nguyễn thị khánh ly nghiên cứu ứng dụng tương quan in vitro in vivo trong bào chế miếng dán qua da chứa l tetrahydropalmatin

TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO

TRONG BÀO CHẾ MIẾNG DÁN QUA DA CHỨA l-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO

TRONG BÀO CHẾ MIẾNG DÁN QUA DA CHỨA l-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Nguyễn Thạch Tùng 2 TS Nguyễn Trần Linh

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS TS Nguyễn Thạch Tùng và TS Nguyễn Trần Linh đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và trang bị

cho em những kiến thức và kĩ năng cần thiết trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Khoa Bào chế - Công nghệ dược phẩm, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đặc biệt

là GS TS Nguyễn Ngọc Chiến, TS Trần Ngọc Bảo, TS Nguyễn Cảnh Hưng đã

quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để em được thực hiện và hoàn thành khoá luận Em xin được gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu và các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn các bạn tổ 11, các anh chị, các bạn và các em trong nhóm nghiên cứu của thầy Thạch Tùng, đặc biệt là NCS Phạm Thị Phương Dung, anh Nguyễn Quốc Hoài, bạn Nguyễn Minh Trang, bạn Đỗ Ngọc Quang, bạn Đặng Thành Vinh, bạn Phí Quang Minh, bạn Phạm An Khánh, em Nguyễn Lê Thùy Trang, em Nguyễn Thị Thanh Hiền, em Tăng Trung Nghĩa và em Nguyễn Trọng Sơn Anh đã luôn đồng hành và giúp đỡ em trong quá trình làm khoá luận

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình vì đã luôn ủng hộ em trong các dự định của bản thân Em cảm thấy vô cùng may mắn vì có gia đình và bạn bè quan tâm, ủng hộ em suốt thời gian qua

Em rất mong nhận được sự nhận xét và góp ý của quý thầy cô để khoá luận có thể được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thị Khánh Ly

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1.4 Một số nghiên cứu về đặc điểm dược động học của l-tetrahydropalmatin 3

1.1.5 Một số nghiên cứu về các dạng bào chế qua da chứa l-tetrahydropalmatin 4 Tương quan in vitro – in vivo 5

1.2.1 Đại cương 5

1.2.2 Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá đối với thuốc qua da 6

1.2.3 Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá đối với thuốc qua da 6

1.2.4 Các bước thiết lập tương quan in vitro – in vivo 7

1.2.5 Một số nghiên cứu về tương quan in vitro – in vivo cho miếng dán qua da 12

1.2.6 Một số nghiên cứu về tương quan in vitro – in vivo cho l-tetrahydropalmatin 12

1.2.7 Phần mềm GastroPlus và các thao tác cơ bản khi xây dựng mô hình PBPK 13

1.2.8 Một số ứng dụng khác của mô hình dược động học sinh lý (PBPK) 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 16

Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Hoàn thiện mô hình dược động học sinh lý cho miếng dán qua da chứa THP 17

l-2.2.2 Xây dựng mô hình dược động học sinh lý đường uống xác định khoảng nồng độ thuốc ở trạng thái ổn định tương ứng với tác dụng dược lý mong muốn 17

2.2.3 Ứng dụng IVIVC trong việc mô phỏng dữ liệu thấm in vitro và dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương in vivo của miếng dán qua da chứa l-THP 17

2.2.4 Tối ưu tỉ lệ các thành phần trong công thức miếng dán qua da chứa l-THP

17

Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bào chế 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro của miếng dán 18

2.3.3 Phương pháp mô phỏng dữ liệu 19

2.3.4 Phương pháp xây dựng mô hình dược động học sinh lý xác định khoảng nồng độ l-tetrahydropalmatin ở trạng thái ổn định ứng với tác dụng dược lý mong muốn 22

2.3.5 Phương pháp đánh giá các đặc tính của cốt dính 23

2.3.6 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 25

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

Thẩm tra phương pháp định lượng l-tetrahydropalmatin in vitro bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 26

Mô hình dược động học sinh lý miếng dán qua da chứa l-tetrahydropalmatin 26

3.2.1 Mô phỏng dữ liệu in vivo đường tiêm tĩnh mạch 27

3.2.2 Mô phỏng dữ liệu in vivo của các miếng dán 28

Xây dựng mô hình dược động học sinh lý (PBPK) xác định khoảng nồng độ l-tetrahydropalmatin ở trạng thái ổn định ứng với tác dụng mong muốn 31

3.3.1 Xác định mối quan hệ giữa liều – tác dụng 31

3.3.2 Mô hình dược động học sinh lý ứng dụng (PBPK) mô phỏng khoảng nồng độ l-tetrahydropalmatin ở trạng thái ổn định 32

Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức bào chế miếng dán chứa tetrahydropalmatin 34

l-3.4.1 Thiết kế thí nghiệm 34

3.4.2 Phân tích kết quả 36

3.4.3 Không gian thiết kế 39

3.4.4 Tối ưu hóa công thức bào chế 39

3.4.5 Đánh giá lại công thức tối ưu 41

Đánh giá ảnh hưởng của miếng dán đến các đặc tính sinh lý của da 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AUC0-t Diện tích dưới đường cong từ thời điểm 0 đến thời điểm t Cmax Nồng độ dược chất cực đại trong huyết tương

CPP Hành vi ưa thích nơi chốn có điều kiện (Conditioned Place

Preference behavior) DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxyd

EMA Cơ quan Y tế Châu Âu (European Medicines Agency) IV Tiêm tĩnh mạch (Intravenous)

IVIVC Tương quan in vitro – in vivo (In vitro – In vivo Correlation)

KLPT Khối lượng phân tử l-THP l-tetrahydropalmatin

NMP N-methyl-2-pyrrolidon

PBPK Mô hình dược động học dựa trên sinh lý (Physiologically based

pharmacokinetics) PE Sai số dự đoán (Predicted error) PSA Phân tích các thông số nhạy cảm (Parameter sensitivity analysis)

TCAT Mô hình sinh lý da (Transdermal Compartmental Absorption & Transit

Model) TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất

Tmax Thời điểm dược chất đạt nồng độ tối đa trong huyết tương (Time to peak

drug concentration)

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration) USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopeia)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số mô hình tương quan in vitro – in vivo phi tuyến tính 11

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.3 Thành phần công thức bào chế miếng dán 17

Bảng 2.4 Các dữ liệu đầu vào của phần mềm GastroPlus 20

Bảng 2.5 Các biến đầu vào trong thiết kế thí nghiệm 25

Bảng 2.6 Các biến đầu ra và mục tiêu thiết kế 25

Bảng 3.1 Giá trị các thông số sinh lý sau khi tối ưu hóa dữ liệu in vivo IV 28

Bảng 3.2 Giá trị các thông số sinh lý sau khi tối ưu hóa dữ liệu in vivo các miếng dán 30

Bảng 3.3 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của l-THP 31

Bảng 3.4 Các công thức thiết kế thí nghiệm miếng dán chứa l-THP 34

Bảng 3.5 Khoảng giới hạn các biến đầu ra 35

Bảng 3.6 Kết quả thực nghiệm các biến đầu ra (n = 3) 36

Bảng 3.7 Các giá trị R2 và p của các phương trình hồi quy 36

Bảng 3.8 Hàm hy vọng riêng của từng biến đầu ra 40

Bảng 3.9 Giá trị tương ứng của biến đầu ra của công thức tối ưu 40

Bảng 3.10 Giá trị biến đầu ra thực nghiệm công thức tối ưu dự đoán và thực nghiệm (n =3) 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của THP 2

Hình 1.2 Các mức tương quan in vitro – in vivo 5

Hình 1.3 Mô hình dược động học phân bố qua da 6 ngăn 8

Hình 1.4 Mô hình dược động học quần thể 8

Hình 1.5 Mô hình sinh lý da 10

Hình 1.6 Cửa sổ làm việc phần mềm GastroPlus (9.8.3) 13

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương từ dữ liệu in vitro 19

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ l-THP 26

Hình 3.2 Nồng độ l-THP trong huyết tương mô phỏng (đường) so với nồng độ l-THP quan sát (điểm) của đường tiêm tĩnh mạch 27

Hình 3.3 Nồng độ l-THP trong huyết tương mô phỏng (đường) so với nồng độ l-THP quan sát (điểm) của các miếng dán trước khi tối ưu 29

Hình 3.4 Nồng độ l-THP trong huyết tương mô phỏng (đường) so với nồng độ l-THP quan sát (điểm) của các miếng dán sau khi tối ưu 29

Hình 3.5 Nồng độ l-THP trong huyết tương mô phỏng (đường) so với nồng độ l-THP quan sát (điểm) 33

Hình 3.6 Nồng độ l-THP trong huyết tương mô phỏng ở trạng thái ổn định 33

Hình 3.7 Phần trăm dược chất thấm qua da theo thời gian, (A) - 1,2g Viscomate, (B) - 1,8g Viscomate, (C) - 2,4g Viscomate 37

Hình 3.8 Đồ thị các đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của lượng l-THP và lượng Viscomate đến (A) nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương Cmax, (B) thời gian nồng độ thuốc trong khoảng Cssmin - Cssmax, (C) thời gian thuốc bắt đầu có tác dụng 38

Hình 3.9 Đồ thị các đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của lượng l-THP và lượng Viscomate đến (A) lực dính, (B) độ nhớt, (C) tanδ 38

