Luận án tiến sĩ Công nghệ hóa học và các chất hữu cơ: Tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học của Chalcone và dẫn chất liên quan

ii TÓM TẮT LUẬN ÁN Chalcon, những chất thiên nhiên và tổng hợp thuộc nhóm flavonoid, sở hữu một phổ rộng những hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viê

Tổng quát về chalcon và dẫn chất

Danh pháp hóa học và cấu trúc chalcon

Tên quốc tế: 1,3-diphenyl-2-propen-1-on

Tên khác: Chalcon, chalkon, benzylideneacetophenon, phenyl styryl keton

Công thức phân tử: C 15 H 12 O Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chalcon

Khối lƣợng phân tử: 208,26 g/mol

Giới thiệu về dẫn chất của chalcon

Công thức chung của các dẫn chất chalcon:

Hình 1.2 Công thức chung của các dẫn chất chalcon

Trong nhóm dẫn chất chalcon có nguồn gốc thiên nhiên, vòng A, B là benzen có mang các nhóm thế R, R‟ phổ biến nhƣ CH 3 , OH, OCH 3 , isophenyl, phenyl…

Trong nhóm dẫn chất chalcon tổng hợp, R, R‟ là các nhóm thế: NO 2 , halogen…

Ngoài ra, còn có các dẫn chất chalcon có vòng A hoặc B có thể là các dị vòng (hình 1.3) Các dẫn chất này còn đƣợc gọi là chalcon dị vòng, hoặc like chalcon, hoặc heterochalcon[1] Hầu hết các dẫn chất chalcon dị vòng đƣợc tổng hợp

Chalcon là một nhóm phụ (nhỏ) của họ flavonoid, nhƣng gần đây có nhiều chất đƣợc

4 báo cáo có tác dụng sinh học rất đa dạng Nhiều hợp chất trong nhóm này có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, kháng gốc tự do, kháng viêm, giảm đau [2], [3], [4]

Chalcon còn là dẫn chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp các flavonoid nhƣ auron, flavonon, flavanol…(Sơ đồ 1.1), vốn là những hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều tác dụng sinh học [5], [6]

Về mặt cấu trúc hóa học, chalcon có hai vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3 cacbon, không có dị vòng C nhƣ các flavonoid khác, số thứ tự cacbon bắt đầu đánh từ vòng B (Hình 1.2) [7] Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam (do chữ chalcos có nghĩa là đồng)

Trong tự nhiên, chalcon hiện diện chủ yếu trong một số hoa của họ cúc (Asteraceae)

Chalcon cũng có thể hiện diện ở các bộ phận khác nhƣ vỏ, lá, quả, rễ [8]

(isoliquiritigenin trong rễ cam thảo [8]) Ngoài họ cúc, chalcon còn đƣợc tìm thấy ở các họ Náng (Amarylliaceae), Ráy (Araceae), Dong riềng (Cannaceae), Hành (Liliaceae), La Dơn (Lay ơn) (Iridaceae) [7]

Hàm lƣợng chalcon trong thực vật phụ thuộc vào nơi mọc Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lƣợng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng Tuy nhiên, lƣợng chalcon hiện diện trong tự nhiên rất ít

Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn chất chalcon đã đƣợc tìm thấy trong thực vật Một số flavonoid đã đƣợc cô lập từ vỏ rễ cây Cẩm lai Dalbergia sissoo:

2,3-dimethoxy-4‟-γ,γ-dimethylallyloxy-2‟-hydroxychalcon; 7-γ,γ-dimethyl-allyloxy-5- hydroxy-4‟-methoxyisoflavon;7-hydroxy-6-methoxyflavon [9]

Trong lá dâu tằm Morus alba L có 02 dẫn chất chalcon đƣợc cô lập có tên là

Hình 1.3 Cấu trúc của 2,3-dimethoxy-4‟- γ,γ -dimethylallyloxy-2‟-hydroxychalcon [9]

5 morachalcons B và C có công thức cấu tạo nhƣ sau:

Trong tự nhiên, chalcon là chất trung gian sinh tổng hợp các dẫn chất flavonoid khác.[11], [12]

Trong tổng hợp hữu cơ, chalcon còn là nguyên liệu tổng hợp các dẫn chất dị vòng nhƣ dẫn chất pyrazolin, isoxazolin, pyrimidinon[13], [14], [15]

Sơ đồ 1.1 Các dẫn chất thuộc họ flavonoid tổng hợp qua trung gian chalcon

Hình 1.4 Cấu trúc của morachalcons B và C [10]

Các phương pháp tổng hợp chalcon và dẫn chất

Phản ứng Suzuki C – C coupling

 Phản ứng cộng hợp giữa acid cinamyl clorid và acid phenylboronic đã hoạt hóa bằng Pd(PPh 3 ) 4 (Sơ đồ 1.3)

 Phản ứng cộng hợp giữa acid benzoic và acid phenylvinylboronic đã hoạt hóa bằng Pd(PPh 3 ) 4 (Sơ đồ 1.4)

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp chalcon theo phản ứng Suzuki Sơ đồ 1.3 Tổng hợp chacon theo phản ứng Suzuki Sơ đồ 1.2 Các dẫn chất dị vòng tổng hợp qua trung gian chalcon

Cả hai phản ứng trên đều dùng Pd(PPh 3 ) 4 làm chất xúc tác và phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm

Eddarir và cộng sự đã khảo sát phản ứng cộng hợp giữa cinnamoyl clorid với nhiều acid phenylboronic khác nhau trong các điều kiện sau:

THF, PdCl 2 (PPh 3 ) 4 /PPh 3 , n - Bu 4 N + HF 2 - s cho hỗn hợp các sản phẩm

Aceton-nước (3:1), PdCl 2 , CaCO 3 cho sản phẩm với hiệu suất trung bình

Phản ứng cộng hợp giữa benzoyl clorid và acid phenylvinylboronic sử dụng Pd(PPh 3 ) 4 s cho các chalcon với hiệu suất cao hơn [16].

Phản ứng Heck

Một vài chalcon hiện diện trong tự nhiên cũng đã đƣợc tổng hợp dựa trên phản ứng Heck Nguyên tắc cơ bản của phản ứng này là dựa trên sự cộng hợp giữa một aryl vinylceton với một aryl iodid (sơ đồ 1.5) [17], [18].

Phản ứng acyl hóa Friedel-Craft

Các chalcon có thể đƣợc tổng hợp bằng cách acyl hóa trực tiếp nhân phenol Trong trường hợp này nhân phenol trở thành vòng A, trong khi tác nhân acyl hóa s trở thành vòng B và nhánh 3 cacbon Ch ng hạn nhƣ acyl hóa trimethoxyphenol với cynamoyl clorid với sự hiện diện của BF 3 -Et 2 O làm chất xúc tác s cho ra 2‟-hydroxy-3‟,4‟,5‟- trimethoxy chalcon (Sơ đồ 1.6) [12]

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp chalcon dựa vào phản ứng Heck

1.2.4 Phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt

Mặc dù có nhiều con đường để tổng hợp chalcon nhưng phương pháp phổ biến nhất thường hay sử dụng là dựa vào phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt giữa các dẫn chất của acetophenon và benzaldehyd thích hợp (Sơ đồ 1.7) Phản ứng đƣợc tiến hành tương đối đơn giản nhưng hiệu quả, cho phép tạo thành liên kết đôi cacbon-cacbon không phụ thuộc vào độ phức tạp trong cấu trúc các phân tử tham gia ngƣng tụ Vì vậy, phản ứng này vẫn đƣợc áp dụng rộng rãi để tổng hợp chalcon

Phản ứng thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng hay gia nhiệt lên đến 50 o C, sử dụng dung dịch hydroxid kiềm hoặc natri ethoxid (C 2 H 5 ONa) nồng độ từ 10–60%

