Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Sàng lọc các hoạt chất có khả năng ức chế Enzyme α-Glucosidase từ một số thực vật

NHIEM VU LUAN VAN:e Điều chế cao tong cua năm loài thực vat khảo sát va cao bộ phán cua cây có hoạt tính ức chế enzyme a-glucoasidase tốt nhát.e So sánh và đánh giá cao tong và cao bộ ph

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

BK

4 TP.HCM

TRAN GIANG SƠN

SÀNG LỌC CÁC HOẠT CHÁT CÓ KHẢNANG UC CHE ENZYME ơ-GLUCOSIDASE

TU MOT SO THUC VAT

Chuyên ngành: Ky thuật Hóa hocMã số: 60 52 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 07 năm 2016

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học ¢o cceecccccssssescecscscsssscssecscsesssssecscsessessessesees

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận Xét Ì : s62 ESESEEESESEEeESESESESEEserkekreree

(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận Xét 2 : - s+EE9E2E SE EESEEESESEEESESESESkEsErkrkreree

(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQGTp HCM ngày tháng năm

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đông cham bảo vệ luận vănthạc si)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lýchuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯƠNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập — Tự Do — Hạnh Phúc

NHIEM VỤ LUẬN VAN THAC SĨ

Họ và tên học viên: Trần Giang Sơn MSHV: 7140197Ngày, tháng, năm sinh: 27/09/1988 Nơi sinh: An GiangChuyên ngành: Kĩ thuật hóa học Mã số: 60520301

I TÊN DE TÀI: SANG LOC CÁC HOẠT CHAT CÓ KHẢ NANG ỨC CHEENZY ME a-GLUCOSIDASE TỪ MOT SỐ THỰC VAT

NHIEM VU LUAN VAN:e Điều chế cao tong cua năm loài thực vat khảo sát va cao bộ phán cua cây

có hoạt tính ức chế enzyme a-glucoasidase tốt nhát.e So sánh và đánh giá cao tong và cao bộ phận.e Định lượng polyphenol tông của các cao bằng phương pháp Folin-

Ciocalteau.e Khảo sát và so sánh họat tinh ức chế enzyme a-glucosidase của các cao.e Thứ nghiệm ba hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm và kháng khuẩn.e Tối wu quy trình chiết của cây cho kết quả ức chế ezyme tốt nhất

Il NGÀY GIAO NHIỆM VU:

Ill NGAY HOÀN THÀNH NHIEM VU:

IV CAN BO HUONG DAN: TS Hà Cam Anh và PGS.TS Lê Thi Hồng Nhan

Nội dung nghiên cứu và dé cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội dồng ChuyênNgành thông qua.

Tp HCM, ngày 25 tháng 07 năm 2016

CAN BO HƯỚNG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Họ tên và chữ ky) (Họ tên và chữ ký)

TS HA CÁMANH PGS.TS.LÊ THỊ HONG NHAN PGS.TS LE THỊ HỎNG NHAN

TRƯỞNG KHOA(Họ tên và chữ ký)

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô trong trườngĐại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM đã tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt thờigian theo học tại trường.

Đặc biệt, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:- Giảng viên hướng dẫn PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan và TS Hà Cam Anh đãhướng dẫn tôi nhiệt tình về nội dung nghiên cứu và động viên tinh than, truyền đạtnhiều kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận văn này

- Cô Huỳnh Thư va thầy Lê Xuân Tiến đã cho tôi những ý kiến đóng góp rất quý

ardgia.

- Quy thay cô khoa Kỹ thuật Hóa hoc nói chung va bộ môn Kỹ thuật Hữu co nóiriêng đã truyền đạt kiến thức chuyên ngành Đây là nên tảng vững chắc để tôi hoànthành luận văn cũng là hành trang kiến thức cho con đường lập nghiệp sau này

- Quý thầy cô bộ môn Sinh hóa, khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học, TrườngĐại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị chotôi để thực hiện đề tài này

- Chị Diễm, các em Khoa, Khải, Tiên, các em lớp HCIIHD, HCIICHC, HCI1ISH

và các bạn trường Đại học Tôn Đức Thắng đã luôn bên cạnh, chia sẻ giúp đỡ tôi trongquá trình học tập và thực hiện luận văn.

- Cha mẹ và mọi người trong gia đình luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc, giúptôi có thêm nghị lực vượt qua khó khăn trong suốt quãng thời gian học tập xa nhà

Mặc dù tôi đã cô găng rất nhiều để hoàn thiện luận văn nhưng không thé tránhkhỏi những thiếu sót Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của thầy côvà các bạn Tôi xin chân thành cảm ơn.

Xin kính chúc tất cả các thầy cô và các bạn những lời chúc tốt đẹp nhất!

Trần Giang Sơn

TOM TAT LUẬN VĂN

Sang loc khả năng ức chế enzyme a-glucosidase in vitro từ năm loài thực vật thuhái ở An Giang (diệp ha châu đắng, cây bình bát, dây bình bát, nghề, rau trai) đã pháthiện cây diệp ha châu đắng có hoạt tính mạnh nhất với ICso là 4,35 ug/mL, thấp hơn1,6 lần so với chứng dương acarbose Khảo sát tiếp trên các bộ phận rễ, thân cành, lá,quả của cây diệp hạ châu đăng, lá cho kha năng ức chế enzyme a-glucosidase mạnhnhất với ICso là 1,01 ug/mL Ngoài ra, cây diệp hạ châu đăng có ham lượngpolyphenol cao, khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn tốt

Khảo sát quy trình chiết nguyên liệu toan cây diệp hạ châu đắng với dung môi lànước được kết quả: chiết ở nhiệt độ 65°C, trong thời gian 2h với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu khô là 20:1 cho cao có hiệu quả ức chế enzyme a-glucosidase tốt nhất,với ICso là 9,26 hg/mL.

Kết quả trên cho thấy, diép hạ chau dang là loài thực vat có kha năng điều trị bệnh

đái tháo đường và ngăn ngừa các biên chứng của đái tháo đường đây triên vọng.

Five herbs that are commonly used in An Giang were selected to determine theirtotal phenolic content and in vitro potential inhibition against a-gucosidase Thehighest phenolic content (TPE = 128,83 mg/g) and the strongest potential inhibition ofa-gucosidase (ICzo= 4,35 ug/mL) were observed in the Phyllanthus amarus Schum etThonn (P.amarus) Among the different parts of P.amarus, leaf shows the highest a-gucosidase inhibiton, with ICs value of 1,01 ug/mL.

Besides, the aquaous ethanol extraction of whole plant and leaf of P.amarus alsoshow the hight antioxidant, anti-inflamamtory and anti-bacterium activities.

Extraction from P.amurus using aqueous was optimized for yield and gucosidase inhibiton activity As the results, the best extraction was found at the

d-temperture of 65°C for 2h, with solvent and material ratio of 20:1.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sô liệu, kêt quả nêutrong luận văn là trung thực và chưa từng có ai công bô trong bat ky công trình naokhác.

Thành pho Hô Chi Minh, ngày 17 tháng 06 năm 2016

Trần Giang Sơn

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

TOM TAT LUẬN VĂN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤCDANH MỤC BANG BIEU

1.1.4 Các biến chứng của bệnh DTD tuýp 21.1.5 Các phương pháp điều trị bệnh DTD tuýp 2

1.2 DIEU TRI BỆNH DTD TUÝP 2 BANG THUC VAT1.2.1 Phương pháp ức chế enzyme ơ-gucosidase

1.2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây1.2.3 Các hoạt tính của thực vật hỗ trợ ngăn ngừa các biến chứng củabệnh DTD tuýp 2

1.3 CÁC LOÀI THUC VAT KHAO SÁT

1.3.1 Cây diệp hạ châu dang (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)1.3.2 Cay bình bat (Annona reticulate L.)

