Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG

TRẦN THÚY HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ DƯỢC CHẤT

NHÓM KHÁNG HISTAMIN VÀ ĐIỀU TRỊ TĂNG HẠ HUYẾT ÁP TRỘN TRÁI PHÉP

Chuyên ngành : KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Công trình được hoàn thành tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương Trường Đại học Dược Hà Nội

Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh TS Trần Thị Hồng Anh

Vào hồi……… giờ …… ngày …… tháng …… năm……

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1 Tính cấp thiết của luận án

Xu hướng chọn sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên để phòng, hỗ trợ và điều trị bệnh ngày càng được ưa chuộng Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến khoảng 80% dân số thế giới sử dụng thuốc dược liệu và 170 trong số 194 quốc gia thành viên của WHO có báo cáo việc sử dụng thuốc dược liệu trong chăm sóc sức khỏe Tuy nhiên, một tỷ lệ chế phẩm đang lưu hành trên thị trường đã bị trộn trái phép một số loại thuốc hóa dược nhằm cải thiện tác dụng và rút ngắn thời gian điều trị Theo các nghiên cứu đã công bố thì hầu hết các nhóm tác dụng dược lý của thuốc hóa dược đều phát hiện có trộn không khai báo trong các chế phẩm chứa dược liệu

Việc trộn dược chất không khai báo vào chế phẩm chứa dược liệu là bất hợp pháp, gian lận thương mại, ngụy tạo tác dụng Hậu quả là gây ra nhiều trường hợp biến chứng nghiêm trọng do không kiểm soát được liều lượng và thời gian tác dụng của thuốc Chính vì vậy, yêu cầu có bộ công cụ hữu hiệu xác định các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng sản phẩm là rất cấp thiết

Chế phẩm chứa dược liệu có thành phần đa dạng, phức tạp, lượng chất phân tích trong mẫu nhỏ nên phương pháp phân tích phải có độ chọn lọc, độ nhạy, độ chính xác cao Nhóm phương pháp sắc ký từ đơn giản là sắc ký lớp mỏng (TLC), phương pháp thường quy là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV đến phương pháp được coi là qui chiếu: Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) - đáp ứng được yêu cầu kỹ thuật, cho phép phân tích số lượng mẫu lớn với thời gian phân tích phù hợp sẽ là lựa chọn tối ưu Nghiên cứu phát triển phương pháp sẽ là tiền đề quan trọng để thực hiện phân tích xác định sự có mặt các thuốc hóa dược trong các chế chứa dược liệu đang lưu hành trên thị trường

Do vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu” được thực hiện

2 Mục tiêu của luận án

- Xây dựng được qui trình định tính và/ hoặc định lượng đồng thời các thuốc kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) trộn trong chế phẩm từ dược liệu bằng HPTLC, HPLC và LC-MS/MS

- Xây dựng được qui trình định tính và/ hoặc định lượng đồng thời các thuốc điều trị tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trộn trong chế phẩm từ dược liệu bằng HPTLC, HPLC và LC-MS/MS

- Áp dụng các qui trình đã xây dựng để đánh giá sơ bộ thực trạng trộn trái phép các nhóm dược chất trên trong một số dạng chế phẩm chứa dược liệu có ở Việt Nam

3 Những đóng góp mới của luận án

+ Luận án là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xây dựng được 2 phương pháp HPTLC: 1) Định tính đồng thời 5 dược chất kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) trên nền mẫu chứa dược liệu dạng cao lỏng và cao khô chứa 18 dược liệu sử dụng trong điều trị, hỗ trợ điều điều trị cảm cúm, dị ứng, mẩn ngứa, và 2) Định tính đồng thời 4 dược chất điều trị tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trên nền mẫu chứa dược liệu dạng cao lỏng và cao khô chứa 14 dược liệu sử dụng trong điều trị, hỗ trợ điều điều trị cao huyết áp Các phương pháp nhanh, đơn giản, có khả năng sàng lọc tốt trong phân tích phát hiện các chất nghiên cứu trong mẫu chế phẩm chứa dược liệu lưu hành trên thị trường