Hình 3.10 Miền giá trị các biến đầu vào để các biến đầu ra đạt yêu cầu 39

Hình 3.11 Kết quả mô phỏng nồng độ thuốc trong máu theo thời gian công thức tối ưu 41

Hình 3.12 Ảnh hưởng của các công thức đến một số đặc tính sinh lý da (n = 5, TB ± SD) 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

l-Tetrahydropalmatin (l-THP) là một alkaloid có nguồn gốc tự nhiên, được sử dụng trong điều trị các bệnh mạn tính như mất ngủ, căng thẳng, lo âu,… Tuy nhiên, l-THP khi dùng đường uống có tác dụng ngắn, chuyển hóa nhanh và sinh khả dụng thấp [72], cần dùng nhiều lần trong ngày để đạt hiệu quả điều trị Dạng bào chế miếng dán qua da chứa l-THP có thể khắc phục các nhược điểm trên bởi l-THP có tính chất lý hóa phù hợp với dạng thuốc này Để phát triển thành công dạng bào chế miếng dán qua da, cần có những nghiên cứu sâu rộng về giải phóng thuốc, khả năng hấp thu qua da và dược động học của l-THP

Mặc dù vậy, các nghiên cứu về ảnh hưởng của dạng bào chế đến khả năng giải

phóng in vitro và sinh khả dụng in vivo của l-THP còn hạn chế, đặc biệt là tương quan in vitro - in vivo (IVIVC) IVIVC là công cụ quan trọng để dự đoán sinh khả dụng in vivo của chế phẩm giải phóng kéo dài dựa trên dữ liệu giải phóng in vitro, tuy nhiên,

tỷ lệ xây dựng và ứng dụng thành công IVIVC vẫn còn thấp [67] Mô hình dược động học sinh lý (Physiologically based pharmacokinetics - PBPK) đã được phát triển để mô tả chính xác quá trình dược động học của thuốc theo từng cơ quan sinh lý, giúp thiết lập IVIVC với khả năng thành công cao hơn [66] Trong IVIVC, mô hình PBPK vừa tham gia vào quá trình giải chập để thiết lập tương quan, vừa dùng để tích chập mô phỏng nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian [46]

Nghiên cứu trước đây của ThS Nguyễn Thị Hòa (2022) [5] đã bước đầu xây dựng mô hình PBPK và IVIVC cho miếng dán qua da chứa l-THP, đạt được tương quan có ý nghĩa mức A Tuy nhiên, mô hình PBPK xây dựng được cho thấy phổi, động mạch, tĩnh mạch là 3 cơ quan chuyển hóa, thải trừ chính của thuốc Điều này không phù hợp với lý thuyết về dược động học, mô hình không mô tả đúng quá trình dược động của thuốc trong cơ thể và có thể dẫn đến kết quả mô phỏng sai lệch so với thực tế

Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng tương quan in vitro – in vivo trong

bào chế miếng dán qua da chứa l-tetrahydropalmatin” được thực hiện với các

mục tiêu chính sau đây:

1 Hoàn thiện mô hình dược động học sinh lý cho miếng dán qua da chứa 1-THP để kết hợp với phương trình tương quan, mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương in vivo từ dữ liệu in vitro của miếng dán qua da chứa l-THP

2 Tối ưu hóa công thức bào chế miếng dán qua da chứa l-THP nhằm duy trì nồng độ thuốc trong khoảng có tác dụng trên 8 giờ và cải thiện khả năng bám dính của miếng dán

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Tổng quan về l-tetrahydropalmatin

1.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hóa học

l-Tetrahydropalmatin là một protoberberin isoquinolin alkaloid, là dược chất có hoạt tính được chiết xuất từ rễ củ của một số dược liệu thuộc họ Stephania spp hoặc Coridalis spp., đặc biệt là cây Bình vôi (Stephania rotunda) và cây cải cần (Corydalisambigua) Hiện nay, l-THP được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp toàn phần [81]

Cấu trúc phân tử của l-THP được thể hiện ở Hình 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của THP

- Công thức phân tử: C21H25NO4; khối lượng phân tử: 355,4 g/mol - Tên khoa học: 5, 8, 13, 13a-tetrahydro-2, 3, 9, 10-tetramethoxy-6H-dibenzo [a,g]

quinolizin [1] - Tên khác: rotundin, gindarin, caseanin, hyndarin [1]

1.1.2 Tính chất lý hóa

Tính chất vật lý: - Cảm quan: tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển sang

màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt độ cao [1] - Độ tan: l-THP tan tốt trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan

trong nước, dễ tan trong acid sulfuric loãng [1] - Nhiệt độ nóng chảy: 141-144˚C [1]

- pKa = 5,34 [29] - LogP = 3,09 [29] - LogKp (khả năng thấm qua da): -6,17 [29]

Tính chất hóa học: - Tính base yếu: l-THP chứa N bậc 3 trong phân tử, có thể dễ dàng tạo muối với

các acid vô cơ

- Tính chất hóa học của alkaloid: l-THP có phản ứng với các thuốc thử alkaloid như thuốc thử Dragendorff, acid picric,… [1]

- Độ ổn định: l-THP dễ bị oxy hóa dưới ánh sáng và nhiệt độ cao, các phân tử bị kích thích lên năng lượng cao có thể trải qua một hoặc nhiều phản ứng và chuyển hóa thành sản phẩm cuối là palmatin [25]

1.1.3 Tác dụng dược lý

l-THP được quan tâm nghiên cứu bởi tác động lên hệ thần kinh l-THP có tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ được chứng minh là có liên quan đến tính đối kháng trên các thụ thể D1, D2 và D3 của dopamin [54], [81] Do cơ chế tác dụng không liên quan đến thụ thể opioid, l-THP được sử dụng kết hợp với pethidin nhằm tăng tác dụng giảm đau, giảm liều pethidin và giảm tình trạng phụ thuộc thuốc [81]

Một số nghiên cứu cho thấy l-THP có tác dụng cải thiện hội chứng gây nghiện do sử dụng các thuốc giảm đau opioid l-THP có tác dụng ức chế mô hình hành vi CPP khi dùng morphin, cocain, oxycodon và methamphetamin (METH), đồng thời có thể ức chế tái phát CPP do METH ở một mức độ nào đó [15] l-THP đối kháng các thụ thể của dopamin, adrenergic và serotonin chọn lọc trên não bộ, do đó ức chế quá trình phosphoryl hóa của enzym ERK, giảm tác dụng phụ thuộc do dùng METH [15], [54]

Gần đây, l-THP cũng được nghiên cứu về khả năng chống ung thư l-THP có khả năng điều trị u nguyên bào thần kinh đệm bằng cách ức chế dòng ERK/NF-κB, làm giảm

thể tích khối u, ức chế khả năng di chuyển và xâm lấn của khối u trên cả in vitro và in vivo ở chuột [78] l-THP có thể gây ra quá trình chết tế bào theo chu kì (apoptosis)

độc lập p53 thông qua protein XIAP bằng cách ức chế MDM2 và tăng độ nhạy cảm của tế bào ung thư bạch cầu EU-4 với doxorubicin l-THP được coi là một phân tử mới có thể gây ra apoptosis đặc biệt trong các tế bào ung thư bạch cầu [23] l-THP có thể làm giảm khả năng kháng thuốc của bệnh nhân đối với các loại thuốc chống ung thư như cisplatin, doxorubicin, fulvestrant và tamoxifen, do l-THP giảm sự tích tụ và độc tính của các chất ở gan và thận [15]

Ngoài ra, l-THP có tác dụng giãn cơ trơn, hạ huyết áp do ức chế thụ thể adrenergic và kênh calci [54] l-THP còn có tác dụng kích thích hệ thống nội tiết trên tuyến yên, tuyến thượng thận và bảo vệ gan [15], [75]

1-1.1.4 Một số nghiên cứu về đặc điểm dược động học của l-tetrahydropalmatin

Nguyễn Đình Đức và cộng sự (2015) đã đánh giá đặc tính dược động học của l-THP dạng nguyên liệu và dạng tự vi nhũ hóa trên thỏ Kết quả cho thấy Tmax đạt được sau 5 phút ở dạng tự vi nhũ hóa và 15 phút ở dạng nguyên liệu thô, sau đó nồng độ l-THP giảm nhanh và không phát hiện được tín hiệu sau 4 giờ [8], [13] Nghiên cứu của Bùi Quang Đông (2018) đã đánh giá đặc tính dược động học của hệ phân tán rắn chứa

l-THP trên thỏ và dạng nguyên liệu (4,5 mg/kg) đường uống và đường tiêm tĩnh mạch cũng cho kết quả tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Đình Đức, Tmax đạt được trong 10 phút và nồng độ l-THP trong huyết tương thỏ giảm nhanh theo thời gian [3]

Chao và cộng sự (2017) đã tiến hành đánh giá dược động học của viên phân tán chứa l-THP ở người với liều 60 mg, đường uống Kết quả cho thấy Tmax đạt được sau 1,25 giờ l-THP hấp thu nhanh với t1/2ka là 0,5 giờ, phân bố nhanh với t1/2 là 0,74 giờ và thải trừ chậm với t1/2β là 11,42 giờ l-THP phân bố chủ yếu ở khoang ngoại vi với V1/F là 133,30 L [41]