1.3.3 Day bình bat (Coccinia grandis (L) Voigt)1.3.4 Cây nghề (Polygonum pulchrum BI.)1.3.5 Cay rau trai (Commelina communis)

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 18

2.1 MỤC TIỂU, DOI TƯỢNG VA NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 182.1.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu 182.1.2 Nội dung nghiên cứu 182.2 HOA CHAT VÀ THIẾT BỊ 192.2.1 Hóa chất 192.2.2 Dung cu 192.3 PHUONG PHAP NGHIEN CUU 202.3.1 Phương pháp đo độ âm 202.3.2 Phương pháp xác định độ tro toàn phần 202.3.3 Định lượng polyphenol tổng theo phương pháp Folin — Ciocalteau 202.3.4 Đánh giá hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase in vitro 222.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH 252.3.6 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 262.3.7 Khảo sát hoạt tính kháng viêm 27

2.4 NOI DUNG THỰC NGHIEM 28

2.4.1 Sang lọc khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của năm loài thựcvật 28

2.4.2 Sang lọc hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidaseva khả năng ngănngừa biến chứng của DTD tuýp 2 của cây có hoạt tính mạnh nhất 29

2.4.3 Nghiên cứu quy trình chiết 29

CHUONG 3 KET QUA VA BAN LUẬN 31

3.1 SANG LOC KHẢ NĂNG UC CHE ENZYME 1 a-GLUOSIDASE

CUA NAM LOAI THUC VAT 31

3.1.1 Chuẩn bị va đánh giá nguyên liệu 313.1.2 Hiéu suat chiét 333.1.3 Ham lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme a-ølucosidase 34

vi

3.2 SANG LOC KHẢ NANG UC CHE ENZYME a-GLUOSIDASE

VÀ NGAN NGUA BIEN CHUNG CUA DTD TUYP 2 CUA CAY DHCDAN GIANG

3.2.1 Chuan bị va đánh giá nguyên liệu3.2.2 Hiệu suất chiết

3.2.3 Hàm lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme ølucosidase

a-3.2.4 Khảo sát các hoạt tính hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD tuýp 23.2.5 So sánh và đánh giá

3.3 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIET CAO TONG

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên cao tổng3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên cao tổng3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết lên cao tổng3.3.4 Đánh giá sản phẩm cao tông

CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

3838Al

424549

5152535557

60

62

DANH MUC BANG BIEU

Các loại thuốc điều tri DTD tuýp 2 7

Các nghiên cứu ngoài nước 10

Năm loài thực vật khảo sát 18Tính chat bột nguyên liệu của năm loài thực vật khảo sát 32

Ty lệ các bộ phận của cay DHCD 39Tính chất bột nguyên liệu các bộ phận của cây DHCĐ 4I

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng và cao lá DHCD 46

So sánh hiệu suất thu cao và kha năng sinh học của các bộ phận cây DHCD

49Kết quả thu cao và hoạt tính của cao DHCD ở các quy mô khác nhau 58

Tinh chat cơ ban của cao tong 59

vill

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số thuốc điều trị DTD tuýp 2

Hình 1.2 Công thức hóa học của acid ferulic, acid protocatechuic và epicatechin

Hình 1.3 Năm loài thực vật khảo sát

Hình 2.1 Đường chuẩn của axid galic

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân của p-NPGHình 2.3 Đồ thị độ hấp thu theo bước sóng của para-nitrophenol

Hình 2.4 Phan ứng của gốc tự do DPPHe và chất chống oxy hóa

Hình 2.5 Vị trí các lỗ thạch

Hình 3.1 Hiệu suất thu nguyên liệu khô của năm loài thực vật khảo sát

Hình 3.2 Nguyên liệu tổng của năm loài thực vật khảo sát

Hình 3.3 Hiệu suất chiết cao của năm loai thực vật khảo sát

Hình 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng của năm loài thực vật khảo sát

Hình 3.5 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của các cao thực vật

Hình 3.6 Hiệu suất thu nguyên liệu khô các bộ phận của cây DHCĐ

Hình 3.7 Ty lệ các bộ phận trong cây DHCD

Hình 3.8 Nguyên liệu các bộ phận của cây DHCĐ (khô)Hình 3.9 Hiệu suất thu cao của các bộ phận của cây DHCD

Hình 3.10 Hàm lượng polyphenol tong của các bộ phận cây DHCD

Hình 3.11 Kết quả ức chế enzyme a-glucosidase của các bộ phận cây DHCD

Hình 3.12 Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao tong và cao lá DHCD

Hình 3.13 Kết quả hoạt tinh kháng viêm của cao tổng và cao lá DHCD

Hinh 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên hiệu suất thu cao DHCĐ

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng ức chế enzyme ơ-glucosidase

Hinh 3.16 Ảnh hưởng của thời gian chiết tới hiệu suất chiết cao DHCĐ 54

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên khả năng ức chế enzyme ơ-glucosidase

55Hình 3.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết tới hiệu suất chiết cao DHCĐ 56

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết lên ICso của cao chiết 57

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Giấy xác nhận định danh năm mẫu thực vật khảo sát

Phụ lục 2 Hiệu suất thu nguyên liệu khô của các thực vật được sang lọc từ 1 kgnguyên liệu tươi

Phụ lục 3 Hiệu suất thu cao của năm loài thực vật khảo sát

Phụ lục 4 Hàm lượng polyphenol tổng của các mẫu cao thực vật

Phu lục 5 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao DHCD (toan cây)

Phụ lục 6 Hoạt tinh ức chế enzyme œ-glucosidase của cao dây bình bát

Phụ lục 7 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao cây bình bát

Phụ lục 8 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao cây nghề

Phụ lục 9 Hoạt tinh ức chế enzyme œ-glucosidase của cao rau trai

Phụ lục 10 Hiệu suất thu nguyên liệu khô các bộ phận của cây DHCD từ 3 kg nguyênliệu tươi (không tính phần lá lẫn quả và phân thất thoát)

Phu lục 11 Tỷ lệ các bộ phận của cây DHCD tươi từ 1 kg nguyên liệu

Phu lục 12 Tỷ lệ các bộ phan của cây DHCD khô từ | kg nguyên liệu (không tínhphân thất thoát)

Phụ lục 13 Hiệu suất chiết cao bộ phận của cây DHCĐ

Phụ lục 14 Hàm lượng polyphenol tổng của các bộ phận cây DHCD

Phụ lục 15 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao lá DHCD

Phụ lục 16 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao qua DHCD

Phụ lục 17 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao thân cành DHCD

Phụ lục 18 Hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao rễ DHCD

Phu lục 19 Hoạt tính kháng viêm của cao DHCD (toàn cây)

Phu lục 20 Hoạt tính kháng viêm của cao DHCD (lá)

Phụ lục 21 Hoạt tính kháng viêm của diclofenac

Phụ lục 22 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao DHCD (toàn cây)

Phụ lục 23 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao DHCD (lá)

Phu lục 24 Hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin CPhụ lục 25 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 45°C lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 26 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 55°C lên kha năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 27 Anh hưởng của nhiệt độ chiết 65°C lên kha năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 28 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 75°C lên kha năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 29 Anh hưởng của nhiệt độ chiết 75°C lên kha năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phụ lục 30 Anh hưởng của nhiệt độ chiết lên hiệu suất thu cao DHCD tổng

Phụ lục 31 Ảnh hưởng của thời gian chiết 1h lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 32 Anh hưởng của thời gian chiết 2h lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 33 Anh hưởng của thời gian chiết 3h lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 34 Anh hưởng của thời gian chiết 4h lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phu lục 35 Anh hưởng của thời gian chiết 5h lên khả năng ức chế enzyme của caoDHCD tong

Phụ lục 36 Anh hưởng của thời gian chiết lên hiệu suất thu cao DHCD tổng

Xii

Phụ lục 37.DHCD tong

Phu luc 38.DHCD tong

Phu luc 39.DHCD tong

Phu luc 40.DHCD tong

Phu luc 41.DHCD tong

Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết 10:1 lên khả năng ức chế enzyme của cao

Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết 20:1 lên khả năng ức chế enzyme của cao

Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết 30:1 lên khả năng ức chế enzyme của cao

Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết 40:1 lên khả năng ức chế enzyme của cao

Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết 50:1 lên khả năng ức chế enzyme của cao

Phụ lục 42 Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết lên hiệu suất thu cao DHCĐ tổng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT

DTD: Dai tháo đườngIDF — International Diabetes Federation: Liên đoàn Dai tháo đường Quốc tế

ADA — American Diabetes Association: Hiệp hội Dai tháo đường Mỹ

IL— Interleukin

CRP — C-Reactive ProteinTNF-a —Tumor Necrosis Factor alpha: yếu tố hoại tử khối u œ

AGEs —Advanced Glycation Endproducts: các san phẩm glycate hóa bền vững

XIV

LỜI MỞ ĐẦU

Theo WHO, “Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh Nội tiết và Rối loạn chuyển hóa”,trong đó, bệnh đái tháo đường (DTD) là một căn bệnh mang tính xã hội cao đượcWHO quan tâm hàng đầu trong các chiến lược chăm sóc sức khỏe cộng đồng

DTD là một căn bệnh không lây nhiễm có mức độ nguy hại cao, là nguyên nhân

gây tử vong đứng hàng thứ tư hoặc thứ năm ở các nước đang phát triển Tăng glucosemáu mãn tính trong DTD làm rỗi loạn, suy yếu chức năng các cơ quan nội tạng, là thủ

phạm chính dẫn đến các ton thương mắt, thận, tim mạch, thần kinh DTD va các biến

chứng của nó trở thành gánh nặng kinh tế cho xã hội, người bệnh và gia đình, khi màsố tiền phải chi cho việc phòng chống và điều trị lên đến 26 tỷ USD vào năm 2007, dựkiến con số này sẽ là 47,2 tỷ USD vào năm 2030

Số người mac bệnh DTD gia tăng nhanh chóng mỗi năm Nếu như 20 năm vềtrước số người bị DTD chi là 135 triệu thì bây giờ con số đó đã lên đến 382 triệu, dựđoán vào 20 năm tới toàn thế giới sẽ có 592 triệu người bị DTD Ở Việt Nam, sốngười mắc bệnh DTD chiếm 5/7% dân số vào năm 2014, trong đó DTD tuýp 2 chiếm90 đến 95% số người bệnh

Các phương pháp điều trị bệnh DTD bao gồm: dinh dưỡng, luyện tập và sử dụngthuốc Trên thị trường ngày nay có nhiễu loại thuốc điều trị bệnh DTD tuýp 2 với cáccơ chế khác nhau, nhằm mục tiêu chính là giữ glucose máu ở mức bình thường Cácloại thuốc này cũng tôn tại nhiều hạn chế như: tăng cân, loãng xương hạ đường huyết,rồi loạn tiêu hóa, Hơn nữa, chi phí cho việc điều trị căn bệnh mãn tính này là mộtgánh nặng đối với bệnh nhân, gia đình và xã hội

Sử dụng thao được trong việc điều trị DTD tuýp 2 là một phương án lựa chọn tốtđể thay thế cho các loại thuốc tong hop Nhiéu loai cây co ở Việt Nam đã được sudụng như một loại thuốc trị DTD tuýp 2 từ hàng nghìn năm qua Trong đó, một số loạicây đã được nghiên cứu ở Việt Nam như lá ôi, lá vối, sen, bằng lăng, khổ hoa Không giống như các lại thuốc tong hợp tri DTD theo một co chế cu thé, các loàidược thảo tác dụng theo nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm: tăng sự tiết insulin, tăng độnhạy của insulin, giảm lượng carbonhydrat hap thu bằng cách ức chế enzyme ơ-glucosidase Thuốc từ thao dược thường không có tác dụng hạ đường huyết mạnh

băng thuốc tổng hợp, nhưng chúng chứa nhiều hoạt chất giúp ngăn ngừa các biếnchứng DTD Ngoài ra, các thảo dược có ưu điểm nổi bật là nguồn nguyên liệu déi dao,có thé tìm thay ở nhiều noi, phù hợp với tình hình kinh tế của nhiều người có thu nhậpthấp và trung bình.

Với mục đích nghiên cứu khả năng điều trị bệnh DTD tuýp 2 bang con đường ứcchế enzyme a-glucosidase, chúng tôi tiễn hành dé tài “Sang lọc các hoạt chất có khanăng ức chế enzyme a-glucosidase từ một số thực vật” Từ kết quả sang lọc, loàithực vật có hoạt tính tốt nhất sẽ được chọn làm khảo sát sâu hơn và thử nghiệm cáchoạt tính ngăn ngửa biến chứng của bệnh DTD tuýp 2 Năm loài thực vật được chonlàm khảo sát đều được thu hái ở An Giang, bao gồm: diệp hạ châu đăng, dây bình bát,cây bình bát, cây nghề va cây rau trai Các thực vat này phân bố rộng rãi nhiều nơi(trồng làm rau, mọc hoang nhiều trên các đồng ruộng, hoặc được trông ở các vườnthuốc nam), nên khả năng áp dụng vào thực tiễn của chúng là rất cao, làm giảm sự phụthuộc vào các thuôc tông hợp từ nước ngoài.

1 TONG QUAN

1.1 BENH DAI THAO DUONG

1.1.1 Bénh DTD trén thé gidi va Viét Nam

Bệnh đái tháo đường (DTD) là một trong những bệnh man tính không lây nhiễm

pho biến trên thé giới, là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ tư ở các nước pháttriển Sự phát triển của quá trình đô thị hóa, lỗi sống không lành mạnh, tiêu thụ nhiềuthực phẩm giau năng lượng, ít vận động là nguyên nhân chính làm bệnh DTD giatăng nhanh chóng Khoảng 50% bệnh nhân DTD bị các biến chứng như bệnh mạchvành, tim mach, đột quy, bệnh lý thần kinh do DTD, cắt đoạn chi, suy thận, mù mat, dan dén tan tat va giam tudi tho [1]

DTD là một căn bệnh phức tap và nguy hiểm, là gánh nặng kinh tế của xã hội vagia đình bởi hậu quả nặng nề của bệnh do phát hiện và điều trị muộn Theo số liệu cậpnhật mới nhất của Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International DiabetesFederation — IDF), tỷ lệ dân số bi DTD là 8,8% trong 7.3 tỷ người vào năm 2015, gâyra 5 triệu cái chết và cứ 11 người trưởng thành thì có 1 người mắc bệnh DTD Trongđó, số ca bệnh DTD tuýp 2 chiếm 87 đến 91% bệnh DTD và tập trung nhiều ở cácnước có thu nhập thấp và trung bình Nguy hiểm hon, có đến 46% số người mac bệnhDTD tuýp 2 không nhận thức được bệnh cho đến khi có những biến chứng nghiêm

trọng [2].

Ở Việt Nam, số người mắc bệnh DTD cũng gia tăng nhanh chóng Dựa trên cácnghiên cứu dịch té học được tiến hành trên toàn quốc năm 2012 của bệnh viện Nội tiếtTrung ương, tỷ lệ người bị DTD ở Việt Nam lên đến 5,7%, cao hơn hắn so với con số3,7% ma IDF đưa ra vào năm 2014 [3] Hon nữa, tỷ lệ mắc DTD ở Việt Nam 10 nămqua đã tăng gấp đôi Đây là con số đáng báo động vì trên thế giới, phải trải qua 15năm tỷ lệ mắc DTD mới tăng gấp đôi Trong khi đó, 75,5% số người được hỏi đều cókiến thức rất thấp về bệnh DTD [2-4]

Gánh nặng kinh tế của căn bệnh này mang lại bao gồm chỉ phí điều trị, giảm khảnăng lao động va tàn tật Theo IDF, chi phí dành cho điều trị DTD và các bién chứngcủa nó chiếm khoảng 12% tổng chi phi chăm sóc sức khỏe năm 2015, ước tính 415 tỷ

USD Trong khi đó 77% trường hợp bị DTD tập trung ở các nước có thu nhập thấp vatrung bình [2] Việt Nam nam trong nhóm những quốc gia này, chịu những tác độngxấu từ bệnh DTD, nhiều bệnh nhân va gia đình đang phải chịu những gánh nặng vềkinh tế do chi phí rất lớn dé điều trị DTD.

