thái vũ thảo nguyên nghiên cứu biện pháp giảm kích thước tiểu phân mangiferin sử dụng thiết bị nghiền bị kiểu hành tinh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Võ Quốc Ánh và TS Đào Văn Nam đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, chỉ dạy, luôn luôn tạo động lực, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, giúp em trang bị, tích lũy thêm nhiều kiến thức, kĩ năng vô cùng quý giá

Em xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Hóa lý nói riêng, Khoa Bào chế - Công nghệ Dược phẩm nói chung và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ để em thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo và các phòng ban, các thầy cô, cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt đến bạn Dương Thị Thùy Linh, bạn Nguyễn Minh Hằng, bạn Nguyễn Thị Nhẫn, bạn Dương Quang Quý và Nguyễn Thị Nhung cùng các anh chị khóa trên và các em khóa dưới, đặc biệt em Thảo, Chi, Nhung, Hoàng, Ngọc, Phúc, Thúy, Tuấn Anh trong nhóm nghiên cứu Bộ môn Hóa lý, các bạn Bộ môn Bào chế và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã luôn đồng hành, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân luôn ủng hộ, động viên em trong những năm tháng học tập và rèn luyện tại trường Đại học Dược Hà Nội

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024 Sinh viên

Thái Vũ Thảo Nguyên

1.2.3.Ưu điểm và nhược điểm 5

1.2.4.Độ ổn định của dạng bào chế hỗn dịch nhỏ mắt và một số biện pháp làm tăng độ ổn định 6

1.3 Phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh trong kĩ thuật bào chế hỗn dịch 9

1.3.1.Thiết bị nghiền bi hành tinh 10

1.3.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP trong quá trình nghiền bi kiểu hành tinh……… 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1.Nguyên vật liệu 13

2.1.2.Thiết bị 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1. Phương pháp bào chế 14

2.3.2.Các phương pháp đánh giá 18

2.3.3.Phương pháp xử lý kết quả 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xây dựng đường chuẩn để định lượng mangiferin bằng phương pháp HPLC ……… 23

3.2 Nghiên cứu biện pháp tăng độ ổn định của mangiferin trong quá trình

3.3.1.Khảo sát, lựa chọn các thông số quy trình nghiền 26

3.3.2.Khảo sát, lựa chọn yếu tố về công thức nghiền 30

3.3.3.Đánh giá ảnh hưởng của thông số quy trình nghiền đến phân bố KTTP MGF ……… 32

3.4 Đánh giá một số đặc tính của hỗn dịch mangiferin 2% định hướng nhỏ mắt ………… 37

3.4.1.Đánh giá hình thức cảm quan, pH, ASTT 38

3.4.2.Đặc điểm cấu trúc mangiferin trong hỗn dịch 39

3.4.3.Phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) 42

3.4.4.Đánh giá khả năng hòa tan dược chất từ hỗn dịch 43

3.4.5.Ảnh hưởng của hỗn dịch lên pH, ASTT của môi trường hòa tan 45

3.4.6.Theo dõi độ bền trạng thái tập hợp của hỗn dịch 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AcOH Acid acetic

ACN Acetonitril ASTT Áp suất thẩm thấu BCS Hệ thống phân loại sinh dược học

(Biopharmaceutics classification system) CDH Chất diện hoạt

CTKS Công thức khảo sát DSC Quét nhiệt lượng vi sai (Differential scanning calorimetry) DĐVN Dược điển Việt Nam

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FTIR Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier Transform Infrared)

LLOQ Giới hạn định lượng dưới RSD Độ lệch chuyển tương đối (Relative standard deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13

Bảng 2.2 Các thiết bị, dụng cụ dùng trong thực nghiệm 13

Bảng 2.4 Công thức khảo sát 2 (CTKS 2) 16

Bảng 2.5 Công thức khảo sát 3 (CTKS 3) 16

Bảng 3.1 Nồng độ dung dịch chuẩn MGF diện tích píc tương ứng 23

Bảng 3.2 Đánh giá sự phân hủy MGF trong dịch ly tâm bằng HPLC 24

Bảng 3.3 Đánh giá sự phân hủy MGF trong cắn rắn sau ly tâm tại bước sóng 258 nm ……… 24

Bảng 3.4 Kết quả KTTP của hỗn dịch nghiền với các biện pháp ổn định khác nhau 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kích thước bi đến hỗn dịch KTTP MGF 26

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tốc độ nghiền đến phân bố KTTP hỗn dịch MGF 27

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ (hỗn dịch : bi) đến phân bố KTTP hỗn dịch MGF 29

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ CDH và nồng độ polyme đến phân bố KTTP MGF 31

Bảng 3.9 Các thông số cơ bản của quy trình nghiền làm nhỏ MGF 32

Bảng 3.10 Các biến đầu vào và khoảng biến thiên tương ứng 32

Bảng 3.11 Kí hiệu và đơn vị của các biến đầu ra 33

Bảng 3.12 Các công thức thí nghiệm được thiết kế theo mô hình Full Fac (2 levels) và phân bố KTTP của MGF sau nghiền tương ứng (n=3) 33

Bảng 3.13 Các tham số thống kê trong mô hình hồi quy 34

Bảng 3.14 Hệ số tương quan và giá trị p của các biến đầu vào 35

Bảng 3.15 Công thức khảo sát loại polyme và nồng độ NaCl 37

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá hình thức cảm quan, ASTT, pH và phân bố KTTP của hỗn dịch MGF 2 % định hướng nhỏ mắt 38

Bảng 3.17 Kết quả thay đổi pH của dịch thử hòa tan theo thời gian 46

Bảng 3.18 Kết quả thay đổi ASTT của dịch thử hòa tan theo thời gian 46

Bảng 3.19 Phân bố KTTP MGF của hỗn dịch 2% ngay sau nghiền và sau 30 ngày bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm 46

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức hóa học của mangiferin 2

Hình 1.2 Hình mô phỏng cấu tạo thiết bị nghiền bi hành tinh 10

Hình 2.1 Cấu tạo thiết bị thử hòa tan kiểu khuấy 20

Hình 2.2 Cấu tạo thiết bị thử hòa tan kiểu buồng dòng chảy (FTC) 21

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của MGF 23

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng kích thước bi và thời gian nghiền 27

Hình 3.3 Tốc độ và thời gian nghiền ảnh hưởng đến giá trị D[4,3] và SPAN của HD MGF 28

Hình 3.4 Biểu đồ phân bố KTTP của HD MGF khi thay đổi thời gian nghiền của thiết bị Mastersizer 3000 286

Hình 3.5 Đồ thị biển diễn ảnh hưởng của tỉ lệ ( hỗn dịch : bi ) và thời gian nghiền đến giá trị D[4,3] và SPAN của hỗn dịch MGF 30

Hình 3.6 Đồ thị biển diễn ảnh hưởng của nồng độ (polyme và CDH) 31

Hình 3.7 Đồ thị đường đồng mức thể hiện ảnh hưởng của: kích thước bi - tốc độ nghiền; kích thước bi - thời gian nghiền; vận tốc nghiền - tốc độ nghiền đến D[4,3] (a,b,c) và D50 (d,e,f) 36

Hình 3.8 Đồ thị đường đồng mức thể hiện ảnh hưởng của vận tốc – tốc độ nghiền, kích thước bi – thời gian nghiền, kích thước bi – vận tốc nghiền đến giá trị D90 37

Hình 3.9 Hỗn dịch trên KHV HD 2% (Ca1, Ca2, Ca3) ở vật kính 10, thang đo 100 μm và (H1, H2, H3) ở vật kính 40, thang đo 1 μm 38

Hình 3.10 Giản đồ phân tích nhiệt của nguyên liệu MGF (a) 40

Hình 3.11 Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu nguyên liệu MGF và CT HD N1, N5, N7 41

Hình 3.12 Phổ IR của nguyên liệu MGF; hỗn hợp vật lý và mẫu HD tương ứng chứa Carbopol (A) và HPMC E6 (B) 42

Hình 3.13 Tỉ lệ MGF hòa tan từ hỗn dịch chứa Carbopol (Ca1, Ca2, Ca3) thử bằng phương pháp khuấy với các tốc độ khác nhau 43

Hình 3.14 Phương pháp kiểu khuấy (khuấy từ đặt ở đáy) và tỉ lệ hòa tan MGF từ hỗn dịch chứa Carbopol (Ca1, Ca2, Ca3) 44

Hình 3.15 Tỉ lệ MGF hòa tan thử bằng phương pháp FTC từ HD chứa Carbopol (Ca1, Ca2, Ca3) với tốc độ 0,05 ml/phút (A) và HD chứa HPMC E6 (H1, H2, H3) với tốc độ 0,03ml/phút (B)……….………452

