop chat nay c6 tac dụng chống oxy hóa và bảo

vệ gan

— Licorice chalcone: Hợp chất này có tác dụng chống viêm và chống vi

khuẩn.[3]

2.3 Chiết xuất băng phương pháp siêu âm

Sóng siêu âm là một loại sóng nằm ngoài vùng nghe của con người, dựa trên tần số của sóng siêu âm mà người ta ứng dụng nó vào trong công nghiệp, chế biến thực phâm hay cả lĩnh vực được phẩm

Chiết xuất băng phương pháp siêu âm sẽ thu được toàn bộ dịch chiết với độ

Plant Material gi Cell

Trong quá trình thực hiện siêu âm, cần phải lưu ý:

—_ Về nhiệt độ: để đảm bảo rằng dung môi có thể hòa tan tốt, dung môi không bị sôi khi thực hiện siêu âm

— Vé tan số: Tần số cao thì thời gian siêu âm ngắn, tuy nhiên cũng tạo bọt gây ra sự gián đoạn cho quá trình Cần phải dựa vào nhiệt độ để

thuc nghiém va cho ra tần số tối ưu để đảm bảo tính kinh tế của quá

vị trí có khả năng liên kết với sắt Vị trí găn là những vị trí đánh dấu đỏ như dưới

2,3-double bond , Baicalein, baicalin, rutin, quercetin

Hình 2.3 V¿ trí gắn ca ion sắt lên phenolic

Qua đó, sản phâm khi sắt kết hợp flanovoid như sau:

thấy được bằng mắt thường).[6]

2.5 Dinh tinh Saponin bang phương pháp kiém tra bot (foaming test)

Saponin có tính đặc trưng là phân tử lớn, có một đầu ưa nước, một đầu ky nước Dựa trên tính tạo bọt của nó mà có thê kiểm tra Saponin bằng phương pháp tạo bọt và xem độ bền của bọt do dịch chiết tạo ra

2.6 Định lượng phenolic trong re Cam thao

Trong rễ cam thảo có chứa polyphenol như hình

Do đó có thé ding phương pháp Folin-Ciocalteu (F-C) đề định lượng hàm lượng phenol tổng có trong mẫu Thuốc thử F-C là một hỗn hợp gồm

phosphomolybdic acid (HaPMo:zOao} và phosphotungstc acid (HaPWzOap) Lithium sulfate (LizSO4-4H20) [7]

12 (Na;MO¿ X 2H,0) + H3PO, + 24HCI ——> H;PM:;O¿ + 24 NaCl + 36 H;ạO

M=Mo or W

[PW42040]*

Hình 2.6 Cấu trúc cza thuốc thứ F-C

Khi tác dụng với phenol, thuốc thử F-C khử và khi nhận electron sẽ cho ra từng mức độ mức độ màu khác nhau.[7]

COOH coo |”? coo”

Na,CO, a

> —ừ (+ Ø” ` &© oxidation half-reaction

HO OH = PpH=10 R! R? © OH

Antioxidant R' R? R? = OH or O Oxidized phenolic

(Phenolic compound) compound

eee M = Mo or W

(+6) — (+5) (+6)

3 >

2([PM 12040] +67) ~ 2IPM,MạO,}? ¢=> reduction half-reaction

F-C reagent (oxidant) (from antioxidant) reduced F-C reagent

Hình 2.7 Phán zng oxy hóa khứ cøa F-C với phenolic[7]

Khi đó, phenolic tác dụng với NaaCO2 sẽ tạo ra electron giải phóng ra từ gốc carboxyl của nó, sau đó gốc này sẽ thay đôi F-C từ vàng sang xanh, lượng phenolic cảng cao thì màu xanh cảng đậm

Gallic acid cũng là một phenolic, do đó từ chất này với các nồng độ khác nhau có thể dùng đề lập ra đường chuân định lượng polyphenol

CHUONG3 QUY TRINH TACH CHIET, THU NHAN HOP

CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CAM THÁO

3.1 Sơ đồ quy trình

Cam thảo

EtOH (10 mL)