1.1.2 Định nghĩa và phương pháp chuẩn đoán

PTD là một bệnh rối loạn chuyển hóa do nhiều nguyên nhân Bệnh được đặctrưng bởi tăng glucose máu mãn cùng với những rối loạn chuyển hóa carbohydrate,lipid và protein, do hậu quả của sự suy giảm bài tiết insulin, hoạt động của insulinhoặc kết hợp cả hai [5]

Các phương pháp chan đoán DTD bao gồm: chỉ số glucose máuvà chỉ số HblAc.e Chỉ số đường huyết lúc đói lớn hơn 126 mg/dL, lớn hon 200 mg/dL trong xét

nghiệm dung nạp glucose sau 2h hoặc đường huyết ngẫu nhiên lớn hơn 126mg/dL đi kèm với triệu chứng “4 nhiều” đặc trưng là ăn nhiều, gay nhiều,uống nhiều, tiểu nhiều [5|

e Chỉ số HbAIc (tỷ lệ hồng cầu gan với glucose) lớn hơn 6,5% thành một tiêuchí mới dé chân đoán DTD [6] Nong độ HbA 1c phản ánh chính xác tinh trạngđường huyết của một người trong vòng 2 tháng đến 3 tháng theo tudi thọ củahong cau

DTD tuýp 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90% ca bệnh DTD trên thế giới, thường gặp ởngười trưởng thành trên 40 tuổi [2] Ở bệnh nhân bị DTD tuýp 2, tuyến tụy van sảnxuất insulin, nhưng lượng insulin tiết ra không đủ hoặc tế bào không thé sự dụng

insulin do cơ thé sản xuất ra Bệnh nhân DTD tuýp 2 không nhất thiết phải tiêminsulin, tuy nhiên trong một sô trường hợp cũng can tiêm insulin đề kiêm soát lượngđường huyết DTD tuýp 2 thường được chan đoán rất muộn vì giai đoạn đầu tăngglucose mau tiên triên âm thâm không có triệu chứng Khi có biêu hiện lâm sàngthường kèm theo các rối loạn khác về chuyển hoá, lipid, các biểu hiện bệnh lý về timmach, thần kinh, thận nhiều khi các biến chứng này đã ở mức độ rất nang [9].

DTD thai kì: thường gặp ở phụ nữ có thai, có glucose máu tăng khi có thai lầndau Sự tiến triển của DTD thai kì sau đẻ theo ba kha năng: bị đái tháo đường, giảmdung nap glucose và bình thường Ước tính có khoảng 2 đến 5% thai phụ bị DTD thaikỳ [2.7].

DTD do các nguyên nhân khác như:Khiếm khuyết gene liên quan đến hoạt tính insulin.Các bệnh lý liên quan đến tụy như: viêm tụy, xơ hóa tuy, Các bệnh nội tiết khác như: Acromegal, hội chứng Cushing, bệnh Basedow ĐTĐ do thuốc hay hóa chất như các thuốc điều trị HIV như pentamidine,thuốc kháng viêm nhóm corticoid, thyroid hormone

1.1.4 Các biến chứng của bệnh DTD tuýp 2

Tăng nông độ glucose máu là nguyên nhân chính dẫn tới các biến chứng của DTDtuýp 2 Do bệnh khởi phát âm thầm, nếu không được chan đoán sớm và điều tri kipthời, những biến chứng mạn tính sẽ làm gia tăng mức độ tàn phế và tử vong trên bệnhnhân DTD tuýp 2.

Các biên chứng này có 2 loại: biên chứng cap tính và biên chứng man tính.Biến chứng cấp tinh bao gdm hôn mê do nhiễm ceton máu hoặc do tăng áp lựcthâm thấu, hội chứng tăng thân nhiệt ác tính dẫn tới tiêu cơ vân Các biếnchứng này thường xảy ra đột ngột trong thời ngăn, và rat dé tử vong [10].Các biến chứng mãn tinh được chia thành: bién chứng mach máu nhỏ (gây tổnthương mắt, thận, thần kinh), biến chứng mạch máu lớn (gây các bệnh vềmạch vành, mạch máu ngoại biên và mạch máu não) và biến chứng khôngphải mạch máu (rỗi loạn tiêu hoá, rối loan tình dục, nhiễm trùng và nhữngthay đối ở da) [11, 12]

1.1.5 Các phương pháp điều trị bệnh DTD tuýp 2

Lối sống ít vận động, tiêu thụ nhiều thực phẩm giàu chất béo, là nguyên nhânchính gây ra bệnh DTD tuýp 2, tăng nguy cơ mac các bệnh tim mạch Theo khuyếncáo của IDF, lối sông tích cực bao gôm một chế độ dinh dưỡng hợp lý và tập thé dụcmỗi ngày là biện pháp tốt nhất dé phòng ngừa và điều trị DTD [13] Theo nghiên cứudo Knowler thực hiện cho thay han ché nang luong tiéu thu mỗi ngày kết hợp với tậpthé dục giúp giảm đến 58% tỷ lệ mac bệnh DTD ở những người có nguy cơ cao [14]

Ngoài insulin cho tác dụng hạ đường huyết trực tiếp, các loại thuốc hiện có đượcphân chia thành các nhóm theo các cơ chế khác nhau Cơ chế tác động, các tác dụngphụ cũng như tên và công thức cau tạo các loại thuốc được trình bày trong Bang1.1[15] và Hình 1.1 Mặc dù có rất nhiều thuốc để lựa chọn điều trị DTD tuýp 2 nhưngcần phải cân nhắc giữa lợi ích của việc giảm đường huyết và các tác dụng phụ củathuốc Chọn lựa thuốc cho từng bệnh nhân dựa trên thời gian bệnh, các biến chứng đikèm, các loại thuốc sẵn có và tình trạng kinh tế của bệnh nhân

Các phương pháp mới như phẫu thuật điều chỉnh hình dạng nhằm khôi phụcchức năng đảo tụy, phẫu thuật giảm cân cải thiện tình trang glucose máu, biệt hóa tếbào gốc trở thành tế bào tiết insulin dang được hy vọng sẽ chữa khỏi hoàn toànDTD tuýp 2 Cơ chế tác động vẫn chưa được xác định và còn nhiều tranh cãi về hiệuquả điều trị [16]

Bang 1.1 Các loại thuốc điều tri DTD tuýp 2

Thuốc điệnNhóm Cơ chế tác động Tác dụng phụ

hìnhTăng cân, gây

Biguanide Tăng độ nhạy insulin Metformin (1)

bénh tim mach, Gay bénh tim GlibenclamideSulfonylureas Tang tiét insulin

mạch, gay phù (2) Hạ đường

Glinides Tang tiệt insulin , Nateglinide (3)

huyét, tang canTang can, taoThiazolidine- mỡ, suy tim, có

Tăng độ nhạy insulin ; Pioglitazone (4)diones thé gay ung thu

bang quang„ „ „ „ „ Acarbose (5)

Chat ức chê a- Hạn chê quá trình hâp thu Rôi loạn tiêu

Miglitol (6)

ølucosidase đường trong ruột hóa

Voglibose (7)Chất ức chế Tăng tiết insulin, giảm tiết

Viêm tụy Sitagliptin (8)

1.2 DIEU TRI BỆNH DTD TUYP 2 BẰNG THUC VAT

Mặc dù hiện nay có nhiều loại thuốc tong hop đặc tri DTD, nhưng chúng van cònnhiéu han ché nhu gia thanh cao va nhiều tác dụng phụ như tăng cân, loãng xương,tăng nguy cơ biến chứng tim mạch [15] Các tác dụng phụ có thé trở nên trầm trọnghơn khi sử dụng lâu dài Hơn nữa, chi phí điều trị DTD tuýp 2 và các biến chứng củanó là một con số lớn cho những bệnh nhân kinh niên Vì thế, sử dụng dược thảo có thé

8

là một lựa chọn tốt để thay thế cho các loại thuốc tong hợp hiện nay [17, 18] Sử dungthuốc thảo dược giúp làm giảm các biến chứng của DTD [19] Cho nên, thảo dược cóthé sử dụng dé điều trị hoặc kết hợp với các thuốc phương tây dé hạn chế các biếnchứng cua DTD tuýp 2.

