VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
2.1.1 Chủng vi khuẩn dùng để tái phân lập và sàng lọc khả năng đối kháng đối với vi khuẩn gây bệnh
Có 12 chủng vi khuẩn Bacillus đã được phân lập từ trùn quế và phân trùn quế (F14, F2, F27, F28, F3, F34, F6, F7, T1, T12, T5, T9) do Phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Mở TPHCM cung cấp
2.1.2 Chủng vi khuẩn thử nghiệm đối kháng
Chủng vi khuẩn gây bệnh cho tôm dùng để thử đối kháng được cung cấp bởi PTN Vi sinh Trường ĐH Mở Tp.HCM
Vi khuẩn gây bệnh cho tôm gồm có: V harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus
− Môi trường dinh dưỡng thông thường: Nutrient broth (NB) bổ sung 1,5 % NaCl (w/v), Nutrient agar (NA), Nutrient agar (NA) bổ sung 1,5 % NaCl (w/v)
− Môi trường tăng sinh cho Vibrio: pepton kiềm
− Môi trường đồng nuôi cấy Bacillus và Vibrio: Luria Bertani (LB)
− Môi trường chọn lọc cho Vibrio: Thạch Thiosulfate Citrate Bile Sucrose
− Máy bể ổn nhiệt MEMMERT
- Micropipette và đầu tip tương ứng
- Que cấy vòng, que cấy gỗ, que cấy trang
- Một số dụng cụ khác trong PTN vi sinh
TÁI PHÂN LẬP BACILLUS
Chủng nhận từ PTN, hoạt hóa trên ống thạch NA Cấy ria trên đĩa NA để làm thuần Ủ 30 o C/ 24 giờ đọc kết quả, kiểm tra tính đồng nhất của khuẩn lạc
Nhuộm Gram, vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn hình trực, bắt màu gram dương màu tím, có bào tử
Thử catalase, dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí o Nhuộm Gram và thử catalase [2]
Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn
Việc nhuộm Gram được thực hiện như sau:
− Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô
− Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 – 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước
− Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước
− Tẩy cồn 96 o từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với Safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước
− Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X, có dầu soi Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram âm sẽ thấy màu hồng; Gram dương sẽ thấy màu tím; vi khuẩn đã hình thành bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu nằm bên trong tế bào sinh dưỡng bắt màu Gram, hoặc bào tử đã phóng thích ra ngoài sẽ tạo một rìa màu hồng xung quanh khối trong suốt
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý đều có enzyme catalase (trừ
Streptococcus sp.) Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2
Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí, vì thế ta sử dụng đặc tính này để thử khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát
Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí, vi khuẩn không sinh catalase sẽ không thấy sủi bọt.
THỬ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO
2.4.1 Phương pháp cấy vạch vuông góc [19]
Sử dụng phương pháp vạch thẳng vuông góc trên đĩa thạch NA có bổ sung 1,5% NaCl (w/v) theo mô tả của Purivirojkul W., và cs (2007) để tiến hành thử khả năng đối kháng của Bacillus trên các chủng Vibrio gây bệnh cho tôm như: V harveyi và V parahaemolyticus, V alginolyticus
Nhiều vi khuẩn có khả năng sinh ra 1 số chất có tính chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Khi cấy vạch vuông góc vi khuẩn thử nghiệm với vi khuẩn gây bệnh Nếu tại vị trí giao nhau, vi khuẩn gây bệnh không mọc được chứng tỏ chủng vi sinh vật gây bệnh mẫn cảm với chất kháng khuẩn do vi khuẩn thử nghiệm tạo ra Nếu chất ức chế không làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh thì sẽ không thấy vùng vi sinh vật này không sinh trưởng
Nếu vi khuẩn gây bệnh vẫn mọc tại vùng giao nhau, nhưng vi khuẩn thử nghiệm mọc lan ra đường cấy của vi khuẩn gây bệnh chứng tỏ vi khuẩn thử nghiệm có khả năng xâm lấn (cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh)
Môi trường hoạt hoá vi khuẩn thử nghiệm: Nutrient Agar (NA)
Môi trường thử nghiệm: NA bổ sung 1,5 % NaCl (w/v)
Môi trường NA bổ sung 1,5 % NaCl (w/v) được đun tan agar và đem hấp vô trùng ở 121 o C trong 20 phút, đổ vào đĩa petri đường kính 60 mm đã được vô trùng sao cho có được lớp thạch dày khoảng 4 mm Để cho nguội trên mặt phẳng, bảo quản lạnh ở 4 – 8 o C
