TỔNG QUAN
Tổng quan về chất nghiên cứu
Lão hóa là quá trình tất yếu của cơ thể sống và bắt đầu diễn ra từ tuổi trưởng thành Khi lão hóa diễn ra, nồng độ NAD + trong cơ thể giảm do tăng enzym tiêu thụ NAD + [28] Hiện tại có nhiều phương pháp chống lão hoá được sử dụng, nhưng xu hướng làm tăng nồng Nicotinamid adenin dinucleotid (NAD + ) trong cơ thể đang được quan tâm NAD là một co-enzym oxy hóa khử tham gia vào hơn 500 phản ứng enzym [38] Nó đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học khác nhau, bao gồm trao đổi chất, lão hóa, sự tồn tại của tế bào, sửa chữa DNA và biểu hiện gen [38]
NMN là nguyên liệu chính, quan trọng ở bước cuối của quá trình tổng hợp NAD + Niacinamid mononucleotid (NMN) - một nucleotid có hoạt tính sinh học với cấu trúc là một gốc pyridin, hợp chất này có tính acid và hòa tan được trong nước tồn tại ở dạng là α và β như niacinamid ribotid, nicotinamid-1-ium-1-β-D-ribofuranosid 5’-phosphat, β- nicotinamid ribose monophosphat và 3-carbamoyl-1-[5-O-(hydroxyphosphinato)-β-D- ribofuranosyl] pyridinium Trong đó dạng β là đồng phân có hoạt tính NMN được hình thành bằng phản ứng được xúc tác bởi enzym nicotinamid photphoribosyltransferase, giữa một nhóm photphat và nucleoside bao gồm niacinamid (một dạng amid vitamin B3) và ribose [28]
Vitamin B3, một loại vitamin tan trong nước, là một chất dinh dưỡng thiết yếu cho con người Nó tồn tại dưới dạng acid nicotinic và niaciamid có hoạt tính sinh học như nhau và được tổng hợp từ tryptophan Acid nicotinic và niacinamid cùng có cấu trúc pyridin nên dễ dàng chuyển hoá lẫn nhau [22] Vitamin B3 cũng là nguồn nguyên liệu để tổng hợp nội sinh NMN và NAD + trong cơ thể, góp phần chống lão hoá
1.1.1 Tổng quan về niacinamid mononucleotid , acid nicotinic, niacinamid
Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý, hoá học và các thông tin cơ bản của niacinamid mononucleotid (NMN), acid nicotinic (NA), niacinamid (NAM) được tóm tắt ở Bảng 1.1 và Bảng 1.2 dưới đây:
Bảng 1.1 Tổng quan về niacinamid mononucleotid (NMN), acid nicotinic (NA), niacinamid (NAM)
1-yl)-3,4- dihydroxyoxolan-2-yl] metyl hydrogen photphat hoặc 3-carbamoyl-1-[5-O-
Acid pyridin-3- carboxylic Pyridin-3-carboxamid
Bảng 1.2 Tính chất vật lý hoá học của niacinamid mononucleotid (NMN), acid nicotinic
Chất rắn màu trắng hoặc vàng, rất hút ẩm
Là một hợp chất có tính acid
Bột tinh thể màu trắng, không mùi, vị chua
Bột màu trắng, không mùi, vị đắng Điểm nóng chảy 166°C 237°C 130 o C Điểm sôi Thăng hoa 157 o C Độ tan trong nước Ít tan trong nước: 1,8 mg/ml Ổn định trong nước ở nhiệt độ thường Ít tan trong nước:
Tan rất tốt trong nước: 100g/100ml ở 20 o C
Hằng số phân ly pKa = 2,4 ở 20 o C pKa =3,35 ở 20 o C
1.1.2 Tác dụng đối với cơ thể
1.1.2.1 Tác dụng của NMN a Tác dụng của NMN
Tác dụng đầu tiên của NMN tăng nồng độ NAD+ trong máu [27], chống lão hoá [29], tăng cường miễn dịch cho cơ thể [17], [31] Bên cạnh hoạt động chống lão hóa, niacinamid mononucleotid (NMN) còn có tác dụng điều trị đối với nhiều loại bệnh Chẳng hạn như phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, giúp kiểm soát cân nặng [36] Hơn nữa NMN còn giúp cải thiện sức khỏe tim mạch [17] Ngoài ra NMN còn có tác dụng chống lại sự thoái hóa thần kinh - nguyên nhân gây nên bệnh Alzheimer ở người già [29] từ đó cải thiện chức năng thần kinh và trí nhớ [40], [28], [41] Nghiên cứu trên chuột cũng chỉ ra rằng việc bổ sung NMN giảm các yếu tố tiền viêm trong huyết thanh và bảo vệ tế bào trứng khỏi sự suy giảm của tuổi tác, cải thiện khả năng thụ tinh [10], [42] Trong tương lai, cải thiện liều lượng cũng như độ dài đợt điều trị, việc bổ sung NMN cho
6 cơ thể đúng lúc chính là “phương thuốc” hữu hiệu để làm giảm các biểu hiện của lão hoá [19] b Giới thiệu NAD +
NAD + được tổng hợp từ các nguồn bao gồm NMN, tryptophan, acid nicotinic, nicotinamid ribosid (NR) và niacinamid (NAM) Khi NAD + suy giảm do lão hóa, “công tắc” kiểm soát gen sirtuins - gen kiểm soát sự lão hoá của các cơ quan trong cơ thể, sẽ ngừng hoạt động, do đó làm giảm chức năng của các cơ quan và mô trong cơ thể NAD + có khả năng tái tạo các chất chống oxy hóa, cải thiện trí nhớ và nâng cao khả năng sáng tạo, phòng ngừa các bệnh liên quan đến thần kinh như Alzheimer bệnh Parkinson, bệnh Huntington [28], [33], [37]
Trong cơ thể, niacinamid chuyển thành nicotinamid adenin dinucleotid (NAD + ) và nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (NADP) Đây là 2 coenzym có vai trò sống còn trong chuyển hóa, chúng là chất xúc tác phản ứng oxy hóa - khử cần thiết cho hô hấp tế bào, phân giải glycogen và chuyển hóa lipid [2] Niacinamid còn được sử dụng trong điều trị rối loạn tâm thần, bệnh tăng nhãn áp [12] NAM có tác dụng cải thiện hàng rào bảo vệ da, tái tạo làn da, khi dùng đường uống có tác dụng trong ngăn ngừa bệnh ung thư da và điều trị bệnh vảy nến [22] Thiếu niacinamid có thể gây ra bệnh pellagra cùng với sự thiếu các vitamin phức hợp B khác [2]