ĐẶT VẤN ĐỀ

Điều trị các bệnh lý nhãn khoa gặp nhiều khó khăn do chỉ một phần dược chất đến được đích tác dụng Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng trên là do sự phức tạp về mặt giải phẫu của mắt, bên cạnh đó, các hoạt động của mắt như chớp mắt, tiết nước mắt sinh lý hoặc bệnh lý làm thuốc nhanh chóng bị rửa trôi, giảm sự lưu thuốc tại mắt và do đó giảm sinh khả dụng của thuốc Các nghiên cứu tăng khả năng lưu giữ thuốc trên bề mặt giác mạc là rất cần thiết và được quan tâm do đây là vấn đề cốt lõi để thuốc phát huy hiệu quả điều trị Hỗn dịch nhỏ mắt có thể cải thiện hiệu quả điều trị nhờ tăng độ bám dính của dược chất trước giác mạc nhờ các thành phần tá dược phù hợp Hơn nữa, tiểu phân dược chất được lưu giữ trong túi cùng giác mạc đóng vai trò như kho dự trữ giúp thuốc hòa tan từ từ, kéo dài thời gian lưu và do đó tăng hiệu quả điều trị tại mắt Kích thước tiểu phân (KTTP) dược chất là một thuộc tính quan trọng ảnh hưởng trực

tiếp đến tính tương hợp với chế phẩm của mắt, sự lưu thuốc và sự hòa tan in vivo, do đó

KTTP cần được kiểm soát chặt chẽ trong công thức hỗn dịch

Mangiferin (MGF) là một hoạt chất có tiềm năng trong điều trị hiệu quả viêm kết - giác mạc do vi rút Herpes Simplex (HSV), bao gồm các chủng kháng thuốc [54], [69] Tuy nhiên, MGF là một chất thuộc nhóm tan kém - thấm kém, do vậy cần thiết phải áp dụng các biện pháp tăng sinh khả dụng Giảm KTTP là một kỹ thuật thường được ứng dụng để cải thiện đặc tính hóa lý của dược chất Kỹ thuật nghiền bi là lựa chọn phổ biến có hiệu quả làm giảm KTTP cao và giảm tác động của nhiệt độ so với khi sử dụng một số thiết bị khác như siêu âm đầu dò [63]

Nhằm góp phần vào việc khai thác tiềm năng của MGF nói chung và cải thiện hiệu quả của chế phẩm hỗn dịch nhỏ mắt chứa mangiferin nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biện pháp giảm kích thước tiểu phân mangiferin sử dụng thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh” với ba mục tiêu:

1 Lựa chọn được biện pháp tăng độ ổn định MGF trong quá trình nghiền ướt 2 Xây dựng được công thức hỗn dịch và đánh giá được ảnh hưởng của một số thông số quy trình nghiền đến khả năng làm giảm KTTP

3 Đánh giá được một số đặc tính chất lượng của hỗn dịch

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về nguyên liệu mangiferin

1.1.1 Nguồn gốc

MGF có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật như Mangifera indica L,

Anacardiaceae; Mangifera sylvatica, Anacardiaceae [58]; Cyclopia genistoides, Podalyrieae [29]; H montanum L, Hypericoideae [40] Tại Việt Nam, hàm lượng MGF

được phát hiện là 1,6% trong lá và 3% trong vỏ thân của cây xoài Mangifera indica L,

được trồng chủ yếu miền Nam và một số tỉnh phía Bắc như Sơn La Phương pháp phân lập bằng dùng dung môi methanol chiết siêu âm mangiferin từ lá cây xoài đem lại hiệu

suất thu nhận hợp chất cao nhất (6,46%) [11], [49]

1.1.2 Công thức hóa học, tính chất vật lý

Mangiferin là hợp chất polyphenol đa vòng thuộc nhóm C-glycosylxanthone có cấu trúc phân tử được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1 Công thức hóa học của mangiferin

- Tên khoa học: 2-C-β-D-glucopyranozido-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon [5] - Công thức phân tử: C19H18O11 Khối lượng phân tử: 422,34 g/mol

- Cảm quan: bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, gần như không mùi - Độ tan: hơi tan trong hỗn hợp aceton - nước (1:1); tan kém trong ethanol và nước;

không tan trong một số dung môi không phân cực như n-hexan hay diethyl ether [5]

- Chỉ số pKa: 6,52; 7,97; 9,44; 12,10 MGF thể hiện tính acid yếu [35] - Hệ số phân bố dầu/nước: LogP = 2,73 [64]

- Nhiệt độ nóng chảy: 271 oC [54]

1.1.3 Đặc điểm dược động học:

Căn cứ theo hệ thống phân loại Sinh dược học (BCS), mangiferin là nhóm thuốc IV có độ tan kém, tính thấm qua màng kém làm hạn chế sinh khả dụng (SKD) đường uống Thử nghiệm trên chuột Wistar cho thấy, khi chuột được uống một liều MGF duy nhất (30 mg/kg), SKD tương đối thấp (1,15%) Tuy nhiên, khả năng được hấp thu của MGF được tăng cường khi thuốc được tiêm qua màng phúc mạc, nồng độ trong huyết tương nhanh chóng đạt 60,83 ± 16,32 ug/mL sau 0,46 giờ và thời gian bán thải là 1,38

± 0,45 giờ [38] MGF được chuyển hóa qua gan và bị phân hủy nhanh bởi hệ vi khuẩn

đường ruột Bacteroides qua các phản ứng khử glycosyl hóa thành aglycon, methyl hóa,

glucuronid hóa, sulfat hóa, Sản phẩm chất chuyển hóa chính có hoạt tính dược lý như norathyriol và 1,7-dihydroxyaxanton [60] Trong cơ thể, MGF phân bố ở nhiều mô (gan, ruột non, lá lách, phổi, tinh hoàn,…) và có thể đi qua được hàng rào máu não - võng mạc chỉ sau một liều duy nhất [37] Nồng độ MGF được phát hiện trong mô mắt chuột (nồng độ 0,34 ± 0,13 ug/mL tại thời điểm 7 giờ sau khi uống [68]) và trong nước mắt thỏ (nồng độ 0,15 μg/mg tại thời điểm 4 giờ sau khi nhỏ thuốc [15]) Các kết quả này cho thấy MGF có thể vượt hàng rào máu – võng mạc và phù hợp để ứng dụng điều trị các bệnh lý về mắt

1.1.4 Tác dụng dược lý

Hiện nay, mangiferin được dùng với chỉ định chính là điều trị các bệnh Herpes cấp tính và tái phát, thủy đậu, eczema Caposi và các bệnh ở miệng do virus gây ra [7] MGF có khả năng về kháng HSV và tác dụng thể hiện mạnh trên nhiều chủng, bao gồm các chủng kháng thuốc theo nhiều cơ chế khác nhau MGF ức chế tốt virus HSV-1 và HSV-2 đồng thời có tác dụng kích thích miễn dịch trên cả hai loại miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Theo tác giả Zheng Min-shi, mangiferin và đồng phân isomangiferin có khả năng ức chế trực tiếp giai đoạn nhân lên của virus trong tế bào vật chủ ở chủng HSV-1 nên đáp ứng hiệu quả điều trị bệnh lý viêm giác mạc do HSV-1 [69] Bên cạnh đó MGF gián tiếp ức chế HSV-2 ở giai đoạn sau nhân lên của virus [54] Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm thuốc mỡ tra mắt chứa MGF 1% có hiệu quả điều trị đối với bệnh nhân bị viêm giác mạc do HSV-1 [69]

Khi thực hiện nghiên cứu trên tế bào Vero bị nhiễm virus, chỉ số chọn lọc tế bào nhiễm virus cao, điều này cho thấy dược chất ức chế tốt virus mà không gây độc đáng kể đến tế bào chủ MGF có tác dụng kháng chủng HSV-1 AR-29 (kháng acyclovir) mạnh hơn so với chủng HSV-1 KOS (nhạy cảm acyclovir), thể hiện qua chỉ số chọn lọc tế bào nhiễm cao hơn Sự khác biệt này có thể do cơ chế tác động giữa MGF và acyclovir là khác nhau, trong đó MGF thay đổi cấu trúc hóa học protein vỏ của HSV-1 và ngăn cản sự bám của virus vào receptor trên màng tế bào vật chủ thông qua tương tác của dược chất với glycoprotein tích điện dương hoặc heparan sulfat tích điện âm Vì thế MGF là một tiềm năng lớn để đáp ứng điều trị các trường hợp HSV đã kháng acyclovir và tránh được sự kháng chéo thuốc của virus đối với các dẫn chất của acyclovir [51]

Bên cạnh đó, MGF còn có một số tác dụng dược lý khác như chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thận gan, chống tiểu đường, chống hen suyễn, điều hòa miễn dịch, chống ung thư và hạ cholesterol máu Ngoài ra, các đánh giá độc tính của MGF đã được thực hiện trên động vật và tế bào người cho

thấy không phát hiện độc tính với gen, đột biến nhiễm sắc thể, không gây độc tính cấp đường uống ở chuột [52] Thuốc chứa MGF được dung nạp tốt, không có hoặc ít có tác dụng phụ, không độc tính và tỉ lệ kháng thuốc thấp nên an toàn cho người sử dụng

1.1.5 Một số nghiên cứu cải thiện đặc tính của mangiferin đối với chế phẩm bào chế cho đường dùng ở mắt

Năm 2012, để tăng hiệu quả điều trị bệnh đục thủy tinh thể, tác giả Rui Lui và cộng sự đã nghiên cứu phát triển dạng tiểu phân nano lipid (NLC) chứa MGF nhằm cải thiện sinh khả dụng ở mắt của MGF như khả năng thấm qua giác mạc tăng gấp 4,31 lần, khả năng dung nạp ở mô mắt tăng gấp 5,69 lần so với dạng dung dịch ở các thử nghiệm

in vivo [45] Nghiên cứu năm 2022 của cùng nhóm tác giả đã công bố cải tiến dạng bào

chế NLC MGF bằng cách sử dụng lipid rắn compritol 888 ATO và lipid lỏng miglyol 812 để tăng cường đặc tính chống oxy hóa của MGF đồng thời không gây kích ứng cho mô mắt [53]