Trong nên y học cổ truyền Việt Nam, có nhiều cây thuốc và phương thuốc đượcsử dụng dé điều trị DTD tuýp 2 Các tác dụng dược lý của thảo dược bao gồm: giảmhấp thu carbonhydart, tăng độ nhạy insulin, tăng sự hấp thu insulin, kích thích tiếtinsulin, kháng oxy hóa, [19] Bởi vì chiết xuất thảo dược chứa nhiều hợp chất khácnhau, nên chúng cũng tác dụng lên cơ thé theo nhiều hướng Các cây này an toàn chocơ thé, có ít hoặc không có tác dụng phụ [17] Hơn nữa, các cây thuốc trị DTD naysinh trưởng trải rộng từ bắc vào nam, giá thành rẻ, là một lựa chọn thích hợp với đa sốbệnh nhân có thu nhập thấp và trung bình hiện nay

Có nhiều công trình ngiên cứu ở Việt Nam đã chứng minh tác dụng hạ đưởnghuyết của các loại thảo dược Việc sử dụng các cây thuốc này có thể giúp làm giảmhoặc chậm sự tăng glucose máu sau ăn trên bệnh nhân [19] Mỗi thảo dược có thểchứa một hoặc nhiều hoạt chất khác nhau có tác dụng hạn chế tăng ølucose máu Hoạtchất bao gồm flavonoid, alkaloid, terpenoid, anthocyanin, glycoside đã được phân lậptừ thực vật [20].

1.2.1 Phương pháp ức chế enzyme a-gucosidase

Phần lớn đường trong khẩu phan ăn hang ngày là polysaccharide Khi vào hệ tiêuhóa, các polysaccharide này trước tiên được chia nhỏ thành oligosaccharide bởienzyme a-amilase trong nước bot và dich tụy Đến ruột non, các oligosaccharide nàytiếp tục bị thủy phân thành các monosaccharide bởi các enzyme a-gucosidase và bịhap thụ ở ruột non [21] Tuy nhiên, khi sử dụng các chất ức chế enzyme a-gucosidase,có thé làm giảm sự thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự hấp thu glucose, vìthé làm giảm lượng đường huyết Các thuốc ức chế enzym a-glucosidase trong điều trịDTD loại 2 được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phậntiêu hóa, tác dụng phụ ít nguy hiểm [22]

1.2.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây

1.2.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, bên cạnh việc sử dụng các thuôc hóa dược trong điều tri DTD, nhiêuloại thảo dược đã được khuyến cáo sử dụng với mục đích hỗ trợ hoặc bồ sung thay thếthuốc điều trị cho bệnh nhân DTD Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 1000 câythực vật đã được ghi nhận có tác dụng trên bệnh nhân DTD Trên thế giới có rất nhiềunghiên cứu về khả năng ức chê enzyme a-glucosidase của các thực vật Bang 1.2 trìnhbày một sô kêt quả nghiên cứu tiêu biêu về hoạt tính này của một sô thực vật cũng cóở Việt Nam.

Bảng 1.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Tên khoa h Dịch chiết

wn eens Cao Tác gia

(Tên tiếng việt) (Bộ phận)

Curcuma longa L Cao Du va cộng su

(Voi)

Taraxacum

officinale(Bồ công anh lùn)

Cao côn 75°

(lá)

Cao côn 75°(trái)

Caomethanol(lá)

Cao nước(thân)

, Wang và cộng sự1,5 mg/mL ức chê 38,3%

(2010) [25]Wang va cOng su407,14 ug/mL

(2012)[26]Liu va cộng sự16,27 mg/mL

(2012) [27]

Mir va cOng su55,50u¢g/mL

(2015)[28]

10

1.2.2.2 Các nghiên cứu trong nướcTrong nước đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc những thực vật có khả năng hạđường huyết trên mô hình in vivo lẫn ức chế enzyme a-glucosidase trên mô hình in

vitro.

Khao sát khả nang ức chế enzyme a-glucosidase cũa 150 loài thực vật của tác giảNguyễn Thị Thanh Mai cho thay 50% số cây có kết quả ICzo<100 g/mL Trong đó,7/16 hoạt chất từ lá cây mít, 7/21 hoạt chất từ lá cây xa kê, 19/27 hoạt chất từ thân câyngũ linh chi, 8/12 hoạt chất từ thân cây núc nát, 6/12 hoạt chất từ cây cỏ sữa lá nhỏ,

10/23 hoạt chất từ vỏ cây mat núi cho hoạt tính tốt Đặc biệt, cây huyết rồng hoa nhỏ

có hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase rất mạnh với giá trị ICso là 0,05 „g/mL [29].Nhóm đã phân lập được ba hợp chất từ cao metanol của cây huyết rồng hoa nhỏ đó làacid ferulic (9), acid protocatechuic (10) và epicatechin (11) với giá tri lCso lần lượt là45 30, 23,04 va > 100 uM [30].

OH

OH OH HO OwHO HO "

MOH

OH

OH

9 10 11

Hình 1.2 Công thức hóa học cua acid ferulic, acid protocatechuic và epicatechin

Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự tiến hành xác định hoạt tính ức chế glucosidasecủa các cao phân đoạn mướp đắng Kết quả khảo sát cho thấy, cao cồn có tác dụng ứcchế mạnh nhất, ICso là 31,25 „g/mL, cao clorofom có tác dụng yếu hon, trong khi caoete petrol không thể hiện hoạt tính [31]

Hà Thị Bích Ngọc và công sự đã khảo sát 24 loài thực vật có khả năng điều trịDTD tuýp 2 trên mô hình in vitro và in vivo Kết qua cho thay có 8 mẫu lá vối, thânvà lá chó đẻ răng cưa, vỏ thân 6i, lá tam gửi trên cây mít, củ chuối hột là phát hiện đầu

tiên ở Việt Nam vẻ hoạt tính ha đường huyết, từ đó cho ra đời thực phẩm chức năng

Thivoda hỗ trợ điều trị DTD tuýp 2 [32]

1.2.3 Các hoạt tính của thực vật hỗ trợ ngăn ngừa các biến chứng của bệnhDTD tuýp 2

1.2.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Sự mat cân băng trong việc tạo các chất hoạt động chứa oxy và nito và hoạt độngcủa các chất chống oxy hóa gây stress oxy hóa Ở người bị DTD, nông độ glucosetrong máu luôn giữ ở mức cao, làm gia tăng sự hình thành các gốc oxy hóa và suy yếuhoạt động của hệ thống chống oxy hóa [33] Tăng glucose máu mãn tinh làm thay đổihoạt động của các cơ quan, kèm theo các quá trình glycat hóa protein khôngenzyme[12], kích hoạt men aldose reductase theo con đường chuyển hóa polyol vàhoạt hóa protein kinase C (PKC) [33], làm gia tăng các biến chứng mãn tính của DTD

Glycat hóa protein không enzyme là sự găn kết của một phân tử glucose với mộtprotein mà không cần enzym Quá trình này tạo ra các gốc oxy hóa và các sản phẩmglycat hóa bền vững (advanced glycation endproducts — AGEs) Glycat hóa albuminlàm xơ hóa cầu thận; glycat hóa myelin protein làm giảm tốc độ dẫn truyền thân kinhgây nên bệnh lý thần kinh ngoại vi; glycat hóa màng tế bào bạch cầu máu đưa đến tình

trang dễ nhiễm trùng trên bệnh nhân DTD [12]

Chuyển hóa glucose theo con đường polyol góp phan gây ra glycat hoá proteinkhông enzym, hoạt hóa men aldose redutase, kéo theo làm giảm nồng độ coenzymeNADPH/ NADF* trong máu [34] Quá trình này hạn chế sự tái sản xuất các chất chongoxy hóa ở tế bào, làm giảm độ linh hoạt của NADP, dẫn đến làm chậm sự chuyển hóaHO; thành H;O Nong độ H,O, tăng không thúc đây sự hình thành DNA, mà ngượclại làm suy thoái tế bào, ảnh hưởng đến chức năng của mô, giảm sự co bóp ở tế bào cơtrơn mạch máu, làm giảm tín hiệu dẫn truyền ngoại vi thần kinh, vì thế gây ra các biếnchứng mạch máu nhỏ và tim mach ở bệnh nhân DTD [35].

