sử dụng kỹ thuật rapd pcr trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống điều thu thập tại bình dương và đồng nai

Hiện nay ở nước ta, thông tin về bộ gene của các giống Điều chưa nhiều, do vậy, nhằm góp một phần nhỏ bé vào công tác tuyển chọn và lai tạo giống Điều có chất lượng tốt, năng suất cao và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ – BÁN CÔNG TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD – PCR TRONG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐIỀU THU THẬP TẠI

BÌNH DƯƠNG VÀ ĐỒNG NAI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG – NÔNG NGHIỆP

KHÓA HỌC : 2001 – 2005

Tháng 03/ 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ – BÁN CÔNG TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD – PCR TRONG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐIỀU THU THẬP TẠI

BÌNH DƯƠNG VÀ ĐỒNG NAI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: MÔI TRƯỜNG – NÔNG NGHIỆP

KHÓA HỌC : 2001 – 2005

Tháng 03/ 2006

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành cuốn luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các Thầy Cô, gia đình và bạn bè Nay tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

➢ Cha Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay

➢ TS Bùi Minh Trí đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất đề tài

➢ KS Phan Đặng Thái Phương đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp

➢ Các Thầy Cô thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở – Bán công Thành phố Hồ Chí Minh

➢ Các anh chị nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc và Dự án điều Bến Cát

➢ Các anh chị thuộc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

➢ Các bạn bè thân yêu lớp SH01A2 đã cùng tôi chia sẻ vui buồn, thành công và thất bại trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tp Hồ Chí Minh, tháng 03/ 2006

Lê Dung Ngọc Châu

MỤC LỤC

2.1 Giới thiệu chung về cây Điều 3

2.2.4 DNA thỏa mãn các yêu cầu đối với vật chất di truyền 12

2.2.4.1 Chứa và truyền đạt thông tin di truyền 12 2.2.4.2 Tự sao chép chính xác 13 2.2.4.3 Có khả năng biến dị di truyền 13 2.2.4.4 Có tiềm năng cho việc tự sửa sai 13 2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 13

2.3.3 Các cấu phần của phản ứng 15 2.3.4 Tối ưu hóa phản ứng PCR 15 2.3.5 Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và phương 17

pháp khắc phục 2.3.6 Những ứng dụng quan trọng của PCR 18 2.3.7 Những hạn chế của PCR 19 2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20

2.4.2 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD 21 2.4.3 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 22 2.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 22 2.4.5 Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD 22 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập một số giống Điều tại Bình Dương,

Đồng Nai

23

3.2 NỘI DUNG 2: Tách chiết và kiểm tra DNA 24

3.2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 24 3.2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 30 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4 NỘI DUNG 4: Phân tích kết quả 32 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 NỘI DUNG 1: Thu thập một số giống Điều tại Bình Dương,

4.1.1 Kết quả thu thập mẫu lá Điều 33 4.1.2 Những vấn đề cần lưu ý khi thu thập mẫu 34 4.2 NỘI DUNG 2: Tách chiết và kiểm tra DNA 35

4.2.1 Kết quả tách chiết và kiểm tra DNA 35

4.2.1.1 Định tính DNA bằng phương pháp điện di trên

4.2.2 Những vấn đề cần lưu ý khi tách chiết và kiểm tra

4.3.1 Kết quả chạy RAPD – PCR cho các nghiệm thức 38

4.4.2 Những vấn đề cần lưu ý khi phân tích kết quả 45

PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ CÂY ĐIỀU GHI NHẬN

PHỤ LỤC 2: PHIẾU GHI CHÚ MẪU ĐIỀU xii PHỤ LỤC 3: MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA NÔNG DÂN xiii PHỤ LỤC 4: ĐẶC ĐIỂM CÁC MẪU ĐIỀU THU THẬP ĐƯỢC xvii PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐO OD VÀ LƯỢNG DNA CÁC MẪU LY

TRÍCH

xxii

PHỤ LỤC 6: MÃ HÓA SỐ LIỆU KẾT QUẢ RAPD – PCR xxiii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