Các chất xúc tác khác nhƣ magie t - butoxid, kali carbonat, bari hydroxyd cũng đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu Ngoài ra phản ứng ngƣng tụ này cũng có thể xúc tác bởi các acid nhƣ HCl, AlCl 3 , BF 3 , Na 2 Br 2 O 7 , TiCl 4 … ên cạnh chất xúc tác, diện tích bề mặt và nhiệt độ là các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất

Về bản chất, phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt là phản ứng ngƣng tụ chéo giữa 2 hợp chất cacbonyl khác nhau, trong đó acetophenon đóng vai trò tác nhân nucleophil dưới dạng enol hoặc enolat, và benzaldehyd đóng vai trò tác nhân electrophil Đầu tiên

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp chalcon dựa vào phản ứng ngƣng tụ Claisen- Schmidt

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp chalcon dựa vào phản ứng acyl hóa Friedel- Crafts

9 là sự tạo thành anion enolat dưới tác dụng của kiềm (Sơ đồ 1.8) Mặc dù cả 2 loại hợp chất cacbonyl đều không đối xứng nhƣng chỉ có nhóm methyl của acetophenon còn proton α, và vì vậy chỉ có vị trí này xảy ra sự enol hóa:

Sơ đồ 1.8 Sự tạo thành enolat trong môi trường kiềm Để tạo thành sản phẩm mong muốn, enolat tạo thành tấn công vào nhóm cacbonyl của aldehyd để tạo aldol Sản phẩm aldol này không bền, lập tức dehydrat hóa trong môi trường kiềm theo cơ chế E1cb tạo chalcon (Sơ đồ 1.9)

Sơ đồ 1.9 Cơ chế phản ứng tạo chalcon trong môi trường kiềm

Trong trường hợp này enolat tạo thành có thể tấn công vào nhóm carbonyl của một phân tử acetophenon khác chƣa đƣợc enol hóa tạo sản phẩm tự ngƣng tụ Tuy nhiên điều này ít xảy ra hơn là do nhóm carbonyl của aldehyd có mật độ điện tích dương cao hơn, vì vậy có tính electrophil mạnh hơn và ƣu tiên phản ứng với enolat hơn

Phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt đôi khi đƣợc tiến hành với những thay đổi nhỏ về xúc tác, dung môi và loại kiềm sử dụng Có thể thực hiện ngƣng tụ aldol khi có mặt hydroxid hay cacbonat của calci, bari và strongti trong một dung môi không proton có khả năng tạo với nước hỗn hợp đ ng phí và điểm sôi thấp để tách nước dễ dàng hơn

Khi đó có thể tổng hợp các chalcon với nhóm thế trifluoromethyl ở vị trí β của hệ thống không no (Sơ đồ 1.10) [19]

Sơ đồ 1.10 Tổng hợp chalcon trifluoromethylat với xúc tác kim loại kiềm thổ

Năm 2013, sử dụng xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromid trong dung dịch kiềm dưới điều kiện vi sóng, Yang và các cộng sự đã tổng hợp thành công các dẫn xuất chalcon dị vòng mang khung cấu trúc 1-phenyl-3-arylpyrazol (Sơ đồ 1.11) [20].

Sơ đồ 1.11 Tổng hợp chalcon dị vòng sử dụng xúc tác chuyển pha

Hóa tổ hợp cũng đã ứng dụng phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt trong pha lỏng, dùng PEG (polyetylen glycol) làm chất mang để tổng hợp các dẫn xuất benzyloxy-2‟- hydroxychalcon để sau đó chuyển hóa thành hydroxyflavon tương ứng (Sơ đồ 1.12) [21]

Sơ đồ 1.12 Tổng hợp chalcon trong pha lỏng sử dụng PEG làm chất mang

Tổng hợp trong cùng bình phản ứng (one-pot synthesis) là phương pháp tiện lợi để thực hiện một phản ứng hóa học, trong đó chất phản ứng tham gia nhiều phản ứng liên tiếp trong cùng một bình phản ứng Nhóm nghiên cứu của các tác giả Chen và Xu đã công bố phương pháp ngưng tụ Claisen-Schmidt để tổng hợp chalcon trong cùng bình phản ứng với hiệu suất từ trung bình đến cao (65 - 98%), đi từ alcol bậc nhất và ceton tương ứng sử dụng CrO 3 làm tác nhân oxy hóa để tạo aldehyd in situ (Sơ đồ 1.13)[22], [23]

Sơ đồ 1.13 Tổng hợp chalcon từ alcol và ceton trong cùng bình phản ứng

Khi sử dụng acid làm chất xúc tác, phản ứng s bắt đầu xảy ra với sự tấn công vào cacbon (mang điện tích dương) của nhóm cacbonyl của benzaldehyd Tiếp theo là sự tấn công vào dây nối enol của acetophenon (sơ đồ 1.14)

Khi sử dụng các chất kiềm nhƣ NaOH, KOH, Ca(OH) 2 … hay acid nhƣ HCl, AlCl 3 , BF 3 , Na 2 Br 2 O 7 , TiCl 4 … làm chất xúc tác, nếu phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao và có sự hiện diện của nhóm thế thích hợp trên nhân thơm (nhóm hút điện tử của nhóm chức cacbonyl, nhóm hydroxy…) thì chalcon tạo thành s đóng vòng tạo ra flavon tương ứng Do vậy khi thực hiện phản ứng tổng hợp chalcon cần phải chú ý kiểm soát nhiệt độ phản ứng không đƣợc vƣợt quá 50 o C

Tuy có nhiều phản ứng để tổng hợp chalcon nhƣng phản ứng ngƣng tụ Claisen- Schmidt là lựa chọn tối ƣu vì dễ tiến hành và có thể tạo ra số lƣợng lớn các dẫn chất

Sơ đồ 1.14 Cơ chế phản ứng ngƣng tụ Claisen - Schmidt với xúc tác là acid[12].

Phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt

của chalcon Trong khi đó nhƣợc điểm của phản ứng Friedel-Crafts là cần thiết phải tiến hành trong môi trường khan nước, tác nhân acyl hóa không có sẵn và hiệu suất thấp Đối với phản ứng cộng hợp Suzuki thì hầu hết các nguyên liệu đầu có giá đắt và không có sẵn Phản ứng Heck có những hạn chế nhất định bởi các chất xúc tác nhƣ TiCl 4 , Pd(PPh 3 ) 4 và nguyên liệu đầu rất đắt, môi trường phản ứng yêu cầu khan nước rất khó thực hiện

Chính vì vậy trong phạm vi luận án này phương pháp ngưng tụ Claisen-Schmidt được chọn để tổng hợp chalcon và dẫn chất.

Tác dụng sinh học của chalcon và dẫn chất liên quan

Một số dẫn chất chalcon có trong tự nhiên

 Hợp chất isoliquiritigenin (hay 4, 2‟, 4‟-trihydroxychalcon) (hình 1.5) trong rễ

13 cam thảo Glycyrrhiza glabra L đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế tế bào ung thƣ và đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ dạ dày [7] Ngoài ra, isoliquiritigenin còn có tác dụng chống dị ứng và hiệu quả trong điều trị hen suyễn, chứng viêm da dị ứng, viêm mũi dị ứng, mày đay

Hình 1.5 Hợp chất isoliquiritigenin trong rễ cam thảo Glycyrrhiza glabra L

 Dẫn chất cyclohexenyl chalcon đƣợc phân lập trong cây Bồng nga truật nam, còn gọi là củ ngải, Boesenbergia pandurataL có khả năng kháng viêm [26]

 Các dẫn chất chalcon mới (Hình 1.6) đƣợc phân lập từ cây Onychium japonicum(họ Dương xỉ) có khả năng gây độc tế bào in vitro, kháng tế bào ung thư Hela và BEL-7402 [3].