Yiran và cộng sự (2021) đã nghiên cứu đánh giá dược động học trên não chuột của 3 dạng bào chế gồm có hỗn dịch l-THP, hỗn dịch l-THP và puerarin (15:100) và hệ vi tự nhũ hóa chứa l-THP với liều 15 mg/kg đường uống Kết quả thông số dược động học của dạng hỗn dịch l-THP thu được như sau: Tmax = 0,34 giờ, Cmax = 2997,54 ng/g, MRT = 4,5 giờ, AUC0-∞ = 4,975,08 ng.h/ml Ngoài ra, hệ vi tự nhũ hóa có sinh khả dụng tương đối cao gấp 3,25 lần dạng hỗn dịch [24]

1.1.5 Một số nghiên cứu về các dạng bào chế qua da chứa l-tetrahydropalmatin

Li, Chunmei và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của chất kết dính, chất tăng thấm đến khả năng thấm qua da của THP dạng racemic, các đặc tính

lưu biến và giải phóng in vitro Nghiên cứu chỉ ra rằng emulgel chứa THP được bào chế

với Carbopol (971P) và chất tăng thấm N-methyl-2-pyrrolidon cho thông lượng giải phóng cao nhất khi so sánh với các chất tăng thấm như Transcutol, polysorbat 80 và propylen glycol cho lượng dược chất thấm qua da là 118,19 µg/cm2 [53]

Xie và cộng sự (2016) đã nghiên cứu đánh giá dược động học của miếng dán chứa l-THP trên da thỏ với liều 45 mg trong 24 giờ Kết quả thông số dược động học thu được như sau: Tmax = 5,0 giờ, Cmax = 153,12 ng/ml, MRT = 10,0 giờ, AUC0-∞ = 2,10 µg.h/ml So với nhóm sử dụng nguyên liệu, nhóm sử dụng miếng dán cho kết quả Cmax tăng 3 lần [77]

Guizhen và cộng sự (2023) đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của gel liposom

chứa l-THP đến khả năng thấm và sinh khả dụng in vivo của l-THP Kết quả cho thấy

Cmax trong huyết tương gel liposom là 0,16 μg/mL và Tmax là 1,2 giờ Sinh khả dụng tương đối của l-THP trong gel liposom là 233,8% so với nhũ tương Kết quả đánh giá lượng thuốc còn lại trên da cho thấy tổng lượng l-THP được giải phóng khỏi bề mặt da và parafilm sau 24 giờ lần lượt là 0,43 ± 0,05 mg và 0,37 ± 0,09 mg đối với nhóm gel liposom và nhũ tương

Từ các nghiên cứu trên, các dạng bào chế qua da chứa l-THP giúp kéo dài nồng độ thuốc trong huyết tương thỏ, góp phần tăng sinh khả dụng so với đường tiêm tĩnh mạch và đường uống

Tương quan in vitro – in vivo

1.2.1 Đại cương

FDA định nghĩa tương quan in vitro – in vivo (in vitro – in vivo correlation IVIVC) là một mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa đặc tính in vitro của dạng bào chế (thường là tốc độ hoặc mức độ thuốc hòa tan hoặc giải phóng) với đáp ứng in vivo

tương ứng (nồng độ dược chất trong huyết tương hoặc lượng dược chất hấp thu) [44] Theo hướng dẫn của FDA và USP, có 5 mức tương quan IVIVC gồm mức A, mức B, mức C, đa điểm mức C và mức D được phân loại dựa vào khả năng dự đoán nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian sau khi dùng chế phẩm [44], [71] Trong đó, tương quan mức A là mức cao nhất, mô tả mối quan hệ điểm - điểm giữa đồ thị tốc độ

giải phóng in vitro và tốc độ hấp thu in vivo [44] Do đó, có thể dự đoán đáp ứng in vivo thông qua kết quả in vitro khi thay đổi về nguyên liệu, nhà xưởng, quy trình sản xuất

hay thay đổi nhỏ trong công thức mà không cần thử lại trên người [44] Các mức tương

quan IVIVC được thể hiện ở hình 1.2

Hình 1.2 Các mức tương quan in vitro – in vivo

Xây dựng IVIVC cho thuốc qua da có thể nghiên cứu ba mối tương quan:

(1) giải phóng in vitro - tính thấm qua da in vivo, (2) giải phóng in vitro - sinh khả dụng in vivo và (3) tính thấm qua da in vitro - sinh khả dụng in vivo [39], [73] Với các thuốc qua da, phương pháp đánh giá độ hòa tan in vitro không phản ánh các cơ chế hấp thu

thuốc qua da [39] Do đó, tương quan mức A sẽ được xây dựng trong nghiên cứu thuốc phân phối qua da bằng cách đánh giá nồng độ thuốc trong huyết tương và mức độ dược chất thấm qua da tại các thời điểm khác nhau Tương quan mức A có thể phản ánh đường

cong nồng độ dược chất trong huyết tương, cũng như dự đoán mức độ hấp thu in vivo của các thuốc qua da từ mức độ thấm in vitro của dược chất [79]

1.2.2 Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá đối với thuốc qua da

Sinh khả dụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ dạng

thuốc, được thực hiện bằng thử nghiệm hòa tan (dissolution test) hoặc thử nghiệm giải

phóng dược chất (drug release test) [44] Đối với dạng thuốc qua da, sinh khả dụng in vitro có thể là phần trăm giải phóng hoặc phần trăm dược chất thấm qua màng khuếch

tán Màng khuếch tán có thể là da động vật, hoặc màng thẩm tích tương ứng với mục đích đánh giá khả năng thấm hoặc khả năng giải phóng của các thuốc qua da

Đối với các nghiên cứu thuốc qua da, thử nghiệm giải phóng dược chất in vitro

có nhiều phương pháp có thể được sử dụng như cánh khuấy kết hợp đĩa thấm (Paddle-over-disk, Apparatus 5), xi lanh quay (Rotating Cylinder, Apparatus 6), giỏ

dao động (Reprocating Holder, Apparatus 7) [71] Các nghiên cứu khuếch tán da in vitro

là bắt buộc đối với phát triển của các thuốc da và thường được thực hiện trong thiết bị khuếch tán Franz Thiết bị được thiết kế phù hợp sinh lý với da và công thức bào chế

[45] Nhược điểm của thiết bị khuếch tán Franz là thiếu hệ mạch máu có trong in vivo

giúp thanh thải thuốc nhanh chóng Đối với các dược chất tan kém, nồng độ dược chất trong ngăn nhận có thể đạt gần đến độ tan bão hòa và làm giảm khả năng thấm thuốc từ

ngăn cho ngay cả trong điều kiện sink Đây là vấn đề đặc biệt cần lưu ý khi đánh giá mức độ thấm in vitro với dược chất kém tan Để tránh những vấn đề này, các hệ thống

ngăn cho và ngăn nhận của thiết bị khuếch tán cần được thiết kế sao cho môi trường thử trong ngăn nhận được loại bỏ liên tục [42]

1.2.3 Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá đối với thuốc qua da

Sinh khả dụng in vivo là mức độ và tốc độ dược chất hoặc chất chuyển hóa

có hoạt tính từ dạng bào chế được hấp thu vào vòng tuần hoàn chung và có mặt tại vị trí tác dụng trong cơ thể sống [44]

Nghiên cứu sinh khả dụng của các dạng thuốc dùng qua da có thể thực hiện trên các mô hình động vật đã được sử dụng để nghiên cứu trên da của chuột, thỏ, lợn, người Trong đó, đánh giá sinh khả dụng trên da người là lý tưởng nhất, nhưng vì tính sẵn có và những ràng buộc về đạo đức, cần có một mô hình động vật có thể mô phỏng được da người Các loài động vật đều có sự khác nhau về mật độ nang lông trên một đơn vị diện tích và độ dày lớp sừng Nhìn chung, độ dày của lớp sừng tăng lên theo kích thước của động vật [42] Vì thế, việc xây dựng tương quan là cần thiết nhằm giúp lựa chọn được

loại da thích hợp trong các thí nghiệm thử tính thấm in vitro của dược chất

Sau khi dán miếng dán, quá trình hấp thu dược chất từ hệ vào vòng tuần hoàn chung trải qua nhiều bước gồm: Dược chất được hòa tan và giải phóng từ dạng bào chế; dược chất phân bố vào lớp sừng; dược chất khuếch tán qua lớp sừng, chủ yếu thông qua các khoảng gian bào thân dầu (bước giới hạn tốc độ thấm với hầu hết dược chất); dược chất phân bố từ lớp sừng vào lớp biểu bì thân nước; dược chất khuếch tán vào lớp hạ bì

và đi vào các mao mạch; cuối cùng vào vòng tuần hoàn chung [48] Để đánh giá sinh

khả dụng in vivo, có 5 cách đánh giá nồng độ dược chất như sau: (a) lượng dược chất

còn trên bề mặt da; (b) lượng dược chất trong da; (c) lượng dược chất trong tĩnh mạch đến vị trí dùng thuốc; (d) lượng dược chất trong tuần hoàn chung; (e) lượng dược chất trong sản phẩm bài tiết Cách phổ biến để xác định sinh khả dụng của thuốc qua da dùng toàn thân là lấy máu trong tuần hoàn chung và định lượng nồng độ dược chất trong huyết tương [48]