Primer F: Forward primer – primer xuôi

Primer R: Reverse primer – primer ngược

DNA: Desoxyribonucleic Acid

RNA: Ribonucleic Acid

A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine

ATP: Adenosine – 5’ – Triphosphate

Ta: Nhiệt độ bắt cặp của primer và DNA trong phản ứng PCR

Tm: Nhiệt độ nóng chảy của primer

OD: Optical Density

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate

TE: Tris – HCl – Ethylene Diamine Tetra Acetate

TAE: Tris – Acetate – Ethylene Diamine Tetra Acetate

EB: Extraction Buffer (CTAB, NaCl, Tris – HCl, EDTA, 2 – mercaptroethanol)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Cách pha và tác dụng của các hóa chất để tách chiết DNA 25

Bảng 3.2: Thành phần và cách pha dịch trích EB 28

Bảng 3.3: Thành phần và cách pha dung dịch TE 1 X 28

Bảng 3.4: Chuẩn bị pha cocktail cho 1 phản ứng 31

Bảng 3.5: Thiết lập chu trình nhiệt cho máy PCR 32

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm trong phản ứng RAPD – PCR 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Phân bố diện tích trồng Điều ở Việt Nam năm 1997 8

Hình 2.2: Nguyên lý kỹ thuật PCR 15

Hình 2.3: Nguyên lý kỹ thuật RAPD 21

Hình 4.1: Kết quả ly trích DNA của các mẫu Điều thu thập tại Bình

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với nghiệm thức 1 38

Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với nghiệm thức 2 39

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với nghiệm thức 3 40

Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với nghiệm thức 3 có

Ladder

41

Hình 4.7: Kết quả RAPD – PCR xử lý trên phần mềm Quantity One 42

Hình 4.8: Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền dưới dạng số liệu

NTSYS của một số giống Điều thu thập ở Bình Dương và

Đồng Nai

43

Hình 4.9: Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền dưới dạng cây di

truyền của một số giống Điều thu thập ở Bình Dương và

Đồng Nai

44

Hình 4.10: Giống Điều MH 4/ 5 3 năm tuổi trồng tại trại giống thuộc

Dự án Điều Bến Cát – Bình Dương

ix

Hình 4.11: Giống Điều PN1 3 năm tuổi trồng tại trại giống thuộc Dự

án Điều Bến Cát – Bình Dương

ix

Hình 4.12: Đọt non của giống Điều CH1 x

Hình 4.13: Đọt non của giống Điều LG1 x

Hình 4.14: Chồi hoa 3 ngày tuổi và chồi hoa sắp nở của giống Điều

Hình 4.16: Hoa đực và hoa lưỡng tính của giống Điều TL Sirichai 25 xi

Hình 4.17: Màu sắc trái của giống Điều PN1 (màu vàng) và LG1

(màu đỏ)

xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thập niên 80, cây Điều (Anacardium occidentale L.) chỉ được xem

là cây trồng xóa đói giảm nghèo, chủ yếu dùng để phủ xanh đất đồi trọc

Hiện nay, cây Điều đã trở thành cây trồng mang lại kim ngạch xuất khẩu lớn cho đất nước Dự báo kim ngạch xuất khẩu nhân Điều và các sản phẩm từ Điều có thể đạt 1 tỷ đô la Mỹ trong vài năm tới [11]

Năm 1999, diện tích cây Điều chỉ có 150.000 ha với năng suất thấp hơn 5 tạ hạt thô/ ha Đến nay, diện tích cây Điều đã đạt 400.000 ha, năng suất bình quân 11 tạ/ ha [15] Tuy nhiên, so với một số nước trong khu vực thì cây Điều của nước ta có năng suất và chất lượng chưa cao Chính vì vậy, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn triển khai đề án giống Điều giai đoạn 2006 – 2010, phấn đấu mỗi năm thay thế, cải tạo khoảng 20 % diện tích Điều hiện có để đảm bảo đến 2010 không còn giống Điều năng suất, chất lượng thấp [9] Vì vậy, việc bảo tồn và phổ biến một số giống Điều có năng suất và chất lượng vượt trội là một việc làm cấp thiết Trong đó, việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể Điều là rất quan trọng, nhằm làm tiền đề cho công tác tuyển chọn và lai tạo giống sau này

Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể, người ta có thể sử dụng nhiều kỹ thuật phân tử khác nhau Tuy nhiên, đối với những đối tượng chưa có nhiều thông tin về bộ gene, người ta thường có xu hướng sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR (vì kỹ thuật này có những ưu điểm như: đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp…)