Tác dụng làm giảm tổn thương gan của chalcon

 Một số chalcon chứa vòng 1,4 – dioxan có khả năng làm giảm thương tổn gan (trên in vivo)ở mức độ trung bình đến khá cao [hình 1.24] [25]

Bảng 1.1 Các chalcon chứa vòng 1,4 – dioxan có tác dụng giảm tổn thương gan [28]

H Hình 1.6 Cấu trúc của dẫn chất chalcon đƣợc phân lập từ cây Onychium japonicum

CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH

Các chất 9a-g đƣợc khảo sát về khả năng giải độc ở gan bằng cách gây độc gan bởi CCl 4 , sau đó so sánh tác dụng giải độc gan với Silybon Kết quả cho thấy chất 9b và 9c có tác dụng khá tốt (trong phân tử mang nhiều nhóm thế OH và OCH 3 ) [25]

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của chalcon

 Một số dẫn chất chalcon dị vòng đƣợc tổng hợp từ 2-acetylpyridin và dẫn chất aldehyd có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt [28]

Hình 1.7 Các chalcon chứa vòng 1,4 – dioxan có tác dụng giảm tổn thương gan

 Năm 2001, Silvia N López và cộng sự đã công bố nghiên cứu hoạt tính kháng nấm và mối liên quan cấu trúc tác dụng của một số dẫn chất của chalcon [30] Các tác giả kết luận rằng chalcon với những nhóm thế khác nhau trên vòng A và B thể hiện hoạt tính rất tốt trên nấm da, cùng với cách thức tác động của chúng mang đến hứa hẹn s có thể phát triển thành những thuốc kháng nấm tiềm lực cao và an toàn

 Năm 2004, Simon F N và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chalcon [29] Licochalcon A là một hydroxy chalcon đƣợc biết đến nhƣ là một chất có tính kháng khuẩn, tuy nhiên khả năng tan trong nước kém và hoạt tính ở mức trung bình nên ít đƣợc sử dụng Trong nghiên cứu này, tác giả nhận thấy việc thêm những nhóm thế có tính acid càng cao vào 4‟-hydroxy chalcon s tạo chất kém hoạt tính, còn thêm những nhóm thế trên vào 4‟-carboxy chalcon thì lại làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và khả năng hòa tan

 Năm 2007, Muhammad Azad và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của một số dẫn chất quinolinyl chalcon [31] Kết quả cho thấy một số quinolinyl chalcon có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn rất tốt trên

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aspergilus niger, Candida albicans…

Sơ đồ 1.15 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất chalcon (1-6) từ 2-acetylpyridin [29]

 Năm 2007, X.L Liu, Y.J Xu, M.L Go và cộng sự đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên E coli và Staphyloccocus aureus đề kháng thuốc của một nhóm chalcon [32] Chất có hoạt tính cao nhất là 2 chất có vòng A đƣợc thế bằng 2- hydroxy-4,6-dimethoxy-3-(1-methyl-piperidin-4-yl), trong đó nhóm OH đóng vai trò thiết yếu Nghiên cứu này cũng cho rằng khung chalcon là cấu trúc đáng chú cho việc tối ƣu hóa để tạo nên những hợp chất có tính kháng khuẩn cao và ít độc

 Năm 2007, Y Rajendra Prasad, A Lakshmana và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của một nhóm hợp chất chalcon [33] Kết luận rằng những chất có nhóm cho điện tử nhƣ OCH 3 , OH cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn những chất không có nhóm thế đó Những kết quả cũng cho thấy rằng những dẫn chất của chalcon cũng là một lĩnh vực đầy tiềm năng cho nghiên cứu những chất kháng khuẩn trong tương lai

 Năm 2008, Hugo P.A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 31 dẫn chất chalcon tổng hợp [34] Nghiên cứu đƣa ra kết luận rằng hoạt tính kháng khuẩn có thể liên quan đến sự có mặt của các nhóm thế trên vòng thơm nhƣ nhóm 4- hydroxy, nhóm thế có oxi ở vị trí 4‟ và chuỗi isoprenoid ở vị trí 3‟ Trong khi đó, nhóm 2‟-hydroxy có thể quan trọng trong tính bền vững của phân tử

 Năm 2008, P.M.Gurubasavaraja Swamy và Y.S Agasimundin đã tổng hợp và khảo sát tác động kháng vi sinh vật của một số chalcon và isoxazolin thế mang nhân hydroybenzofuran [35] Trong đó, 1-(3-hydroxy benzofuran-2-yl)-3-aryl-2-propen-1- on và -(3-hydroxy benzofuran-2-yl)-3-(4-methoxyaryl)-2-propen-1-on thể hiện hoạt tính kháng nấm trên Aspergillus flavus và Candida albicans gần như tương đương với chất chuẩn Griseofulvin

 Năm 2009, tại Việt Nam, tác giả Huỳnh Thị Ngọc Phương, Phan Thị Huyền và cộng sự đã tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của một số nitro/hydroxyl chalcon [36] Kết quả cho thấy nhóm nitro có thể không ảnh hưởng đến tác dụng kháng vi sinh vật của chalcon Các chalcon có thể làm giảm nồng độ ức chế tối thiểu của ampicillin và clindamycin trong phối hợp trên Staphylococcus aureus

 Năm 2010, Đỗ Tường Hạ, Trần Thành Đạo và cộng sự đã tổng hợp 12 dẫn chất chalcon dị vòng, với vòng A chứa nhân dị vòng thơm pyridinyl, thiophenyl vàfuranyl

17 và khảo sát tác dụng kháng Staphylococcus aureus của các dẫn chất tốt hợp Trong 12 chất khảo sát có 10 chất có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus trong đó 5 có tác dụng kháng MSSA mạnh với MIC= 4 g/ml, kháng MRSA với MIC= 8 g/ml Đây là chất có tiềm năng kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin, có thể dùng làm

“chất khởi nguồn” trong nghiên cứu tổng hợp và phát triển hợp thuốc điều trị tụ cầu đề kháng [37]

 Năm 2012, các tác giả Trần Thành Đạo, Nguyễn Thị Thảo Nhƣ và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất chalcon dị vòng bằng phản ứng ngƣng tụ Claisen Schmidt và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất chalcon dị vòng này Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm tạo thành cũng đƣợc khảo sát Cấu trúc của các chalcon đƣợc xác định bằng các phương pháp phổ hồng ngoại (IR) và 1 H-NMR Các kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất p5, f6 và t5 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên cả hai dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng và không kháng

Methicillin (MRSA và MSSA) được cô lập từ một mẫu sinh học trên người Nghiên cứu SAR đã kh ng định tiềm năng của f5, f6 và t5 trong nghiên cứu tìm kiếm và phát triển thuốc [38]

 Năm 2012, các tác giả Trần Thành Đạo, Đỗ Tường Hạ và cộng sự đã tổng hợp 30 dẫn chất chalcon bằng phương pháp ngưng tụ Claisen Schmidt và sàng lọc hoạt tính kháng Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin và Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (MRSA) hoặc kết hợp với các kháng sinh non-betalactam nhƣ ciprofloxacin, chloramphenicol, erythromycin, vancomycin, doxycyclin và gentamicin Trong thí nghiệm bằng phương pháp bàn cờ, các chỉ số nồng độ ức chế riêng phần (FICI) cho thấy sự kết hợp của ciprofloxacin với 25 (4-bromo-2- hydroxychalcon); doxycyclin với 21 (4-hydroxychalcon); doxycyclin với 25; và doxycyclin với 4 (2,2‟-dihydroxychalcon) có tác dụng hiệp đồng kháng vi khuẩn

MRSA Trong khảo sát sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính (SAR), mối liên hệ giữa cấu trúc của các chalcon và hoạt tính kháng khuẩn của chúng đối với S areus cũng nhƣ tính hiệp đồng với các chất kháng sinh đƣợc sử dụng cũng đƣợc trình bày Cơ chế kháng khuẩn độc lập cũng nhƣ cơ chế hợp lực đƣợc đề nghị dựa trên các nghiên cứu mô phỏng phân tử Các kết quả từ sự kết hợp giữa chalcon và các chất kháng sinh

18 thông dụng đã cho thấy đây có thể là một phương cách thay thế hiệu quả trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn MRSA gây ra [39]

 Gần đây nhất, năm 2016, R Kant, D Kumar, và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 1,2,3-triazol của chalcon và flavon và các dẫn chất này có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis), vi khuẩn Gram âm (E coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae), kháng chủng khác nhau của nấm men Candida (albicans, tropicalis, parapsilosis, )[40].