Ở Việt Nam, năm 2002, công ty Dược Trung ương Huế đã sản xuất thành công thuốc mỡ tra mắt MGF 2%, tuy nhiên vì nhược điểm thuốc mỡ gây bất tiện cho người sử dụng, các nghiên cứu về dạng bào chế thay thế khác vẫn được tiếp tục quan tâm [14] Từ năm 2010 đến 2015, công ty Cổ phần Dược Trung ương Medipharco -Tenamyd đã công bố kỹ thuật bào chế hỗn dịch nhỏ mắt MGF 2% bằng phương pháp phân tán cơ học nhưng khi thử nghiệm tiền lâm sàng trên 30 thỏ, kết quả có 25 thỏ không kích ứng và 5 thỏ kích ứng nhẹ [8] Năm 2016, tác giả Đào Văn Nam đã xây dựng được công thức và phương pháp bào chế hỗn dịch nhỏ mắt nano mangiferin đông khô, khi sử dụng thêm môi trường phân tán để tạo hỗn dịch lỏng 0,2% bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi Chế phẩm thử tính kích ứng trên 3 mắt thỏ thử nghiệm theo hướng dẫn của OECD 405 cho kết quả cả 3 thỏ đều không bị kích ứng và không có tổn thương tại mắt được ghi nhận [9]

Mangiferin cũng đã được làm giảm KTTP bằng thiết bị nghiền bi có khuấy (quy mô 5 g/mẻ), sau đó được phối hợp với các tá dược ổn định để tạo hỗn dịch MGF 2% định hướng nhỏ mắt [12] Hỗn dịch chứa các phân đoạn tiểu phân có kích thước khác

nhau được chứng minh là có khả năng hòa tan tốt khi thử in vitro và in vivo trên mắt thỏ,

có khả năng lưu thuốc trước giác mạc đến 4 giờ sau khi nhỏ thuốc [15] Ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, chất chống oxy hóa, pH, hệ đệm và ánh sáng đến sự phân hủy MGF trong dung dịch cũng đã được nghiên cứu và công bố, đây là tiền đề trong việc phát triển sản phẩm cũng như lựa chọn các điều kiện trong phân tích đánh giá chất lượng của các chế phẩm chứa MGF [10]

1.2 Tổng quan về hỗn dịch dùng trong nhãn khoa

- Môi trường phân tán thường dùng nhất là nước để pha thuốc tiêm, ngoài ra có thể dùng dung môi thân nước, dầu thực vật, triglycerid trung bình hoặc đồng dung môi

- Chất ổn định dược chất: chất chống oxy hóa và chất hiệp đồng chống oxy hóa… - Chất ổn định hỗn dịch: chất gây thấm, chất gây phân tán, chất tăng thế zeta, chất làm tăng nhớt…

- Chất điều chỉnh pH, chất điều chỉnh độ đẳng trương, chất sát khuẩn…[2],[17]

1.2.3 Ưu điểm và nhược điểm

HD nhỏ mắt giúp tăng thời gian lưu thuốc trên mắt Tiểu phân dược chất trong HD nhỏ mắt khó bị rửa trôi bởi nước mắt và lưu lại trước vùng giác mạc có tác dụng giống như một kho dự trữ và bổ sung dung dịch bão hòa để quá trình khuếch tán xảy ra liên tục, từ đó làm tăng thời gian lưu trước giác mạc, kéo dài tác dụng của thuốc Do đó, sinh khả dụng của thuốc thường cao hơn và kéo dài hơn so với dạng dung dịch nhỏ mắt có cùng nồng độ [2],[65]

So với dạng thuốc mỡ, gel tra mắt, HD nhỏ mắt không làm mờ mắt tạm thời khi sử dụng, đồng thời khả năng phân liều chính xác nên tăng tăng hiệu quả điều trị bệnh

1.2.3.2 Nhược điểm

Dạng bào chế HD không phù hợp với dược chất không bền trong môi trường nước, thay vào đó có thể tiến hành bào chế dược chất dưới dạng bột pha để pha hỗn dịch trước khi dùng [2]

Hỗn dịch nhỏ mắt là hệ phân tán dị thể, không bền về mặt nhiệt động học Các hiện tượng thường gặp trong quá trình bảo quản là hiện tượng kết tụ, sa lắng, đóng bánh Khả năng phân tán hỗn dịch đồng nhất trở lại phụ thuộc vào biện pháp ổn định sử dụng trong quá trình bào chế, và ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân liều cũng như hiệu quả điều trị bệnh [2] Ngoài ra, sự thay đổi của KTTP dược chất do tác động của nhiệt độ trong quá trình bào chế (nghiền làm nhỏ KTTP sinh nhiệt, tiệt khuẩn thuốc bằng nhiệt như nhiệt ẩm) hoặc do sự chuyển dạng thù hình của dược chất khi bảo quản cũng làm thay đổi đặc tính chất lượng chế phẩm, ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc [50]

1.2.4 Độ ổn định của dạng bào chế hỗn dịch nhỏ mắt và một số biện pháp làm tăng độ ổn định

Độ ổn định thuốc là khả năng của thuốc giữ được những đặc tính vốn có về vật lý, hóa học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới hạn quy định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc trong quá trình sản xuất và bảo quản trong điều kiện xác định [4] Đây là nhân tố quan trọng có ảnh hưởng đến chất lượng, an toàn và hiệu quả của thành phẩm thuốc [1]

Hỗn dịch thường được đánh giá độ ổn định trên các tiêu chí chính, bao gồm: hình thức cảm quan, sự phân bố KTTP, khả năng tái phân tán của hỗn dịch, hàm lượng dược chất và tạp phân huỷ, pH, độ nhớt, các đặc tính lưu biến, giới hạn vi sinh vật, tiểu phân lạ và hàm lượng chất bảo quản [1] Trong đó, độ ổn định về phân bố kích thước tiểu phân và hàm lượng là 2 yếu tố cần phải kiểm soát chặt chẽ ngay từ quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm

1.2.4.1 Độ ổn định vật lý

Hỗn dịch là hệ phân tán dị thể, thường xảy ra các hiện tượng kết tụ, sa lắng và đóng bánh của các tiểu phân dược chất rắn, dẫn đến không có khả năng tái phân tán đồng nhất trở lại [5] Xu hướng sa lắng xảy ra khi tỉ trọng của tiểu phân dược chất lớn hơn tỉ trọng của môi trường phân tán Ngoài ra, việc giảm KTTP làm tăng diện tích bề mặt, tăng năng lượng tự do Gibbs của hệ, do vậy hỗn dịch có nguy cơ bị kết tụ tiểu phân và tăng kích thước tiểu phân [22] Hỗn dịch còn có thể xảy ra sự kết tụ Ostwald do chênh lệch nồng độ dược chất bão hòa ở lớp khuếch tán của các tiểu phân có kích thước khác

nhau, điều này dẫn đến hòa tan các tiểu phân nhỏ và tăng kích thước các tiểu phân lớn [59],[67]

Để đảm bảo hỗn dịch dễ dàng tái phân tán đồng nhất trở lại, cần đảm bảo các tiểu phân được bảo vệ, tránh kết tập và tăng kích thước Việc sử dụng chất ổn định, bao gồm chất ổn định không gian hoặc ổn định tĩnh điện có tác dụng giảm năng lượng tự do của hệ, giảm khả năng va chạm tiểu phân [46] Có thể tạo liên kết lỏng lẻo giữa các tiểu phân pha phân tán (kết bông), ở trạng thái này hỗn dịch dễ dàng được phân tán trở lại [2] Bên cạnh đó, điều chỉnh độ nhớt hỗn dịch cũng có tác dụng làm chậm sự sa lắng và tách lớp, giúp hỗn dịch duy trì được trạng thái đồng nhất trong thời gian phù hợp khi phân tán lại

Chất diện hoạt (CDH) đóng vai trò là chất gây thấm thực sự trong hỗn dịch thuốc, làm giảm sức căng bề mặt hai pha, cải thiện tính thấm của các DC rắn với môi trường phân tán và giảm năng lượng bề mặt tự do của hệ khiến hệ trở nên bền hơn về nhiệt động học [2] Tuy nhiên, nếu nồng độ CDH lớn hơn nồng độ micell tới hạn (CMC) làm tăng đáng kể độ tan của dược chất và đẩy nhanh quá trình kết tụ Ostwald, làm tăng KTTP [24] Theo nghiên cứu của Bilgili trên hỗn dịch fenofibrate hoặc griseofulvin, nếu sử dụng nồng độ sodium dodecyl sulfate 0,05% (nhỏ hơn CMC) kết hợp cùng 2,5% hydroxypropyl cellulose cho kết quả KTTP không thay đổi đáng kể sau 7 ngày nhưng nếu tăng nồng độ CDH lên 0,5% hệ kém ổn định và tăng KTTP [22] Đối với thuốc nhãn khoa, CDH ở nồng độ cao có thể gây kích ứng, chảy nước mắt và tổn thương giác mạc, độc tính của CDH giảm dần theo thứ tự CDH anionic > CDH cationic > CDH không ion hóa Polysorbat 20 và 80, polyoxyl 40 stearat thường được sử dụng với nồng độ đủ để thực hiện chức năng cần thiết [2]