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NA, ủ 30 o C/ 24 giờ
Vi khuẩn gây bệnh được tăng sinh trên môi trường pepton kiềm, ủ 30 o C/ 24 giờ
Dùng que cấy gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh cấy thẳng vạch thứ nhất trên đĩa môi trường NA + 1,5 % NaCl (w/v) Ngay sau đó, cũng dùng que cấy gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn thử nghiệm cấy thẳng 1 vạch vuông góc với vạch thứ nhất (xem hình 2.1)
Sau đó quan sát tại vị trí giao nhau của 2 vạch cấy, ghi nhận kết quả sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ
Bước 1 Bước 2 Hình 2.1 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc 2.4.2 Phương pháp đổ thạch 2 lớp [19]
Thử nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus đối với vi khuẩn vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp theo mô tả của Purivirojkul và cs (2007) trong 3 trường hợp: vi khuẩn Bacillus được cấy chấm, ủ 1 ngày, 2 ngày và 3 ngày trước khi đổ lớp thạch thứ 2
Bacillus được cấy trên đĩa thạch sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sẽ sinh ra lượng chất ức chế khác nhau khuếch tán trên môi trường Khi đổ lớp thạch thứ 2 chứa vi khuẩn gây bệnh lên, chất ức chế đã sinh ra sẽ ức chế, vi khuẩn gây bệnh không mọc được,
(1) tạo vòng vô khuẩn quanh khuẩn lạc Bacillus Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh càng mẫn cảm với chất ức chế của Bacillus Theo Avendaủo-Herrera và cs (2005) [10], Leyton và cs (2010) [26] thỡ giỏ trị đường kính vòng sáng lớn hơn 5 mm được xem là có khả năng ức chế
− Dùng que cấy gỗ lấy khuẩn lạc Bacillus chấm nhẹ trên mặt thạch (tiến hành cấy đồng loạt cho 3 trường hợp nói trên)
− Hoạt hóa vi khuẩn gây bệnh trong canh NB + 1,5 % NaCl (w/v) /24 giờ
− Hút 0,2 ml dịch vi khuẩn gây bệnh trộn vào 20 ml NA + 1,5 % NaCl (w/v), được giữ ở nhiệt độ 40 - 45 o C, lắc đều rồi đổ lên đĩa thạch đã được cấy chấm để tạo lớp thạch thứ 2
− Giữ trong tủ ấm 30 o C/ 24 giờ, đọc kết quả Dùng thước đo đường kính vòng vô khuẩn
2.4.3 Phương pháp đồng nuôi cấy [15, 19, 24]
Vi khuẩn thử nghiệm (mật độ ban đầu 10 5 , 10 7 , 10 8 , 10 9 CFU mL -1 ) được kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh (mật độ ban đầu 10 3 CFU mL -1 ) bằng thử nghiệm đồng nuôi cấy và kiểm tra lại mật độ vi khuẩn gây bệnh
Nhiều vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm mật độ của chúng
Vi khuẩn Bacillus và Vibrio được nuôi cấy riêng rẽ 24 giờ
Các chủng vi khuẩn này được pha trong NaCl 0,85% tạo huyền dịch vi khuẩn sao cho mật độ vi khuẩn gây bệnh sao khi cho vào LB là 10 3 CFU mL -1 và vi khuẩn thử nghiệm đạt 10 5 , 10 7 , 10 8 , 10 9 CFU mL -1
Cấy trang trên đĩa TCBS để kiểm tra lại mật độ vi khuẩn ban đầu và sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày, 7 ngày đồng nuôi cấy.
THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG GÂY DUNG HUYẾT CỦA CÁC CHỦNG
Sau khi thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus, chúng tôi tiến hành thử nghiệm kiểm tra khả năng làm dung huyết của các chủng để kiểm tra khả năng sinh hemolysin của các chủng thử nghiệm
Một vài loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym hemolysin làm tan máu (dung huyết) Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu BA (Blood Agar), có bổ sung 5 – 10% máu cừu, tùy theo loài vi khuẩn, có 1 trong 3 loại tan máu sau
- Tan máu α: tan máu không hoàn toàn
- Tan máu β: tan máu hoàn toàn
- Tan máu γ: không tan máu
− Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường thạch máu BA, có bổ sung 5% máu cừu, có thể tiến hành với VK đối chứng không dung huyết
− Cho vào tủ ấm 30 o C, ủ trong 24 giờ Đọc kết quả
Tùy loại vi khuần, sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết sau
− Tiêu huyết α (tiêu huyết không hoàn toàn): vùng tiêu huyết trong phần thạch dưới khuẩn lạc, màu tối, hơi xanh lục Tan máu α do hydrogen peroxide do vi khuẩn sản xuất, oxy hóa hemoglobin thành methemoglobin màu xanh [4, 30]
− Tiêu huyết β (tiêu huyết hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải hoàn toàn do hemolysin, tạo nên vòng tiêu huyết rộng, sáng (màu vàng) và trong suốt bao quang khóm vi khuẩn trên thạch máu [4, 30]
− Tiêu huyết γ (không tiêu huyết): hồng cầu không bị ly giải nên không tạo ra vòng tiêu huyết [4, 30].