Tác dụng chống oxy hóa của chalcon

 Năm 2008, Boem –Tae Kim, Kwang-Joong O và cộng sự đã công bố nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính đánh bắt gốc tự do của những dẫn chất chalcon có 2 nhóm hydroxyl thế [41] Kết quả cho thấy những chalcon với 2 nhóm hydroxyl thế trên vòng B ở vị trí orto- (2‟,3‟- và 3‟,4‟-) và para- (2‟,5‟-) cho hoạt tính chống oxi hóa tốt so sánh với chất đối chiếu acid ascorbic và α-tocopherol Còn những chalcon thế ở vị trí meta- (2‟,4‟- và 3‟,5‟-) thì lại có hoạt tính kém Trong khi đó sự thế ở vị trí para tại vòng A thì không có ảnh hưởng gì đến hoạt tính kháng gốc tự do

 Năm 2009, Anastasia Detsi, Maya Majdalani và các cộng sự đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và ức chế lipooxygenase của các 2‟-hydroxy chalcon và auron [42] Kết quả cho thấy những chất có nhóm methoxy ở vị trí 2‟ và 4‟ thì vừa có tính chống oxi hóa vừa ức chế lipooxygenase tốt.

1.3.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư của chalcon

 Từ thân của loài Rhus verniciflua một dẫn chất cấu trúc polyphenol là butein (3,4,2‟,4‟-tetrahydroxychalcon) đƣợc phân lập và thể hiện khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào adenocarcinoma ruột người [43].

Hình 1.8 3,4,2‟,4‟-tetrahydroxychalcon phân lập từ thân cây Rhus verniciflua

 Licochalcon A phân lập từ rễ của loài cam thảo Trung Quốc (Glycyrrhiza uralensis) được báo cáo có khả năng kiểm soát sự tăng trưởng các tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 không phụ thuộc androgen [44]

Hình 1.9 Licochalcon A phân lập từ rễ Glycyrrhiza uralensis

 Xanthohumol là một chalcon prenylat đƣợc phân lập từ cây hoa bia (Humulus lupulus L.) Chất này thể hiện hoạt tính kháng ung thƣ phổ rộng trên nhiều tế bào ung thƣ khác nhau chủ yếu thông qua sự ức chế tăng sinh và cảm ứng quá trình chết theo chương trình [45],[46 ]

Hình 1.10 Prenylchalcon phân lập từ cây hoa bia Humulus lupulus L

 4-Hydroxyderricin từ rễ của loài Angelica keiskeicó tác động cảm ứng quá trình chết theo chương trình ở tế bào leukemia (HL60) thông qua trung gian thụ thể và lưới nội chất, có l một phần là do ức chế topoisomerase II [43] Chất này cũng thể hiện khả năng gây độc tế bào rất mạnh trên 4 dòng tế bào ung thư người: HL60 (leukemia), CRL1579 (u hắc tố), A549 (ung thƣ phổi) và AZ521 (ung thƣ dạ dày)[43]

Hình 1.11 4-Hydroxyderricin chalcon phân lập từ rễ của loài Angelica keiskei

 Một số dẫn chất chalcon và bis-chalcon chứa nhóm boronic acid có hoạt tính kháng khối u,kháng tế bào ung thƣ vú MDA-MB-231 (estrogen receptor-negative) và MCF7 (estrogen receptor-positive) và kháng 2 dòng tế bào biểu mô ngực bình thườngMCF-10A và MCF-12A Những phân tử này ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ vú ở nồng độ thấp (từ micromol đến nanomol) [26]

 Năm 2016, các tác giả Đỗ Tường Hạ, Trần Thành Đạo và cộng sự đã sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ cơ vân Rhabdomyosarcoma (RD-A) và tế bào mô thận thường của các dẫn chất chalcon dị vòng Các dẫn chất chalcon tổng hợp được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thƣ mô liên kết và tế bào không ung thƣ Ảnh hưởng của các cấu trúc dị vòng khác nhau trên hai vòng A và như phenothiazin,

20 thiophen, furan và pyridin cũng đƣợc khảo sát Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc gắn ba nhóm methoxy lên vị trí 3,4,5 của vòng có tác động quan trọng lên hoạt tính độc hại tế bào ên cạnh đó, hợp chất chalcon với cấu trúc vòng A là dị vòng phenothiazin và vòng là dị vòng thiophen có tác dụng tốt nhất về độc tính trên tế bào gây ung thƣ, (IC 50 = 12.51 μM so sánh với giá trị 10.84 μM của paclitaxel) Đặc biệt, hầu hết các hợp chất có độc tính trên tế bào gây ung thƣ thử nghiệm cho hoạt tính độc tế bào yếu đối với các tế bào bình thường [47].

 Các dẫn chất chalcon có nhóm thế fluor (Hình 1.12) đƣợc tổng hợp và khảo sát khả năng chống tăng sinh dòng tế bào ung thƣ dựa trên sáu loại dòng tế bào (tế bào phôi thận người (HEK293),tế bào biểu mô ung thư tuyến phổi người (A549), tế bào ung thư thận(A498), tế bào ung thư cổ tử cung người (Hela), các tế bào hắc tố trên da người (A375), tế bào ung thư gan (HepG2) [48]

Hình 1.12 Các dẫn chất chalcon có nhóm thế fluoro

 Các dẫn chất quinazolin chalcon (Hình 1.13) có hoạt tính chống ung thƣ thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư của người như ung thư tuyến phế nang (A549), ung thƣ đại trực tràng (HT-29), ung thƣ vú (MCF-7), khối u ác tính (A375) [49]

Hình 1.13 Một số dẫn chất quinazolin chalcon

1.3.6 Tác dụng kháng viêm, ức chế ký sinh trùng gây bệnh sốt rét của chalcon

 Các dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có tác dụng kháng viêm dựa trên cơ chế giảm sự sản sinh NO và ức chế sinh tổng hợp prostaglandin E2 thông qua sự ức chế 2 enzyme NO synthase và COX-2 [23]

 Năm 2010, Nguyễn Thị Thu Giang, Trần Thành Đạo và cộng sự đã tổng hợp 10 dẫn chất chalcon và khảo sát tác động kháng viêm in vitro trên chuột nhắt trắng Các dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có tác dụng kháng viêm in vitro mạnh hơn chalcon gốc

(không mang nhóm thế); trong đó dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có mang ít nhất 01 nhóm thế methoxy trên vòng đƣợc xem có tiềm năng để phát triển chất kháng viêm mới [50]

 Năm 2003, Mei Liu và cộng sự trong nghiên cứu “Liên quan cấu trúc và tác dụng của chalcon trong chống sốt rét” đã xác định 2‟,4‟-dimethoxy-4-ethyl chalcon và 4‟-methoxy-4-hydroxy chalcon có hoạt tính kháng sốt rét rất tốt [51]

Tác dụng kháng viêm, ức chế ký sinh trùng gây bệnh sốt rét của

 Các dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có tác dụng kháng viêm dựa trên cơ chế giảm sự sản sinh NO và ức chế sinh tổng hợp prostaglandin E2 thông qua sự ức chế 2 enzyme NO synthase và COX-2 [23]

 Năm 2010, Nguyễn Thị Thu Giang, Trần Thành Đạo và cộng sự đã tổng hợp 10 dẫn chất chalcon và khảo sát tác động kháng viêm in vitro trên chuột nhắt trắng Các dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có tác dụng kháng viêm in vitro mạnh hơn chalcon gốc

(không mang nhóm thế); trong đó dẫn chất 2‟-hydroxychalcon có mang ít nhất 01 nhóm thế methoxy trên vòng đƣợc xem có tiềm năng để phát triển chất kháng viêm mới [50]