Sử dụng các loại polyme tan trong nước như dẫn chất cellulose (hydroxypropyl methylcellulose, hydroxy ethyl cellulose,…), carbopol, alcol polyvinyl, có thể trương nở, được hấp phụ tạo lớp áo bao quanh tiểu phân pha phân tán, có thể tạo kết bông lỏng lẻo và cấu trúc không gian cồng kềnh làm tăng độ ổn định vật lý hỗn dịch Hiện nay các polyme ổn định đều có cấu trúc hỗn tạp nhằm tăng tương tác với cả tiểu phân và môi trường phân tán Một số cặp polyme và dược chất có tính tương hợp tốt, đã được nghiên cứu bao gồm HPC/ ibuprofen, PEG/ glimepirid, HPC/ paclitaxel, PVP/ nifedipin, PVP/ hydrocortison acetat và Lutrol F127/ hydrocortison acetat [43] Đồng thời, polyme ảnh hưởng đến đặc tính lưu biến của hỗn dịch, giúp tăng độ nhớt môi trường phân tán và làm giảm tốc độ sa lắng Hỗn dịch sucralfate và magie cacbonat được đánh giá ổn định hơn khi sử dụng chất làm đặc là xanthane thay vì hydroxy ethylcellulose ở cùng nồng độ 0,3% [31] Tuy nhiên biện pháp tăng độ nhớt để giảm tốc độ sa lắng chỉ áp dụng cho hỗn dịch loãng khi tương tác giữa các tiểu phân là tối thiểu [44] Khả năng lấy ra khỏi

bao bì và phân liều trở nên thiếu chính xác khi chế phẩm quá nhớt, do đó cần chú ý nồng độ sử dụng

Để thay đổi lực đẩy tĩnh điện giữa các tiểu phân, có thể sử dụng các chất ổn định có độ phân ly cao hoặc có khả năng solvat, hấp phụ lên bề mặt tiểu phân để thay đổi điện tích tiểu phân Các tác nhân hay được sử dụng gồm chất điện ly, CDH hoặc polyme anionic / cationic có thể hấp phụ lên bề mặt pha phân tán tạo điện thế Zeta nhất định khiến lực đẩy tĩnh điện càng lớn, thắng lực liên kết Van der waals giữa các tiểu phân, hệ phân tán càng ổn định Thông thường hỗn dịch có thế zeta nằm ngoài + 30 hoặc – 30 mV sẽ có độ bền phù hợp và ổn định khi bảo quản [28] Ngoài ra, quá trình bào chế hỗn dịch sử dụng năng lượng cao có thể tạo ra một phần tiểu phân ở dạng đa hình hoặc vô định hình, khiến hệ không bền về mặt động học và xu hướng chuyển dần về dạng tinh thể có mức năng lượng thấp hơn Các dạng tiểu phân có cấu trúc vô định hình bị hòa tan trong dung môi quá bão hòa gây ra xu hướng kết tinh trên tiểu phân DC, tăng nguy cơ kết tụ tiểu phân Do đó cần kiểm soát các thông số kĩ thuật và công thức bào chế, đặc biệt là những chất ổn định ở nồng độ tạo micell, giúp kiểm soát cấu trúc tiểu phân tạo ra từ đó hạn chế sự chuyển dạng thù hình [66]

1.2.4.2 Độ ổn định hóa học

Độ ổn định về mặt hóa học phụ thuộc chủ yếu về độ ổn định của dược chất và sự tương kị hóa học giữa các thành phần trong công thức Thông thường, quá trình phân hủy dược chất trong hỗn dịch là động học giả bậc không, diễn ra chủ yếu ở pha dung dịch biểu thị bởi phương trình sau, trong đó, M là lượng dược chất còn lại ở thời điểm t, M0 là lượng dược chất ban đầu, Cs là độ tan dược chất và V là thể tích hỗn dịch [3]

𝑀 = 𝑀0− 𝑘1𝑉𝐶𝑆𝑡 Trong thực tế, nếu dược chất có độ tan kém (< 1 mg/ml) hoặc nồng độ thuốc đưa vào hỗn dịch đủ lớn thì sự phân hủy trong hỗn dịch xảy ra chậm Nhiều dược chất có bản chất hóa học là các chất khử nên rất dễ bị oxi hóa, làm giảm hàm lượng dược chất trong chế phẩm, làm giảm tác dụng điều trị, thậm chí gây phản ứng độc trong cơ thể [19],[30],[39] Các yếu tố xúc tác cho phản ứng oxy hóa dược chất bao gồm: pH, bức xạ tử ngoại (thay đổi mức năng lượng phân tử, xúc tác phản ứng gốc), vết kim loại nặng (xúc tác cho phản ứng oxy hóa) và nhiệt độ (tăng tốc độ phản ứng)

Để hạn chế phản ứng oxy hóa phân hủy dược chất, có thể thêm chất chống oxy hóa như natri sulfit, natri bisulfit, natri metabisulfit (0,1 - 0,5%), natri thiosulfat (0,1 - 0,2%) Có thể sử dụng các chất hiệp đồng chống oxy hóa để tác dụng khóa các ion kim loại nặng như dinatri edetat (0,01 - 0,3%), acid tartric, acid citric, acid fumaric hoặc acid malic… Điều chỉnh pH thích hợp cũng giúp kiểm soát tốc độ phản ứng oxy hóa dược

chất Bên cạnh đó, có thể áp dụng biện pháp loại oxy hòa tan trong nước cất pha tiêm trước và trong khi pha chế như siêu âm và sục khí N2 Ngoài ra, cần hạn chế sự tác động của nhiệt độ, ánh sáng trong quá trình pha chế, bảo quản đối với những dược chất nhạy cảm có thể làm giảm đáng kể tác động của các yếu tố này đến sự phân hủy dược chất

1.3 Phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh trong kĩ thuật bào chế hỗn dịch

Hỗn dịch có thể được bào chế dựa trên kĩ thuật phân chia (top - down) (tiểu phân lớn được làm nhỏ kích thước) [17] Nguyên tắc của kỹ thuật phân chia tạo hỗn dịch là áp dụng sự tác động cơ học để làm nhỏ tiểu phân đến kích thước nhỏ dưới 50 𝜇m Một số kĩ thuật hay được dùng là phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao hoặc phương pháp nghiền [13] Phương pháp nghiền bi là giải pháp mang tính khả thi cao và dễ áp dụng trong thực tế sản xuất Có thể tiến hành nghiền khô hoặc nghiền ướt tùy theo bản chất dược chất và mục đích bào chế [16]

FDA đã phê chuẩn biện pháp này để giảm KTTP trong sản xuất 4 loại thuốc

Rapamune, Emend, Tricor và Megace [36], nghiền 30 đến 60 phút có thể nghiền được

hỗn dịch có KTTP dưới 200 nm [41] Bên cạnh đó, nghiền ướt là phương pháp trực tiếp tạo ra dạng hỗn dịch, phù hợp dược chất nhạy cảm với nhiệt, rút ngắn thời gian nghiền tránh hiện tượng sinh nhiệt và tạp chất sinh ra khi bi mài mòn với thành buồng nghiền có thể lẫn vào thuốc Khả năng vận hành liên tục và nâng cấp quy mô của nghiền ướt được đánh giá cao [13] Lực phân chia chính trong nghiền ướt là lực va đập giữa viên bi, thành buồng nghiền, tiểu phân và có thể là tác động phân rã của môi trường lỏng Do đó, các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch là tỉ lệ dược chất so với môi trường hoặc tỉ lệ tá dược, số lượng và kích thước bi, nhiệt độ và độ nhớt môi trường, tốc độ và thời gian nghiền [17] Kiểm soát tốt các yếu tố này có thể giúp tạo ra hỗn dịch với KTTP mong muốn

Một số thiết bị nghiền bi năng lượng cao được sử dụng phổ biến trên thị trường như thiết bị nghiền bi hành tinh kiểu đứng hoặc kiểu ngang, thiết bị nghiền bi có bàn xoay nghiêng [46]

1.3.1 Thiết bị nghiền bi hành tinh

Hình 1.2 Hình mô phỏng cấu tạo thiết bị nghiền bi hành tinh

Nguyên tắc hoạt động: Trong quá trình nghiền, nguyên liệu phải chịu va chạm mài mòn với năng lượng cao, bị biến dạng nứt rạn và đứt gãy làm vỡ thành KTTP nhỏ hơn Do sự chuyển động quay theo hai hướng ngược nhau của đĩa đế và cối nghiền nên xuất hiện nhiều lực ly tâm khác nhau tác dụng lên viên bi Các viên bi va chạm nhau dưới tác dụng các lực ly tâm khác loại và va chạm với thành cối nhờ lực ly tâm cùng loại Tại một thời điểm nhất định, bi có vận tốc cao sẽ đột ngột chuyển hướng gây va chạm mạnh Động năng được chuyển hóa thành cơ năng để phá vỡ tiểu phân hoặc một phần nhiệt năng Nguyên liệu bị biến dạng do bị tác dụng lực ép giữa các viên bi nghiền cũng như giữa bi và thành cối