Hiện nay ở nước ta, thông tin về bộ gene của các giống Điều chưa nhiều,

do vậy, nhằm góp một phần nhỏ bé vào công tác tuyển chọn và lai tạo giống Điều có chất lượng tốt, năng suất cao và ổn định, chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống Điều thu thập tại Bình Dương và Đồng Nai”

- Thu thập một số giống Điều tại Bình Dương và Đồng Nai

- Tách được mẫu DNA của các giống Điều tham gia thí nghiệm

- Phân tích tính đa dạng di truyền của các giống Điều thu thập được tại Bình Dương và Đồng Nai

- Vẽ biểu đồ cây thể hiện tính đa dạng di truyền của các giống Điều thu thập được tại Bình Dương và Đồng Nai

1.4 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI

- Đề tài chỉ được nghiên cứu đối với một số giống Điều đang được canh tác

ở Bình Dương và Đồng Nai

- Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 07/ 2005 – 12/ 2005

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY ĐIỀU

2.1.1 Nguồn gốc [14]

Cây Điều (Anacardium occidentale L.) mọc tự nhiên ở các bãi cát ven

biển và trong các khu rừng ở vùng đảo Ăngti và Braxil, lưu vực sông Amazon ở Nam Mỹ

Từ cây hoang dại, cây Điều dần dần được trồng trên diện tích lớn ở Braxil Vào thế kỷ XVI, người Bồ Đào Nha mang giống Điều trồng ở các nước Châu Á và Châu Phi

2.1.2 Đặc điểm thực vật học [14]

Điều thuộc loại cây gỗ, cao trung bình 6 – 10 m Trong điều kiện thích hợp, cây có thể cao đến 15 – 20 m

Rễ Điều thuộc loại rễ cọc, mọc rất nhanh (sau 2 năm có thể đâm sâu đến

2 m hay hơn nữa), nên cây Điều chịu hạn giỏi

Lá Điều thuộc loại lá đơn, nguyên, phiến lá dày, gân nổi rõ ở dưới mặt lá, cuống ngắn

Điều trổ hoa tập trung từ tháng 1 đến tháng 4 Hoa nhỏ màu trắng vàng, nở từ từ trung bình khoảng 32 ngày Mỗi cụm hoa có từ 65 – 240 hoa gồm 2 loại: hoa đực và hoa lưỡng tính, trong đó phần lớn là hoa đực, hoa lưỡng tính chỉ chiếm khoảng 14 % Cây Điều ra hoa từ Đông sang Tây theo chiều kim đồng hồ Hoa thụ phấn chéo (nhụy cái của cây Điều này hầu hết đều nhận phấn của cây Điều khác) Sự thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng, một phần nhờ gió Cây Điều chỉ

thụ phấn tốt trong điều kiện thời tiết khô ráo, trời không u ám Khi ra hoa, nếu gặp mưa, độ ẩm không khí cao, thì cây Điều dễ bị mất mùa

Sau khi thụ phấn, hạt Điều phát triển rất nhanh, cuống phình lên thành trái (trái giả) Sau 60 ngày, trái chín có màu đỏ hay vàng tùy gïiống Trái thường tập trung thành chùm ở đầu cành

Hạt Điều (trái thật) hình thận, khi còn tươi có màu xanh, khi khô chuyển sang nâu, mọc lộ ra ngoài đầu trái giả trông giống như trái đào có hột chui ra ngoài Vì vậy, cây Điều còn được gọi là đào lộn hột

Hột Điều gồm 3 phần:

- Vỏ thường dày 0,4 cm, chiếm 70 % trọng lượng hột, có 3 lớp:

• Lớp vỏ ngoài dai và láng

• Lớp vỏ giữa xốp như bọt biển, chứa dầu vỏ hột Điều

• Lớp vỏ trong rất cứng

- Vỏ lụa bao quanh nhân, chiếm 5 % trọng lượng hột

- Nhân

2.1.3 Công dụng [14]

Trái Điều chứa nhiều Vitamin B1, B2 và C Trái Điều vàng chứa nhiều Vitamin C và ít Vitamin B2 hơn trái Điều đỏ Trái Điều có thể ăn sống, nấu canh chua hay chế biến thành tinh dầu, nước giải khát, rượu, dấm, mứt, ép lấy nước làm si rô nguyên chất hay đem cô đặc, đóng hộp Rượu từ trái Điều có tính giải nhiệt, trị nhứt mỏi, làm lợi tiểu, chữa viêm họng Nước trái Điều pha với sunfat sắt có thể dùng để nhuộm đen tóc