 Năm 2003, Mei Liu và cộng sự trong nghiên cứu “Liên quan cấu trúc và tác dụng của chalcon trong chống sốt rét” đã xác định 2‟,4‟-dimethoxy-4-ethyl chalcon và 4‟-methoxy-4-hydroxy chalcon có hoạt tính kháng sốt rét rất tốt [51]

 Một loạt các dẫn chất sulfonamid chalcon đƣợc tổng hợp và khảo sát khả năng ức chế β-hematin trong ống nghiệm và hoạt tính chống lại ký sinh trùng Plasmodium falciparum (dạng nuôi trong phòng thí nghiệm) (Hình 1.14) Nồng độ ức chế β- hematin tối thiểu thể hiện ở các hợp chất mang nhóm thế 3, 4,5-trimethoxyl (IC 50 0,48 μM)và dẫn chất mang nhóm thế 3 pyridinyl(IC 50 0,50 μM) [52]

Hình 1.14 Một số dẫn chất sulfonamid chalcon

1.3.7 Khả năng ức chế sự hoạt động của enzym tyrosinase và sự sản sinh sắc tố melanin trên da

Sự tích tụ bất thường của sắc tố melanin là nguyên nhân dẫn tới rối loạn sắc tố và gây ra các khối u ác tính trên da Năm 2016, Byung-Hak Kim và các cộng sự đã tổng hợp một số dẫn chất chalcon và xác định 1-(2-cyclohexylmethoxy-6- hydroxyphenyl)-3-(4-hydroxymethyl-phenyl)-propenon có hoạt tính nhƣ một tác nhân làm giảm sự hình thành bất thường của các sắc tố melanin trên da [53].

Khả năng ức chế HIV

Năm 2016, Amy L Cole, Sandra Hossain và cộng sự đã tổng hợp và khảo sát hoạt tính của một số dẫn chất chalcon về khả năng ức chế tế bào HIV đồng thời gây độc tính thấp với người Trong đó (E)-1-(2- (benzyloxy)-6-hydroxyphenyl)-3-(5- bromo-2-ethoxy-phenyl) prop-2-en-1-on và 1-(2-benzyloxy-6-hydroxy-phenyl)-3-(5- chloro-2-ethoxy-phenyl)-propenon (ở 10àM )cho khả năng ức chế virus HIV lớn hơn 92% mà không ảnh hưởng tới tế bào chủ Nghiên cứu còn cho thấy rằng những chalcon với nhóm thế o-benzyl đƣợc xác định là tác nhân chống HIV đầy hứa hẹn trong tương lai [54].

Cấu trúc và tác động sinh học của chalcon dị vòng

Hầu hết các chalcon tìm thấy trong tự nhiên có vòng A và B là nhân benzen [6]

Trong các thập kỷ gần đây, có nhiều tác giả đã tổng hợp và đánh giá tác động sinh học của nhiều chalcon với vòng A và/hoặc B là 1 nhân thơm dị vòng 5 cạnh hoặc 6 cạnh

Các hợp chất này đƣợc gọi là chalcon dị vòng (heterocyclic chalcon) (hình 1.15) [1]

Những hợp chất chứa vòng 1,4 - dioxan, đặc biệt những hợp chất có chứa nhóm 2- hydroxy methyl ở vị trí 2 trên vòng dioxan có khả năng làm giảm độc tính trên gan khá cao Những hợp chất có hoạt tính mạnh đã đƣợc tổng hợp nhƣ sau: (Hình 1.16, 1.17)

Hình 1.16 Cấu trúc 2-hydroxy-4-methoxy-3‟,4‟-(2-hydroxy methyl-1,4-dioxan)

Hình 1.15 Minh họa một số hợp chất chalcon dị vòng

Sự thay thế các nhóm thế trên vòng thơm của dẫn chất chalcon trên có vai trò quan trọng trong sự thể hiện hoạt động chống lại độc tính trên gan Tuy nhiên, nhóm methoxy ở vị trí 4 và 6 trong các chalcon trên thể hiện hiệu quả giảm độc tính trên gan tốt nhất [3]

 Không có những nhóm thuốc kháng sinh mới được giới thiệu ra thị trường trong suốt 37 năm từ năm 1962 đến năm 2000 Tất cả những thuốc kháng sinh đƣợc giới thiệu trước đó, vi khuẩn đã phát triển sự đề kháng, làm cho nhu cầu có những thuốc kháng sinh mới trở nên cấp bách Hydroxy chalcon đƣợc biết đến nhiều năm qua có tính kháng khuẩn nhưng khả năng ứng dụng bị hạn chế vì độ hòa tan trong nước thấp và tính kháng khuẩn trung bình Nghiên cứu cho thấy sự thay thế nhóm 4 - hydroxy bằng nhóm 4 - cacboxyl làm tăng tính kháng khuẩn tốt nhất, trong đó các hợp chất có hiệu lực kháng khuẩn tốt nhất đƣợc nghiên cứu là 4‟ - carboxy - 3,5 - bis - trifluoromethyl chalcon và 4‟ - carboxy - 3,5 - dibromo chalcon [6], [55]

 Một số quinolinyl pyrimidin chalcon tổng hợp từ quinolinyl chalcon kháng

Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium falciparum in vitro cũng nhƣ có tác dụng kháng khuẩn [56]

Hình 1.18 Cấu trúc một số quinolinyl chalcon Hình 1.17 Cấu trúc 2-hydroxy-4,6-dimethoxy-3‟,4‟-(2-hydroxymethyl-1,4-dioxan)

Bảng 1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn một số quinolinyl chalcon và dẫn chất [56]

Nhóm thế Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) R R 1 E coli P aeruginosa B subtilis K erogeues S albus

15 21 (-): không có sự ức chế; Ofl.: ofloxacin

Bảng 1.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm một số dẫn chất quinolinyl chalcon

Chất Đường kính vòng kháng nấm (mm)

A niger A flavus R rubra L lopofera C albicans

 Năm 2010, Trần Thành Đạo, Trần Lê Ánh Thùy, và cộng sự đã tổng hợp 12 dẫn chất chalcon dị vòng (pyridinyl chalcon, furfuranyl chalcon và thiophenyl chalcon) và khảo sát tác động kháng vi khuẩn S.aureus, Strep.Faecalis, P.aeruginosae, E.coli và vi

26 nấm C.albicans Kết quả cho thấy nhóm chất chalcon dị vòng, đặc biệt là pyrinidyl- chalcon là nhóm tiềm năng đề phát triển chất kháng vi sinh vật mới Dẫn chất 1- pyridin-2-yl-3-(2-chlorophenyl)-2-propen-1-on có thể sử dụng làm chất “lead compound” để tổng hợp dãy chất mới có tác dụng kháng vi sinh vật[57]

Một số dẫn chất chalcon dị vòng đã đƣợc tổng hợp khác [24], [58]

1-(pyridin-2-yl)-3-(3-nitrophenyl)-2-propen-1–on;

1-(pyridin-2-yl)-3-(4-dimethylaminophenyl)-2-propen-1–on;

1- (pyridin-2-yl)-3-(3,4,5 trimethoxyphenyl)-2-propen-1–on;

1-(pyridin-2-yl)-3-(2-chlorophenyl)-2-propen-1–on;

1-(thiophen-2-yl)-3-(3-nitrophenyl)-2-propen-1-on;

1-(thiophen-2-yl)-3-(4-dimethylaminophenyl)-2-propen-1–on;

1-(furan-2-yl)-3-(3-nitrophenyl)-2-propen-1-on;

1-(furan-2-yl)-3-(4-dimethylaminophenyl)-2-propen-1-on;

1-(furan-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2-propen-1-on

Tổng quan về các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Theo quan niệm cũ kháng sinh là chất có nguồn gốc vi sinh vật có khả năng ức chế hoặc diệt vi sinh vật nhạy cảm ở nồng độ thấp (hàng mcg/ml) Định nghĩa này đƣợc đƣa ra bởi Waksman vào năm 1940 để phân biệt loại thuốc mới đƣợc khám phá là penicillin (một sản phẩm của các loài nấm Penicillium) với các chất sulfamid tổng hợp đã đƣợc phát hiện vào những năm 30 Sau đó khi các chất kháng khuẩn khác đƣợc biến đổi hay tổng hợp từ các nhân tự nhiên thì định nghĩa này không thể áp dụng đƣợc nữa [6]