Acid nicotinic làm giảm lượng cholesterol, điều trị rối loạn lipid máu và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch [30]
1.1.3 Các nguồn tự nhiên cung cấp NMN, NA, NAM
1.1.3.1 Các nguồn tự nhiên cung cấp NMN cho cơ thể
NMN có trong thức ăn tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật và động vật Hàm lượng NMN trong các loại rau và trái cây này lần lượt là 0,25 - 1,88mg/100g và 0,26 - 1,6mg/100g, trong khi thịt bò và tôm sống chứa mức độ NMN tương đối thấp hơn so với thực phẩm có nguồn gốc thực vật là 0,06 - 0,42mg/100g [27]
Vitamin B3 thường được tìm thấy dưới dạng niacinamid trong các sản phẩm từ động vật Acid nicotinic trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật như các loại hạt và rau xanh Hàm lượng vitamin B3 tự do trong các thực phẩm trên vẫn còn thấp [2]
7 Hàm lượng acid nicotinic trong rau cải xoong là 2,165 mg/100g, hàm lượng niacinamid trong nấm là 1,829 mg/100g, trong gan, ức gà các nguồn thực phẩm từ động vật có hàm lượng niacinamid cao hơn thực vật là 13,4 - 17,29 mg/100g [22]
1.1.4 Các nghiên cứu ảnh hưởng đến sức khoẻ của NMN, NA, NAM
Việc bổ sung NMN tăng tốc độ sản xuất NAD + được sử dụng qua đường uống với liều
1250 mg mỗi ngày một lần tối đa 4 tuần đã được nghiên cứu và đánh giá độ an toàn qua các thử nghiệm trên cả người và động vật mà không gây nhiễm độc gan và giãn mạch [17], [20] NMN có giới hạn dung nạp cao hơn so với NAM và NA trên cả nam và nữ trưởng thành
Liều cao niacinamid qua đường uống đã được báo cáo là gây độc cho gan, thận… [28], giảm độ nhạy insulin, giảm dung nạp glucose và tăng căng thẳng stress [35], gây buồn nôn, khó chịu ở dạ dày và đau đầu [39] Liều cao acid nicotinic làm giảm bài tiết acid uric và gây giải phóng histamin; dẫn đến tăng nhu động dạ dày, tăng tiết acid; gây giãn mạch, đỏ mặt, tổn thương gan cấp tính, có thể nguy hiểm dẫn đến gây tử vong [39], [2]
Radenkovic và Verdin [31] đã báo cáo rằng tác dụng phụ của việc bổ sung NAD + , vitamin B3 liều cao, bao gồm cả NMN trong thời gian dài là có thể tồn tại nhưng rất khó xác định và chẩn đoán mức độ
Từ tháng 12/2022, FDA đã cấm bán NMN dưới dạng thực phẩm bổ sung vì nó đang được nghiên cứu sử dụng dưới dạng dược phẩm, bên cạnh đó FDA cũng chưa từng đưa ra văn bản tuyên bố về tính an toàn hay hiệu quả của NMN [15]
Tổng quan về các phương pháp phân tích
Một số nghiên cứu phân tích niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid trên thế giới và ở Việt Nam được tóm tắt ở bảng Bảng 1.3:
Bảng 1.3 Một số nghiên cứu phân tích niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid trên thế giới và ở Việt Nam
Phương pháp Nền mẫu Điều kiện sắc kí Kết quả TLTK
Mẫu:Tế bào nấm men
Sắc kí lỏng tương tác ưa nước HILIC
Cột 150 mm × 1,0 mm; 3 μm hạt Phenomenex Luna NH2
Pha động: chế độ gradient A: Acetonitril
B: 5 mM ammonium acetat được điều chỉnh đến độ pH 9,9 bằng ammonium hydroxid
MS/MS Mẫu:mô chuột
Cột : C18 (25 cm × 4,6 mm, 5 μm) Pha động: chế độ gradient A: 5mM ammonium acetat pH 3 B: Methanol Thể tích tiêm: 20μL MS: ESI + , MRM
Sử dụng chuẩn nội: benzamid, 3 -
FID, dẫn chất hoá trước cột
NMN LC-MS Mẫu:nấm men
Cột SAX 240mm Pha động: Chế độ gradient A: 20 mM KH2PO4 B: 750 mM KH2PO4
MS/MS Mẫu:sữa bột
Cột : C18 Pha động: chế độ gradient:
A: Methanol B: 20 mM amoni format trong nước
Thể tích tiêm: 10 μL và nhiệt độ cột là 40 o C
Tốc độ dòng pha động:
Mẫu: Thực phẩm bổ sung
Cột: ODS Pha động gradient: đệm phosphat-acetonitril pH 3,0, thuốc thử ghép cặp ion, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, bước sóng 210 nm
RSDr và RSDR lần lượt là 0,542
Các mẫu sữa được chiết bằng TCA 4%, mẫu thuốc được chiết bằng acid acetic Cột: Supelco C18 (5 àm, 6,1 x 250 mm)
Pha động ACN/ dung dịch đệm photphat được điều chỉnh đến pH 3 bằng acid
H3PO4, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, bước sóng 261 nm
NMN, acid nicotinic, niacinamid đều là chất phân cực có khả năng tan trong nước và ổn định trong nước ở nhiệt độ thường [28], có vòng thơm nên có hấp thụ UV-VIS ở bước sóng đặc trưng Theo tìm hiểu tài liệu, trên thế giới có ít nghiên cứu định lượng NMN Nghiên cứu xác định đồng thời nồng độ của 3 chất trên cũng rất ít, đã được đề cập trong những nghiên cứu về các chất chuyển hoá NAD + ở mô động vật và dịch sinh học Chưa có nghiên cứu nào thực hiện phân tích đồng thời 3 hoạt chất trên nền thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung
Các nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector khối phổ hai lần MS/MS, ion hoá phun điện tử (ESI) [10], [29], [39] để xác định NMN trong nền dịch sinh học và vitamin
B3 trong thực phẩm, sữa bột [26], dịch mô, nấm men [14], [11] Phương pháp UPLC/HPLC-MS/MS giúp phân tích mẫu có hàm lượng thấp, nền mẫu phức tạp, cùng với ưu điểm là thời gian phân tích mẫu nhanh, độ nhạy cao, LOQ thấp Tuy nhiên, nhược điểm lớn là cần thiết bị hiện đại tốn kém, nếu xác định thực phẩm bổ sung có nồng độ chất phân tích cao thì cần pha loãng nhiều bước sẽ gây ra sai số, thời gian chuẩn bị mẫu dài và phức tạp
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector FLD được Laura và cộng sự [16] áp dụng để tiến hành định lượng NMN và phương pháp này cũng đã được xây dựng trong tiêu chuẩn Việt Nam để xác định vitamin B3 trong nền thực phẩm, ngũ cốc [12], [5] Bên cạnh độ nhạy và độ chọn lọc được đánh giá cao, phương pháp chịu ảnh
11 hưởng của nền mẫu, độ tái lặp không cao do sản phẩm không bền, thời gian xử lý mẫu dài
Năm 2021, ChromaDex đã thực hiện báo cáo kiểm tra 22 sản phẩm thực phẩm chức năng chứa NMN bán chạy nhất trên amazon bằng HPLC [13] HPLC-UV cũng được áp dụng thành công để tách acid nicotinic và niacinamid trên nhiều nền mẫu như thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, dược phẩm, sữa bột [34], [9], [8], [4] Vì vậy, đề tài này sử dụng phương pháp phổ biến, đơn giản là HPLC-PDA để phân tích tích đồng thời 3 hoạt chất NMN, acid nicotinic, niacinamid trong sản phẩm chức năng, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ trên địa bàn
Hà Nội với độ chính xác cao.
Tổng quan phương pháp HPLC-PDA
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography-HPLC) là một kỹ thuật tách các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng Các chất phân tích tách khỏi nhau do khả năng tương tác khác nhau của từng chất phân tích với pha tĩnh và pha động
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến sự phân bố của chúng giữa hai pha Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý
Cơ chế tách tuỳ thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích Các cơ chế tách bằng HPLC là: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, ái lực, sắc ký lỏng siêu tới hạn, tách đồng phân đối quang [1]
1.3.2 Cấu tạo máy sắc kí lỏng hiệu năng cao
Hình 1.1 Cấu tạo máy sắc kí lỏng hiệu năng cao
12 Các bộ phận chính của máy sắc kí lỏng hiệu năng cao:
- Hệ thống cấp pha động
- Bộ xử lý dữ liệu
Trong đề tài này, ba chất phân tích được định lượng đồng thời bằng phương pháp HPLC sử dụng detector PDA Đây là thiết bị phổ biến trong các phòng phân tích kiểm nghiệm hoá lý Detector PDA có khả năng phân tích các thành phần phức tạp trong mẫu, nhờ có khả năng thu thập dữ liệu đa phổ và phân tích các tín hiệu quang phổ tương ứng
1.3.3 Nguyên lý về kỹ thuật HPLC - PDA
Detector UV-Vis có thể tiến hành ở các chế độ bước sóng cố định và bước sóng thay đổi Hiện nay, đa số detector UV của HPLC là bước sóng thay đổi và mảng diod (DAD/PDA)
Kỹ thuật HPLC với detector mảng diod (PDA) là một loại detector hấp thụ UV-Vis được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp phụ bức xạ UV-Vis (trong khoảng
190 - 800 nm) của các chất phân tích Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu sau đó được tách thành các bước sóng đơn Detector có một hoặc hai mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách từ kẻ vạch bằng laser Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định
Do đó, detector PDA cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau trong cùng một thời điểm và theo dõi đồng thời nhiều thành phần hấp thụ tại nhiều bước sóng khác nhau [1] Detector PDA là một thành phần quan trọng trong phương pháp sắc ký HPLC, giúp phân tích và xác định các thành phần trong mẫu dựa trên việc đọc và chuyển đổi tín hiệu từ ánh sáng hấp thụ của các chất Phần mềm máy tính hiển thị kết quả gồm quang phổ và sắc ký đồ Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian Ứng dụng: detector PDA giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích và có khả năng chồng phổ thông qua hệ số match Hệ số match > 0,99: hai phổ tương tự nhau Hệ số match < 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau Hệ số match càng gần 1 thì sự tương tự phổ càng cao
Detector PDA có những ưu điểm sau:
- Có thể thu thập dữ liệu ở một hoặc nhiều bước sóng trên sắc ký đồ;
- Có thể thu thập phổ của một hoặc nhiều chất phân tích trong sắc ký;
- Có khả năng xác định độ tinh khiết píc
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: niacinamid mononucleotid (NMN), acid nicotinic và niacinamid Đối tượng phân tích: các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (viên nang cứng, cốm, siro) mua trên địa bàn Hà Nội.