+ Nghiên cứu đã xây dựng được qui trình: Định tính, định lượng đồng thời 5 thuốc kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) trên nền mẫu chứa dược liệu dạng cao lỏng và cao khô chứa 18 dược liệu sử dụng trong điều trị, hỗ trợ điều điều trị cảm cúm, dị ứng, mẩn ngứa bằng HPLC và LC-MS/MS

Định tính, định lượng đồng thời 4 dược chất điều trị tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trên nền mẫu chứa dược liệu dạng cao lỏng và cao khô chứa 14 dược liệu sử dụng trong điều trị, hỗ trợ điều điều trị cao huyết áp bằng HPLC và LC-MS/MS

Các phương pháp có độ chọn lọc cao, độ đúng, độ chính xác đảm bảo, độ nhạy phù hợp Các qui trình phân tích này đã được đánh giá tại phòng thí nghiệm độc lập đúng chức năng và đạt chuẩn mực ISO IEC 17025 nên các qui trình này có thể ứng dụng phát hiện và xác định hàm lượng các chất nghiên cứu trong mẫu chế phẩm chứa dược liệu lưu hành trên thị trường phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng

+ Luận án đã ứng dụng các qui trình đã xây dựng để trong phân tích các mẫu thực đang lưu hành trên thị trường, kết quả đã chứng minh tính khoa học và khả thi của phương pháp/ qui trình trong thực tiễn kiểm nghiệm Trong nghiên cứu, đã phát hiện 12/55 mẫu chế phẩm chứa dược liệu sử dụng điều trị, hỗ trợ điều điều trị cảm cúm, dị ứng, mẩn ngứa dương tính với các chất nghiên cứu thuộc nhóm thuốc kháng histamin; nhưng chưa phát hiện được mẫu dương tính với 4 dược chất điều trị tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trong 56 mẫu chế phẩm chứa dược liệu sử dụng điều trị, hỗ trợ điều điều trị cao huyết áp Do đó, cần phải tăng cường quản lý và kiểm tra chất lượng đối với các chế phẩm chứa dược liệu lưu hành trên thị trường và nâng cao nhận thức của người tiêu dùng để đảm bảo an toàn cho khi sử dụng các chế phẩm này

+ Đã xây dựng được công thức thành phần và bào chế ra 2 nền mẫu chứa dược liệu dạng lỏng và dạng rắn dựa trên các bài thuốc cổ truyền, các nghiên cứu khoa học, các chế phẩm có thị phần lớn trên thị trường có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm hoặc cao huyết áp Hoàn toàn có thể sử dụng 2 nền mẫu này trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích cho các dược chất có tác dụng dược lý tương tự

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 146 trang, 44 bảng, 44 hình, 97 tài liệu tham khảo Bố cục gồm: Đặt vấn đề (3 trang); tổng quan (29 trang); nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (15 trang); kết quả nghiên cứu (78 trang); bàn luận (17 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang); tài liệu tham khảo (8 trang); phụ lục (145 trang); danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang)

B NỘI DUNG LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Phần tổng quan trình bày các nội dung: - Khái quát chung về tình hình thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu trên thế giới và Việt Nam;

- Cấu trúc, tính chất lý hóa, tác dụng dược lý, tác dụng phụ của 9 dược chất nghiên cứu (Tổng quan về đối tượng nghiên cứu);

- Tổng quan các phương pháp nghiên cứu gồm HPTLC, HPLC và LC-MS/MS Đồng thời, tóm tắt các công bố ứng dụng các phương pháp này trong phát hiện dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp và kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

- Khái quát về các dược liệu và chế phẩm từ dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, cao huyết áp để làm cơ sở chế tạo nền mẫu nghiên cứu (Tổng quan về nền mẫu nghiên cứu)