Ngày nay, khái niệm “kháng sinh” đƣợc dùng để chỉ những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hay tổng hợp hoàn toàn có tác động kháng khuẩn ở nồng độ thấp [6] Chính vì vậy mà diện tìm kiếm các kháng sinh mới đƣợc mở rộng rất nhiều

1.4.1.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn

 Sự nhạy cảm, sự kìm khuẩn và diệt khuẩn [6]

- Sự kìm khuẩn là tình trạng vi khuẩn không tăng trưởng được (về số lượng) khi có mặt chất kháng khuẩn ở nồng độ nhất định

- Sự diệt khuẩn đạt đƣợc khi mật độ vi sinh vật thử nghiệm giảm xuống còn 0,1%

[hay 0,01% (Pháp)] so với ban đầu khi có mặt chất kháng khuẩn ở nồng độ nhất định

- Nhạy cảm là tình trạng của một vi sinh vật có thể bị ức chế hoặc bị tiêu diệt bởi một chất kháng khuẩn ở giới hạn nồng độ nhất định

 Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) và nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC)

 MIC (Minimum Inhibitory Concentration - nồng độ tối thiểu ức chế): là nồng độ thấp nhất của một chất kháng khuẩn, trong những điều kiện nhất định, ức chế sự tăng trưởng của một vi khuẩn thử nghiệm quan sát được bằng mắt thường

Nếu tiến hành trong những điều kiện nhất định, giá trị MIC tỷ lệ nghịch với năng lực kháng khuẩn của chất thử nghiệm và có thể dùng để so sánh giữa các chất kháng khuẩn với nhau

Thông qua MIC người ta có thể ước lượng được liều sử dụng của kháng sinh trong lâm sàng và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh [59], [60]

 MBC (Minimum Bactericidal Concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn) : là nồng độ thấp nhất của một chất kháng khuẩn, trong những điều kiện tiến hành nhất định, làm giảm mật độ vi khuẩn thử nghiệm xuống còn 0,01% [hoặc 0,1% ( ở các nước anglo-saxon)] so với ban đầu [59], [60]

MBC phản ánh khả năng diệt khuẩn của kháng sinh

Một kháng sinh đƣợc coi là diệt khuẩn khi có MBC gần với MIC hay khi MBC có thể đạt được tại điểm tác động khi dùng với liều thông thường, ngược lại thì đó là một kháng sinh kìm khuẩn [60]

MIC và MBC rất hữu ích khi nghiên cứu chất kháng khuẩn mới

MIC 50 , MIC 90 : là nồng độ kháng sinh ức chế đƣợc ít nhất 50% hay 90% số chủng của loài vi khuẩn khảo sát

Thông số này giúp ích cho việc theo dõi sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh sau khi lưu hành, giúp cho việc chọn lựa kháng sinh sử dụng trong điều trị.

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn

 Phương pháp đặt đĩa giấy

Thường áp dụng đối với kháng sinh có tác động trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ - đây là thử nghiệm đi trước thử nghiệm tìm MIC)

Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng một lớp huyền dịch vi khuẩn Chất thử s khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế Nhược điểm của phương pháp này là nếu thuốc thử và hóa chất khó khuếch tán vào bản thạch s làm sai lệch kết quả và phải tính toán phức tạp

Dùng đĩa thạch đã đƣợc tráng sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đường kính khoảng 2 mm đến đáy hộp Cho dung dịch thử vào các lỗ tròn, chất thử s khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo thành vùng ức chế quanh chỗ đục lỗ (vòng vô khuẩn) Phương pháp này có ưu điểm là nhanh chóng, dễ thực hiện và độ ổn định cao Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là nếu chất thử khó khuếch tán vào trong bản thạch s làm kết quả không ổn định Do đó phải thăm dò để tìm ra dung dịch đệm và môi trường để thuốc khuếch tán tốt

Kháng sinh đƣợc cho vào ống hình trụ, đặt vào bản thạch, kháng sinh s khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế xung

29 quanh nơi đặt kháng sinh Đo đường kính, đường kính này tỉ lệ nghịch với MIC, do đó ta có thể dựa vào đường kính này tra bảng đối chiếu để biết mức độ nhạy cảm của vi khuẩn

Trong các phương pháp trên, chất thử được coi là có tính kháng khuẩn nếu có vòng ức chế rõ ràng Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại thử nghiệm bằng phương pháp pha loãng

1.4.2.2 Phương pháp pha loãng (Dilution method) [63] [64]

Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trường đã pha sẵn chất thử nghiệm ở những nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đƣa vi khuẩn thử nghiệm vào Đem ấp ở 35-37 o C trong vòng 18–24h Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử s ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường s trong), ngược lại thì môi trường đục Phương pháp này có ưu điểm nhanh gọn, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được cho những chất dễ tan trong nước

 Phương pháp pha loãng trên thạch

Pha loãng chất thử vào môi trường còn ở dạng lỏng, đổ vào hộp petri Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ từ 18 – 24h Nếu có khóm vi khuẩn mọc lên thì chất thử không có tác dụng, nếu vi khuẩn không mọc thì chất thử có tác dụng ức chế Trường hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm, kiểm tra các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm (nhiệt độ, môi trường, chất nhũ hóa, dung môi hòa tan chất thử…) Tuy nhiên, để đảm bảo kết quả chính xác thì cần phải có kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên bản thạch và phương pháp này đòi hỏi số lượng vi khuẩn mỗi lần chấm là nhƣ nhau

Phương pháp xác định tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn

Phương pháp khuếch tán đĩa (phương pháp Kirby và auer)

Nguyên tắc: So sánh đường kính (mm) của vùng ức chế vi khuẩn khi chỉ có một kháng sinh và khi phối hợp hai hay nhiều kháng sinh sau khi ủ ở 35-37 o C/18h (National

Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002)

Phương pháp này không xác định được tỷ lệ kháng sinh phối hợp cho tác dụng hiệp đồng cao nhất.

Phương pháp bàn cờ (Checkerboard method)

Pha nồng độ của hai chất thử phối hợp với nhau theo tỉ lệ nhất định trong mỗi giếng của phiến 96 giếng và dao động xung quanh MIC (minimum inhibitory concentration) của mỗi chất thử

Trên phiến 96 giếng xem chiều ngang là nồng độ xác định của chất thử 1 phối hợp với cỏc chất thử 2 cú nồng độ giảm dần ẵ bắt đầu từ giếng chứa chất thử 1 và chất thử 2 có nồng độ gấp 2 lần MIC của mỗi chất, giếng tiếp theo nồng độ chất thử 1 giữ nguyên cũn chất thử 2 cú nồng độ giảm dần ẵ

Vi khuẩn khảo sát đƣợc pha với nồng độ 10 7 CFU/ml (colony forming unit) đƣợc chấm khoảng 1 - 2 àL lờn bề mặt tất cả cỏc giếng, ủ ở 35-37 o C/16 -18h

Song song tiến hành chấm vi khuẩn lên một mẫu chứng không chứa hai chất thử

Tính nồng độ ức chế riêng phần FIC (Fractional inhibitory concentration) của mỗi chất thử: [68] ô ô

FIC index = FIC CT1 + FIC CT2 (CT: chất thử)

FIC index  0,5 : hiệp đồng 0,5 < FIC index  1 : cộng hợp 1 < FIC index  2 : riêng r FIC index > 2 : đối kháng

31 Ưu điểm của phương pháp bàn cờ (checkerboard)

 Chất thử đƣợc pha loãng trực tiếp trên giếng

 Lƣợng mẫu sử dụng ít (mỗi giếng chứa 0,2 mL thạch chứa chất thử) nên rất phù hợp khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chất mới khi lƣợng mẫu ít

 Dễ thực hiện, khảo sát ở nhiều nồng độ chất thử khác nhau

 Dễ đọc kết quả, độ chính xác cao.