Ưu điểm: Thiết bị cung cấp năng lượng nghiền rất lớn, vượt trội về lực nghiền và tần số nghiền, rút ngắn thời gian nghiền và nâng cao hiệu suất nghiền so với các máy nghiền bi thông thường Máy được đánh giá cao về tính ứng dụng, có thể nghiền được nhiều loại dược chất và phù hợp nâng cấp quy mô Thiết bị kín, có thể duy trì trạng thái vô khuẩn của nguyên liệu Quá trình vận hành liên tục, đơn giản, tiết kiệm chi phí

Nhược điểm: Thiết bị có thể bị mài mòn và sự hư hao thiết bị trong quá trình khó kiểm soát được, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Để tránh sinh nhiệt, thiết bị cần được trang bị thêm bộ làm lạnh bên ngoài

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP trong quá trình nghiền bi kiểu hành tinh

Đối với quá trình nghiền ướt, quá trình nghiền vỡ tiểu phân và quá trình kết tập tiểu phân để làm giảm năng lượng bề mặt diễn ra đồng thời, đối nghịch nhau có ảnh hưởng đến phân bố KTTP Do đó, việc kiểm soát các thông số thuộc về công thức và quy trình nghiền giúp kiểm soát quá trình động học, từ đó cho phân bố KTTP dược chất mong muốn sau khi nghiền [20]

1.3.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố quy trình nghiền

a Bi nghiền

Hình dạng, kích thước, bản chất và số lượng của bi nghiền ảnh hưởng đến sự chuyển động va chạm của bi với nguyên liệu làm thay đổi KTTP

-Kích thước bi: Thông thường, các tiểu phân nhỏ sẽ được nghiền bởi viên bi có kích thước nhỏ Theo phương trình năng lượng va chạm, khi tốc độ nghiền không đổi, kích thước bi càng nhỏ thì tổng diện tích tiếp xúc bề mặt bi càng lớn, số lần va chạm càng nhiều, tạo năng lượng va chạm lớn, giảm KTTP hiệu quả Nhưng do kích thước bi tỉ lệ với khối lượng bi dẫn đến nếu bi quá nhỏ, khối lượng bi giảm ảnh hưởng đến năng lượng va chạm không đủ để nghiền nguyên liệu [61] Động năng nghiền của bi đối với nguyên liệu tỉ lệ thuận với bình phương vận tốc và khối lượng bi (E = mv2/2) nên để đáp ứng đủ năng lượng nghiền, tiến hành nghiền ở tốc độ cao với kích thước bi nhỏ hoặc nghiền ở tốc độ thấp với kích thước bi to vẫn đáp ứng tạo tiểu phân nhỏ Do đó, trong quá trình nghiền bi nên cân nhắc cả thông số tốc độ nghiền và kích thước bi để tạo ra KTTP mong muốn [33]

-Khối lượng bi: Với cùng kích cỡ bi, khối lượng bi tăng quá nhiều dẫn đến thể tích của cả khối bi tăng, chuyển động bi sẽ bị hạn chế dẫn đến làm giảm năng lượng phân chia nhỏ tiểu phân Khi lượng bi trong khoang nghiền ít quá sẽ ảnh hưởng đến tần suất va chạm làm giảm hiệu suất nghiền

-Độ cứng bi: Bi có độ cứng càng cao thì năng lượng va chạm càng lớn, KTTP thu được càng nhỏ [46] Khi so sánh nghiền trên hai loại bi có cùng kích thước, hạt zirconia có độ cứng lớn hơn so với hạt alumina, do vậy hạt zirconia truyền nhiều năng lượng hơn cho mỗi lần va chạm, gây ra sự phá vỡ các tiểu phân dược chất nhanh hơn trong quá trình nghiền [23] Ngoài ra, quy trình nghiền với các hạt alumina hình cầu hiệu quả hơn so với quy trình sử dụng các hạt alumina có hình dạng không đều [24]

b Tốc độ nghiền

Tốc độ nghiền càng lớn, tần suất va chạm và năng lượng va chạm giữa bi với tiểu phân tăng lên ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân [33] Tuy nhiên, nếu tốc độ nghiền tăng lên quá cao, dưới tác dụng lực ly tâm làm bi bám sát thành buồng nghiền hoặc dược chất bị dính trên nắp buồng nghiền làm giảm tương tác giữa bi và dược chất nên hiệu suất nghiền kém Đồng thời tốc độ quay quá cao sẽ dẫn

đến ứng suất uốn trên đáy trục quay cao hơn và ứng suất này tiếp tục tăng theo chu kì quay, do vậy có thể gây ảnh hưởng đến vận hành thiết bị

c Thời gian nghiền

KTTP giảm khi thời gian nghiền tăng và đạt tới giới hạn nào đó khi quá trình nghiền vỡ và kết tụ tiểu phân đã đạt trạng thái cân bằng Tuy nhiên, việc kéo dài thêm thời gian nghiền khiến cơ chế kết tập chiếm ưu thế hơn [21] Trạng thái kết tập tiểu phân còn xảy ra do hiện tượng quá nhiệt, bay hơi nước trong quá trình nghiền [21]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố công thức

a Nồng độ dược chất

Nồng độ dược chất càng lớn tạo làm tăng số lần va chạm của tiểu phân dược chất với bi nghiền, thành khoang nghiền và với các tiểu phân dược chất khác, giảm KTTP càng nhiều [23] Tuy nhiên, khi tăng nồng độ dược chất mà không thay đổi tốc độ nghiền và thời gian nghiền, hiệu suất phân chia tiểu phân giảm

b Thành phần trong công thức

Tiểu phân dược chất sơ nước có kích thước nhỏ hơn 5 𝜇m rất dễ bị kết tụ Việc sử dụng chất ổn định hỗn dịch bao gồm polyme và CDH trong và sau quá trình nghiền là giải pháp để ngăn cản sự kết tụ đó [46] Việc tạo áo thân nước trong quá trình nghiền tăng sự cồng kềnh về không gian và tích điện bề mặt tiểu phân có thể giúp đẩy các tiểu phân ra xa nhau, giảm kết tụ tiểu phân Nồng độ polyme tăng giúp tăng độ nhớt cho môi trường, ổn định HD trong quá trình nghiền và bảo quản Tuy nhiên, đến một giá trị nhất định, nồng độ polyme tăng khiến độ nhớt tăng quá cao, gây khó khăn trong quá trình nghiền và khó phân tán đều trở lại sau thời gian bảo quản [2] Bên cạnh đó, CDH làm giảm sức căng bề mặt và tăng thấm ướt cho các tiểu phân rắn, giúp tiểu phân phân tán đều trong HD, thuận lợi cho quá trình nghiền Việc lựa chọn nồng độ chất ổn định có thể dựa vào tỷ lệ của polyme và CDH so với dược chất Thông thường, tỷ lệ polyme và dược chất là từ 0,1:1 đến 0,5:1 và tỷ lệ CDH : dược chất là từ 0,02:1 đến 0,06:1 [56]

2.CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

3 Dinatri ethylendiamin tetraacetic acid dihydrat Phân tích Trung Quốc

Các hóa chất: acid acetic, acid borat, acid hydroclorid, acetonitril, citric aicd

monohydrat, kali dihydrophosphat, natri hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích, nguồn gốc Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị, dụng cụ dùng trong thực nghiệm

Đức

Sỹ

STT Tên thiết bị Model Xuất xứ

10 Thiết bị đo KTTP bằng tán xạ

11 Thiết bị thử hòa tan kiểu dòng

14 Thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh Tencan 10L Planetary

Các dụng cụ chuyên dụng cho bào chế: cân kĩ thuật, cân phân tích, cốc có mỏ, bình định mức, đũa thủy tinh, pipet thủy tinh, micropipet, màng lọc cellulose acetat (0,45 µm và 0,22 µm), tủ sấy, bể siêu âm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp tăng độ ổn định của hỗn dịch

- Lựa chọn công thức nghiền và các thông số của quá trình nghiền làm giảm KTTP sử dụng thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh

- Thiết kế và tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các thông số của quá

trình nghiền đến KTTP

- Đánh giá một số đặc tính của hỗn dịch MGF 2% định hướng nhỏ mắt bào chế được: cảm quan, kích thước tiểu phân, dạng thù hình, tương tác hóa học các thành phần, pH, áp suất thẩm thấu và khả năng hòa tan dược chất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp giảm KTTP MGF sử dụng máy nghiền bi hành tinh

- Thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh Planetary Ball Mill (Trung Quốc), sử dụng bốn cối nghiền bằng vật liệu zirconia có dung tích 50 ml (kích thước: 45 mm, 65 mm); có bộ phận làm mát bên ngoài

- Cách tiến hành: + Chuẩn bị dung dịch nghiền: cân và hòa tan NaH2PO4, Na2EDTA, Na2S2O3 và CDH trong nước, phân tán polyme vào dung dịch trên và ngâm trương nở qua đêm

+ Chuẩn bị dung dịch polyme bảo quản: pha dịch polyme (5% kl/kl) và ngâm trương nở qua đêm

+ Chuẩn bị cối nghiền đã chứa sẵn một lượng bi xác định Thêm một phần dịch nghiền placebo vào cối để thấm ướt bi Thêm MGF theo CT Thêm phần dịch nghiền placebo còn lại vừa đủ, sục N2 trong 10 phút

+ Vận hành máy để thực hiện quá trình nghiền; nhiệt độ 20 oC, chu kì nghiền (15 phút nghiền - 5 phút nghỉ) Các thông số khảo sát: kích thước bi, tốc độ nghiền, thời gian nghiền, tỉ lệ bi - hỗn dịch; polyme và CDH