Đường huyết tăng làm kích hoạt tong hop diacylglycerol và làm hoạt hóa menPKC PKC bị hoạt hóa làm gia tăng sự sản xuất các yếu tố tăng trưởng, đóng vai tròquan trọng trong biến chứng mạn tính của DTD Yếu tố tăng trưởng nội mạc machmau gia tăng trong bệnh võng mạc tăng sinh do DTD, còn yếu tổ tăng trưởng giốnginsulin gia tăng trong bệnh thận DTD, làm day màng đáy co bản ở cầu thận [12]

12

Ở bệnh nhân DTD, stress oxy hóa có thé không đủ khả năng làm phá hủy mô,nhưng nó gây ton thương bên trong tế bào, có thé làm phá vỡ DNA, gây chết tế bào,làm giảm tính toàn vẹn của mô, suy yếu chức năng mô, khả năng tái tạo và sữa chữacủa mô [33] Stress oxy hóa và sự hình thành các gốc tự do là hậu quả của tăng đườnghuyết, cũng có thé thúc day sự phát triển các biến chứng mạn DTD Do đó việc điềutrị với những chất chống oxy hóa sẽ cải thiện được các biến chứng mãn ở bệnh nhân

DTD.

1.2.3.2 Hoat tinh khang viém

Viêm là một đáp ứng miễn dich tự nhiên của cơ thé, nhăm bảo vệ co thé khỏi sựtan công của các tác nhân ngoại lai hoặc tác nhân bên trong Nhiéu nghiên cứu đã chỉra viêm có liên hệ chặt chẽ đến tình trang kháng insulin và các tính năng trao đối chattrong cơ thé [36, 37] O người bị DTD và béo phì, các mô mỡ tổng hợp và phóng thíchcác cytokine quá mức, đặc biệt là interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) va yếu tốhoại tử khối u œ (tumor necrosis factor alpha — TNF-ơ), gây nên tình trạng khánginsulin [38].

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh viêm (đặc biệt là các cytokine) đóng vaitrò quyết định trong sự phát triển của các bién chứng than kinh và mach máu của bệnhDTD Ở bệnh nhân DTD, sự tăng glucose mãn tính dẫn đến sự rối loạn giải phóng cáccytokine [39] Tăng cường phóng thích TNE-œ làm tăng tính thắm thành mach, ảnhhưởng đến quá trình đông máu, tốn thương dây thần kinh, vì thế gây ra các biến chứngthan kinh của DTD Sự phóng thích IL-6 quá mức gây hại lên hệ thống tim mach, làmtăng nguy cơ các biến chứng tim mạch ở bệnh nhân DTD [40]

Sự biến tính protein là một trong những biệu hiện cơ bản của sự viêm Khiølucose kết hợp với albumin sẽ làm albumin bị biến dạng, cầu trúc và chức năng bịthay đôi Albumin bị glycat hóa sẽ không được thu nhận ở gan bởi các glycoprotein vàđược đưa vào thành các mạch máu nhỏ nhanh hơn các albumin bình thường, làm xơhoá cau thận ở người bị DTD [12]

Các dẫn chứng trên cho thấy vai trò của việc ức chế các đáp ứng viêm sẽ giúp cânbang lại lượng cytokine trong cơ thé, giúp hạn chế tinh trạng kháng insulin và phòngngừa được những biến chứng trên mat, thận và tim mạch ở bệnh nhân DTD

1.2.3.3 Họat tính kháng khuẩn

Nguy cơ nhiễm trùng ở bệnh nhân DTD cao hơn han so với người bình thường.Các nhiễm trùng nay thường rất nghiêm trong và khó điều trị, dẫn đến các ton thươngnặng nề Các nhiễm trùng thường gặp ở bệnh nhân DTD bao gồm: lao phổi, nhiễm

khuẩn ban chân, đường hồ hấp, tiết niệu, da, niêm mạc, viêm tai, túi mật, nha

chu [41-43].

Duong huyết tang cao két hop voi suy giam hé thong mién dich tao diéu kién

thuận lợi cho vi khuan phát triển Các biến chứng thần kinh làm mat hoàn toàn cảmgiác ở bệnh nhân DTD, kết hợp với tình trạng dé kháng kém làm nhiễm trùng rất khókhống chế, nó lan dan gây hoại tử chi dưới Vì vậy mà nguy cơ đoạn chi ở bệnh nhânDTD cao gap 15 lần so với người bình thường [44]

Các nhiễm trùng trên hệ hô hap cũng thường hay gặp ở bệnh nhân DTD Chính vihệ miễn dịch suy yếu nên nguy cơ bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh cơ hội ở bệnh nhânPTD cao hơn han người thường [45]

Các vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng ở bệnh nhân DTD bao gồm các vikhuẩn gram âm, gram dương, đôi khi có cả nắm [42] Staphylococcus arreus là loài vikhuẩn chính khu trú ở vùng da, thường gây nhiễm trùng bàn chân |46] Escherichiacoli là vi khuẩn gây ra nhiễm trùng đường tiết niệu [47] Staphylococcus arreus gây raviêm phối và các vết lở loét trên da Pseudomonas aeruginosa thì gây ra nhiễm trùngmáu, gây tỷ lệ tử vong cao néu không khống chế được tình trạng nhiễm khuẩn [42]

1.3 CÁC LOÀI THUC VAT KHAO SÁT

1.3.1 Cây diép hạ châu dang (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)

Diệp ha châu dang (DHCD) có tên khoa hoc là Phyllanthus amarus Schum etThonn., thường gọi tắt là P.amarus, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae), là một loại comọc hàng năm, mọc thắng đứng, mang cành Cây mọc hoang ở nơi đất 4m trên khắpcác địa phương của Việt Nam [48].

Cây DHCD được sử dụng rộng rãi để chữa bệnh sỏi thận, vàng da, sốt rét, bệnhviêm gan B Các hoạt chất có nhiều hoạt tính sinh hoc trong cây DHCD bao gồm:Lignan, flavonoid, tanin, alkaloid, triterpene, sterol, dau béo [49] Nỗi bật nhất là 2

14

hợp chất thuộc nhóm lignan: phyllanthin và hypophyllanthin được chứng minh cónhiều công dụng như kháng ung thu, kháng oxy hóa, trị viêm gan [50].