Nguyên vật liệu, thiết bị
Niacinamid Mononucleotid (NMN) (chuẩn Sigma, số kiểm soát N3501, hàm lượng > 99%)
Niacinamid (Chuẩn sigma, lô LRAD5073, hàm lượng > 99%), Acid nicotinic (chuẩn Sigma, lô LRAB7604, hàm lượng > 99%)
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion
Acetonitril (ACN), methanol (MeOH), Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) của Merck, acid othor-phosphoric 85% Nước siêu tinh khiết được điều chế bằng hệ thống nước Milli-Q (Millipore, Billerica, MA, USA)
Pha động 10 mM đệm phosphat pH 3: Cân chính xác khoảng 1,56g natri dihydro phosphat hoà tan trong 900 ml nước, điều chỉnh đến pH 3 bằng acid othor-phosphoric 85%, sau đó thêm nước vừa đủ 1000ml
2.2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn a Pha dung dịch chuẩn gốc đơn NMN, acid nicotinic và niacinamid 1000 mg/L:
Dung di ̣ch chuẩ n đơn NMN, acid nicotinic và niacinamid được pha từ chất chuẩn tương ứng trong nước cất: Cân chính xác 100 mg chất chuẩn chuyển vào bình định mức 100,0 mL, hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cất thu được dung di ̣ch gốc có nồng đô ̣ 1000 mg/L Dung di ̣ch được bảo quản trong tủ lạnh b Pha dung dịch chuẩn làm việc: Chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp
Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,1 - 75mg/L với 10 điểm chuẩn NMN, acid nicotinic và niacinamid là 75; 50; 20; 10; 5; 2; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 mg/L được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L trong nước sử dụng pipetman với các bình định mức thích hợp
- Hệ thống HPLC (Shimadzu, model: 20A) được trang bị bơm cao áp kết nối với detector PDA, bộ lấy mẫu tự động, detector PDA và cột C18 InertSustain của GL Sciences (250 mm x 4,6 mm, 5 àm) và tiền cột tương ứng
- Cân phân tích của hãng Mettler Toledo (Thuỵ Sĩ), độ chính xác 0,0001g
- Cân kỹ thuật của hãng Scientech (Thuỵ Sĩ), độ chính xác 0,01g
- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu (Việt Nam)
- Máy lắc xoáy vortex (IKA)
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu gồm:
- Dụng cụ thủy tinh: bình đi ̣nh mức, pipet, cốc, ống nghiệm
- Micropipet cỏc loại: 1000 àL; 200 àL; 20 àL
- Ống nhỏ: 2 àL để đựng mẫu phõn tớch
- Các lọ Falcon 15 mL; 50 mL để đựng dung di ̣ch chuẩ n và mẫu
- Bụ ̣ xylanh lọc mõ̃u có đường kớnh màng lọc là 0,45 àm
Mô ̣t số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát điều kiện sắc kí để định lượng đồng thời niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid
- Thẩm định phương pháp đã xây dựng:
+ Độ thích hợp hệ thống sắc kí
+ Độ chọn lọc/đặc hiệu
+ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Áp dụng quy trình đã xây dựng để phân tích đồng thời ba chất phân tích với 13 sản phẩm thu thập trên địa bàn Hà Nội
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Khảo sát điều kiện HPLC-PDA
Tham khảo các tài liệu phân tích NMN, tách thành công hai dạng acid nicotinic và niacinamid bằng HPLC [25], [34], [9], [29], [11] nhóm nghiên cứu đã lựa chọn cột C18 là pha tĩnh dựa trên sự sẵn có tại Khoa Dinh Dưỡng và Phụ Gia thực phẩm - Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia
2.4.1.1 Khảo sát thành phần pha động
Lựa chọn pha động A (đệm phosphat) và pha động B (Methanol và Acetonitril) tham khảo ở tài liệu [8], [14], [4], [16], [29], [11], [11] Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp (NMN, acid nicotinic và niacinamid) ở nồng độ 20 àg/mL
2.4.1.2 Khảo sát pH pha động đệm phosphat
Khảo sát pH đệm phosphat ở 3 điểm pH 5,3; pH 3; pH 2 tham khảo tài liệu [4], [34], [8], [40] Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp (NMN, acid nicotinic và niacinamid) ở nồng độ 20 àg/mL
2.4.1.3 Khảo sát nồng độ pha động đệm phosphat
Pha động NaH2PO4 pH 3 được khảo sát với nồng độ 5 mM, 10 mM, 20 mM Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp (NMN, acid nicotinic và niacinamid) ở nồng độ 20 àg/mL
2.4.1.4 Khảo sát tỷ lệ pha động
Ba hoạt chất niacinamid mononucleotid, acid nicotinic, niacinamid có tính chất hoá học khác nhau do đó khảo sát tỷ lệ pha động với 3 tỷ lệ: 10 mM NaH2PO 4 pH 3 - MeOH (70 : 30); 10 mM NaH2PO4 pH 3 - MeOH (80:20) và 10 mM NaH2PO4 pH 3 - MeOH (90 : 10) Tiến hành phõn tớch dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 20àg/mL