1.2.4 Các bước thiết lập tương quan in vitro – in vivo

1.2.4.1 Mô hình hóa dữ liệu in vitro

Mô hình hóa là phương pháp mô phỏng dữ liệu bằng các phương trình toán học,

từ đó dự đoán các đặc tính của hệ Đồ thị giải phóng in vitro thường được mô hình hóa

theo các mô hình sau Hill, Weibull, Makoid Banakar, Weibull đôi

Mô hình hóa dữ liệu thử hòa tan in vitro là phương pháp mô phỏng dữ liệu thử

hòa tan thành các đường cong động học tương ứng với các phương trình hòa tan Từ đó có thể dự đoán được cơ chế hòa tan hoặc giải phóng của dược chất từ dạng bào chế [42]

1.2.4.2 Mô hình hóa dữ liệu in vivo Dữ liệu đường cong hấp thu in vivo thu được bằng phương pháp giải chập dữ liệu

nồng độ thuốc trong máu theo thời gian và mô hình dược động học Các phương pháp giải chập truyền thống bao gồm phương pháp Wagner-Nelson, Loo-Reigelman và giải chập số học (Numerical deconvolution) Trong đó, 2 phương pháp của Wagner-Nelson và Loo-Riegelman giải chập dựa trên mô hình ngăn Wagner-Nelson sử dụng mô hình 1 ngăn, Loo-Riegelman tiếp tục mở rộng với mô hình 2 ngăn, 3 ngăn nhờ phương pháp cân bằng khối (Mass balance methods) có sử dụng chế phẩm đối chiếu dùng theo đường tiêm tĩnh mạch Phương pháp còn lại là kĩ thuật giải chập phân tích dược động học không dựa trên mô hình ngăn sử dụng chế phẩm đối chiếu là dung dịch tiêm tĩnh mạch, dung dịch uống hoặc chế phẩm rắn giải phóng nhanh (thường dùng trong nghiên cứu xây dựng tương quan với dạng thuốc giải phóng kéo dài) [9], [11], [12], [10]

Tuy nhiên, quá trình dược động học của thuốc trong cơ thể diễn ra phức tạp, vì vậy mô hình 3 ngăn chưa phù hợp để mô phỏng quá trình dược động học của các thuốc hấp thu phức tạp Phương pháp giải chập cơ học (Mechanistic deconvolution) giải chập thông qua các mô hình ngăn phức tạp hơn [49], [62] Một số mô hình dược động học đối với thuốc qua da được xây dựng từ các nghiên cứu trước, được trình bày dưới đây:

a Mô hình đa ngăn Nakayama và cộng sự (1999) đã phát triển một mô hình sáu ngăn chia các lớp da và cơ là các ngăn khác nhau [28] Họ chỉ ra rằng lớp da và cơ bên dưới miếng dán

hoạt động như một ngăn khác so với các lớp da và cơ đối diện Mô hình được thể hiện ở hình 1.3 [42]

Hình 1.3 Mô hình dược động học phân bố qua da 6 ngăn

Trong đó: V và C tương ứng là thể tích và nồng độ thuốc trong mỗi ngăn Cl là độ thanh thải giữa các mô với mô hoặc với huyết tương Các chỉ số phụ d, vs, m, cs, ms và p tương ứng là ngăn cho, da, cơ, lớp da đối diện, cơ đối diện và khoang huyết tương

Phương trình vi phân cho các ngăn mô tả sự phân bố thuốc trong mỗi ngăn Trong mô hình này, các giá trị của Clvs-m và Clvs-p có thể là đại diện cho hiệu quả của việc phân phối toàn thân hoặc phân phối cục bộ Mô hình này có thể được sử dụng để đánh giá sự đóng góp phân đoạn của sự thâm nhập trực tiếp và cung cấp máu cho lớp cơ sâu hơn bên dưới vị trí sử dụng miếng dán [42]

b Mô hình dược động học quần thể Auclair và cộng sự (1998) đã phát triển mô hình dược động học quần thể cho nitroglycerin và các chất chuyển hóa của nó sau khi dùng qua da [16] Họ sử dụng mô hình 1 ngăn với chuyển hóa bước 1, giải phóng bậc hỗn hợp Mô hình được thể hiện như hình 1.4 [42]

Hình 1.4 Mô hình dược động học quần thể

Trong đó: Tlag – thời gian lag; K1 Ka1 và Ka2 – theo thứ tự là hằng số tốc độ hấp thu; K0 – hằng số tốc độ bậc 0; kf1 và kf2 – hằng số tốc độ hình thành chất chuyển hóa; km – hằng số tốc độ quá trình thải trừ chất chuyển hóa; Vc/F, V2/F và V3/F – lượng phân phối của nitroglycerine và các chất chuyển hóa của nó; A – phần trăm thuốc vào

vòng tuần hoàn được giải phóng từ miếng dán qua quá trình bậc 1 (K1)

Do cốt chứa và màng kiểm soát giải phóng của miếng dán, mô hình giải phóng bậc hỗn hợp phù hợp hơn so với giải phóng giả định bậc nhất hoặc bậc không Vì cần thời gian để thiết lập cân bằng giữa miếng dán và da, và các ngăn của da phải được lấp đầy trước khi xuất hiện thuốc trong tuần hoàn chung nên trong mô hình có thông số Tlag Mô hình này có lợi thế trong việc so sánh trực tiếp giữa các công thức khác nhau bằng cách giảm thiểu các lỗi kết quả từ sự dao động nồng độ trong huyết tương và phân biệt các công thức trong quá trình hấp thu và thải trừ thuốc [42]

c Mô hình dược động học sinh lý Theo EMA, mô hình PBPK được định nghĩa là một mô hình toán học mô phỏng nồng độ của thuốc trong máu và trong các mô theo thời gian, thông qua các thông số tốc độ hấp thu thuốc vào cơ thể, phân bố thuốc trong các mô, chuyển hóa và thải trừ (ADME) dựa trên tương tác giữa các yếu tố sinh lý, hóa lý và sinh hóa [39]

Mô hình dược động học sinh lý (PBPK) chia cơ thể thành nhiều ngăn tương ứng với các cơ quan hoặc mô khác nhau bao gồm các mô trung tâm của cơ thể, cụ thể là mỡ, xương, não, ruột, tim, thận, gan, phổi, cơ, da và lá lách, và được liên kết bởi hệ thống máu tuần hoàn và hệ bạch huyết Mỗi ngăn được mô tả chính xác bằng thể tích mô và lưu lượng máu đặc trưng cho từng loài Mỗi mô được xác định với các giả định về giới hạn tốc độ tưới máu hoặc tốc độ thẩm thấu [14], [33]

Đối với thuốc dùng qua da, các yếu tố sinh lý về da và quá trình tương tác dược động học của thuốc với da ảnh hưởng nhiều đến ADME của thuốc Xây dựng mô hình sinh lý mô phỏng cấu trúc của da sẽ giúp dự đoán chính xác sự hấp thu, phân bố của thuốc tại các lớp của da theo từng loài khác nhau trước khi thuốc đi vào vòng tuần hoàn chung

Mô hình sinh lý da (Transdermal Compartmental Absorption & Transit Model – TCAT) được xây dưng dựa trên giải phẫu sinh lý da bao gồm các ngăn: Lớp sừng, biểu bì, hạ bì, mô dưới da, bã nhờn, lông và lỗ chân lông, và hệ trị liệu qua da Hình 1.5 mô tả mối quan hệ tương tác giữa các ngăn trong mô hình sinh lý da và với hệ tuần hoàn [46]

Hình 1.5 Mô hình sinh lý da

Các ngăn trong mô hình TCAT (trừ ngăn mô dưới da) có thể được chia thành các ngăn phụ nhỏ hơn để tính gradient nồng độ của thuốc Sự khuếch tán của thuốc ở các ngăn thường không ổn định và theo nhiều cơ chế dẫn đến khác biệt về hấp thu, phân bố và tính thấm của từng thuốc Quá trình tương tác diễn ra trong mô hình TCAT như sau [46]:

- Sự bay hơi của dung môi ở hệ trị liệu qua da: Các thành phần tại lớp trên cùng của hệ trị liệu qua da có thể khuếch tán vào lớp không khí bao quanh hệ trị liệu qua da - Sự bay hơi của dược chất: Ở lớp trên cùng của hệ trị liệu qua da, dược chất có thể

bay hơi vào không khí - Sự hấp thu dược chất từ hệ trị liệu qua da: Dược chất từ hệ trị liệu qua da có thể

khuếch tán vào lớp sừng, phần bã nhờn, phần ngoài của lớp lipid của lông - Hấp thu dược chất vào hệ tuần hoàn: Từ lớp hạ bì, dược chất có thể khuếch tán vào

mao mạch và đi vào vòng tuần hoàn Quá trình hấp thu là một quá trình bậc nhất - Quá trình chuyển hóa thải trừ: Sự chuyển hóa của dược chất có thể diễn ra trong

lớp biểu bì và hạ bì - Sự liên kết của dược chất tại các mô: Khi dược chất hấp thu vào các ngăn nhỏ của

da có thể xảy ra hiện tượng dược chất liên kết với mô và lưu giữ tại các ngăn này Có hai dạng liên kết chính là liên kết melanin trong biểu bì, lõi lông và liên kết không melanin ở tất cả các ngăn trong da

Mô hình TCAT có thể mô tả quá trình hấp thu của dược chất dùng qua da, giúp dự đoán các đặc tính ADME của thuốc và đánh giá các giai đoạn giới hạn về hòa tan, hấp thu và phân bố của thuốc qua da