Phương pháp Time-kill

Phương pháp Time-Kill của thử nghiệm hiệp đồng được thực hiện bởi kỹ thuật pha loãng canh thang theo hướng dẫn của „National Committee for Clinical Laboratory Standards‟ (NCCLS) Kháng sinh đƣợc dùng đơn độc hay phối hợp trên một vi sinh vật

Hiệp đồng: khi giảm  2 log 10 CFU (colony forming unit) sau ủ 24h khi dùng phối hợp so với khi dùng kháng sinh hoạt tính đơn độc

Phương pháp này tốn thời gian và đòi hỏi nhiều công sức.

Phương pháp Epsilometter (E-Test)

Là phương pháp khuếch tán trên thạch khá mới E-test là một dải plastic được bao bởi một gradient nồng độ kháng sinh liên tục trên một mặt, mặt kia có thước chia tỷ lệ của kháng sinh Dải này đƣợc đặt trên bề mặt đĩa thạch có vi khuẩn và ủ qua đêm, một vùng ức chế phát triển hình elip hình thành xung quanh dải MIC đƣợc đọc ở chỗ giao nhau của vùng ức chế với dải Hiện nay, dải plastic của phương pháp E-test chưa phổ biến ở Việt Nam.

Tổng quan về độc tính tế bào và phương pháp xác định độc tính tế bào

Khái niệm về độc tính tế bào

Tính độc tế bào của một chất là khả năng của chất đó gây ra những tác động phá hoại trên các tế bào nhất định, đặc biệt khi tác động này liên quan đến sự ly giải tế bào do miễn dịch hoặc do tiếp xúc với các tác nhân kháng khối u để diệt chọn lọc các tế bào đang phân chia

Phương pháp xác định độc tính tế bào

Ngành công nghiệp dƣợc sử dụng rộng rãi các thử nghiệm độc tính tế bào để sàng lọc độc tính trên tế bào của các chất Đây là công cụ không thể thay thế của các nhà nghiên cứu trong quá trình sàng lọc các tác nhân có khả năng trị liệu ung thƣ, cũng như để xác định các tác động bất lợi của một chất nào đó trên tế bào trước khi phát triển thành dƣợc phẩm

Một trong những phương pháp để xác định độc tính tế bào là đánh giá tính toàn vẹn của màng tế bào, vì những chất có độc tính tế bào thường làm hư hại tính toàn vẹn này Các phẩm nhuộm sống như xanh trypan và propidium iodid thường bị thải trừ bởi các tế bào khỏe mạnh, tuy nhiên khi màng tế bào đã bị hƣ hại, các chất này dễ dàng đi qua màng và nhuộm màu lên các bào quan [70] Ngoài ra, tính toàn vẹn của màng tế bào cũng được xác định bằng cách theo dõi đường đi của các chất mà bình thường chúng đƣợc đƣa ra ngoài tế bào từ bên trong Lactat dehydrogenase (LDH) là một trong số đó, và enzym này thường được xác định bằng thử nghiệm LDH [71] Độc tính tế bào cũng có thể đƣợc xác định bằng thử nghiệm MTT (3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid) Các tế bào sống sót s khử MTT thành sản phẩm formazan có màu Xác định độ hấp thu của của dung dịch màu formazan này và suy ra khả năng gây chết tế bào của chất thử nghiệm Phẩm nhuộm huỳnh quang resazurin cũng được sử dụng trong một thử nghiệm tương tự

Ngoài phương pháp dùng phẩm nhuộm để đo thế khử từ đó xác định khả năng sống sót của tế bào, các nhà khoa học cũng đã phát triển phương pháp sử dụng ATP làm chỉ dấu sống sót [70] Các thử nghiệm dựa trên ATP gồm các thử nghiệm sinh phát quang (bioluminescent assay) trong đó ATP là chất giới hạn (limiting reagent) trong phản ứng luciferase [71] Độc tính tế bào cũng có thể đƣợc xác định bằng thử nghiệm sulforhodamin B (SRB), thử nghiệm WST và thử nghiệm clonogenic.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu

Các dẫn chất chalcon đã tổng hợp đƣợc chia thành các nhóm khác nhau căn cứ theo cấu trúc vòng A:

- Nhóm 01: có 9 dẫn chất chalcon với vòng A là nhân benzene không mang nhóm thế, ký hiệu là CH

- Nhóm 02: có 10 dẫn chất chalcon với vòng A là nhóm benzen mang nhóm OH ở vị trí 2‟, k hiệu HCH

- Nhóm 03: có 6 dẫn chất chalcon vớivòng A là nhân benzen có mang nhóm thế benzylamin Ký hiệu BCH

- Nhóm 04: có 10 dẫn chất chalcon vớivòng A là benzen có mang nhóm thế hydroxybenzylamin, ký hiệu HBCH

- Nhóm 05: có 7 dẫn chất chalcon với vòng A là nhân furan, k hiệu FCH - Nhóm 06: có 9 dẫn chất chalcon với vòng A là nhân thiopen, k hiệu TCH - Nhóm 07: có 9 dẫn chất chalcon vớivòng A là nhân pyridin, k hiệu PCH

- Nhóm 08: có 9 dẫn chất chalcon với vòng A là nhân phenothiazin, ký hiệu PTCH

Nguyên liệu và thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu 2.2.1.1 Nguyên liệu tổng hợp

Nguyên liệu từ các công ty hóa chất Merck, Across, Guangdong Guanghua, Sigma Andrich và các dung môi công nghiệp đƣợc sử dụng trực tiếp không tinh chế lại, đƣợc trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong tổng hợp chalcon

Tên hóa chất Xuất xứ Hàm lƣợng

Acros Organics Acros Organics Acros Organics Across Organic

Diclorometan Trung Quốc > 99,5 % n – Hexan Trung Quốc > 99,5 %

Bản mỏng silicagel GF 254 tráng sẵn của Merck

Các dung môi chạy sắc ký: cloroform, methanol, n- hexan, aceton, toluen,… đƣợc cung cấp từ công ty hóa chất Guangdong Guanghua và sử dụng trực tiếp không tinh chế lại

2.2.1.3 Nguyên liệu thử vi sinh

Các chủng vi khuẩn chuẩn do bộ môn Vi - K sinh (Khoa Dƣợc - Đại học Y Dƣợc Tp.HCM) cung cấp:

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn được cung cấp từ công ty Merck:

 Môi trường phân lập và giữ gốc vi khuẩn: Tryptic Soy Agar (TSA)

 Môi trường hoạt hóa vi khuẩn: Canh thang Tryptic Soy Broth (TSB)

 Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn: Thạch Mueller-Hinton (MHA)

Các môi trường này được cung cấp dưới dạng bột khô, khi sử dụng hòa tan vào nước theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các môi trường thạch phải đun nóng cho thạch tan, tiệt trùng ở nhiệt độ 121 o C trong 15 phút bằng lò hấp Môi trường đã đun nóng nhưng chưa sử dụng được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 o C để tránh mất nước

2.2.2 Thiết bị 2.2.2.1 Trang thiết bị dùng trong tổng hợp

Cân phân tích Kern Abs 220-4 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA C-MAG HS10, phễu Buchner, sinh hàn, ơm chân không TPR-6 Woosung, Korea

Dụng cụ thủy tinh (erlen, becher, ống đong …) Tủ hút, tủ sấy Memmert 500, Allemand

Bình khai triển sắc ký, bản mỏng silicagel GF 254 tráng sẵn Merck, mao quản, pipet

2.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng trong kiểm nghiệm Đ n UV 254/365 Máy đo điểm chảy Stuart SMP10, Anh Máy đo phổ UV-Vis Shimadzu UV-2500, Nhật Máy đo IR FTIR 8101 Shimadzu, Nhật

Máy cộng hưởng từ Bruker AC (500 MHz) Máy đo phổ LC-MS IT TOF

2.2.2.3 Thiết bị dụng cụ dùng trong thử vi sinh

 Lò hấp tiệt trùng, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, máy đo quang Novaspec Plus

 Ống nghiệm, pipet, micropipet, eppendorft, bếp cách thủy, que cấy, que bông, đ n cồn, bông gòn…

 Tất cả đều được hấp tiệt trùng trước khi sử dụng.