2.4.1.5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Sử dụng pha động 10mM NaH2PO4 pH 3 - MeOH (90:10) tiến hành khảo sát với các thể tớch tiờm mẫu khỏc nhau: 10, 20, 50 àL Phõn tớch dung dịch chuẩn hỗn hợp (NMN, acid nicotinic và niacinamid) ở nồng độ 20 àg/mL
2.4.1.6 Khảo sát chọn bước sóng phân tích
Sử dụng pha động đã lựa chọn, tiến hành quét phổ UV-VIS bước sóng từ 190 - 400 nm của ba chất niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid lựa chọn bước sóng phù hợp
2.4.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Quy trình chiết đóng vai trò quan trọng trong việc làm sạch mẫu phân tích do đó cần khảo sát để lựa chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được nồng độ chất phân tích là tối đa từ nền mẫu, ít tạp chất, nồng độ chất phân tích cao dựa vào 3 yếu tố chính: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu và độ ổn định của chất phân tích trong dung môi Cả ba chất phân tích đều phân cực, ổn định trong nước ở 25 o C và tham khảo ở tài liệu tham khảo [34], [8], [4], chúng tôi chọn khảo sát ở hai dung môi chiết là
H2O và TCA 4% Tham khảo ở tài liệu [34], lựa chọn thời gian chiết tối ưu là 20 phút bằng máy lắc ngang
2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích
2.4.3.1 Độ thích hợp hệ thống sắc kí
Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quy trình phân tích Đánh giá tính thích hợp của hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử Các thông số của phép thử tính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định Các thông số này đặc biệt quan trọng trong các phương pháp sắc ký Tiến hành chạy sắc kí một dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 ppm 6 lần
Giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%, độ phân giải trên 2 [18], [7]
2.4.3.2 Độ chọn lọc/đặc hiệu Độ đặc hiệu: là khả năng phát hiện được chính xác và đặc hiệu chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, tạp chất, nền mẫu… Trong phép phân tích định lượng cần đánh giá khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác [7]
Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn, các mẫu được chuẩn bị cụ thể như sau: Mẫu nền trắng: mẫu nền viên nang (đã được chạy khảo sát, kết quả là không chứa ba chất phân tích)
Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp 20 ppm
Mẫu trắng thêm chuẩn: dung dịch thêm chuẩn có nồng độ 20 ppm
Yêu cầu: Kết quả đạt tiêu chuẩn nếu phù hợp các yêu cầu: Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện peak sắc ký tại vị trí của hoạt chất chính Mẫu thêm chuẩn có tín hiệu tại
18 thời gian lưu gần với tín hiệu của mẫu chuẩn (chênh lệch tuyệt đối không quá ± 0,1 phút) [7]
Khoảng tuyến tính được xác định trong khoảng 0,1 - 75 mg/L với 10 điểm chuẩn là 75; 50; 20; 10; 5; 2; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 àg/mL Tiến hành khảo sỏt sự phụ thuộc của tớn hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị mới hằng ngày Hệ số hồi quy tuyến tính R 2 trên nền dung môi 1≥ R 2 ≥ 0,99 [7] Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:
Trong đó: i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn
Cc: Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn Giá trị không được vượt quá 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn 20% [7]
2.4.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp phân tích, lựa chọn điều kiện sắc kí và quy trình xử lý mẫu
3.1.1 Kết quả khảo sát LC
3.1.1.1 Khảo sát thành phần pha động
Pha động ảnh hưởng đến quá trình rửa giải chất phân tích (thời gian lưu), hiệu lực cột tách, độ chọn lọc, độ rộng của pic sắc kí (sự mở rộng dải) Ba hoạt chất trên đều là những chất phân cực, tham khảo pha động [4], [8], [14], [16], [29] ở nên chúng tôi lựa chọn khảo sát pha động với pha động A đệm phosphat và pha động B là Methanol và Acetonitril Với pha động đệm natri dihydro phosphat: Acetonitril với cột C18 ba chất phân tích có thời gian rửa giải nhanh, nhưng nhiều tạp nền dẫn đến hiện tượng dâng nền, đường chân peak không phẳng Với pha động B thay acetonitril bằng methanol cho pic sắc ký đối xứng hơn Vì vậy pha động (đệm natri dihydro phosphat : Methanol) với cột C18 được lựa chọn để khảo sát tiếp
Hình 3.1 Sắc kí đồ của ba chất phân tích khảo sát thành phần pha động