1.2.4.3 Thiết lập tương quan in vitro – in vivo mức A Tương quan in vitro – in vivo mức A được xác định là một mô hình toán học dự đoán mối liên hệ giữa tất cả dữ liệu in vitro theo thời gian và toàn bộ các đáp ứng in vivo

theo thời gian [63] Nhiều mô hình khác nhau đã được đề xuất, trong đó đơn giản nhất là các mô hình tuyến tính như:

Bảng 1.1 Một số mô hình tương quan in vitro – in vivo phi tuyến tính

9 Propotional Hazard 1 − 𝐹𝑣𝑖𝑣𝑜 = (1 − 𝐹𝑣𝑖𝑡𝑟𝑜)𝐴

𝑛

𝑖=0

1.2.4.4 Cơ sở lựa chọn mô hình tương quan in vitro – in vivo

Một số hệ số, giá trị được ứng dụng để lựa chọn mô hình tương quan phù hợp nhất đã được tiến hành trên các nghiên cứu ví dụ như hệ số hồi quy tuyến tính R2, hệ số hồi quy tuyến tính hiệu chỉnh R2adjust, tổng bình phương phần dư (The sum of square, SSR), tổng bình phương phần dư có trọng số (Weighted sum of square, WSSR), sai số bình phương trung bình (The mean square error, MSE), tiêu chuẩn thông tin Akaike (The Akaike’s information criterion, AIC) [6]

Hầu hết các nghiên cứu sử dụng hệ số hồi quy tuyến tính R2 và hệ số R2 hiệu chỉnh để lựa chọn mô hình IVIVC Ngoài ra, tiêu chuẩn thông tin Akaike được sử dụng như

một công cụ chuẩn để đánh giá tính phù hợp của mô hình cho tương quan in vitro - in vivo Mô hình phù hợp nhất là mô hình có giá trị R2, R2 hiệu chỉnh gần 1 nhất hoặc giá trị AIC nhỏ nhất

1.2.5 Một số nghiên cứu về tương quan in vitro – in vivo cho miếng dán qua da

Yang và cộng sự (2015) đã nghiên cứu xây dựng mối tương quan IVIVC mức A

đối với miếng dán da chứa estradiol với 3 mức hàm khác nhau Phần trăm thấm in vitro đánh giá trên da người và nồng độ thuốc in vivo đánh giá trên phụ nữ sau mãn kinh với

3 miếng dán chứa estradiol Nghiên cứu sử dụng phần mềm GastroPlus và mô hình

Wagner- Nelson để xây dựng IVIVC giữa mức độ thấm in vitro của thuốc (X) và mức độ phần trăm hấp thụ thuốc in vivo (Y) đối với 3 miếng dán Kết quả thu được tương

quan có ý nghĩa (R2 = 1) với mô hình hồi quy bậc 2: Y = -0,227X2 + 0,331X – 0,001 Thẩm định ngoại trên 2 miếng dán khác (liều lần lượt là 60 và 100 µg/ngày) cho thấy phần trăm sai số dự đoán của Cmax và AUC của các công thức nhỏ hơn 15% đạt theo tiêu chuẩn FDA [79]

Kondamudi và cộng sự (2016) đã xây dựng tương quan IVIVC mức A cho 2 chế phẩm miếng dán chứa Lidocain bằng 2 mô hình phân tích không ngăn (NCA) và

giải chập đại số (NDC) Phần trăm thấm ex vivo đánh giá trên da người và nồng độ thuốc in vivo đánh giá trên tình nguyện viên Phương trình tương quan cho 2 chế phẩm miếng

dán có giá trị R2 là 0.9977 và 0.9976 Tuy nhiên, giá trị sai số dự đoán PE với mô hình NDC của Cmax tương ứng là 30,9 và 25,4% Trong khi sai số dự đoán tối thiểu trong phương pháp NCA thấp hơn so với sai số trong phương pháp NDC (lần lượt là 3,9 và 0,03%) Giá trị sai số dự đoán PE của AUC0-∞ dưới 2% đối với cả 2 phương pháp và 2 chế phẩm [51]

1.2.6 Một số nghiên cứu về tương quan in vitro – in vivo cho l-tetrahydropalmatin

Nghiên cứu của Bùi Quang Đông (2018) đã xây dựng tương quan in vitro – in vivo

cho pellet giải phóng nhanh chứa l-THP trên thỏ Tuy nhiên nghiên cứu mới chỉ thực hiện khảo sát độ hòa tan của các chế phẩm giải phóng ngay, khảo sát các môi trưởng thử

hòa tan có pH khác nhau Tương quan xây dựng được là tương quan không tuyến tính và các sai số dự đoán của Cmax chưa đáp ứng yêu cầu của FDA [3]

Nghiên cứu của Nguyễn Như Nam (2021) đã xây dựng tương quan IVIVC mức A cho dạng bào chế pellet giải phóng kéo dài trên thỏ Kết quả thẩm định AUC cho giá trị sai số dự đoán lớn, Cmax có kết quả sai số trong khoảng cho phép của FDA Tương quan

in vitro – in vivo được tiến hành thẩm định nội và thẩm định ngoại, tuy có thông số thẩm

định chưa đạt theo yêu cầu của FDA, nhưng việc xây dựng và ứng dụng IVIVC trong phát triển dạng bào chế thuốc có ý nghĩa quan trọng khi mở ra những hướng nghiên cứu mới sau này trong thiết kế dạng thuốc [4]

Nghiên cứu của ThS Nguyễn Thị Hòa (2022) đã xây dựng tương quan IVIVC mức A cho miếng dán qua da chứa l-THP với mức ý nghĩa cao Nghiên cứu sử dụng phần mềm GastroPlus và phương pháp giải chập cơ học để xây dựng IVIVC giữa mức độ

thấm in vitro của thuốc (X) và mức độ phần trăm hấp thụ thuốc in vivo (Y) đối với 3

miếng dán Kết quả thu được tương quan có ý nghĩa (R2 = 0,934) với phương trình hồi quy bậc 3: 𝑌 = 0,355𝑋3− 0,555𝑋2+ 0,28𝑋 + 7,31𝑥10−3 Kết quả thẩm định nội tương quan có giá trị sai số dự đoán nhỏ hơn 16% [5]

Hiện nay, các nghiên cứu tập trung xây dựng mô hình PBPK, tương quan IVIVC cho dạng bào chế qua da và ứng dụng để xác định ảnh hưởng của các yếu tố sinh lý đến nồng độ thuốc trong huyết tương, chưa có nghiên cứu về ứng dụng IVIVC cho miếng dán qua da trong bào chế Vì vậy, ứng dụng của tương quan IVIVC trong tối ưu công thức bào chế miếng dán qua da chứa l-THP đã được tiến hành nghiên cứu trong đề tài

1.2.7 Phần mềm GastroPlus và các thao tác cơ bản khi xây dựng mô hình PBPK

Hiện nay, phầm mềm GastroPus được sử dụng nhiều trong việc thiết lập mô hình PBPK, tương quan IVIVC, đánh giá tương tác thuốc DDI, … Cửa sổ làm việc của phần mềm GastroPlus phiên bản 9.8.3 được thể hiện trong hình 1.6

Hình 1.6 Cửa sổ làm việc phần mềm GastroPlus (9.8.3)

Các dữ liệu đầu vào được nhập vào phần mềm qua phần Load / Import trong File Lựa chọn mô hình động vật đánh giá và mô hình dược động học ở cửa sổ Pharmacokinetics và Gut Physiology

Đánh giá ảnh hưởng của các thông số sinh lý đến các thông số dược động học bằng công cụ phân tích độ nhạy các thông số (PSA) trong tab Simulation, lựa chọn các thông số sinh lý cần đánh giá trong cửa sổ này Kết quả đánh giá thu được ở cửa sổ Graph

Tối ưu hóa các thông số bằng chức năng Optimization trên thanh Modules Các thông số sinh lý dựa trên kết quả PSA trong cửa sổ này, lựa chọn trọng số phù hợp với mô hình, các giá trị ban đầu và khoảng giá trị tối ưu có thể thay đổi Kết quả tối ưu các thông số lưu lại trong mô hình PBPK ở cửa sổ Pharmacokinetics và Gut Physiology

Mô phỏng kết quả của mô hình PBPK trong cửa sổ Simulation, tại đây thu được kết quả Cmax và AUC quan sát được và kết quả dự đoán Đồ thị mô phỏng thu ở cửa sổ Graph Dựa vào những kết quả này đánh giá lựa chọn mô hình thông qua giá trị sai số dự đoán (PE) và hệ số hồi quy tuyến tính R2

Bên cạnh đó, SimulationPlus Inc cũng cập nhật hướng dẫn sử dụng phần mềm chi tiết cho các phiên bản trên các nền tảng của hãng

1.2.8 Một số ứng dụng khác của mô hình dược động học sinh lý (PBPK)

Bên cạnh ứng dụng xây dựng tương quan IVIVC, mô hình PBPK cũng có thể mô tả hoạt động của thuốc trong cơ thể, từ đó có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu tiền lâm sàng, bao gồm: (1) đánh giá ảnh hưởng của các tương tác thuốc - thuốc (DDI), (2) dự đoán kịch bản điều trị bằng cách mô phỏng các phác đồ dùng thuốc cụ thể, (3) đánh giá tác động của các dạng bào chế khác nhau, (4) ngoại suy cho các quần thể (trẻ em, phụ nữ có thai, bệnh nhân suy gan/suy thận), (5) ngoại suy chéo loài, tạo cầu nối chuyển giao từ nghiên cứu đến lâm sàng [13], (6) thiết lập tương đương sinh học ảo [26], (7) thiết lập mô hình dược động học sinh lý – dược lực học (PBPK/PD) dự đoán tác dụng dược lực học trên người từ nghiên cứu dược lý trên động vật [58]