Nhân hột Điều có giá trị dinh dưỡng cao chứa protit ít hơn đậu phộng nhưng nhiều lipit, gluxit hơn, dùng để ăn: hột Điều rang, làm gia vị, nhân bánh trung thu, nhân kẹo sô cô la và một số loại bánh kẹo khác Ngoài ra, hột Điều

còn được dùng để ép lấy dầu chế biến margarin (bơ thực vật) Bánh dầu hột Điều còn có thể dùng làm bánh mứt

Dầu vỏ hột Điều gồm chủ yếu là axit anacardic (C22H32O3) và một lượng

ít cardol (C24H32O2) Dầu vỏ hột Điều dùng để điều chế verni, sơn chống thấm, chịu nhiệt, bảo vệ kim loại, dung môi chống nóng, cháy, vật liệu cách điện, chất bôi trơn, keo dán gỗ, chất phòng lão cho cao su, xi măng đặc biệt, thuốc nhuộm, thuốc trừ sâu, diệt mối, chống nấm, mực in, mực dấu, thuốc trừ bệnh phong, mụn cóc, nứt gót chân, hương liệu, mỹ phẩm…

Trong kỹ thuật nhiệt đới hóa các máy móc thiết bị, nhất là các thiết bị điện tử tinh vi, dầu vỏ hột Điều làm tăng tuổi thọ các linh kiện điện tử và tăng độ an toàn trong máy móc Đặc biệt, dầu vỏ hột Điều còn được dùng làm tranh sơn mài Vỏ lụa chứa một ít đạm, đường và muối khoáng, có thể dùng để nuôi gà vịt

Lá Điều: người Inđônêxia ăn lá non, người Bồ Đào Nha nấu lá Điều để làm thuốc ngủ, người Ấn Độ dùng lá già để chữa da bị phồng lở hay phỏng lửa

Vỏ cây Điều chứa chất chát dùng trong kỹ nghệ thuộc da, làm mực, thuốc nhuộm vải Vỏ cây Điều ngâm lấy nước chữa bệnh đau cổ, trừ bệnh tiêu chảy nhẹ và táo bón

Rễ cây Điều dùng làm thuốc chống nôn, chống xổ

Gỗ cây Điều dùng làm bàn ghế, nguyên liệu giấy, sợi đóng thùng Thân cây và cành cung cấp củi

Nhựa cây Điều có thể dùng làm thuốc sát trùng, điều chế verni, làm keo dán sách, thuốc trừ bệnh phong hay các bệnh ngoài da

2.1.4 Tình hình sản xuất Điều trên thế giới [14]

Hiện nay, những nước chủ yếu sản xuất hạt Điều trên thế giới là Ấn Độ, Mozambique, Tanzania, Kenya, Braxil

Trong những năm qua, Ấn Độ đi đầu trong nghiên cứu cây Điều, đã vươn lên vị trí hàng đầu trên thị trường thế giới, với tư cách là nước sản xuất hột Điều, đồng thời là nước nhập khẩu hột Điều quan trọng bậc nhất

Trên thế giới, sản lượng hạt Điều hàng năm không ổn định, nhịp độ phát triển chậm Hiện nay, sản lượng hạt Điều vẫn ở mức 400.000 – 500.000 tấn/ năm

Các nước Mỹ, Canada, Đức, Anh, Pháp, Nhật, Úc là những nước nhập nhân Điều với khối lượng lớn và tỷ trọng cao nhất Liên Xô là nước nhập khẩu nhân Điều quan trọng sau Mỹ

Từ 1976 – 1982, giá nhân Điều có xu hướng tăng nhanh một cách đột biến từ 2.580 đô la Mỹ/ tấn (năm 1976) tăng lên 5.250 đô la Mỹ/ tấn (năm 1982), tăng 20 % mỗi năm Giá dầu Điều bằng 20 – 25 % giá nhân Điều