Có nhiều nghiên cứu về tác dụng trị DTD của cây DHCD trên thé gidi Dich chiétnước của toàn cây DHCD với liều lượng 260mg/kg thé trong được chứng minh có tácdụng hạ đưởng huyết tốt trên mô hình chuột Wistar gây bệnh DTD [51] Một nghiêncứu khác cho thay, cao methanol của DHCD có khả năng ức chế enzyme #-amylasevà a-glucosidase Đặc biệt là cao lá cho hoạt tính vượt trội thé hiện qua giá tri ICsthấp hơn 10 lần so với acarbose, thuốc ức chế enzyme a-glucosidase dién hinh [52]

Ở Việt Nam, hiện tại van chưa có công trình nào được công bố về công dụng điều

trị DTD của diệp ha châu đăng

1.3.2 Cây bình bat (Annona reticulate L.)

Tên khoa học: Annona reticulate L., thuộc họ Na (Annonaceae), còn được gọi làcây nê, đào tiên Cây gỗ nhỡ, sớm hay nửa rụng lá Thân cao 2 đến 5 m, thậm chí đến10 m Quả hình tim, ăn được Cây thường phố biến ở vùng đất thấp, có khí hậu nóngvà âm, thường mọc ven bờ kênh, rạch có nước phèn, nước lợ ở Nam Bộ và một số tỉnhđồng bang Bắc Bộ [49]

Toàn cây bình bát có vị chát, có độc đặc biệt là hạt và vỏ thân, có tác dụng sáttrùng Quả xanh có tac dụng làm se, trừ ly, tri giun Quả bình bát, tri được bệnh khí hu

(huyết trăng) , tiêu chay, [48, 49]

Kha năng trị bệnh DTD của cây bình bát chỉ được nghiên cứu trên mồ hình invivo, vì vay thử nghiệm hoạt tinh ức chế enzyme ø-glucosidase để khám phá thêm cochế hạ đường huyết khác của thực vật này Nghiên cứu trên chuột Wistar albino DTDcủa Soumya cho thay ở liều 200 mg/kg cho hiệu quả hạ đường huyết tương đương vớimetfomin 300mg/kg [53] Một nghiên cứu khác trên chuột Wistar albino với cao láethanol 20° ở liều lượng 50, 100, 200, 400 mg/kg thé trọng, cho thấy hiệu quả haglucose mau sau | giờ lần lượt là 34,8, 37, 49,6 và 56,1% so với lô chứng [54]

1.3.3 Dây bình bát (Coccinia grandis (L) Voigt)

Binh bát dây hay còn gọi là dây bát hay mang bát, có tên khoa học là Cocciniagrandis (L) Voigt, thuộc ho Bầu bí (Cucurbitaceae) Cây thảo nhan và mảnh, mọcleo cao, đôi khi dài tới 5m hay hơn Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, khi chín có

màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt Mọc hoang trên nương rẫy, ở rào, lùm bụi từvùng thấp tới vùng cao 1500m khắp nước ta Có thé thu hái các bộ phận của câyquanh năm [48, 49].

Vỏ và rễ cây có tác dụng x6, rễ hạ nhiệt; lá hạ nhiệt, dùng ngoài chống ngứa, tiêuviêm, quả trị DTD [49] Nghiên cứu của Neelesh (2010) cho thay các hợp chat saponintrong dây bình bát có thé cải thiện được tình trạng đường huyết Enzyme @-amylase bịức chế mạnh bởi các flavonoid có trong dây bình bát [55] Dây bình bát còn có khảnăng ức chế glucose-6-phosphatase, là enzyme tham gia trực tiếp vào quá trìnhchuyển hóa đường ở gan [56] Theo công bố của Poongunran (2014), là dây bình bát ởSri Lanka có khả năng ức chế enzyme a-glucosidase với ICso bang 1800 tug/mL [57]

1.3.4 Cây nghề (Polygonum pulchrum BI.)

Cây nghề hay còn gọi là nghề lông dày, nghề trâu, có tên khoa học là Polygonumpulchrum BI., thuộc họ rau ram (Polygonaceae) Cây nghề là cây thân thảo, mọchoang khắp nơi trong nước ta, đặc biệt ở những nơi âm thấp, khi cây ra hoa háitoàn cây về phơi chỗ mát [48]

Theo y học cô truyền, cây nghề có tác dụng cầm máu, chữa giun, nhuận tràng vàchữa ran căn [48] Hiện nay, vẫn chưa có tài liệu nào trên thế giới và ở Việt Namnghiên cứu về khả năng trị bệnh DTD của cây nghề, vì vậy nghiên cứu khả năng ứcchế enzyme a-glucosidase có thé khám phá thêm loài thực vật có kha năng trị DTDmới.

1.3.5 Cay rau trai (Commelina communis)

Rau trai có tên khoa học là Commelina communis, là một cây thầnthảo hàng năm thuộc họ thài lài, mọc nhiều ở nơi đất 4m, ruộng vườn của các tỉnh

đồng băng, miễn núi [48|

Theo Đông y, cây rau trai có vị ngọt nhạt, tính hơi lạnh, có tác dụng giải nhiệt,chồng viêm, lợi tiểu, tiêu sưng: thuờng được dùng toàn cây dé làm thuốc Có thé dùngtươi hay khô có tác dụng trị cảm cúm, nhiễm khuẩn đường hô hấp, viêm họng, viêmamidan cấp, nhiễm trùng đường tiết niệu, phù thũng |48]

Đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu công bố về tác dụng điều trị DTD của rautrai Một nghiên cứu của Youn (2004) cho thay cao nước của lá rau trai cho hoạt tính

l6

ức chế enzyme a-glucosidase mạnh hon so với acarbose [58] Ở liễu 100 mg/kg còncó tác dụng giảm lượng glucose mau trên chuột bị DTD Nghiên cứu của Kim (1999)

B Cây bình bát

E Rau trai

Hình 1.3 Năm loài thực vat khảo sát

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 MỤC TIỂU, DOI TƯỢNG VA NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu

Thay được sự cấp thiết trong việc điều tri DTD tuýp 2 và ngăn ngừa các biếnchứng DTD, luận văn này sẽ tiến hành tiến hành sàng lọc khả năng trị bệnh DTD tuýp2 từ năm loài thực vật thu hái ở Long Xuyên, An Giang bằng phương pháp ức chếenzyme a-glucosidase in vitro Đối với thực vật cho kết quả ức chế enzyme a-glucosidase tốt nhất, tiến hành khảo sát sâu hơn đối với từng bộ phận, đồng thờinghiên cứu khả năng hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD và xây dựng qui trình chiếttoàn cây dé đạt được hoạt tính trên tốt nhất, nhằm mục đích ứng dụng dụng trong lĩnhvực thực phẩm chức năng và định hướng trong dược phẩm và làm tiền đề cho nhữngnghiên cứu tiếp

Đối tượng nghiên cứu cụ thể trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.1 Năm loài thực vật khảo sát

Tên thực vật Tên khoa học Bộ phận sw dụng

Diệp hạ châu đắng = Phyllanthus amarus Schum Et Thonn Toan cay

Cay binh bat Annona reticulata Linn La

Day binh bat Coccinia grandis (L) Voigt Than, láCay nghé Polygonum pulchrum BÌ Than, lá

Rau trai Commelina communis Linn Than, lá

2.1.2 Nội dung nghiên cứuTừ mục tiêu đề ra, nội dung của luận văn bao gồm hai nội dung chính.Nội dung 1: sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase của năm loài thực vatvới các nội dung thực hiện cụ thể như sau:

e_ Chiết kiệt và so sánh hiệu quả chiết của các loại nguyên liệu.e Định lượng polyphenol tổng của các cao dé dự đoán hoạt tính sinh học của

chúng.

18

Khảo sát kha năng ức chế enzyme a-glucosidase của các cao dé tìm ra loài thựcvật có hoạt tính mạnh nhất.

Sang lọc và so sánh khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của các bộ phậncủa thực vật có hoạt tính mạnh nhất

Khảo sát thêm các hoạt tính khác có liên quan đến ngăn ngừa biến chứng DTDnhư: kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn của cây này

Nội dung 2: Khảo sát điều kiện chiết đối với thực vật có hoạt tính ức chế enzymea-glucosidase mạnh nhất

Nghiên cứu quy trình chiết cao ở các điều kiện khác nhau (nhiệt độ, thời gian,ty lệ dung môi/ nguyên liệu khô) với dung môi là nước.

So sánh hàm lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme a-glucosidasecủa các cao đó.

2.2 HOA CHAT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1 Hóa chất

Enzyme a-glucosidase (Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA))p-Nitrophenyla-D-Glucopyranoside (p-NPG) (Sigma Chemical Co.)Acid gallic (Sigma Chemical Co.)