Phương pháp nghiên cứu

Phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt là lựa chọn tối ƣu vì dễ tiến hành và có thể tạo ra số lượng lớn các dẫn chất của chalcon Phản ứng được tiến hành tương đối đơn giản nhƣng hiệu quả, cho phép tạo thành liên kết đôi cacbon-cacbon không phụ thuộc vào độ phức tạp trong cấu trúc các phân tử tham gia ngƣng tụ Chính vì vậy trong phạm vi luận án này chúng tôi chọn phương pháp ngưng tụ Claisen-Schmidt để tổng hợp các nhóm chalcon và dẫn chất

Phản ứng tổng hợp các dẫn chất của chalcon đƣợc tiến hành bằng phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt giữa dẫn chất acetophenon và dẫn chất benzaldehyd thích hợp, tất cả các phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong môi trường kiềm với dung môi là methanol

Sơ đồ 2.1 Phản ứng ngƣng tụ Claisen-Schmidt tạo chalcon

Cho vào erlen dẫn chất acetophenon và dẫn chất benzaldehyd với tỷ lệ mol 1:1 Đặt bình phản ứng lên bếp khuấy từ Hòa tan từ từ hỗn hợp nguyên liệu ban đầu với một lượng tối thiểu methanol Sau đó cho từ từ lượng KOH tương đương 2 lần số mol dẫn chất acetophenon vào hỗn hợp trên Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng, dung môi khai triển n-hexan : aceton (5:2) cho đến khi phản ứng kết thúc Acid hóa từ từ hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl đậm đặc đến pH ≈ 4 Tủa hình thành được lọc, rửa bằng nước lạnh Tủa được kết tinh lại trong hỗn hợp MeOH – cloroform (1:1), lọc, sấy sản phẩm ở 40 o C

Cho 2-acetylphenothiazin (4 mmol) và các dẫn xuất benzaldehyd (4 mmol) vào bình cầu Thêm DMSO tối thiểu để hòa tan hoàn toàn hỗn hợp rắn Hỗn hợp sau đó đƣợc khuấy trên máy khuấy từ, không gia nhiệt Thêm từng giọt dung dịch NaOH 1M (0,25g NaOH hòa tan trong 3ml nước cất, sau đó thêm 3 mL DMSO) đến khi thấy dung dịch chuyển sang màu đỏ đen thì thêm 3 giọt dung dịch NaOH Chấm sắc ký lớp mỏng, theo dõi phản ứng cách mỗi 15 phút Cứ sau 3h, nếu nguyên liệu vẫn còn thì thêm 1 giọt dung dịch NaOH 1M Kết thúc phản ứng khi một trong hai vết nguyên liệu thấy không còn hay rất mờ trên bản mỏng khi chấm sắc ký

Dịch phản ứng được cho vào becher chứa 200 ml nước cất Khi thấy tủa mịn xuất hiện, hỗn hợp đƣợc khuấy trên máy khuấy từ, không gia nhiệt Sau đó cho từ từ dung dịch acid acetic vào, đến pH khoảng 4 – 5 Sau đó hỗn hợp đƣợc làm lạnh trong 12h, lọc lấy tủa Tủa này được rửa với nhiều nước, sản phẩm thu được mang đi sấy áp suất giảm ở nhiệt độ 50 o C hoặc đƣợc hút ẩm trong bình hút ẩm

Trong luận án này, phương pháp kết tinh lại được dùng để tinh chế sản phẩm Dùng một lƣợng hỗn hợp dung môi methanol-cloroform (1:1) tối thiểu để hòa tan sản phẩm, đun nóng cho tan hoàn toàn, lọc nóng Để nguội, làm lạnh dịch lọc, sản phẩm s kết tinh trở lại Lọc thu tủa, sấy ở 40 o C, thu đƣợc sản phẩm tinh khiết

2.3.3 Phương pháp kiểm nghiệm 2.3.3.1 Xác định nhiệt độ nóng chảy

Chất thử đƣợc nhồi trong ống mao quản, đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuart SMP10, Anh Đo 3 lần, lấy giá trị trung bình

Sử dụng bảng nhôm tráng sẵn silicagel (Merk) Dịch chấm hòa tan trong dicloromethan hoặc methanol

Hệ dung môi dùng để khai triển sắc ký: tùy thuộc vào loại dẫn chất chalcon mà sử dụng các hệ sau với tỉ lệ dung môi thích hợp:

- Hệ 1: n- hexan : aceton - Hệ 2: cloroform : methanol - Hệ 3: toluen : aceton

- Hệ 4: n-hexan : ethyl acetat - Hệ 5: n-hexan : dicloromethan

Phát hiện vết bằng máy soi UV 254 – 365 nm Chất thử đƣợc xem là tinh khiết khi R f sản phẩm khác R f nguyên liệu và trên sắc k đồ không có vết lạ

Mỗi chất đều đƣợc kiểm tra với 03 hệ dung môi Trên sắc k đồ của 03 hệ dung môi này, các vết sản phẩm phải tách biệt với nguyên liệu (thể hiện qua giá trị R f ) và không có vết phụ

Phổ tử ngoại UV đƣợc xác định trên máy UV-2010 Spectrophotometer của Shimadzu

Dùng dung môi methanol pha dịch chấm sắc ký ở nồng độ 1%

Với chalcon và các dẫn chất thì phổ hấp thu tử ngoại có 3 đỉnh hấp thu đặc trƣng nằm trong các dãy: 310-390 nm, 225-260 nm, 203-215 nm

Sử dụng phương pháp dập viên KBr Chất thử được trộn với KBr và nghiền mịn trên cối mã não, sau đó ép trên máy nén để tạo viên K r Đo trên máy FTIR 8101 của Shimadzu (Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh) Phổ IR cho thấy sự có mặt của các đỉnh đặc trƣng của các nhóm chức trong phân tử

Bảng 2.2 Một số đỉnh IR đặc trƣng [73]

Kiểu dao động Tần số (cm -1 ) Kiểu dao động Tần số (cm -1 ) ν O-H 3650 - 3200 ν C-O- 1300 - 1000 ν C-H 3300 - 2900 ν C=N 1690 - 1630 ν C=O 1850 - 1630 ν C-Cl 800 - 600 ν C=C ~ 1600 ν N-H 3500 - 3300

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR)

Phổ 1 H- NMR ghi bằng máy Bruker AC-500 MHz, Viện Hàn lâm Khoa Học và công nghệ Việt Nam Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu diễn bằng giá trị ppm theo chiều giảm dần đối chiếu với chất chuẩn nội tetra methylsilan

Số lượng pic: tương ứng với số proton trong phân tử, lưu đến yếu tố đối xứng và tương đương

Hình dạng pic và hằng số ghép J (Hz): tương tác spin-spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau s cho các kiểu ghép vân phổ và hằng số ghép tương ứng

Các đỉnh phân nhánh đƣợc ký hiệu: s: đỉnh đơn d: đỉnh đôi t: đỉnh ba m: đa đỉnh

Trong cấu trúc của chalcon và dẫn chất có hai vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3 carbon mang nhóm etylen C  và C  Độ dịch chuyển hóa học trong phổ 1 H-NMR của nguyên tử H  và H  dao động trong khoảng 7-9ppm [28]

Chalcon có thể tồn tại ở cấu hình E hoặc Z, thông thường đồng phân E ổn định hơn về mặt nhiệt động Phổ 1 H-NMR của nguyên tử H  và H  có xuất hiện đỉnh đôi với hằng số ghép (coupling constant) J có giá trị trong khoảng 14-16Hz thì chalcon tồn tại ở cấu hình E, J có giá trị