Bảng 2.1: Sản lượng nhân hạt Điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001

Các nước Châu Phi nói tiếng Pháp

Các nước khác

350.000 180.000 110.000 80.000 40.000 30.000 30.000

-

-

- 80.000

425.000 200.000 140.000 150.000 30.000 20.000 30.000 45.000 20.000 70.000 70.000

Cộng 900.000 1.200.000

Nguồn: Đề án phát triển cây Điều đến năm 2010 – Bộ Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn, 2000

2.1.5 Tình hình sản xuất Điều ở Việt Nam

Ở nước ta, cây Điều được xếp thứ 4 trong số các cây công nghiệp xuất khẩu quan trọng Cây Điều dễ thâm canh, bảo quản hơn so với nhiều loại cây trồng khác nên có thể phát triển và tồn tại được ở những nơi có lượng mưa từ

300 – 500 mm/ năm Do đó, trước đây cây Điều tập trung ở những địa phương từ Đà Nẵng trở vào, thì nay đã vượt qua đèo Hải Vân ra Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Quảng Bình… Những đồi trọc, những vùng đất trống, những trảng bạt ngàn ở Bình Dương, Bình Phước, Đồng Nai, Tây Ninh, Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú

Yên, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Kon Tum… có thể quy hoạch đưa vào trồng Điều đều phù hợp [13]

Hiện nay, cả nước có khoảng 400.000 ha Điều [15], tập trung chủ yếu ở vùng Đông Nam Bộ chiếm khoảng 60 %, duyên hải Nam Trung Bộ khoảng 24

%, Tây Nguyên khoảng 11 %, Đồng bằng sông Cửu Long khoảng 5 %… diện tích (Phạm Đình Thanh, 2003) Nước ta đang từng bước hình thành các vùng Điều tập trung, gắn với cụm công nghiệp chế biến [13]

Hình 2.1: Phân bố diện tích trồng Điều ở Việt Nam năm 1997

(Nguồn: Phạm Đình Thanh, 2003)

ĐBSCL

5 %Tây Nguyên

11 % Duyên hải Nam Trung Bộ

24 % Đông Nam Bộ

60 %

Năm

Bảng 2.2: Tình hình phát triển sản xuất Điều tại Việt Nam dự kiến đến 2010

Đơn vị tính: ha

1997 2005 2010 Toàn quốc 250.000 340.000 500.000 Duyên hải Nam Trung Bộ

100.000

10.000 10.000 15.000 15.000 15.000 10.000 25.000

180.000

25.000 25.000 25.000 20.000 25.000 20.000 40.000

60.000

16.000 17.000 15.000 12.000

120.000

25.000 35.000 30.000 30.000

Đông Nam Bộ

170.000

40.000 25.000 28.000 65.000 10.000 2.000

190.000

40.000 30.000 28.000 65.000 25.000 2.000

Đồng bằng sông Cửu Long 13.000 10.000 10.000

Nguồn: Đề án phát triển cây Điều đến năm 2010 – Bộ Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn, 2000

Vùng/ Tỉnh

Theo Vũ Thái Sơn, từ năm 1999 đến nay, năm 2004 là năm thành công nhất cả về sản lượng Điều thô, sản lượng Điều nhân xuất khẩu và giá xuất khẩu [11]

Năm 2004, các nhà xuất khẩu nhân Điều của Việt Nam đã mua được 350.000 tấn Điều thô nguyên liệu từ trong nước và nhập khẩu thêm 50.000 tấn Điều thô để chế biến xuất khẩu được 100.000 tấn Điều nhân, thu về 410 triệu đô

la Mỹ, tăng 25 % về khối lượng xuất khẩu và 40 % về kim ngạch so với năm

2003 [11]

Theo Hiệp hội Cây Điều Việt Nam (Vinacas), vụ Điều năm nay được mùa toàn diện cả năng suất, sản lượng và giá cả Chỉ trong tháng 1, cả nước đã xuất khẩu được hơn 5.000 tấn Điều nhân, góp phần giữ vững vị trí thứ 2 thế giới, sau Ấn Độ, về xuất khẩu hạt Điều [13]

