Cải Thiện Năng Suất Sinh Sản Trên Nái Thông Qua Chẩn Đoán Bệnh Bằng Sinh Học Phân Tử

. Định lượng virus, vi khuẩn đang nhiễm trên vật nuôi - Định lượng PCV2  tiên lượng hiện trạng bệnh 2. Xác định chủng virus  lựa chọn đúng vacxin - Virus tai xanh: bảo hộ chéo không cao; 3 chủng gây bệnh NA, EU, HP  cần tiêm phòng đúng chủng lưu hành trong trại 3. Xác định đối tượng đang mang trùng, thải trùng, F0  Nái có nhập đàn được hay không 4. Đánh giá vacxin: Tầm soát, định lượng virus sau tiêm phòng và công cường độc

TS BSTY Đinh Xuân Phát

CẢI THIỆN NĂNG SUẤT SINH SẢN

thông qua

Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Sinh học Phân tử

Năng suất nái sinh sản

Văn Ngọc Phong và cs., 2017

1 Tai xanh PRRSV2 ASFV

3 Dịch tả CSFV4 Giả dại ADV5 PCV2

6 Khô thai PPV7 Cúm heo

1 Mycoplasma (MH, MS, MR)2 Tụ huyết trùng (Pasteurella)3 Viêm phổi màng phổi (APP)4 Salmonella

5 Dấu son (Erysipelothrix)6 Hồng lỵ (Brachyspira)

7 Viêm hồi tràng (Lawsonia)

Nái: Tác nhân gây rối loạn sinh sản

Đặc điểm các phương pháp XN

Virus: môi trường tế bào (PK15, MARC-

Giữ được mô: IF, IHC 1 Kháng sinh

2 Phát triển vacxin

3 Nghiên cứu

VSV sốngVSV sống/chết

Dựa trên Protein

Giữ được mô: ISHKhông giữ mô:

Western blot, Đánh dấu phóng xạ

Không giữ mô: PCR, Microarray, LAMPVi khuẩn: môi

trường thạch (COS, CNA, PVX, XLD )

1 Phát triển vacxin

2 Nghiên cứu

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

PCR / RT-PCR

Phương pháp chẩn đoán dựa trên gene

Realtime PCR định lượng

- Có bao nhiêu- Có

- Không

PCR định tính

CK 5 10 15 20 25 30 35

PCR / RT-PCR: Mục đích

1 Định lượng virus, vi khuẩn đang nhiễm trên vật nuôi

- Định lượng PCV2  tiên lượng hiện trạng bệnh

2 Xác định chủng virus  lựa chọn đúng vacxin

- Virus tai xanh: bảo hộ chéo không cao; 3 chủng gây bệnh NA, EU, HP  cần tiêm phòng đúng chủng lưu hành trong trại

3 Xác định đối tượng đang mang trùng, thải trùng, F0  Nái có nhập đàn được hay không

4 Đánh giá vacxin: Tầm soát, định lượng virus sau tiêm

phòng và công cường độc

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

HUYẾT THANH HỌC

ELISA

ELISA: Mục đích xét nghiệm

1 Đánh giá miễn dịch sau tiêm phòng (PRRSV, PCV2,

CSFV, ADV, PPV, HPS ): độ đồng đều, tỷ lệ có đáp ứng, mức độ đáp ứng (chỉ số S/P, S/N)

2 Kiểm tra mức kháng thể → tiên lượng hiện trạng dịch bệnh trong trại (ADV, PCV2, Parvovirus, PRRSV)

3 Kiểm tra kháng thể mẹ có truyền sang con hay không? (PRRSV, PCV2, CSFV, ADV, PPV, HPS )

4 Kiểm tra tình trạng miễn dịch và mang trùng của thú giống trước khi nhập đàn (PRRSV, PCV2, CSFV, ADV, PPV, HPS )

5 Xác định nhiễm virus thực địa: Giả dại ADV, FMD6 Định tính khả năng trung hòa virus (tương ứng SNA)

ELISA: Mục đích xét nghiệm

1 Đánh giá miễn dịch sau tiêm phòng (PRRSV, PCV2, CSFV, ADV, PPV, HPS ): độ đồng đều, tỷ lệ có đáp ứng, mức độ đáp ứng (chỉ số S/P, S/N)

PRRSV ELISA: 9 mẫu, 2 tháng sau tiêm

Hướng cải thiện?

ELISA: Mục đích xét nghiệm

2 Kiểm tra mức kháng thể → tiên lượng hiện trạng dịch bệnh trong trại 3 Kiểm tra kháng thể mẹ có truyền sang con hay không?

CSFV ELISA: 12 mẫu, XN định kỳ

Tiên lượng gì?Kháng thể mẹ truyền ntn?

gì?