Yamamoto và cộng sự (2018) đã nghiên cứu xây dựng mô hình PBPK dự đoán dược động học ở hệ thần kinh trung ương Nghiên cứu xây dựng mô hình PBPK ở người dựa trên mô hình PBPK trên chuột và dự đoán dữ liệu nồng độ thuốc theo thời gian của 4 loại thuốc có sẵn dữ liệu trên người là acetaminophen, oxycodon, morphin và phenytoin Kết quả cho thấy mô hình PBPK cho người dự đoán thành công dữ liệu nồng độ thuốc theo thời gian với sai số gấp 1,6 lần so với dữ liệu thực tế Ngoài ra, mô hình cho phép nghiên cứu các cơ chế tiềm ẩn có thể giải thích sự khác biệt trong dược động học trên hệ thần kinh trung ương liên quan đến những thay đổi sinh lý bệnh Phân tích này hỗ trợ sự phù hợp của mô hình cho phép lựa chọn sử dụng các thuốc có vị trí tác dụng trên hệ thần kinh hiệu quả hơn [36]

Segregur và cộng sự (2020) đã nghiên cứu xây dựng mô hình PBPK dự đoán nồng độ thuốc trong huyết tương của thuốc có bản chất base yếu (PSWB) sau khi dùng omeprazol (PPI), nhằm đánh giá tương tác giữa 2 thuốc thông qua việc thay đổi pH dạ

dày Nghiên cứu xây dựng mô hình từ dữ liệu in vivo đường tiêm tĩnh mạch, đường uống PSWB độc lập và phối hợp với omeprazol, dữ liệu in vitro là dữ liệu giải phóng của

PSWB trong các môi trường pH 4 và pH 6 - mô phỏng sự ảnh hưởng của PPI đến pH dạ dày Kết quả mô phỏng cho thấy tỉ lệ AUC dự đoán khi thay đổi pH dạ dày pH 4 và pH 6 so với người khỏe mạnh lần lượt là 0,76 và 0,18 Tương tự, tỉ lệ Cmax là 0,63 và 0,18 Từ đó, chứng minh pH 4 có thể mô phỏng tốt ảnh hưởng của PPI đến đáp ứng nồng độ thuốc trong máu, pH 6 có thể sử dụng để mô phỏng khi dùng PPI tác dụng mạnh và kéo dài [64]

Có thể thấy mô hình dược động học sinh lý (PBPK) ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong việc dự đoán nồng độ thuốc trong cơ thể nhằm đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh Bên cạnh đó, l-THP là một hoạt chất có tác dụng dược lý đa dạng thông qua nhiều cơ chế khác nhau Để tối ưu hóa hiệu quả điều trị, việc thiết lập mối quan hệ giữa nồng độ l-THP trong huyết tương và đáp ứng dược lý là rất cần thiết Tuy nhiên, các mô hình đánh giá tác dụng dược lý thường phức tạp và tốn kém Một cách tiếp cận hiệu quả và tiết kiệm hơn là tận dụng dữ liệu về tương quan dược động học (PK) và dược lực học (PD) từ các nghiên cứu trước đây, kết hợp với mô hình PBPK Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ khoá luận này, mô hình PBPK sẽ được xây dựng để thiết lập mối quan hệ giữa nồng độ l-THP trong huyết tương ở trạng thái ổn định và đáp ứng dược lý tương ứng Khoảng nồng độ thuốc trong huyết tương ở trạng thái ổn định thu được từ mô hình PBPK sẽ được sử dụng làm mục tiêu để tối ưu hóa công thức bào chế miếng dán qua da chứa l-THP

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các nguyên liệu và hoá chất chính được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

1 l-Tetrahydropalmatin (hàm lượng 99,13%, số lô CO34A180703)

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị chính được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2 Hệ thống thử tính thấm bằng bình khuếch tán Franz – Hanson

7 Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer HR1 Mỹ

10 Cột GL Science C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) Nhật Bản

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Hoàn thiện mô hình dược động học sinh lý cho miếng dán qua da chứa l-THP 2.2.2 Xây dựng mô hình dược động học sinh lý đường uống xác định khoảng nồng độ thuốc ở trạng thái ổn định tương ứng với tác dụng dược lý mong muốn

2.2.3 Ứng dụng IVIVC trong việc mô phỏng dữ liệu thấm in vitro và dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương in vivo của miếng dán qua da chứa l-THP

2.2.4 Tối ưu tỉ lệ các thành phần trong công thức miếng dán qua da chứa l-THP

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

Theo nghiên cứu của ThS Nguyễn Thị Hòa và cộng sự (2022), thành phần công thức cốt miếng dán chứa l-THP bao gồm: l-THP, Viscomate NP-700, Transcutol, glycerin, chất tăng thấm và nước [5] Transcutol trong công thức đóng vai trò là dung môi hòa tan dược chất nhưng đồng thời cũng là một chất tăng thấm [65] Vì vậy, nghiên cứu tiến hành tối ưu tỉ lệ thành phần l-THP và Viscomate NP-700 như bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần công thức bào chế miếng dán

20 – 35°C

2.3.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro của miếng dán

2.3.2.1 Phương pháp định lượng l-tetrahydropalmatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Định lượng l-THP bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2], [5] Điều kiện tiến hành định lượng l-THP bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

- Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV của Shimadzu - Pha động: Acetonitril và dung dịch đệm phosphat pH 4,5 (0,05M) với tỉ lệ 30:70 (tt/tt) - Pha tĩnh: Cột GL Science C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm)

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Nhiệt độ cột: 40°C

- Thể tích tiêm: 50 µl - Detector UV phát hiện ở bước sóng 283 nm

Dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0100 g chất chuẩn l-THP, hoà tan và định mức tới 50,0 ml bằng methanol sắc ký, thu được dung dịch S1 với nồng độ khoảng 200 μg/ml Pha loãng dung dịch S1 bằng methanol sắc ký để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 100, 75, 50, 10, 5 và 2 μg/ml Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dung dịch thử: Các mẫu nghiên cứu được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng methanol sắc ký (nếu cần thiết) và lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng thấm dược chất in vitro

Chuẩn bị da chuột: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng khoảng 20 g được nuôi trong phòng thí nghiệm Dược lý trường Đại học Dược Hà Nội ở điều kiện phòng thí nghiệm trong một tuần trước khi tiến hành thực nghiệm Trước thí nghiệm 24 giờ, gây chết chuột bằng phương pháp làm trật khớp xương sống Loại bỏ lông chuột, lấy phần da lưng và loại bỏ lớp mỡ dưới da Bảo quản da trong điều kiện 2-8˚C, sử dụng trong khoảng 1 tuần Hoạt hóa lại da bằng nước muối sinh lý ở nhiệt độ 32˚C trong 10 phút trước thí nghiệm

Cách tiến hành: Theo nghiên cứu của ThS Nguyễn Thị Hòa và cộng sự, môi trường đệm phosphat

pH 7,4 chứa 50% Ethanol là môi trường phù hợp để đánh giá in vitro cho miếng dán

qua da chứa l-THP [5]

Do đó, tiến hành đánh giá in vitro của miếng dán với điều kiện như sau:

- Thiết bị: Thiết bị khuếch tán Franz (thể tích 5 ml, diện tích khuếch tán 1,1304 cm2) - Màng khuếch tán: Màng da chuột đã xử lý

- Tốc độ khuấy từ: 700 vòng/phút - Nhiệt độ: 32 ± 0,5˚C

- Môi trường: dung dịch đệm phosphat pH 7,4 chứa ethanol với tỉ lệ 50:50 (tt/tt) Sau khi cho đầy ngăn nhận bằng môi trường, đặt da chuột phủ kín diện tích khuếch tán bình Franz Tiến hành đưa miếng dán diện tích 4 cm2 đặt lên trên da chuột, đảm bảo phủ kín diện tích khuếch tán Tại các thời điểm 1, 3, 5, 7, 8 và 24 giờ, lấy chính xác 0,5 ml môi trường ngăn nhận, bổ sung bằng đồng lượng môi trường mới Mẫu được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như mục 2.3.2.1

Phần trăm lượng l-THP thấm qua da chuột được xác định theo công thức:

𝑋𝑡 = 𝐶𝑐

𝑆𝑐 x 1

𝑆𝑚 x 1

𝑚x(V1 x Sk + V2 x ∑𝑘𝑡=2𝑆t-1) x 100 Trong đó:

- Xt là phần trăm thấm của l-THP qua da chuột tại thời điểm k (%) - Sc, Sk (k là thứ tự các thời điểm lấy mẫu) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn

và dung dịch thử tại các thời điểm 1, 3, 5, 7, 8 và 24 giờ (LU.s) - Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)

- V1, V2 là thể tích môi trường trong ngăn nhận, thể tích môi trường lấy mẫu tại thời điểm t (ml)

- Sm là diện tích màng da chuột đem thử tính thấm (cm2) - m là khối lượng l-THP trong miếng dán có diện tích 1 cm2 (μg)