* Hầu hết các nghiên cứu phân tích đồng thời nhiều dược chất điều trị tăng huyết áp hay kháng histamin đã công bố đều là các nghiên cứu của các nhà khoa học quốc tế, sử dụng các phương pháp sắc ký với kỹ thuật phân tích hiện đại như Q-TOF, LC-MS/MS và được xây dựng dựa trên nền mẫu của 1 sản phẩm cụ thể Từ tổng quan, đưa ra định hướng nghiên cứu là kế thừa các kết quả đã được công bố, khảo sát tối ứu hóa các qui trình phân tích trong điều kiện thực tế, mở rộng đối tượng áp dụng, xây dựng và phát triển một hệ thống các phương pháp từ sàng lọc nhanh bằng phương pháp đơn giản (TLC) đến định lượng các chất phát hiện được bằng phương pháp chính xác hơn sau khi đã được sàng lọc (HPLC; LC-MS/MS)

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị

2.1.2 Trang thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Agilent 6460 Triple Quad MS/MS, Mỹ Hệ thống HPLC Shimazu 20AD với detector UV-PDA, Nhật Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695 detector PDA, Mỹ Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ)

LC-Các trang thiết bị, dụng cụ khác của phòng thí nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Trường Đại học Dược Hà Nội; Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thử: 111 mẫu thuốc dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe

(TPBVSK) gồm: 56 chế phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh cao huyết áp (HA); 55 chế phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh dị ứng (DU), mẩn ngứa, cảm cúm đang lưu hành tại Việt Nam

- Mẫu nền: 2 nền mẫu có thành phần (bao gồm 14 loại dược liệu)

dựa trên các bài thuốc cổ truyền điều trị tăng huyết áp dạng rắn HA.N1 và dạng lỏng HA.N2; 2 nền mẫu có thành phần (bao gồm 18 loại dược liệu) dựa trên các bài thuốc cổ truyền chống dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm dạng rắn DU.N1 và dạng lỏng DU.N2

- Mẫu tự tạo: Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ

lệ nhất định

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Xây dựng thành phần và bào chế nền mẫu áp dụng trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

- Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC định tính; phương pháp HPLC và LC-MS/MS định tính và định lượng đồng thời các dược chất điều trị tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC định tính; phương pháp HPLC và LC-MS/MS định tính và định lượng đồng thời các dược chất kháng histamin (clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinarizin, promethazin) trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

- Đánh giá phương pháp phân tích tại phòng thí nghiệm độc lập - Áp dụng các qui trình đã xây dựng để kiểm tra phát hiện các dược chất nghiên cứu trong một số chế phẩm chứa dược liệu đang lưu hành tại Việt Nam

2.3.1 Xây dựng và bào chế nền mẫu

Thành phần nền mẫu đông dược dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, “Danh mục thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền, thuốc dược liệu thiết yếu” được ban hành kèm theo Thông tư số 19/2018/TT-BYT và “Danh mục thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và vị thuốc y học cổ truyền” ban hành kèm theo Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT; các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu đã công bố và các chế phẩm chứa dược liệu có thị phần lớn đang lưu hành trên thị trường

Các dược liệu trong mỗi thành phần công thức được bào chế thành dạng cao khô (Nền dạng rắn: Mẫu nền N1) và cao lỏng (dạng lỏng: Mẫu nền N2) theo hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam (DĐVN)

2.3.2 Xây dựng qui trình định tính bằng HPTLC

2.3.2.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chất chuẩn

2.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Sử dụng bản mỏng

Silica gel 60 F254, pha động tùy thuộc vào từng nhóm hoạt chất Khảo sát và lựa chọn điều kiện tách riêng các chất, vết gọn, rõ nét, phổ trùng với phổ chuẩn để định tính

2.3.2.3 Xử lý mẫu: Khảo sát các dung môi chiết khác nhau, lựa chọn

dung môi chiết cho hiệu suất cao, ổn định

2.3.2.4 Thẩm định phương pháp: Tiến hành thẩm định phương pháp

trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Độ chọn lọc (Độ đặc hiệu) và LOD

2.3.3 Xây dựng qui trình định tính, định lượng bằng HPLC

2.3.3.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chất chuẩn

2.3.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Sử dụng cột tách C18

(250  4,6 mm; 5 µm) pha động tùy thuộc vào từng nhóm hoạt chất Lựa chọn điều kiện tách riêng các chất, pic gọn, cân đối, phổ trùng với phổ chuẩn