ELISA: Vai trò trong chẩn đoán

1 Xác định được thú có miễn dịch đặc hiệu một tác nhân gây bệnh nào đó hay không

2 Xác định được thú đã từng tiếp xúc với mầm bệnh hay không (quan trọng với trại âm tính với bệnh)

3 Xác định thú hậu bị, thú chuẩn bị nhập đàn đã được tiêm phòng hay không

4 Vai trò tầm soát sự lưu hành của virus đối với những bệnh không cần tiêu hủy khi phát hiện virus

5 Cùng với vacxin, ELISA giúp phân biệt thú nhiễm bệnh tự nhiên hoặc thú được tiêm phòng (Vacxin đánh dấu)

6 Dựa vào chỉ số S/P, CV%, tỷ lệ có miễn dịch, đánh giá nguy cơ bệnh của đàn

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

ELISA / RT-PCR

BỆNH TAI XANH PRRSV

ELISA: Bệnh PRRS trên heo

RT-PCR định chủng PRRSV

Kết luận

gì?

RT-PCR định chủng PRRSV

Thấy được điều

gì?

Đặc điểm của virus và của bệnh PRRS Hiện có 3 kiểu gen virus: NA, HP, EU

 Virus có nhiều glycoprotein trên bề mặt: GP2,3,4,5 Các vacxin đều là: vacxin toàn vẹn sống nhược độc Mức bảo hộ chéo còn nhiều tranh luận

 Kháng thể trung hòa PRRSV xuất hiện trễ, thường 4 tuần sau tiêm phòng

 Trước 2020, chỉ số S/P của vacxin thường <2.5 Sau 2020, một số vacxin có thể tạo S/P >3

ELISA: Bệnh PRRS trên heo

PRRSV – Miễn dịch

Vai trò của ELISA trong chẩn đoán PRRS

1 Dùng ELISA tìm kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRSV trên đàn âm tính hoặc chuẩn bị nhập đàn

* Kháng thể này chưa phải là kháng thể trung hòa

Với đàn âm tính: tầm soát mỗi 4-6 tháng trên các đối tượng nái (các lứa, trạng thái: khô, mang thai, nuôi con) và nọc

+ Mỗi đối tượng 8-16 mẫu

+ Nếu chia theo lứa: mỗi lứa 4-8 mẫu

- Nhập đàn: 1/ngày về; 2 tuần; 6 tuần; từng cá thể

ELISA: Bệnh PRRS trên heo

2 Đánh giá miễn dịch sau tiêm phòng: trên nái và heo thịt Lấy mẫu sau tiêm phòng: 2-4 tuần; 6-8 tuần

 Đối tượng: được tiêm, phân nhóm phù hợp Số lượng: theo độ chính xác mong muốn

3 Đánh giá kháng thể mẹ truyền cho con: trên nái và heo con theo mẹ

- Lấy mẫu trong giai đoạn heo con theo mẹ, tốt nhất là 15 ngày tuổi

10 Đối tượng: Cần lấy máu theo cặp mẹ 10 con

ELISA: Bệnh PRRS trên heo

ELISA thực tiễn

Thấy được điều gì?

ELISA thực tiễn

Thấy được điều gì?

4 Lưu ý

- Vì có 3 kiểu gen virus và bảo hộ chéo hạn chế  chỉ số ELISA không đủ để đánh giá trạng bệnh hay khả năng miễn dịch chống PRRSV Do không xác định được kiểu gen nào đang lưu hành và tác hại ra sao.

 Cần kết hợp Realtime PCR với ELISA, nhằm:+ PCR: xác định chủng lưu hành Số lượng virus.+ Vừa xác định được khả năng miễn dịch

ELISA: Bệnh PRRS trên heo

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

ELISA / PCR

BỆNH DỊCH TẢ HEO CHÂU PHI ASF

PCR xác định virus ASFV

1 Thời điểm này nên dùng PCR hay ELISA để chẩn đoán ASFV, giả sử cả 2 phương pháp có chi phí như nhau? Tại sao?

2 Tại sao có thông tin Realtime PCR cho ASFV có thể không phát hiện?

Realtime PCR có lỗi?

Hoang Vu Dang etal., , 2020

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

ELISA / PCR

BỆNH LIÊN QUAN PCV2

Porcine circovirus

Genome: single-stranded DNA

Genome size: 1500-2000 kbVirion size: 17-23 nm

Chong-Gee Teo et al., 2012

1 Rep – Tổng hợp gene2 Cap – Vỏ

3 ORF3 - apoptosis4 ORF4 - Ức chế

apoptosis, kích thích T CD4, T CD8 (He et al., 2013)

Liên hệ di truyền của PCV1/2/3/4

ELISA IgM/IgG đối với PCV2

1.IgM+/IgG(-) : IgM > IgG: mới nhiễm (<7 ngày)

2.IgM+/IgG+ : IgM>IgG: đang viêm nhiễm (7-21 ngày)

3.IgM(+)/IgG+ : IgM< IgG: nhiễm giai đoạn trễ (>21 ngày) 4.IgM(-)/IgG+ : IgM< IgG: nhiễm đã lâu (>2-3 tháng)

PCR định lượng PCV2

PCV2 tồn tại hầu như trong mọi trang trại heo

Sự hiện diện  chưa chắc liên quan đến bệnh

Sự gia tăng mật độ  là dấu chỉ quan trọng

Số lượng có thể gây bệnh >107 copy/ml mẫu

PCR định lượng PCV2

Lượng virus PCV2?