(a) natri dihydro phosphat : acetonitril (b) natri dihydro phosphat : methanol 3.1.1.2 Khảo sát pH pha động đệm phosphat pH của pha động có ảnh hưởng tới chất dễ ion hoá (acid yếu) vì vậy cần hạn chế tối đa sự ion của chất phân tích sẽ ảnh hưởng đến thời gian lưu, hiệu lực tách Tiến hành phân tớch dung dịch chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 20 àg/mL khảo sỏt pH đệm phosphat ở 3 điểm pH 5,3; pH 3; pH 2
22 Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat NaH2PO4 10 mM pH 5,3: Cân 1,56g Natri dihydro phosphat hoà tan trong 1L nước (dung dịch đệm có pH là 5,3) Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat NaH2PO4 10mM pH 3 và pH 2: Cân 1,56 g natri dihydro phosphat hoà tan trong
900 ml nước, điều chỉnh pH lần lượt là 3 và 2 bằng acid othor-phosphoric 85%, sau đó thêm nước vừa đủ 1000ml
Kết quả cho thấy ở pH 2 pic sắc kí của ba chất phân tích bị dính nhau, hiệu lực tách kém, tín hiệu phân tích thấp (Hình 3.2 (a)) Ở pH 5,3 thì thời gian phân tích bị kéo dài, có nhiều tạp nền, pic sắc kí bị chẻ ( Hình 3.2 (b)) Vì vậy chọn pha động pH 3 cho các pic sắc nét, hệ số tách tốt, thời gian lưu ngắn, hạn chế ảnh hưởng nền Datafile Name:m ix-iso1-pH2-Me90%.lcd
Datafile Name:m ix-iso1-m eoh002.lcd
N M N /3 3 7 9 N ic o ti n ic a c id /5 3 9 7 N ia c in a m id e /1 2 9 0 6
Datafile Nam e:s td m ix 20.lcd
Hình 3.2 Sắc kí đồ của ba chất phân tích khảo sát pH pha động A: đệm phosphat 10 mM ở pH 2 (a), pH 5,3 (b) và pH 3 (c) 3.1.1.3 Khảo sát nồng độ pha động đệm phosphat
Nồng độ pha động có ảnh hưởng đến tín hiệu của chất phân tích và độ bền của vật liệu thiết bị Trong nghiên cứu này, pha động NaH2PO4 pH 3 được khảo sát với nồng độ 5 mM, 10 mM, 20 mM
Chuẩn bị dung dịch NaH2PO4 pH 3 với nồng độ 5 mM, 20 mM: Cân lần lượt 0,78 g và
3,12 g natri dihydro phosphat hoà tan trong 900ml nước, điều chỉnh đến pH 3 bằng acid othor-phosphoric 85%, sau đó thêm nước vừa đủ 1000ml Ở nồng độ 5 mM, acid nicotinic và niacinamid hầu như không tách ra được (Hình
3.3(a)), ở nồng độ 10 mM và 20 mM cho tín hiệu phân tích cao nhưng với nồng độ 10 mM cho hiệu lực tách tốt hơn, pic nhọn sắc nét Lựa chọn pha động 10mM NaH2PO 4 pH
3 để khảo sát tiếp Datafile Name:m ix-iso1-5m M-pH3-Me90%.lcd
Datafile Name:m ix-iso1-10m M-pH3-Me90%.lcd
Datafile Name:m ix-iso1-20m M-pH3-Me90%.lcd (b)
Hình 3.3 Sắc kí đồ của ba chất phân tích khảo sát pha động A: đệm phosphat pH 3 nồng độ 5 mM (a), 10 mM (b)và 20mM (c) 3.1.1.4 Khảo sát tỉ lệ pha động
Tiến hành phõn tớch dung dịch chuẩn hỗn hợp trong nồng độ 20 àg/mL Datafile Name:mix-iso1-pH3-Me90%.lcd
Datafile Name:mix-iso1-pH3-Me70%.lcd
Datafile Name:mix-iso1-pH3-Me80%.lcd
(c) Hình 3.4 Sắc kí đồ của ba chất phân tích khảo sát tỷ lệ pha động 10mM phosphat pH 3 –
Với pha động 10 mM NaH2PO4 pH 3 - MeOH (70:30) và 10 mM NaH2PO4 pH 3 -
MeOH (80:20) giảm thời gian phân tích nhưng các pic bị rửa giải quá nhanh gây ra hiện tượng dính pic, chồng pic Do đó trong nghiên cứu này, pha động 10 mM NaH2PO4 pH 3
- MeOH (90:10) được chọn vì thời gian phân tích ngắn, hình dạng pic nhọn đối xứng, hệ số tách tốt
3.1.1.5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Hỡnh 3.5 Sắc kớ đồ của ba chất phõn tớch khảo sỏt thể tớch tiờm 10 àL
26 Khảo sỏt với cỏc thể tớch tiờm mẫu khỏc nhau: 10, 20, 50 àL Thể tớch 10 àL thỡ tớn hiệu thấp Với thể tớch tiờm mẫu 20 àL, hỡnh dạng pớc đẹp, cõn đối Khi tăng thể tớch tiờm mẫu lờn 50 àL xảy ra hiện tượng cột quỏ tải cho nờn hỡnh dạng pớc xấu, khụng cõn đối
3.1.1.6 Kết quả khảo sát bước sóng
Tiến hành quét phổ UV-VIS của ba chất niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid Kết quả thu được như Hình 3.6:
Hình 3.6 Phổ hấp thụ UV-VIS của niacinamid mononucleotid (A), acid nicotinic (B) và niacinamid (C)
Dựa vào phổ UV-VIS của ba chất, nhận thấy bước sóng 261 nm là bước sóng cực đại của acid nicotinic và tại bước sóng này NMN và niacinamid cũng có độ hấp thụ cao Do đó nghiên cứu này chọn bước sóng 261nm để phát hiện chất phân tích
Cột sắc kớ C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
Pha động: 10 mM đệm phosphat pH 3: methanol (90:10)
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
Bước sóng phát hiện 261nm
3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
3.1.2.1 Khảo sát dung môi pha mẫu