Sản lượng xuất khẩu 5.000 tấn Điều nhân/ năm cũng là chỉ tiêu được Chính phủ đề ra cho ngành Điều trong năm 2010 (Hồ Ngọc Cầm, 2005)

2.2 DESOXYRIBO NUCLEIC ACID (DNA)

2.2.1 Giới thiệu [7]

Năm 1868, Friedrich Miescher, nhà sinh hóa học Thụy Điển, phát hiện trong nhân tế bào bạch cầu một chất không phải là protein và gọi là nuclein (từ chữ nucleus – nhân) Về sau thấy chất này có tính acid nên được gọi là nucleic acid Nucleic acid có 2 loại là desoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA) Chất mà ông Miescher tìm ra là DNA

Năm 1914, R Feulgen, nhà hóa học Đức, tìm ra phương pháp nhuộm màu đặc biệt đối với DNA và 10 năm sau cho thấy DNA của nhân giới hạn trong các nhiễm sắc thể Nhiều sự kiện gián tiếp cho thấy DNA là chất di truyền, nhưng trong một thời gian dài quan niệm protein là chất di truyền vẫn ngự trị Các

nhiễm sắc thể đều có chứa DNA lẫn protein, hơn nữa lúc đó cho rằng các protein mới có đủ sự phức tạp hóa học cần thiết để chứa thông tin di truyền

Mãi đến năm 1944, vai trò mang thông tin di truyền của DNA mới được chứng minh lần đầu tiên và đến năm 1952 mới được công nhận sau nhiều tranh cãi

Năm 1953, J Watson và F Crick đã tổng hợp các số liệu phân tích hóa học và tán xạ tia X để xây dựng đúng đắn mô hình cấu trúc của phân tử DNA, còn gọi là mô hình cấu trúc DNA của Watson – Crick hay chuỗi xoắn kép

Từ năm 1953 đến nay, mô hình đó là trung tâm của các nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử Hai ông nhận được giải Nobel vào năm 1962

Theo mô hình của Watson – Crick, phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép mà hai mạch polynucleotide gồm khung đường xen kẽ với các nhóm phosphate, được gắn với nhau nhờ các liên kết hydro giữa Adenine (A) với Thymine (T) ở mạch đối diện và giữa Guanine (G) với Cytosine (C) ở mạch đối diện

2.2.2 Thành phần hóa học [7]

DNA là một chất trùng hợp (polimer) – một polynucleotide, được tạo nên

do sự nối liền nhiều đơn phân (monomer) cùng kiểu là các nucleotide

Thành phần hóa học của DNA gồm có:

- Gốc phosphoric acid

- Đường 5 – desoxyribose (Đường pentose)

- Các nitrogenous base gồm:

• 2 purine là Adenine (A) và Guanine (G)

• 2 pyrimidine là Thymine (T) và Cytosine (C) RNA có Uracil (U) thay cho Thymine (T)

Đường pentose (5C) desoxyribose gắn với nitrogenous base ở vị trí C1 sẽ tạo nên nucleoside Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của

đường pentose thành nucleotide Tính đặc hiệu của nucleotide do base, nên khi nói đến nucleic acid, base thường được dùng thay cho nucleotide Cách gọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp (base pair) hay kb (kilobase – 1000 cặp base)

2.2.3 Cấu trúc hóa học [7]

- Các base purine và pyrimidine có cấu trúc phẳng, mặt phẳng của chúng xếp vuông góc với trục dài của mạch polynucleotide và chúng chồng cái này lên cái kia như một cột gồm những viên gạch chồng lên nhau, khoảng cách trung tâm của 2 mặt phẳng kề nhau là 3,4 Å

- Mạch polynucleotide không duỗi thẳng mà xoắn lại thành lò xo quanh trục giữa, mỗi bước xoắn của lò xo dài 34 Å

- Số liệu tính toán cũng cho thấy DNA có nhiều hơn một mạch polynucleotide

2.2.4 DNA thỏa mãn các yêu cầu đối với vật chất di truyền [7]

2.2.4.1 Chứa và truyền đạt thông tin di truyền

Phân tử DNA có chiều ngang giới hạn nhưng chiều dài thì không hạn chế Trình tự sắp xếp các nucleotide theo chiều dài có thể phản ánh những thông tin nhất định Tuy DNA chỉ có 4 loại nucleotide nhưng số trình tự khác nhau là một con số khổng lồ Người ta tính rằng với đoạn DNA có 20 nucleotide, thì số trình tự của nó theo chiều dài có đến 420 tức khoảng nghìn tỉ tổ hợp Khả năng chứa thông tin đó làm cho phân tử DNA là phân tử dài nhất trong tự nhiên