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

ELISA

BỆNH GIẢ DẠI ADV / PRV

Structural gp gene deleted from PRV genome

Deleted gp is used as antigen for the Diff ELISA kit

PRV marker vaccine principle

Vacxin ĐÁNH DẤU: Phân biệt nhiễm virus tự nhiên hay vacxin

Để trở thành DIVA, vacxin đó cần có đối tác ELISA tương ứng!

Vacxin không toàn vẹn, sống

nhưng không đánh giá được đáp ứng đối với vaccine.

SANPHAR is part of ERBER Group

ELISA: Aujeszky

ELISA sử dụng

Không tiêm (+): nhiễm tự nhiên(-): không nhiễm tự nhiên

(+): nhiễm tự nhiên(-): không nhiễm tự nhiên

Có tiêm

- Porcilis - Geskypur, - Suvaxyn -

(-): không đáp ứng vacxin

Vacxin ĐÁNH DẤU: Aujeszky

Khi có tiêm phòng, cần thực hiện cả hai xét nghiệm: gE để biết có nhiễm tự nhiên hay không; và gB để biết đáp ứng KT đối với vacxin

Ví dụ thực tiễn: KQ ELISA

ELISA gE  Kết luận?ELISA gB  Kết luận?

DIVA vacxin: Aujeszky

Tóm tắt về chẩn đoán Aujeszky:

1 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch hiện hành (không quan tâm do vacxin hay nhiễm tự nhiên):  dùng kit gB và không cần quan tâm loại vacxin sử dụng

2 Kiểm tra virus lưu hành là từ vacxin hay nhiễm tự nhiên  dùng kit gE

3 Đánh giá hiệu quả tiêm phòng: xác định heo không

nhiễm virus tự nhiên bằng kit gE, sau đó dùng kit gB để đánh giá đáp ứng kháng thể.

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

ELISA

BỆNH DỊCH TẢ CỔ ĐIỂN CSF

RNA; family Flaviviridae; genus Pestivirus.

3 genotype nhưng chỉ 1 serotype

Glycoprotein bề mặt: E1, E2

Miễn dịch cao và có tính bảo hộ tốt

SANPHAR is part of ERBER Group

CSFV – Chẩn đoán ELISA - SNA

S/N titer Titer group

Chẩn đoán phòng thí nghiệm

MỘT SỐ TÌNH HUỐNG CÂU HỎI SẴN

Trường hợp 1

Bệnh sinh sản trên nái: 5% có dịch âm đạo bất thường 15-30 ngày sau phối

- Chỉ xảy ra trên nái lứa 1?

- Chỉ xảy ra trên nái mới mua về 2 tháng trước

Bạn hãy chọn số lượng nái và số lượng nhà heo để được tư vấn?

Trường hợp 3

Bệnh sinh sản trên nái: cứ tháng 7 hàng năm là có khoảng 3% heo nái đẻ con bị run và chết khi sinh Trên tất cả các lứa.

ADV, PRRSV; CSFV, PCV2; ASFV; nguồn nước, chất độc hại từ công việc hàng ngày;

Bạn hãy chọn số lượng nái và số lượng nhà heo để được tư vấn?

Trường hợp 4

Bệnh sinh sản trên nái: Tiêm phòng đầy đủ nhưng vẫn rải rác 3% lên giống lại sau phối; 5% xảy thai 35-90 ngày thai kỳ Trên tất cả các lứa.

Bạn hãy chọn số lượng nái và số lượng nhà heo để được tư vấn?

2 Đánh giá miễn dịch bằng ELISA

Đối tượng lấy mẫu: các hạng heo (nái, heo con theo mẹ, cai sữa, choai (10-15t), nọc, hậu bị.

Số mẫu: mỗi hạng heo nên có 5-6 mẫu.

Hoàn hảo hơn: riêng nái nên chọn 3-4 lứa khác nhau (1, 3, 5, 7) hoặc (2, 4, 6 , 8)

Nếu trại đang bình thường thì phần vi sinh: khảo sát vi sinh nền chuồng (phết nền chuồng); 5 mẫu phết mũi, 3-5 mẫu phân; nước (lý hóa + vi sinh); hầm phân (kiểm tra virus)