12

Hinh 3.7 Phan dich chiết cam thao

Phần bã đó được dùng để chiết lại bằng cach thém 10 mL EtOH 70%, siéu

âm 10 phút rồi ly tâm Tiếp đó thực hiện lại thêm một lần nữa bằng cách thêm 5 mL,

EtOH 70% siêu âm 10 phút rồi ly tâm Phần bã cuối cùng đó thì mang đi bỏ, còn

phần dịch chiết thì thu lại, định mức tông dịch chiết lên 25 mL

Hình 3.6 Dich chiết cam táo

— Ông 2: Hút l mL dịch chiết, thêm 2 giọt chi acetate 10 %

— Ong 3: déi chimg bang EtOH 70%

Tir day cho thay két qua

Hình 4.1 Hinh anh két qud dinh tinh hop ch

tr nhiên có trong cam thđo

Ở ông I: có màu xanh đen, điều này chứng tỏ rắng có sự xuât hiện của phenolic

Ở ông 2: có sự xuất hiện của kết tủa, chứng tỏ cũng có sự hiện diện của

14

phenolic

Dinh tinh Cyanidin:

Tiếp đến, thực hiện phản ứng Cyanidin trên vòng y-pyrone (phản ứng Shinoda) để xem xét phenolic đã định tính trước đó có phải là Cyanidin hay không

Hut lay 1 mL dich chiết cho vào ống nghiệm có sẵn ít bột Mg (khoảng 0,5 g), Thêm từ từ vào thành ống nghiệm 0,5 đến 1 mL HCI đậm đặc, quan sát sự chuyển mau cua dung dich

Lưu ý: Vì đây là thí nghiệm với acid đậm đặc, cần phải mang găng tay, làm việc trong tủ hút có kính bảo vệ, thực hiện cần thận

Hình 4.2 7rzóc và sau khi thực hiện ph¿n zng Shinod

15

Từ đây cho thấy, flavone đã phản ứng với Hydrogen tự do và tạo thành anthocyanidin

4.1.2 Dinh tinh saponin (foaming test)

Hut lay 1 mL dich cho vao éng falcon 15mL có nắp, trong đó có sẵn 10 mL nước cất, lắc mạnh thèo chiều thắng đứng của ông nghiệm trong 1 phut dé quan sat

16

Khi vừa mới lắc lên, bọt dân lên rất cao, sau 15 phút thì cho thấy lớp bọt vẫn

còn khá dày, và sau 30 phút, 60 phút, lớp bọt vẫn còn

Từ đây có thê thấy, trong chế phâm có chứa nhiều saponin

4.2 Định lượng hàm lượng phenolic có trong cam thảo

4.2.1 Dựng đường chuẩn Gallic acid

Đường chuân acid gallic được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 10 đến 50 mg/L.Trong bài này, sử dụng đường chuẩn cho sẵn như sau:

Hình 4.4 Duong chudn phenolic

4.2.2 Thao tac thực hiện

— Mẫu thí nghiệm pha loãng 25 lần bằng bình định mức, sau do lay | mL dich

cho vào falcon

— Mẫu trắng sử dụng EtOH 70%

— Sau đó, bọc giấy bạc cho ống nghiệm để thực hiện phản ứng trong tối thực

hiện bô sung 5 mL F-C 10% và lắc đều, giữ 5 phút

— Tiếp đến, bố sung 4 mL Na2CO3 7,5% vào mỗi ống nghiệm và giữ trong 60

phút

— Cuối cùng, thu và đo OD tại bước sóng 760 nm

17

Hinh 4.5 Thue hién dinh leong phenolic

4.2.3 Két qua thu dugc

Kết quả khi đo OD của mẫu là 0,597 và mẫu đối chứng là 0,067

Hình 4.6 Ket qud do OD cia mau và máu trắng

Từ đây có thể suy ra:

AOD = 0,599 — 0,065 = 0,534 Ham lượng phenolic dựa trên đường chuẩn là:

_ AOD — 0,0065 00161 = 32,764 (mg/mL)