+ Thu hỗn dịch MGF bằng cách lọc qua rây (kích thước mắt rây 80 μm), pha loãng với dịch bảo quản hỗn dịch theo tỉ lệ 3:1 HD được bảo quản trong lọ thủy tinh, đậy kín bằng nút cao su và bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

2.3.1.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp tăng độ ổn định và chống oxi hóa đến độ ổn định của MGF trong quá trình nghiền hỗn dịch

- Nguyên tắc: thay đổi biện pháp chống oxy hóa (sục nitơ, thêm chất chống oxy hóa) và đánh giá ảnh hưởng đến độ ổn định hóa học (sự phân hủy của MGF) và độ ổn định vật lý (KTTP MGF) sau khi nghiền Các tá dược được đưa vào khảo sát dựa trên thí nghiệm tiền công thức, đánh giá tác động đến KTTP hỗn dịch khi bảo quản

- Tiến hành nghiền hỗn dịch với các thông số và thành phần khác nhau (bảng

2.3), sử dụng phương pháp nghiền bi có khuấy [12]

- Xác định KTTP của hỗn dịch sau nghiền (mục 2.3.2.1) - Đánh giá phân hủy: ly tâm các hỗn dịch sau nghiền (6000 vòng/phút x 30 phút, làm khô phần rắn thu được trong bình hút ẩm (phần R); hỗn dịch phía trên được tách ra và tiếp tục ly tâm (22000 vòng/phút x 10 phút) thu được dịch trong (phần L)) Định lượng phần R và phần L theo phương pháp HPLC với điều kiện như mô tả dưới đây, đánh giá sự phân hủy thông qua sự xuất hiện của píc tạp và tỉ lệ S píc tạp/ Spíc MGF

- Điều kiện sắc kí: cột sắc kí C18 4,6 x 250 mm, kích thước hạt nhồi 5 μm, duy trì 40 oC bằng ổn nhiệt cột (Athena Technology, India); pha động: hỗn hợp AcOH 3% : ACN (tỉ lệ 88:12 v/v) trong đó tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH dung dịch AcOH 3% (2, 3, 4) Tốc độ rửa giải: 1,1 mL/phút Detector DAD - UV - VIS, bước sóng phát hiện:

210, 258, 320, 370, 500 nm Tiêm mẫu tự động, thể tích tiêm 10 μL

2.3.1.3 Phương pháp lựa chọn các thông số kĩ thuật của quá trình nghiền MGF

Khảo sát các thông số quá trình nghiền theo công thức khảo sát 2 (CTKS 2) ở bảng 2.4 (phương pháp mục 2.3.1.1) và đánh giá phân bố KTTP MGF sau nghiền (phương pháp mục 2.3.2.1)

- Tỉ lệ bi và hỗn dịch nghiền: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bi và hỗn dịch lần lượt là 4:1, 5:1, 6:1 đến phân bố KTTP MGF Lựa chọn tỉ lệ phù hợp để giảm KTTP và phù hợp các thông số kỹ thuật đã lựa chọn, quy mô bào chế

2.3.1.4 Phương pháp xây dựng công thức dịch nghiền

Khảo sát loại, nồng độ của CDH và polyme theo công thức khảo sát 3 (CTKS 3) ở bảng 2.5 bằng phương pháp nghiền mô tả mục 2.3.1.1

- Khảo sát loại polyme: HPMC E6, HPC L Nồng độ dao động 1% - 3% - Khảo sát loại chất diện hoạt: Tween 80, hỗn hợp Tween 80 - Span 80 (HLB 11) Nồng độ dao động 1% - 3%

Tiêu chí lựa chọn: D90 ≤ 25 𝜇m; D[4,3] có thể đạt được < 500 nm

Bảng 2.5 Công thức khảo sát 3 (CTKS 3)

Na2HPO4 0,1M 0,04 g

2.3.1.5 Phương pháp thiết kế thí nghiệm và phân tích ảnh hưởng của các thông số quy trình nghiền đến KTTP MGF trong hỗn dịch sau nghiền

- Mục đích thiết kế thí nghiệm: sàng lọc xác định các thông số quy trình nghiền có ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình nghiền

- Phương pháp: sử dụng thiết kế Screening Design theo mô hình sàng lọc Full Factorial (2 levels) với sự hỗ trợ của phần mềm MODDE 13.0 (Umetrics Inc, USA) Sử dụng phương trình hồi quy đa biến và các đường đồng mức để phân tích ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra [32], [42]

+ Biến đầu vào: các thông số quy trình có thể ảnh hưởng đến phân bố KTTP của MGF sau nghiền, bao gồm: kích thước bi, tốc độ nghiền, thời gian nghiền

+ Biến đầu ra: KTTP trung bình theo thể tích (D[4,3]); mức độ phân bố KTTP (SPAN) và phân vị KTTP 90%, 50%, 10% dựa trên thể tích (D90, D50, D10) của hỗn dịch MGF thu được sau nghiền

+ Biến cố định: khối lượng dịch nghiền, bản chất vật liệu của bi, khối lượng bi

2.3.1.6 Phương pháp bào chế hỗn dịch MGF định hướng dùng để nhỏ mắt

Dựa vào kết quả của tác giả Lương Thị Thu Hà [12] và điều chỉnh phù hợp với thí nghiệm, các bước tiến hành bào chế được thực hiện như sau:

Bước 1 Nghiền làm giảm KTTP MGF: tiến hành theo phương pháp mục 2.3.1.1 Thu được hỗn dịch 7,5%, bảo quản trong lọ thủy tinh trung tính, đậy kín ở nhiệt độ phòng Bước 2 Bào chế hỗn dịch MGF 2%:

- Phân tán polyme vào nước, ngâm trương nở qua đêm, điều chỉnh pH thích hợp bằng NaOH 0,2M hoặc HCl 0,1M đến pH 6,2 Phối hợp NaCl và mannitol theo công thức được dung dịch tá dược Sục khí N2 trong 10 phút

- Phối hợp hỗn dịch MGF 7,5% sau nghiền và dung dịch tá dược theo tỉ lệ phù hợp, bổ sung nước vừa đủ khối lượng, khuấy đều thu được hỗn dịch MGF 2 % Sục khí N2 trong 5 phút Đóng nút cao su, bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng

toán bằng các thuật toán xây dựng trên định luật Mie [47]

- Cách tiến hành: cài đặt thông số của tiểu phân MGF (chỉ số khúc xạ: 1,64 [12]; hệ số hấp thụ: 1 [47]; tỉ trọng: 1,843 g/cm3 [27]) Đo mẫu theo phương pháp trừ nền placebo [63] Môi trường phân tán là dung dịch bão hòa MGF đã được lọc qua màng 0,45 μm Điều chỉnh nồng độ MGF trong môi trường phân tán về giá trị % độ che phủ thấu kính phù hợp với khoảng phân bố KTTP nhằm tránh hiện tượng đa nhiễu xạ gây sai số: % độ che phủ < 3% đối với KTTP < 1 µm và từ 3% - 10% đối với KTTP lớn hơn (1 µm - vài trăm µm) Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần Các mẫu đồng thời được quan sát dưới kính hiển vi quang học

- Kết quả đo: + D[4,3] là KTTP TB theo thể tích D[4,3] = ∑ Dn1i4

∑ Dn1 i3 (Di là đường kính tiểu phân thứ i) + D90, D50, D10 lần lượt là phân vị 90%, 50%, 10% KTTP theo thể tích + SPAN là độ rộng dải phân bố KTTP theo thể tích SPAN = D90−D50

D10

b Phương pháp sử dụng kính hiển vi quang học

- Thiết bị: kính hiển vi quang học Nikkon kết nối camera Eclipse Ci-L, sử dụng phần mềm NIS Elements D 4.2 trên máy tính

- Cách tiến hành: Chuẩn bị các mẫu thử (pha loãng mẫu nếu cần) trên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi với cường độ ánh sáng và vật kính phù hợp Sử dụng phần mềm NIS Elements D 4.2 điều chỉnh các thông số hình ảnh phù hợp và ghi lại hình ảnh Với mỗi mẫu, quan sát trên ít nhất 3 tiêu bản, mỗi tiêu bản chụp hình ngẫu nhiên ít nhất 3 vi trường đại diện

2.3.2.2 Phương pháp xác định dạng thù hình của dược chất

Mẫu đo: hỗn dịch MGF được ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 30 phút, lấy phần cắn đem làm khô ở trong bình hút ẩm chứa silicagel trong 48 giờ; các mẫu nguyên liệu, hỗn hợp vật lý, hỗn hợp placebo được đo trực tiếp

a Phương pháp quét nhiệt lượng vi sai (DSC)

- Thiết bị phân tích nhiệt DSC 1 StarSystem (Mettler Toledo, Thụy Sỹ) - Cách tiến hành: Cân mẫu đo vào đĩa phân tích với lượng mẫu chứa khoảng 1 - 5 mg dược chất, dập hàn kín sau đó đưa vào buồng máy Dùng kẹp đưa đĩa phân tích vào buồng gia nhiệt của thiết bị Thông số: ổn định mẫu ở 25 oC trong 5 phút; khoảng quét nhiệt 25 oC – 350 oC, tốc độ gia nhiệt: 10 oC/phút, lưu lượng khí N2: 50,0 mL/phút

b Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X (XRD)