2.3.3 Phương pháp mô phỏng dữ liệu

Mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương từ dữ liệu phần trăm dược chất

thấm qua da in vitro bằng phần mềm GastroPlus 9.8.3 theo quy trình mô tả ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương từ dữ

liệu in vitro

Bảng 2.4 Các dữ liệu đầu vào của phần mềm GastroPlus

Patch 1: Transcutol (20%) Patch 2: Transcutol (20%), NMP (1,5%) Patch 3: Transcutol (20%), DMSO (1,5%)

2.3.3.1 Phương pháp xây dựng mô hình dược động học sinh lý (PBPK)

Mô hình PBPK có rất nhiều cơ quan sinh lý ảnh hưởng đến ADME của dược chất

Để mô phỏng được dữ liệu in vivo của miếng dán theo mô hình PBPK cần xác định các

thông số sinh lý của các cơ quan thỏ ảnh hưởng đến hấp thu, phân bố, chuyển hóa và

thải trừ của dược chất Do đó để mô phỏng được dữ liệu in vivo của miếng dán theo

mô hình PBPK cần tiến hành như sau:

• Bước 1: Mô phỏng dữ liệu in vivo đường tĩnh mạch (IV) để tính toán các thông số

sinh lý cơ quan chuyển hóa, thải trừ

Dữ liệu in vivo IV trên thỏ 2 kg với liều 4,5 mg/kg trong nghiên cứu của

Bùi Quang Đông (2018) [3] được sử dụng để tính toán các thông số dược động học của các cơ quan chuyển hóa và thải trừ theo trình tự như sau:

Đánh giá mức độ ảnh hưởng của thông số sinh lý của các cơ quan đến dữ liệu

in vivo IV: Có nhiều cơ quan và các thông số sinh lý trong mô hình PBPK ảnh hưởng

quá trình chuyển hóa và thải trừ nên cần tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng các thông số sinh lý của từng cơ quan ảnh hưởng đến sinh khả dụng của các đường dùng Chức năng phân tích độ nhạy thông số – PSA trong phần mềm GastroPlus sàng lọc các

thông số sinh lý từng cơ quan của thỏ ảnh hưởng đến dữ liệu in vivo IV

Xác định các thông số sinh lý của các quan chuyển hóa, thải trừ dựa theo dữ liệu

in vivo IV: Dựa vào kết quả phân tích PSA, tiến hành sử dụng công cụ Module

Optimization với chức năng thay đổi các giá trị thông số sinh lý tại cơ quan khác nhau

để tính toán nồng độ thuốc trong huyết tương dự đoán sao cho gần nhất với dữ liệu in vivo IV quan sát Mô hình mô phỏng được lựa chọn khi có giá trị R2 thu được gần 1 nhất, thỏa mãn giá trị sai số dự đoán (PE) theo hướng dẫn của FDA Các thông số

sinh lý của các cơ quan này sẽ được sử dụng để tính toán mô phỏng dữ liệu in vivo của

miếng dán

• Bước 2: Mô phỏng dữ liệu in vivo của miếng dán

Sau khi đã xác định được các thông số sinh lý của các cơ quan liên quan đến chuyển hóa và thải trừ, tiến hành xác định các yếu tố ảnh hưởng liên quan đến hấp thu, phân bố của dược chất trong miếng dán theo mô hình TCAT Với thuốc qua da, các yếu tố công thức, yếu tố sinh lý của da thỏ từng ngăn và quá trình động học tương tác dược chất và mô ở từng ngăn ảnh hưởng nhiều đến dược động học của dược chất Tương tự

như mô phỏng dữ liệu in vivo IV, tiến hành mô phỏng in vivo của miếng dán theo

trình tự như sau: - Đánh giá mức độ ảnh hưởng các thông số sinh lý của da thỏ và các yếu tố ảnh hưởng

của công thức bằng chức năng PSA - Xác định các thông số sinh lý của từng ngăn trong da thỏ bằng công cụ Optimization

Mô hình mô phỏng dữ liệu in vivo của miếng dán lựa chọn là mô hình cho kết quả

R2 gần 1 nhất, thỏa mãn giá trị PE theo hướng dẫn của FDA • Thẩm định mô hình: Thẩm định mô hình dựa vào sai số dự đoán PE giữa kết quả

dự đoán (pred) và kết quả thực tế (obs) của 2 giá trị Cmax và AUC Sai số dự đoán (PE) được tính bằng công thức sau:

(1) Giá trị tuyệt đối của sai số dự đoán (PE)  15% đối với mỗi công thức (ứng với các mức độ giải phóng thấp, trung bình, cao)

(2) Giá trị tuyệt đối của sai số dự đoán trung bình  10%

2.3.3.2 Mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc trong huyết tương từ dữ liệu in vitro

Quá trình mô phỏng dữ liệu được thể hiện trong sơ đồ ở hình 2.1 Dữ liệu phần

trăm dược chất thấm qua da in vitro được dùng để dự đoán nồng độ dược chất trong huyết tương theo phương trình tương quan in vitro – in vivo đã thiết lập trong

nghiên cứu của ThS Nguyễn Thị Hòa và công sự (2022) cho dạng bào chế miếng dán

qua da chứa l-THP Phương trình tương quan dự đoán mức độ hấp thu in vivo từ dữ liệu thấm in vitro [5]:

𝑌 = 0,355𝑋3− 0,555𝑋2+ 0,28𝑋 + 7,31𝑥10−3

Trong đó: X là mức độ thấm in vitro và Y là mức độ hấp thu in vivo

Sử dụng công cụ IVIVC của phần mềm GastroPlus chuyển đổi dữ liệu phần trăm

thấm in vitro qua da chuột thành mức độ hấp thu in vivo Mô hình hóa dữ liệu mức độ hấp thu in vivo bằng các mô hình Weibull (dưới dạng hàm Weibull đơn, Weibull đôi và

Weibull ba) trong phần mềm GastroPlus để tối ưu hóa những thông số ảnh hưởng dữ

liệu in vitro như thời gian tiềm tàng – Tlag, tổng lượng giải phóng (total released) và các

tham số theo từng giai đoạn (phase) giải phóng Mô hình mô phỏng tốt nhất tương ứng với giá trị AIC nhỏ nhất [6]

Sử dụng chức năng Simulation, mô phỏng dữ liệu nồng độ dược chất trong

huyết tương từ mô hình Weibull của dữ liệu mức độ hấp thu in vivo và mô hình PBPK

đã xây dựng

2.3.4 Phương pháp xây dựng mô hình dược động học sinh lý xác định khoảng nồng độ l-tetrahydropalmatin ở trạng thái ổn định ứng với tác dụng dược lý mong muốn

2.3.4.1 Phương pháp xác định mối quan hệ giữa liều – tác dụng

l-THP có nhiều tác dụng dược lý khác nhau Mỗi tác dụng có liều dùng và các mô hình thí nghiệm đánh giá khác nhau Mô hình PD được xác định dựa trên kết quả của các nghiên cứu đã được công bố

Dữ liệu PD được thu thập thông qua tìm kiếm từ khóa trên các cơ sở dữ liệu: PubMed, ScienceDirect, Google Scholar Các từ khóa sử dụng là:

- Từ khóa về hoạt chất “l-tetrahydropalmatine” - Từ khóa về mục đích tìm kiếm “dose – efficacy”, “dose-response”, “pharmacology”,

“pharmacodynamics”, “therapeutic effect”

2.3.4.2 Phương pháp xây dựng khoảng nồng độ l-THP ở trạng thái ổn định từ chế phẩm giải phóng nhanh

Nồng độ thuốc trong huyết tương có tác dụng được xác định bằng cách xây dựng khoảng nồng độ l-THP ở trạng thái ổn định (Cssmin – Cssmax) dựa trên dữ liệu PK đường cong hấp thu theo thời gian của dạng bào chế giải phóng nhanh với mức liều phù hợp Tuy nhiên, các nghiên cứu dược lực học và dược động học thường có sự khác biệt về động vật thí nghiệm Nghiên cứu dược lực học thường đánh giá trên chuột hoặc thỏ Trong khi đó, nghiên cứu dược động học thường đánh giá trên thỏ, chó hoặc người Đáp ứng dược lực học và dược động học giữa các loài là khác nhau Vì vậy, cần chuyển đổi liều dùng giữa các loài Công thức tính liều chuyển đổi như sau [59], [60]:

𝐷′ = 𝐷 𝑥 𝐾𝑚

𝐾′𝑚Trong đó: D’, D lần lượt là liều chuyển đổi, liều xác định (mg/kg) Km, K’m là hệ số hiệu chỉnh của loài động vật thí nghiệm tương ứng

Dữ liệu PK nồng độ thuốc theo thời gian được thu thập thông qua tìm kiếm từ khóa “l-tetrahydropalmatine pharmacokinetics” trên các cơ sở dữ liệu: PubMed, ScienceDirect, Google Scholar Lựa chọn dữ liệu có liều dùng, đường dùng và dạng bào chế phù hợp

- Từ khóa về hoạt chất “l-tetrahydropalmatine” - Từ khóa về mục đích tìm kiếm “pharmacokinetics”, “dose - plasma concentration”

Xây dựng khoảng nồng độ l-THP ở trạng thái ổn định bằng phần mềm GastroPlus theo trình tự như sau:

− Xây dựng mô hình PBPK với dữ liệu PK thu được như đã nêu trong mục 2.3.3.1 − Thông số liều nạp, liều duy trì là liều đã lựa chọn