DPPH (1,1-Diphenyl - 2 - picrylhydrazyl) (Sigma Chemical Co.)Acid ascorbic (Sigma Chemical Co.)

thuốc thử Folin—Ciocalteau (Si gma Chemical Co.)1-Deoxynojirimycin (DNJ) (Sigma Chemical Co.)Diclofenac sodium (Vién kiém nghiệm thuốc)Gentamicine (Dopharma)

Ethanol (Chemsol), NaaCO% (Trung Quốc), Mueller Hinton Agar (Himedia), Và một số hóa chat cần thiết khác

2.2.2 Dụng cụThiết bị: Máy VICTORTM X3 Multilabel Plate Reader, máy đo độ hap thu UV—VIS, máy khuấy từ RH basic KTC, máy cô quay RE 301A-W, hệ thống tách chiết, lò

nung 500°C, bé đánh siêu âm, tủ ủ 37 °C, máy đo độ âm SATORIUS MB45, bể điều

nhiệt 67°C

Một số dụng cụ khác như bình tam giác, chai đựng dung dịch, lọ bị, cốc bechercác loại 100 ml, 200 ml, 250 ml, bình trích, đũa thủy tinh, bếp điện, cân điện tử, ốngmao quan,

2.3 PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.3.1 Phương pháp đo độ âm

Độ am của nguyên liệu được đo bang máy do độ âm hiệu SATORIUS MB45.Cách tiễn hành: Cân 2,000g nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm,cho vào máy đo độ âm Nguyên liệu được say ở 105°C đến khối lượng không đổi Kếtthúc đo khi màn hình máy hiện chữ END vả đọc độ âm trên máy Độ âm được xácđịnh bằng công thức:

_ khối lượng đầu — khối lượng sau

W = ; ` x 100,9khối lượng đầu 1

Phép đo dược thực hiện 3 lần và lay kết quả trung bình Từ độ 4m W, khối lượngnguyên liệu khô được tính theo công thức:

Mean X (100 — W)

100Trniy =

2.3.2 Phương pháp xác định độ tro toàn phần

Độ tro toàn phần là lượng chất vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn mẫunguyên liệu Cân một lượng chính xác 2,000 g nguyên liệu cho vào chén sứ, đượcnung trong tủ ở 500°C đến khi phân giải thành tro màu trăng Chén sứ được cho vàobình hút âm đến khi nguội và đem cân khối lượng (đến khi khối lượng không đổi) Độtro được tính theo công thức sau:

Msau — Mchén2 x(1—0,01.W)Độ tro = x 100, %

2.3.3 Định lượng polyphenol tổng theo phương pháp Folin — Ciocalteau

Hàm lượng polyphenol tổng của các thực vật được xác định theo phương phápFolin — Ciocalteau theo phương pháp cua Singleton (1999).

20

2.3.3.1 Nguyên tắc

Sự trao đối điện tử trong môi trường kiềm của hop chat phenolic bị oxi hóa bởithuốc thử Folin — Ciocalteau sẽ tạo thành hợp chất có màu xanh (molydenium) Do độhap thu ở bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo acid gallic, tínhđược hàm lượng tổng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích

2.3.3.2 Phương pháp tiễn hành

Chuẩn bị các dung dịch sau:Dung dịch Na;CO+s 20%: hòa tan 20 g Na,CO3 băng nước cất, định mức lên thểtích 100 mL rồi đun sôi Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh the NazCOa, sau24 giờ lọc lay dung dịch trong

Dung dịch acid gallic 1 mg/mL: hòa tan 10 mg acid gallic trong | mL ethanol, sauđó định mức lên 10 mL bang nước cat Từ dung dịch trên pha ra các dung dịch cónông độ sau băng nước cất: 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 và 0,1 (mg/mL)

Lập đường chuẩn: Cho 200 pL thuốc thử Folin — Ciocalteau vào 40 uL dungdich acid gallic ở các nồng độ khác nhau, đồng nhất bằng bề lac siêu âm trong 5 phútở nhiệt độ phòng Thêm 600 uL dung dịch NazCO¿ 20% và 3160 uL nước cất vào hỗnhợp trên, tiếp tục đồng nhất bằng bề lắc siêu âm trong 30 phút cũng ở nhiệt độ phòng.Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng À = 760 nm Lap lại 3 lần cho mỗi nồng do,lay gid tri trung binh

Do mau: hòa tan cao chiết trong cồn 20° với nồng độ là 0,5 mg/mL Tiến hành domẫu tương tự như bước dựng đường chuẩn Lặp lại ba lần cho mỗi mẫu cao, lấy giá trịtrung bình.

Tính toán kết quả: từ độ hấp thu của dung dịch acid galic tại các nông độ dựngđược đồ thị ở Hình 2.1

y =0.0016x - 0.002R =0.99880.16

5=

Hình 2.1 Đường chuẩn của axid galic

Ghi nhận các giá trị độ hấp thu của mẫu và tính toán hàm lượng ước lượng củapolyphenol tổng có trong mẫu theo công thức:

VTPE = GAE —

m

Trong đó:-TPE (mg GAE/g cao): hàm lượng polyphenol tổng tính trên 1 g cao chiết.-V: Thể tích mẫu

-m: Khối lượng mẫu.-GAE (mg/L): là hàm lượng ước lượng của phenol suy ra từ đường chuẩn acidgallic GAE chính là giá trị x trong công thức đường chuẩn acid gallic, được tính bangcách thay độ hấp thu của mẫu vào giá trị y

2.3.4 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase in vitro

2.3.4.1 Nguyên tắc

Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase của các cao chiét duoc tién hanhtheo phương pháp cua Mahomoodally (2014) [52] Phuong pháp này dựa trên phanứng thủy phân chất nền para-nitrophenyl a-D-glucopyranoside (p-NPG) khi có mặtenzyme a-glucosidase, tạo ra sản phẩm para-nitrophenol (p-NP) và a-D-glucose

22

HO, HO

O O

enzyme a-glucosidase HO

OH Ann + HO = OH +OH pH = 6,8, 37°C OH OH NOỎ

OH lận OH

NO2p-NPG a-D-glucose p-NP

Hinh 2.2 Phan wng thuy phan cua p-NPG

Khi có mặt chất ức chế, enzyme a-glucosidase sẽ giảm một phân hoạt tinh, lượngp-nitrophenol sinh ra ít hơn dẫn đến việc làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 405 nm.Thông qua việc so sánh độ hấp thu của mẫu cao với chứng âm, có thể xác định đượclượng enzyme đã bị cao ức chế

Phan trăm lượng enzyme ơ-glucosidase bị ức chế được tinh theo công thức:

control -A sample

100A

% ức chê=

control

Trong đó: — Acontro là độ hấp thu của mẫu trăng

A sampe là độ hap thu của mẫu khảo sát.ICso là nồng độ mẫu cho kết quả ức chế 50% đối tượng thử nghiệm, ở khảo sátnay chính là enzyme ơ-glucosidase Giá trị này càng nhỏ thé hiện mẫu có hoạt tính ứcchế càng cao.Trên mô hình in vitro, thông qua ICso có thé đánh giá và so sánh hoạttính ức chế enzyme a-glucosidase giữa các mẫu cao với nhau và với chứng dương

ICso được xác định bang cách vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa giá trị phầntrăm ức chế (I%) theo nồng độ (C) Từ đồ thị trên xác định được phương trình đườngthang I% = aC + b trong đoạn chứa giá tri I% = 50 vì đường biểu diễn trên chỉ tuyếntính trong một khoảng I% nhất định Thay I% = 50 vào phương trình trên sẽ tìm đượcgiá trị C tương ứng, giá tri này chính là ICso.

2.3.4.2 Phương pháp tiễn hànhChuẩn bi mẫu: cân khối lượng cao và dựa vào độ 4m để quy ra khối lượng caokhô Dịch gốc được pha ở nông độ 10000 z„g/mL trong DMSO Từ dịch gốc, pha racác nồng độ nhỏ hơn sao cho nông độ DMSO trong mẫu là 5% (v/v) Chọn một vàinông độ dé rà soát sơ bộ giá trị 1% Từ kết quả sơ bộ, chọn khoảng nồng độ chứa giátrị 1% = 50 dé chia nhỏ tìm ICs