Tham khảo ở tài liệu tham khảo [34], [8], [4] nên chúng tôi chọn khảo sát ở hai dung môi là H2O và TCA 4%
Sau khi đồng nhất mẫu, cân chính xác khoảng 0,3 g mẫu thử vào 2 ống ly tâm polypropylen 50 mL Ống 1 thêm 20 mL nước, ống 2 thêm 20 ml TCA 4% Lắc cơ học 20 phút và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Gạn lấy phần dịch chiết chuyển vào bình định mức 25 mL, bình 1 định mức vừa đủ bằng nước cất, bình 2 định mức vừa đủ bằng TCA 4% Dịch chiết được lọc qua bộ lọc ống tiêm PTFE 0,2 μm trước khi được phân tích bằng HPLC-PDA
Kết quả cho thấy như bảng bên dưới, hàm lượng chất phân tích chiết được ở dung môi nước cao hơn ở dung môi TCA 4%, ở dung môi nước có nhiều hơn 1 tạp chất Tuy nhiên, nước là dung môi thân thiện với môi trường nên được ưu tiên sử dụng
Bảng 3.1 Hàm lượng NMN, acid nicotinic và niacinamid với dung môi TCA 4% và nước
NMN (mg/kg) NA (mg/kg) NAM (mg/kg)
Sử dụng nước là dung môi chiết, tiến hành chạy sắc kí trên mẫu viên nang cứng Kết quả thu được như Hình 3.7 bên dưới: Datafile Nam e:vnc-0.1580-l20-TCA.lcd
Hình 3.7 Sắc kí đồ của 3 hoạt chất trong mẫu được chiết bằng dung môi TCA 4% (a) và
Nước (b) 3.1.2.2 Quy trình xử lý mẫu
Cân chính xác khoảng 0,3 - 2,0 g mẫu đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm polypropylen 50 mL Thêm 20 mL nước vào các ống Lắc cơ học 20 phút và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Gạn lấy phần dịch chiết chuyển vào bình định mức 25 mL, định mức vừa đủ bằng nước cất Dịch chiết được lọc qua bộ lọc ống tiêm PTFE 0,2 μm trước khi được phân tích bằng HPLC-PDA.
Thẩm định phương pháp
3.2.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 ppm: Hỳt chớnh xỏc 100 àl dung dịch chuẩn gốc NMN, acid nicotinic và niacinamid vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng nước cất
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp niacinamid mononucleotid (NMN), acid nicotinic
(NA), niacinamid (NAM) ở nồng độ 10 ppm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, kết quả thu được như ở Bảng 3.2:
Bảng 3.2 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống
Nhận xét: Độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu và diện tích pic dưới 2,0% và độ phân giải trên 2 Do vậy đáp ứng yêu cầu phân tích cho ba chất NMN, acid nicotinic và niacinamid
Kết luận: Hệ thống HPLC-PDA thích hợp để tiến hành phân tích NMN, acid nicotinic và niacinamid [7]
3.2.2 Độ chọn lọc/đặc hiệu
Nhận xét: Mẫu nền trắng không cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích Mẫu thêm chuẩn cho tín hiệu thời gian lưu gần với thời gian lưu của mẫu chuẩn và chênh lệch tuyệt đối thời gian lưu không quá ± 0,1 phút
Datafile Name:std m ix 20.lcd
Datafile Name:DD tb A 1.lcd
Hình 3.8 Sắc kí đồ nền mẫu trắng (A), mẫu chuẩn hỗn hợp (B) và mẫu trắng thêm chuẩn
Kết luận: Phương pháp có tính chọn lọc/đặc hiệu với NMN, acid nicotinic và niacinamid [7]
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn NMN, acid nicotinic và niacinamid có nồng độ trong khoảng 0,1 - 75 ppm, dãy chuẩn gồm 10 điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là 75; 50; 20; 10; 5; 2; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 àg/mL, phõn tớch theo quy trỡnh và xõy dựng đường phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích tương ứng, kết quả được trình bày tại Bảng 3.3:
Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của NMN, acid nicotinic và niacinamid
Hình 3.9 Đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ NMN, NA và
Nhận xét: Hệ số tương quan (R 2 ) của ba chất đều lớn hơn 0,999 chứng tỏ tính tuyến tính cao giữa các diện tích pic và nồng độ các chất 0,1 - 75 ppm, giá trị tuyệt đối của độ chệch (bias) mỗi điểm chuẩn không vượt quá 15% và giá trị R 2 thoả mãn 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
Kết luận: Vậy khoảng tuyến tính của NMN, acid nicotinic và niacinamid được lập trong khoảng 0,1 ppm đến 75 ppm đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC [7]
3.2.4 Giới hạn phát hiện(LOD), Giới hạn định lượng(LOQ)
Thực hiện thêm chuẩn hỗn hợp vào nền mẫu trắng trước khi xử lý mẫu để thu được nồng độ mẫu thêm chuẩn là 0,2 ppm Phân tích mẫu 10 lần song song, tính giá trị trung bình của hàm lượng và độ lệch chuẩn SD Kết quả được trình bày tại Bảng 3.4; Bảng 3.5;
Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) của NMN
Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) của NA
Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ) của NAM
Bảng 3.7 Nhận xét kết quả, Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ)
Kết luận: Kết quả phân tích hệ số R nằm trong khoảng 4 - 10, như vậy nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD - LOQ tính được là đáng tin cậy [7]
3.2.5 Độ lặp lại và độ chụm trung gian Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,3 g mẫu viên nang cứng 6 vào ống ly tâm polypropylen 50 mL, sau đó thêm 20 mL nước vào các ống Lắc cơ học 20 phút và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Gạn lấy phần dịch chiết chuyển vào bình định mức 25 mL, định mức vừa đủ bằng nước cất Pha loãng dịch chiết 100 lần Dịch chiết được lọc qua bộ lọc ống tiêm PTFE 0,2 μm trước khi được phân tích bằng HPLC-PDA
Kết quả được tính dựa trên độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến động RSD (%) của hàm lượng thu được từ 6 lần phân tích mẫu độc lập được trình bày tại Bảng 3.8:
Kết luận Đạt Đạt Đạt
Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ lặp lại trên nền mẫu viên nang cứng 6 Độ chụm trung gian của phương pháp được đánh giá thông qua hệ số biến động RSDR
(%) Kết quả tập hợp như bảng dưới cho thấy phương pháp có độ chính xác cao
Bảng 3.9 Kết quả phân tích độ chụm trung gian trên nền mẫu viên nang cứng 6
Kết luận Đạt Đạt Đạt
Kết luận: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại, độ chụm trung gian tốt đối với cả ba hoạt chất, đạt yêu cầu quy định của tiêu chuẩn AOAC [Phụ lục A]
3.2.6 Độ thu hồi Độ thu hồi được tiến hành bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu trắng và tính hiệu suất thu hồi Chuẩn NMN, acid nicotinic và niacinamid được bổ sung với 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao trước khi xử lý mẫu sao cho sau khi xử lý mức nồng độ trong dung dich mẫu thêm chuẩn trong khoảng đường chuẩn đã thẩm định Mỗi mức nồng độ thực hiện phân tích trên 4 mẫu độc lập
Với mức nồng độ thấp lượng chuẩn thêm vào của 3 chất phân tích tương đương 167 mg/kg trong mẫu, có nồng độ phân tích là 2 ppm Mức nồng độ trung bình lượng chuẩn thêm vào của 3 chất phân tích tương đương 1667 mg/kg trong mẫu, có nồng độ phân tích là 20 ppm Mức nồng độ cao lượng chuẩn thêm vào của 3 chất phân tích tương đương
3333 mg/kg trong mẫu, có nồng độ phân tích là 40 ppm
Mỗi mức nồng độ thực hiện phân tích trên 4 mẫu độc lập Kết quả được trình bày tại
Bảng 3.10 Kết quả phân tích độ thu hồi của NMN
Khối lượng tìm lại (àg)
Bảng 3.11 Kết quả phân tích độ thu hồi của acid nicotinic
Khối lượng tìm lại (àg)
Bảng 3.12 Kết quả phân tích độ thu hồi của niacinamid
Khối lượng tìm lại (àg)
Kết luận: Kết quả thực nghiệm cho thấy các giá trị của độ thu hồi tại các nồng độ trong mẫu nền thêm chuẩn đều đạt yêu cầu của AOAC 2016 [Phụ lục A].
Áp dụng trên các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khoẻ
Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra 13 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên thị trường Hà Nội Kết quả thu được như Bảng 3.13:
Bảng 3.13 Kết quả định lượng thành phần niacinamid mononucleotid, acid nicotinic và niacinamid trong các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khoẻ trên thị trường Hà Nội
7 Viên nang 151,1mg/g 144,6mg/g 3,02mg/ g
1 0,67mg/ml 0,51mg/m l / / 0,33mg/ml 0,42mg/ml
0,007mg/m l Chú thích: / nhà sản xuất không công bố hàm lượng chất phân tích trên nhãn Đối với kết quả của 13 mẫu sản phẩm ở trên cho thấy sản phẩm chứa NMN đơn thành phần và dạng phối hợp trên thị trường có chất lượng chênh lệch lớn Có 7 mẫu sản phẩm (chiếm 54%) không có mặt hoặc tín hiệu NMN dưới giới hạn định lượng, có 2 sản phẩm hàm lượng NMN cao hơn 90% so với công bố trên nhãn (chiếm 15% tổng mẫu) là viên nang cứng 7 (95,7%) và bột cốm 3 (101,7%), 2 sản phẩm có hàm lượng thấp hơn hàm lượng ghi trên nhãn lần lượt là siro 1 (76,1%) và bột cốm 1 (51,2%) Các mẫu sản phẩm có ba hoạt chất đều cho thấy khả năng tách tốt, độ phân giải cao
Vì sự chênh lệch về chất lượng giữa các sản phẩm chứa NMN có mặt trên thị trường là rất cao với nhiều sản phẩm còn kém chất lượng Do đó, đặt ra vấn đề cần có biện pháp quản lý chặt chẽ hơn từ các đơn vị chức năng để đảm bảo lợi ích của người tiêu dùng.