XỬ LÝ KẾT QUẢ
Kết quả được xử lý thống kê ANOVA của phần mềm Excel của Microsoft Office với độ tin cậy P< 0,05 Kết quả trình bày gồm giá trị trung bình ± sai số
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS
Từ 12 chủng Bacillus phân lập từ trùn quế và phân trùn quế, chúng tôi tiến hành phân lập lại trên môi trường NA, chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram, thu được kết quả là chủng Bacillus thuần Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 Các chủng này được tiếp tục được thử nghiệm khả năng đối kháng với 3 chủng Vibrio
Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24 giờ nuôi cấy
STT Mã chủng ĐẶC ĐIỂM ĐẠI THỂ KHUẨN LẠC ĐẶC ĐIỂM VI THỂ TẾ BÀO Catalase
1 F14 Rìa nhăn, bóng, ướt Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Rìa nhăn, khuẩn lạc khô
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
3 F28 Rìa nhăn, khô Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Rìa nhăn, khuẩn lạc khô, bám sát mặt thạch
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Rìa nhăn, bờ nhô cao, khô
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Rìa nhăn, xù xì, mọc phân lớp Hình que, xếp thành chuỗi, gram
7 F6 Rìa nhăn, lồi Hình que, xếp thành chuỗi, gram
8 F7 Rìa nhăn, khô, dẹp Hình que, xếp thành chuỗi, gram
9 T1 Rìa nhăn, dẹp, ướt Hình que, xếp thành chuỗi, gram
10 T12 Rìa nhăn, dẹp, ướt, bóng
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Rìa nhăn, khuẩn lạc khô, xù xì
Hình que, xếp thành chuỗi, gram
12 T9 Rìa trơn, khuẩn lạc ướt Hình que, xếp thành chuỗi, gram
Hình 3.1 Hình ảnh nhuộm Gram của Bacillus
Hình 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24 giờ nuôi cấy
KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG
3.2.1 Phương pháp cấy vạch vuông góc
Từ 12 chủng Bacillus được thử khả năng đối kháng với 3 chủng Vibrio gây bệnh trên tôm
Tiến hành thử nghiệm phương pháp cấy vạch vuông góc và đọc kết quả sau
24 giờ nuôi cấy Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần
Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vuông góc
KY: kháng yếu XL: xâm lấn (cạnh tranh dinh dưỡng)
Trong số 12 chủng được thử nghiệm, có 6 chủng F27, F28, F2, F3, F6, T5 có khả năng đối kháng với vi khuẩn V harveyi nhưng không đối kháng với V parahaemolyticus, V alginolyticus
Chủng T9 không có hiện tượng đối kháng đối với cả 3 chủng Vibrio nhưng có hiện tượng xâm lấn đối với V harveyi sau 72 giờ cấy vuông
Kết quả thí nghiệm cho thấy Bacillus có khả năng đối kháng tương tự với một số báo cáo như: đối kháng với Vibrio gây bệnh của Domrongpokkaphan và cs
(2006) [15], kiểm soát Vibrio bằng Bacillus subtilis của Vaseeharan và cs (2003)
[24], kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trong nuôi thủy sản của Karunasagar [18]
Tuy nhiên vẫn có những báo cáo cho thấy Bacillus không có khả năng đối kháng với V harveyi như nghiên cứu của Purivirojkul và cs (2007) [19] Kết quả trong thí nghiệm này cho thấy các chủng vi khuẩn F14, F34, F7, T1, T12 hầu như không đối kháng với cả 3 chủng Vibrio,tương tự với kết quả báo cáo trên
24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
Trong số 6 chủng có đối kháng, đáng chú ý nhất là 3 chủng (F2, F3, F6) đối kháng mạnh với khuẩn V harveyi mạnh nhất trong số các chủng khảo sát
Hình 3.3 Kết quả thử khả năng đối kháng bằng cấy vạch vuông góc sau 72 giờ
3.2.2 Phương pháp đổ thạch hai lớp
Tổng số 12 chủng Bacillus đều được thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp Kết quả được biểu diễn là: đường kính trung bình vòng kháng khuẩn (mm) ± sai số
Bảng 3.3 Đường kính trung bình vòng khángkhuẩn
C hủ ng V k V parahaemolyticus V alginolyticus V harveyi
Tg 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm đổ thạch 2 lớp
Biểu đồ 3.1 Khả năng đối kháng của Bacillus với V parahaemolyticus
Biểu đồ 3.2 Khả năng đối kháng của Bacillus với V alginolyticus