- Thiết bị: hệ thống phân tích nhiễu xạ tia X D8 Advance Bruker (Mỹ)

- Cách tiến hành: Quét phổ nhiễu xạ tia X với các thông số: nhiệt độ 25 oC; độ phân giải: 0,020o; khoảng góc đo 2θ từ 5o đến 60o; độ quét góc 2θ: 0,020 o/giây

2.3.2.3 Phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

- Thiết bị đo FTIR IRAffinity-1S FT-IR Shimadzu (Nhật Bản) - Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu đo tương tự mục 2.3.2.2 Điều chỉnh cần nén mẫu sao cho mẫu cần đo tiếp xúc tối đa với bề mặt ATR với một lực ép vừa phải Tiến hành quét phổ IR trong dải số sóng 4000 - 400 cm-1 Dựa vào các dải hấp thụ đặc trưng để đánh giá thành phần hóa học và tương tác giữa các thành phần trong công thức

2.3.2.4 Phương pháp định lượng MGF bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Điều kiện sắc kí: thiết bị HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Đức); cột C18 - 4,6 x 150 mm, hạt nhồi 5 μm (GL Sciences, Japan), nhiệt độ 40 oC được duy trì bởi bộ ổn nhiệt cột (Athena Technology, India); detector DAD - UV - VIS, bước sóng 258,4 nm; pha động: dung dịch AcOH 3 % : ACN (85 : 15 v/v), được lọc qua màng 0,22 μm và siêu âm đuổi bọt khí trong 10 phút; tốc độ rửa giải: 1,5 mL/phút; tiêm mẫu tự động, thể tích tiêm: 10 μL Kết quả được xử lý trên phần mềm ChemStation

- Cách tiến hành: Quá trình chuẩn bị và phân tích mẫu được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng nhiệt độ phòng thí nghiệm

+ Dung môi hòa tan mẫu chuẩn: dung dịch đệm phosphat 0,1M pH 7,4; + Dung môi pha loãng mẫu: pha động

+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 11 mg MGF, chuyển vào bình định mức 25 mL, thêm khoảng 20 mL dung môi hòa tan mẫu, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung thêm dung môi hòa tan mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều

+ Dãy dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng pha động thành các nồng độ thích hợp (0,171 – 22 μg/mL)

+ Dung dịch thử: mẫu dịch hòa tan thu được sau mỗi thời điểm, được pha loãng bằng pha động đến nồng độ thích hợp Mẫu chế phẩm được hòa tan trong đệm pH 7,4 trước khi pha loãng bằng pha động

+ Dung dịch mẫu placebo (mẫu không chứa dược chất nhưng chứa các thành phần khác với tỉ lệ tương tự mẫu thử): tiến hành tương tự giống mẫu thử

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng hòa tan dược chất từ hỗn dịch

a Phương pháp thử hòa tan kiểu khuấy

Hình 2.1 Cấu tạo thiết bị thử hòa tan kiểu khuấy

- Thiết bị thử hòa tan kiểu khuấy có cấu tạo được mô tả như hình 2.1 [18], bao gồm: một buồng khuấy hình trụ (đường kính đáy 22 mm, chiều cao 63 mm) đặt trên máy khuấy từ, bên trong có một lớp lưới mỏng (có kích thước mắt lưới 1 mm) được đặt cách đáy khoảng 50 mm và giữ con khuấy từ (kích thước 1 cm)

- Điều kiện thử hòa tan: + Môi trường thử hòa tan: dung dịch đẳng trương pH 7,4 (tham khảo theo DĐVN V chứa KH2PO4 (1,1mM); NaCl (0,025M); Na2HPO4.H2O (9,8 mM)) chứa Na2EDTA (0,01 mg/mL) và Na2S2O3 (0,1M) được siêu âm và sục khí N2 trong 10 phút Thể tích môi trường: 10 mL Nhiệt độ thử nghiệm: 25 oC

+ Tốc độ khuấy: 400; 550; 700 vòng/phút - Cách tiến hành: dùng xilanh 1 mL đưa chính xác một lượng mẫu khoảng 0,1 g tới trung tâm mặt đáy của buồng khuấy đã chứa sẵn môi trường hòa tan, vận hành máy khuấy từ Thời điểm lấy mẫu: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180,… phút sau khi bắt đầu Tại mỗi mốc thời điểm, hút 1 ml môi trường thử tại vị trí cách bề mặt chất lỏng 1 cm và bổ sung ngay 1 mL môi trường thử mới Dịch thử hoà tan tại mỗi thời điểm được lọc qua màng 0,22 μm ngay sau khi lấy mẫu và pha loãng bằng pha động [12], sau đó định lượng mẫu theo phương pháp HPLC (mục 2.3.2.4) Toàn bộ quá trình thử hòa tan và pha loãng mẫu được thực hiện trong điều kiện hạn chế ánh sáng

- Tỉ lệ (%) MGF hòa tan tại các thời điểm được tính như sau, trong đó: % 𝐺𝑃𝑛 là tỉ lệ % MGF hòa tan khỏi hỗn dịch so với lượng lý thuyết; 𝐶𝑛 là nồng độ MGF trong

môi trường hòa tan tại thời điểm thứ n (mg/mL); V là thể tích toàn bộ môi trường thử (10 mL); 𝑉𝑜 là thể tích dịch thu được tại thời điểm thứ n (1 mL); m là khối lượng MGF đem thử hòa tan (mg)

% 𝐺𝑃𝑛 = 𝐶𝑛 ∗ 𝑉 + ∑𝑛 (𝐶𝑛− 1 ∗ 𝑉𝑜)

𝑖=1

b Phương pháp thử hòa tan kiểu buồng dòng chảy (FTC)

Hình 2.2 Cấu tạo thiết bị thử hòa tan kiểu buồng dòng chảy (FTC)

1 Bình chứa môi trường thử hòa tan; 2 bơm đẳng dòng; 3 Bể điều nhiệt; 4 Khoang (cell) chứa mẫu, dung tích 1,7 mL; 5 Bộ phận hứng mẫu - Điều kiện thử: môi trường: dung dịch đẳng trương pH 7,4 chứa Na2EDTA 0,01 mg/mL và Na2S2O3 0,1M đã được siêu âm và sục khí N2 trong 10 phút; tốc độ dòng 0,03 và 0,05 ml/phút; nhiệt độ: 35 oC

- Cách tiến hành: cho 2 g bi (zirconium bead) đường kính 1 mm vào khoang chứa mẫu, đưa chính xác 0,1 g hỗn dịch thử và thêm 0,5 mL môi trường thử hòa tan, đậy nắp khoang và đặt khoang chứa mẫu vào trong bể điều nhiệt, vận hành bơm Thời điểm lấy mẫu: 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 phút sau khi bắt đầu thử (tại mỗi mốc thời điểm, thu toàn bộ dịch thử hòa tan từ thời điểm cuối của mốc thời gian trước đến thời điểm cuối của mốc thời gian hiện tại) và pha loãng bằng pha động [12] Định lượng mẫu theo phương pháp HPLC (mục 2.3.2.4) Toàn bộ quá trình thử hòa tan và pha loãng mẫu được thực hiện trong điều kiện hạn chế ánh sáng

Tỉ lệ (%) MGF hòa tan tại các thời điểm được tính như sau, trong đó: % 𝐺𝑃𝑛là tỉ lệ % MGF hòa tan khỏi hỗn dịch so với lượng lý thuyết; 𝐶𝑖 là nồng độ MGF trong dịch thử hòa tan tại thời điểm thứ i (mg/mL); 𝑉𝑖 là thể tích dịch hòa tan thu được tại thời điểm thứ i (mL); m là khối lượng MGF có trong lượng hỗn dịch đem thử hòa tan (mg)

% 𝐺𝑃𝑛 = ∑𝑛 (𝐶𝑖∗ 𝑉𝑖)

𝑖=1

2.3.2.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của hỗn dịch lên pH của môi trường

- Nguyên tắc: theo dõi sự thay đổi pH môi trường khi MGF được hòa tan từ hỗn dịch 2% so với thời điểm ban đầu

- Điều kiện thử: môi trường thử có dung lượng đệm tương tự như của nước mắt nhân tạo gồm có H2PO4- (6,16 mM), HPO42- (9,76 mM), Na2EDTA (0,01 mg/mL), pH 7,4 đã được siêu âm và sục khí N2 trong 10 phút [6]; tốc độ dòng: 0,05 mL/phút

- Cách tiến hành tương tự như phép thử hòa tan sử dụng thiết bị FTC Thời điểm lấy mẫu: 1, 2, 3, 4, 6 (giờ) pH môi trường ở từng thời điểm được xác định ngay bằng phương pháp điện hóa trên máy đo pH Mettler Toledo FE20 đã được hiệu chuẩn

2.3.2.7 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của hỗn dịch đến áp suất thẩm thấu của môi trường

- Nguyên tắc: theo dõi sự thay đổi áp suất thẩm thấu môi trường khi MGF được hòa tan từ hỗn dịch 2% so với thời gian ban đầu, được thử hòa tan bằng phương pháp buồng dòng chảy

- Điều kiện thử: môi trường thử: dung dịch đệm phosphat đẳng trương pH 7,4 chứa Na2EDTA 0,01 mg/mL và Na2S2O3 (0,1M) đã được siêu âm và sục khí N2