− Khoảng cách giữa các lần đưa thuốc là 4 giờ − Sử dụng công cụ Simulation mô phỏng nồng độ thuốc trong huyết tương trong 28

giờ, ứng với số lần đưa thuốc để đạt trạng thái ổn định (steady state) là 7 lần

2.3.5 Phương pháp đánh giá các đặc tính của cốt dính

2.3.5.1 Phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến của cốt gel

Tiến hành các phép đo lưu biến bằng máy đo lưu biến DISCOVERY HR-1 rheometer, mô hình sử dụng là côn - đĩa (côn nghiêng 4°1’08”, đường kính đĩa 40mm, đĩa có khả năng điều nhiệt)

Các mẫu đo được để ổn định ở nhiệt độ thực hiện phép đo trong khoảng 120 giây để loại bỏ ngoại lực tác động từ việc đưa mẫu lên đĩa đồng thời giúp mẫu đồng đều về nhiệt Lượng mẫu dùng cho mỗi phép đo là rất nhỏ (khoảng 1,2 – 1,5 g)

Cách tiến hành: Cho 1 lượng nhỏ mẫu vào chính giữa đĩa, hạ côn xuống sao cho mẫu bao phủ hết bề mặt côn Sau đó dùng mica vét sạch lượng mẫu thừa xung quanh côn rồi tiến hành các phép đo lưu biến

- Chế độ trượt liên tục: Chế độ trượt liên tục được sử dụng trong trường hợp này để đánh giá đặc tính chảy lỏng (shear – thinning)/đặc tính đông đặc (shear – thickening) của các mẫu gel Sử dụng phép đo trượt liên tục quét tốc độ trượt (flow sweep) trong khoảng từ 0.01 – 100 s-1 tại 32°C để thu được kết quả biểu diễn dưới dạng đường cong độ nhớt Độ nhớt của cốt gel ở trạng thái tĩnh được ngoại suy từ đường cong độ nhớt theo mô hình Cross bằng phần mềm TRIOS

- Chế độ đo dao động: Chế độ đo dao động sử dụng trong trường hợp này để đánh giá ảnh hưởng của các mức độ dao động đến khả năng lưu giữ miếng dán trên da

Sử dụng phép đo quét tần số dao động với tần số dao động trong khoảng 0,1 – 100 rad/s ở nhiệt độ 32°C Đánh giá thông qua giá trị tanδ được tính bằng tỉ số giữa mô đun nhớt G’’ và mô đun đàn hồi G’ của biến dạng nhớt - đàn hồi

2.3.5.2 Phương pháp đánh giá tính bám dính của miếng dán

Theo nghiên cứu của ThS Nguyễn Văn Khuyến và cộng sự (2021), thuộc tính bám dính dựa trên hai đặc tính cơ bản là độ bóc tách và độ bền dính Tiến hành đánh giá bằng phương pháp lột vỏ cam với thiết bị Texture analyzer CT3 1500 [7]

Cách tiến hành: Miếng dán được cắt thành các dải 3x15 cm, dán lên mặt phẳng đo làm bằng thép không gỉ, dùng quả cân 500 g lăn đều lên phần bám dính; hạ thấp đầu kẹp xuống mức tối đa (101,4 mm), cố định miếng dính bằng cách kẹp chặt đầu không mang dược chất vào đầu đo Thuộc tính bám của cốt dính được đánh giá qua các chỉ số: Peak load (g); Deformation of peak (mm); Work (mJ); Final load (g)

2.3.5.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của miếng dán đến đặc tính sinh lý của da

Tiến hành đo các thông số bằng thiết bị Dermalab Combo với các đầu dò được đo theo thứ tự lần lượt là skin color, hydration

Nghiên cứu đánh giá với 5 tình nguyện viên nam khỏe mạnh, không có sự bất đối xứng trái phải và không có bệnh về da ở cánh tay Các tình nguyện viên đã cung cấp thông tin đồng ý trước khi tham gia nghiên cứu Các tình nguyện viên được thông báo hạn chế việc rửa tay bằng xà phòng hoặc bất kỳ chất tẩy rửa nào khác, tránh bôi bất kỳ loại mỹ phẩm nào lên vị trí thử nghiệm 12 giờ trước khi thử nghiệm và tránh tiếp xúc với nước 2 giờ trước khi thử

Điều kiện môi trường được kiểm soát, với nhiệt độ và độ ẩm duy trì ở mức tương ứng là 22±2°C và 50-70% Các tình nguyện viên được yêu cầu thích nghi với môi trường trong 15-30 phút trước khi thực hiện phép đo

Đánh giá các thông số ban đầu tại các vị trí được xác định trước trên bề mặt bên trong của bên trái và bên phải cánh tay Sau đó, miếng dán diện tích 2×2 cm2 được dán vào các vị trí Sau khoảng thời gian 2 giờ, loại bỏ các miếng dán một cách cẩn thận, chất kết dính còn sót lại được loại bỏ nhẹ nhàng bằng khăn mềm khô, sau đó đánh giá lại lần hai Các thông số đánh giá như sau:

Skin color: Thông số đánh giá trong phép đo là erythema (chỉ số ban đỏ) đánh giá tình trạng đỏ của da, từ đó đánh giá mức độ kích ứng trên da Đầu dò cần được hiệu chỉnh mỗi lần đo Đặt đầu dò lên vị trí da cần đo, đảm bảo đầu dò tiếp xúc hoàn toàn với da và kín hoàn toàn

Hydration: Phép đo đánh giá độ ẩm trên da, từ đó đánh giá mức độ hydrat hóa da của miếng dán Đặt đầu dò lên vị trí da cần đo, đảm bảo đầu dò tiếp xúc hoàn toàn với da

2.3.6 Phương pháp thiết kế thí nghiệm

- Biến đầu ra: Để đạt mục tiêu nghiên cứu, các biến đầu ra được thể hiện ở bảng 2.6

Bảng 2.6 Các biến đầu ra và mục tiêu thiết kế

Y1 Nồng độ thuốc tối đa trong huyết

Nằm trong khoảng giới hạn Y2 Thời gian nồng độ thuốc trong

Y3 Thời gian thuốc bắt đầu có tác dụng

Nằm trong khoảng giới hạn

Loại thiết kế được sử dụng là thiết kế I-optimal Tối ưu hóa công thức theo vùng không gian thiết kế và phương pháp hàm hy vọng với công cụ Maximize Desirability

2.3.6.2 Đánh giá lại kết quả công thức tối ưu Sau khi thu được công thức tối ưu, đánh giá khả năng thấm dược chất in vitro công

thức tối ưu như đã nêu ở mục 2.3.2.2 và tính bám dính của miếng dán như đã nêu ở mục 2.3.5.2 Dữ liệu phần trăm thấm dược chất thấm qua da này được dùng để mô phỏng nồng độ l-THP trong huyết tương bằng phần mềm GastroPlus theo trình tự như đã nêu ở mục 2.3.3.2 So sánh với kết quả dự đoán của phần mềm JMP Pro 17

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Tiến hành thực nghiệm với cỡ mẫu n = 3, kết quả được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 365, Graphpad Prism 10 và được trình bày dưới dạng TB ± SD

Dự đoán các thông số sinh dược học của dược chất bằng phần mềm ADMET

Predictor Xây dựng mô hình PBPK, mô phỏng dữ liệu hòa tan in vitro và dữ liệu in vivo, xây dựng nồng độ trạng thái cân bằng bằng phần mềm bằng phần mềm GastroPlus

Tối ưu hóa công thức được thực hiện bằng phần mềm JMP Pro 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thẩm tra phương pháp định lượng l-tetrahydropalmatin in vitro bằng sắc ký

lỏng hiệu năng cao

Tiến hành đánh giá một số tiêu chí của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký như đã nêu trong mục 2.3.2.1, kết quả thu được như sau:

Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký trên các mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn theo phương pháp phân tích Ghi lại sắc ký đồ Xác định thời gian lưu của chất phân tích trong các mẫu Kết quả trên hình PL-1.1 và PL-1.2 cho thấy thời gian lưu của pic l-THP trên sắc ký đồ của mẫu thử là khoảng 5,9 phút, tương tự với sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào ở thời gian lưu trên Như vậy, tá dược và dung môi không ảnh hưởng đến kết quả định tính và định lượng l-THP

Khoảng tuyến tính

Tiến hành sắc ký với dãy dung dịch chuẩn ở khoảng nồng độ 2–100 μg/ml Khảo sát tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của l-THP Kết quả được thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ l-THP

Giá trị hệ số tương quan R2 = 0,9996 > 0,99, với khoảng nồng độ dung dịch l-THP từ 2-100 µg/ml thì nồng độ và diện tích pic của dung dịch có mối tương quan tuyến tính Phương pháp định lượng l-THP bằng HPLC detector UV có thể được ứng dụng để định

lượng nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán in vitro tại các thời điểm

khác nhau

Mô hình dược động học sinh lý miếng dán qua da chứa l-tetrahydropalmatin

Trong nghiên cứu của ThS Nguyễn Thị Hòa, mô hình PBPK được nghiên cứu xây dựng dựa trên các thuật toán của phần mềm GastroPlus Tuy nhiên, kết quả tối ưu các thông số của mô hình PBPK cho thấy phổi, động mạch, tĩnh mạch là 3 cơ quan chuyển

y = 37076x + 27073R² = 0.9996

05000001000000150000020000002500000300000035000004000000