Biểu đồ 3.3 Khả năng đối kháng của Bacillus với V harveyi Trong số 12 chủng thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy 6 chủng (F27, F28, F2, F6, F7,
T9) có khả năng kháng tốt với cả 3 chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở 48 và 72 giờ
Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của tác giả Yanett Leyton và cs (2010) [26] Đối với V parahaemolyticus thì F14, F7, T9 có kết quả đối kháng cao nhất (đường kính vòng kháng khuẩn > 20 mm) V alginolyticus bị F27, F28, F6 đối kháng mạnh nhất V harveyi thì bị F27, F28 và F2 đối kháng mạnh nhất (đường kính vòng kháng khuẩn > 20 mm)
Trong các chủng còn lại, 3 chủng (F34, T1, T12) không kháng chủng Vibrio nào Chủng F3 chỉ đối kháng với V harveyi, V parahaemolyticus mà không đối kháng V alginolyticus
Nhìn chung ở các chủng có khả năng đối kháng với Vibrio trong thử nghiệm này cho kết quả đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất ở 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy
Tổng hợp kết quả của 2 phương pháp thử đối kháng trên, từ 12 chủng Bacillus thử nghiệm, chúng tôi thu được 6 chủng (F27, F28, F2, F3, F6, T9) có khả năng kháng cả 3 chủng Vibrio Kết quả này tương tự với một số kết quả nghiên cứu trước đây về
Bacillus đối kháng Vibrio của một số tác giả: Nguyễn Văn Minh và cs (2010), Kurunasagar và cs (2005), Domrongpokkaphan và Wanchaitanawong (2006)
Sau khi tiến hành 2 thử nghiệm tính đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc và đổ thạch hai lớp, chúng tôi tuyển chọn ra 3 chủng (F27, F2, F28) để tiếp tục tiến hành thử đối kháng bằng phương pháp đồng nuôi cấy dựa trên tiêu chí:
⮚ Có khả năng đối kháng với cả 3 chủng Vibrio gây bệnh
⮚ Có khả năng đối kháng mạnh với Vibrio harveyi
3.2.3 Phương pháp đồng nuôi cấy
Mật độ Vibrio được kiểm tra ban đầu và sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày, 7 ngày đồng nuôi cấy cùng 3 chủng Bacillus ở 4 mật độ khác nhau cho kết quả như sau
Hình 3.5 Cấy trang V parahaemolyticus và V alginolyticus trên TCBS
Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V parahaemolyticus
(tính trên LOG10CFU mL -1 )
Mật độ V parahaemolyticus tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
Biểu đồ 3.4 Sự biến đổi mật độ của V parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V parahaemolyticus, đặc biệt ở mật độ 10 9 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 1,9 lần so với đối chứng
Bảng 3.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V alginolyticus
(tính trên LOG10CFU mL -1 )
Mật độ V alginolyticus tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
Biểu đồ 3.5 Sự biến đổi mật độ của V alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V alginolyticus, đặc biệt ở mật độ
10 9 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 1,9 lần so với đối chứng
Bảng 3.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V harveyi
(tính trên LOG10CFU mL -1 )
Mật độ V harveyi tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
10 9 3.3 ± 0.11 8.4 ± 0.08 8.13 ± 0.15 7.65 ± 0.17 6.52 ± 0.17 6.34 ± 0.11 4.93 ± 0.17 4.39 ± 0.07 ĐC 3.09 ± 0.05 8.58 ± 0.02 9.58 ± 0.01 8.55 ± 0.04 8.49 ± 0.01 8.19 ± 0.11 7.52 ± 0.64 8.29 ± 0.2 Đồng nuôi cấy F27 với V harveyi
Thời gian khảo sát (ngày)
Biểu đồ 3.6 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau
Theo biểu đồ 3.6, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F27 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 ,
10 8 , 10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V harveyi, đặc biệt ở mật độ
10 9 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 1,9 lần so với đối chứng
Bảng 3.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V parahaemolyticus
(tính trên LOG10 CFU/mL)
Mật độ V parahaemolyticus tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