2.3.3.3 Xử lý mẫu: Khảo sát các dung môi chiết khác nhau, lựa chọn

dung môi chiết cho hiệu suất cao, ổn định, giảm nhiễu của nền mẫu

2.3.3.4 Thẩm định phương pháp: Tiến hành thẩm định phương pháp

trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ, độ đúng, độ chính xác (trong ngày và khác ngày)

2.3.4 Xây dựng qui trình định tính, định lượng bằng LC-MS/MS

2.3.4.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chất chuẩn

2.3.4.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích:

- Điều kiện khối phổ: Khảo sát điều kiện khối phổ (MS) dựa trên tính năng Optimizer của thiết bị để lựa chọn chế độ ion hóa, năng lượng bắn phá, điều kiện phân mảnh ion mẹ và các ion con

- Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký, pha động, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện các chất nghiên cứu ở nồng độ ppb, sắc đồ rõ ràng, thời gian phân tích không quá dài

2.3.4.3 Xử lý mẫu: Đánh giá khả năng chiết các chất bằng các dung

môi chiết khác nhau, lựa chọn dung môi chiết cho hiệu suất cao, ổn định

2.3.4.4 Thẩm định phương pháp: Tiến hành thẩm định phương pháp

trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ, độ đúng, độ chính xác (trong ngày và khác ngày)

2.3.5 Ứng dụng các phương pháp xây dựng phân tích mẫu thực

2.3.5.1 Xử lý mẫu: Mẫu thử được đồng nhất mẫu, cân và xử lý như

qui trình xử lý mẫu đã xây dựng đối với mỗi nhóm chất

2.3.5.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn

hoặc dung dịch chuẩn đối với mỗi nhóm dược chất và mỗi phương pháp;

2.3.5.3 Tiến hành sắc ký: Sắc ký mẫu thử, mẫu chuẩn theo phương

pháp đã xây dựng

2.3.5.4 Đánh giá kết quả về định tính:

- Phương pháp HPTLC: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm

và/ hoặc 254 nm, so sánh Rf và màu sắc của vết trên sắc ký đồ (SKĐ) mẫu thử với mẫu chuẩn làm song song Nếu phát hiện vết có Rf trùng với Rf của chất chuẩn, quét phổ các vết tương ứng, chồng phổ với phổ

chất chuẩn xác định hệ số match để khẳng định kết quả (hệ số match > 0,99)

- Phương pháp HPLC: So sánh thời gian lưu, hệ số chồng phổ của

pic trong mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng hoặc nghi ngờ sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử

- Phương pháp LC-MS/MS: So sánh thời gian lưu, mảnh mẹ, hai

mảnh ion con, tỷ lệ cường độ hai mảnh ion con định tính và định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass) hoặc nghi ngờ (fail) sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử

2.3.5.5 Đánh giá kết quả về định lượng

Tính nồng độ các chất phân tích (nếu có) trong dung dịch mẫu thực dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính tương ứng của các chất

phân tích được thiết lập trong cùng ngày phân tích Từ nồng độ các

chất phân tích (nếu có) trong dịch chiết mẫu thử, tính hàm lượng chất phân tích trong mẫu thực ban đầu dựa vào khối lượng cân và hệ số pha loãng sau quá trình xử lý mẫu

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu được phân tích và xử lý bằng phần mềm có sẵn trong thiết bị HPTLC, HPLC và LC-MS/MS, thu được các thông số dùng trong định tính, định lượng như thời gian lưu, diện tích pic, phổ UV, mảnh phổ

Sử dụng các các phép thống kê trong phân tích bằng Microsoft Office Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng và bào chế nền mẫu

3.1.1 Xây dựng công thức nền mẫu

- Nghiên cứu đã xây dựng thành phần công thức gồm 14 dược liệu có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu

- Đồng thời, nghiên cứu đã xây dựng thành phần công thức gồm 18 dược liệu có tác dụng trị chứng dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm

3.1.2 Bào chế nền mẫu

Áp dụng hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam điều chế được nền cao khô (N1) và cao lỏng (N2), tương ứng với nền mẫu điều chế từ dược liệu có tác dụng điều trị tăng huyết áp là HA.N1 và HA.N2; nền mẫu

điều chế từ dược liệu có tác dụng trị chứng dị ứng, cảm cúm, mẩn ngứa là DU.N1 và DU.N2

3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

3.2.1 Phương pháp HPTLC

- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Từ kết quả khảo sát, đã lựa

chọn được điều kiện sắc ký là bản mỏng Silica gel 60 F254; thể tích chấm 10 µL; hệ dung môi (ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac) (1,5:9:3:0,3); bước sóng phát hiện: 254 nm với NIF, FUR; 366 nm với AML và FEL cho kết quả tách tốt cả 4 chất phân tích trên cả 2 nền HA.N1 và HA.N2

- Xử lý mẫu: Mẫu thử được xử lý bằng cách cân chính xác khoảng 0,50

g đối với mẫu rắn hoặc 1,00 g mẫu lỏng vào ống falcon Thêm chính xác 10,0 mL methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc có kích cỡ lỗ lọc 0,45 µm

- Thẩm định qui trình: Kết quả cho thấy phương pháo có độ đặc hiệu

cao với Rf của FUR, AML, NIF, FEL lần lượt 0,10; 0,29; 0,47; 0,55 Phổ UV-VIS của các vết sắc ký thu được cho hệ số phù hợp đều đạt > 0,99 Giới hạn phát hiện (LOD) của các chất từ 0,10 - 0,20 µg/vết tương ứng 0,10 - 0,40 mg/g mẫu

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ở bước sóng 254 nm (a); 366 nm (b); Kết quả chồng phổ hấp thụ tại

vị trí tương ứng với vết của FUR trên sắc ký đồ mẫu nền HA.N1

thêm chuẩn và chuẩn (c)

3.2.2 Phương pháp HPLC

- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Từ kết quả khảo sát đã lựa

chọn được điều kiện sắc ký là cột tách Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); pha động gồm: Kênh A (Dung dịch acid phosphoric 0,1%) và kênh B (Acetonitril) với chương trình gradient: 0 → 10 phút: 30% B; 10 → 20 phút: 30 → 60% B; 20 → 32 phút: 60% B; 32 → 33 phút: 60 → 30% B; 33 → 38 phút: 30% B; tốc độ dòng: 1,0 mL/phút; thể tích tiêm mẫu: 10 µL; bước sóng phát hiện: 238 nm Các chất phân tích được tách riêng biệt, pic gọn, cân xứng

- Xử lý mẫu: Điều kiện xử lý mẫu được lựa chọn cho hiệu suất chiết

cao, ổn định Cụ thể như sau: Cân chính xác khoảng 1,00 g mẫu vào ống falcon Thêm khoảng 20 mL methanol Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 25 mL, tráng ống 2 lần, mỗi lần với khoảng 2 mL methanol, tập trung dịch rửa vào bình định mức, thêm methanol tới vạch Lắc đều Chuyển khoảng 10 mL hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Thẩm định phương pháp phân tích: Kết quả cho thấy phương pháp

có độ chọn lọc cao với RT của FUR, AML, NIF, FEL lần lượt là 10,344; 16,019; 19,077; 26,300 phút Phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 7,5 µg/g và 62,5 µg/g ở cả 2 nền mẫu,các chất nghiên cứu có tương quan chặt chẽ giữa tín hiệu thu được và nồng độ chất phân tích (R2 > 0,99), độ chính xác và độ thu hồi đáp ứng yêu cầu AOAC 2016

(a) (b)

Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC xác định LOQ các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trên nền mẫu HA.N1 (a); mẫu nền HA.N2 (b)

3.2.3 Phương pháp LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Sử dụng tính năng optimizer của thiết

bị xác định được điều kiện MS để phân tích 4 chất nghiên cứu là nguồn ion hóa ESI (+); mảnh khối lựa chọn (ion mẹ→ ion định lượng*/ion