- Cách tiến hành tương tự phương pháp đánh giá ảnh hưởng của HD 2% lên pH của mắt Giá trị áp suất thẩm thấu môi trường tại từng thời điểm được xác định ngay bằng phương pháp đo độ hạ băng điểm trên máy đo áp suất thẩm thấu Osmomat 3000 basic đã được hiệu chuẩn

2.3.3 Phương pháp xử lý kết quả

- Số liệu thu được được xử lý và vẽ đồ thị trên bảng tính Microsoft Excel 2019 - Phương pháp phân tích số liệu trong đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về công thức và thông số của quá trình nghiền đến đặc tính hỗn dịch xử lý bằng phần mềm MODDE 13 (Umetrics Inc, USA)

3.CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng đường chuẩn để định lượng mangiferin bằng phương pháp HPLC

Pha một dãy các dung dịch chuẩn của MGF có nồng độ từ 0,171 μg/mL đến 22,000 μg/mL và tiến hành phân tích sắc ký theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.4, kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ MGF và diện tích píc ở khoảng nồng độ đã khảo sát, phương trình hồi quy y = 17,933x + 0,2003 với hệ số tương quan R2 = 1 Điều này cho thấy khoảng nồng độ đã khảo sát là phù hợp để định lượng MGF trong các mẫu hỗn dịch nghiền, hỗn dịch định hướng nhỏ mắt, môi trường hòa tan và dùng để kiểm tra sự phân hủy của MGF Các tiêu chí thẩm định phương pháp khác được trình bày ở Phụ lục 1

Bảng 3.1 Nồng độ dung dịch chuẩn MGF diện tích píc tương ứng khi phân tích HPLC

Nồng độ thực (μg/mL) 22,000 11,000 5,500 2,750 1,375 0,171

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của MGF

3.2 Nghiên cứu biện pháp tăng độ ổn định của mangiferin trong quá trình nghiền

Nguyên liệu MGF được kiểm tra KTTP bằng phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.1 Kết quả cho thấy MGF có KTTP trung bình D[4,3] khoảng 11 μm và giá trị SPAN là 2,929 cho thấy KTTP lớn và phân tán rộng (hình PL-5.1) Do vậy cần thiết phải làm giảm KTTP để phù hợp với dạng bào chế tại mắt

MGF có cấu trúc polyphenol nên khi có mặt oxy hòa tan trong dung môi dẫn đến sự phân hủy MGF liên quan trực tiếp đến tính chất hóa học của các nhóm phenol, bao gồm phản ứng theo cơ chế gốc tự do và oxy hóa khử [30]; ngoài ra quá trình nghiền bi có thể sinh nhiệt làm tăng sự phân hủy dược chất Do vậy cần thiết áp dụng các biện pháp để đảm bảo độ bền hóa học của MGF trong quá trình nghiền Các biện pháp này cũng cần có ít thay đổi/ tác động đến phân bố KTTP khi nghiền Qua tham khảo tài liệu

[10], các biện pháp được lựa chọn để ổn định MGF bao gồm sử dụng đệm pH 4,0; sục N2 trong 10 phút; thêm các tác nhân chống oxi hóa ở các nồng độ khác nhau

Tiến hành thí nghiệm tiền khả thi để đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp kể trên đến HD MGF đã được làm nhỏ KTTP (phụ lục 2) Kết quả cho thấy việc áp dụng các biện pháp này không làm các tiểu phân kết tụ và không làm ảnh hưởng đáng kể đến KTTP MGF, do vậy có thể được sử dụng trong quá trình nghiền

3.2.1 Ảnh hưởng của biện pháp ổn định đến đến độ bền hóa học của MGF

Tiến hành nghiền theo CTKS 1 (bảng 2.3) và theo phương pháp khảo sát đã nêu ở mục 2.3.1.2 Các mẫu hỗn dịch sau nghiền được ly tâm để tách phần rắn và dung dịch, sau đó được phân tích HPLC theo phương pháp mục 2.3.2.4 Khả năng ổn định MGF trong hỗn dịch nghiền được đánh giá thông qua sự xuất hiện và tỉ lệ tạp phân hủy trên sắc ký đồ Kết quả được thể hiện qua bảng 3.2, 3.3 và hình PL-3

Bảng 3.2 Đánh giá sự phân hủy MGF trong dịch ly tâm tại bước sóng 258 nm

Nhận xét: sắc ký đồ của các mẫu dịch ly tâm (dịch bão hòa trong HD nghiền) tại bước sóng 258 nm chỉ xuất hiện píc của dược chất (tR = 10,9 phút) và không xuất hiện các píc tạp lạ có tỉ lệ tín hiệu đáp ứng > 0,6 % píc của dược chất (hình PL-3.1) Các phân đoạn mẫu chất rắn MGF sau ly tâm khác nhau cũng ko xuất hiện các tạp có tỉ lệ

diện tích píc > 1,5 % so với píc dược chất Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích ở các bước sóng khác (320, 370) (hình PL-3.2) Khi thay đổi tỉ lệ pha động cũng như pH dung dịch acid acetic (phép thử robustness), không có píc lạ xuất hiện xung quanh píc chính của dược chất (hình PL-3.3), cho thấy píc dược chất là tinh khiết Điều này cho thấy các mẫu dịch ly tâm và mẫu bột MGF sau ly tâm của hỗn dịch nghiền không có sự xuất hiện đáng kể của tạp phân hủy và quá trình nghiền không làm tăng phân hủy dược chất so với nguyên liệu (% Stạp / SMGF = 0,64) Các kết quả này gợi ý rằng việc kết hợp các biện pháp đã sử dụng giúp đảm bảo độ ổn định hóa học của MGF trong quá trình nghiền

3.2.2 Ảnh hưởng đến độ bền vật lý của hỗn dịch

Đánh giá sự thay đổi KTTP khi nghiền MGF với các biện pháp ổn định khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.4 Có thể nhận thấy việc áp dụng các biện pháp trên (dùng đơn lẻ hoặc kết hợp) không làm ảnh hưởng đáng kể đến phân bố KTTP MGF (bảng PL-3.1 và 3.2) Kết quả này gợi ý rằng có thể sử dụng các biện pháp này khi nghiền mà không ảnh hưởng đến độ bền trạng thái tập hợp và độ bền hóa học của MGF

Bảng 3.4 Phân bố KTTP của HD khi nghiền với các biện pháp ổn định khác nhau

(μm)

D50 (μm)

D90 (μm)

0,799 2,838 8,860 3,926 2,844

Qua khảo sát ảnh hưởng độ ổn định vật lý và hóa học của MGF sau nghiền, lựa chọn kết hợp các biện pháp ổn định MGF trong quá trình nghiền, bao gồm: sử dụng đệm phosphat 0,1M tại pH 4 (pH ít phân hủy); sục khí N2 để loại O2; thêm chất khử Na2S2O3

0,005M phản ứng trực tiếp với O2, và tác nhân khóa ion kim loại Na2EDTA 0,01 mg/mL

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của thông số quy trình nghiền và công thức nghiền đến phân bố KTTP mangiferin sau nghiền

3.3.1 Khảo sát, lựa chọn các thông số quy trình nghiền

3.3.1.1 Kích thước bi nghiền

Sử dụng CTKS 2 (bảng 2.4) để khảo sát ảnh hưởng của 4 loại kích thước bi (0,1; 0,5; 1; 1,5 mm) đến phân bố KTTP của MGF trong hỗn dịch sau nghiền Tiến hành nghiền (phương pháp mục 2.3.1.1) với vận tốc nghiền 350 rpm trong 4 giờ và xác định phân bố KTTP hỗn dịch nghiền thu được (phương pháp mục 2.3.2.1) Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và đồ thị hình 3.2

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kích thước bi đến hỗn dịch KTTP

Thời gian (giờ)

Phân bố KTTP MGF khi thay đổi kích thước bi nghiền

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng kích thước bi và thời gian nghiền đến giá trị D[4,3]

và SPAN của hỗn dịch MGF

Nhận xét: hình 3.2 minh họa ảnh hưởng của kích thước bi đến khả năng giảm KTTP MGF Nhìn chung khi tăng thời gian nghiền thì KTTP đều giảm khi dùng các loại bi nghiền khác nhau Sau 4 giờ nghiền, giá trị KTTP trung bình của hỗn dịch dùng bi có kích thước 0,1; 0,5; 1,0 mm đều giảm xuống < 0,5 µm, SPAN < 1, tuy nhiên HD dùng bi có kích thước 1,5mm có D[4,3] là 1,47 μm, SPAN > 2 Bên cạnh đó khi dùng bi 1,5 mm giá trị SPAN của HD nghiền có xu hướng tăng dần theo thời gian, cho thấy hiệu suất làm giảm KTTP kém nhất trong các loại bi đã khảo sát Lựa chọn được 3 kích thước bi nghiền phù hợp là 0,1 mm; 0,5 mm; 1,0 mm

3.3.1.2 Tốc độ nghiền

Sử dụng CTKS 2 với bi 0,1 mm để khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nghiền (350 và 550 rpm) đến phân bố KTTP của MGF sau nghiền Tiến hành nghiền (phương pháp mục 2.3.1.1) và đánh giá phân bố KTTP hỗn dịch nghiền thu được (phương pháp mục 2.3.2.1) Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.3

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tốc độ nghiền đến phân bố KTTP hỗn dịch MGF

Thời gian (giờ)

Phân bố KTTP MGF khi thay đổi tốc độ nghiền