10 9 3,85±0,07 8,79±0,03 8,04±0 7,94±0,13 8,25±0,13 7,79±0,08 6,79±0,09 6,41±0 ĐC 3,85±0,03 10,21±0,00 10,26± 0,09 10,56±0,52 11,11±0,06 11,29±0,15 11,26±0,02 10,68±0,10 Đồng nuôi cây F28 với V.parahaemolyticus
Thời gian khảo sát (ngày)
Biểu đồ 3.7 Sự biến đổi mật độ của V parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau Theo biểu đồ 3.7, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V parahaemolyticus, đặc biệt ở mật đô 10 9 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 1,7 lần so với đối chứng
Bảng 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V alginolyticus(tính trên LOG10 CFU/mL)
Mật độ V alginolyticustại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
Biểu đồ 3.8 Sự biến đổi mật độ của V alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau Theo biểu đồ 3.8, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V alginolyticus, đặc biệt ở mật độ
10 8 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 1,5 lần so với đối chứng Đồng nuôi cấy F28 với V.alginolyticus
Thời gian khảo sát (ngày)
Bảng 3.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V harveyi
(tính trên LOG10CFU mL -1 )
Mật độ V harveyitại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
10 9 3,84±0,1 8,48±0,09 10,16±0,01 6±0,09 5,86±0,06 5,69±0,2 5,3±0,11 4,42±0,08 ĐC 4,74±0,03 9,37±0,35 10,31±0,42 9,27±0,49 9,5±0,08 9,4±0,02 9,62±0,2 9,57±0,09 Đồng nuôi cấy F28 với V.harveyi
Thời gian khảo sát (ngày)
Biểu đồ 3.9 Sự biến đổi mật độ của V harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau Theo biểu đồ 3.9, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F28 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V harveyi, đặc biệt ở mật độ 10 9
CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm
2,2 lần so với đối chứng
Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V parahaemolyticus
(tính trên LOG10 CFU mL -1 )
Mật độ V parahaemolyticus tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
10 9 3,36±0,01 8,47±0,44 8,63±0,05 6,76±0,15 6,86±0,03 6,55±0,2 5,11±0,06 4,98±0,02 ĐC 3,85±0,03 10,21±0,00 10,26± 0,09 10,56±0,52 11,11±0,06 11,29±0,15 11,26±0,02 10,68±0,10 Đồng nuôi cấy F2 với V parahaemolyticus
Thời gian khảo sát (ngày)
Biểu đồ 3.10 Sự biến đổi mật độ của V parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở những mật độ khác nhau Theo biểu đồ 3.10, chúng tôi nhận thấy rằng chủng F2 ở 4 mật độ (10 5 , 10 7 , 10 8 ,
10 9 CFU mL -1 ) đều có khả năng đối kháng với V parahaemolyticus, đặc biệt ở mật độ 10 9 CFU mL -1 là đối kháng mạnh nhất, mật độ vi khuẩn gây bệnh ở ngày thứ 7 giảm 2,1 lần so với đối chứng
Bảng 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V alginolyticus
(tính trên LOG10CFU mL -1 )
Mật độ V alginolyticus tại các thời điểm (LOG10 (CFU mL -1 ))
0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày
10 9 2,39±0,21 9,45±0,05 9,2±0,03 11,37±0,03 8,68±0,02 8,94±0,06 7,31±0 6,63±0,44 ĐC 3,91±0,02 9,73±0,25 11,24±0,09 11,7±0,07 13±0,11 11,71±0,16 11,68±0,09 11.38±0 Đồng nuôi cấy F2 với V alginolyticus
Thời gian khảo sát (ngày)
KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DUNG HUYẾT
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng làm tan máu của 3 chủng (F27, F28,
F2) Đây là một trong những bước xác định tính gây bệnh của các chủng chọn lọc, đây là đặc tính quan trọng để có thể ứng dụng và an toàn cho người khi bị lây nhiễm qua chuỗi thức ăn [23] Kết quả được thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13 Kết quả khả năng gây dung huyết
Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết
Ghi chú: α : tan máu không hoàn toàn γ : không tan máu
Trong 3 chủng thử khả năng sinh hemolysin thì có 2 chủng gây tan máu không hoàn toàn (F2, F28), 1 chủng không gây tan máu (F27) và không có chủng nào gây tan máu hoàn toàn
Theo FAO/WHO, thử nghiệm hemolysin là một bước sàng lọc tính gây bệnh của các chủng để đảm bảo tính an toàn của probiotic [16]
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