Ngoài việc chứa thông tin theo chiều dài, khả năng này còn được mở rộng

do các thay đổi cấu trúc, do gãy nối lại hay lắp ghép giữa các đoạn DNA

Thông tin chứa trên DNA được sử dụng và thực hiện hóa nhờ các chất trung gian RNA, rồi đến tổng hợp các protein là những công cụ phân tử thực hiện chức năng của tế bào

2.2.4.2 Tự sao chép chính xác

Chuỗi xoắn kép gồm 2 sợi bổ sung cho nhau theo nguyên tắc A – T và G – C, làm cho phân tử như có một bản âm và một bản dương Mỗi bản có thể làm khuôn tạo ra bản kia để từ 1 phân tử ban đầu có 2 phân tử con giống hệt

2.2.4.3 Có khả năng biến dị di truyền

Trên phân tử DNA có thể xảy ra nhiều biến đổi Các biến đổi có thể được

di truyền Ví dụ: cặp A – T trên DNA được thay bằng cặp G – C thì sự thay thế được truyền cho các phân tử con

2.2.4.4 Có tiềm năng cho việc tự sửa sai

Do cấu trúc mạch kép nên sai hỏng ở 1 mạch có thể bị cắt bỏ và dựa vào mạch nguyên vẹn làm khuôn để tổng hợp lại cho đúng

2.3 KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.3.1 Giới thiệu

PCR được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Tám năm sau (1993), phát minh này đã đem lại cho tác giả một giải Nobel Hóa học Kary Mullis lập tức nổi tiếng trong giới khoa học thời bấy giờ [12]

PCR là quá trình khuếch đại của một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro

do sự xúc tác của enzym DNA polymerase, được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng Nhờ vậy, 1 mạch kép DNA sau phản ứng do DNA polymerase thực hiện thành 2 mạch DNA kép và có thể tiếp tục chu trình khuếch đại mới: 2 thành 4, 4 thành 8 theo cấp số nhân [7]

Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng và làm nguội theo chương trình định sẵn gọi là Thermocycler, đây chính là máy PCR [7]

2.3.2 Nguyên tắc chung [3]

PCR (25 – 35 vòng) được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự như sau:

- Denature (Biến tính): Hai mạch đơn của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 – 96 oC), trong 15 giây (hoặc lâu hơn tùy theo vật liệu)

- Annealing (Bắt cặp): Nhiệt đđộ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đđích theo nguyên tắc bổ sung ở 50 – 56 oC (tùy thuộc vào primer), trong 30 giây

- Extension (Kéo dài): Kéo dài dây mới từø primer nhờ sự có mặt của DNA polymerase ở 72 oC, trong 1,5 phút

Chu kỳ được kết thúc bằng một “Extension” ở 72 oC trong 5 phút Sau đó, người ta cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở 4 oC

Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đoạn Denature và Annealing Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA

Hình 2.2: Nguyên lý kỹ thuật PCR [16]

2.3.3 Các cấu phần của phản ứng [7]

Trong các ống nghiệm plastic nhỏ có các thành phần chủ yếu sau:

- Khuôn mẫu (Template) tức đoạn DNA cần khuếch đại

- Các oligonucleotide primer (các mồi) còn gọi là amplifer (nhân tố khuếch đại), oligo hay primer

- DNA polymerase chịu nhiệt (thermostable)

- dNTP: các loại desoxynucleotide triphosphat

- Dung dịch đệm (buffer) thích hợp

- MgCl2

2.3.4 Tối ưu hóa phản ứng PCR [1]

- Trình tự của primer: theo nguyên tắc, primer càng dài sự bắt cặp càng chuyên biệt và ngược lại Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng của sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ sung giữa những nucleotide của

Bước 1: Biến tính

Bước 2: Bắt cặp

Bước 3: Nối dài

primer với những nucleotide của DNA Template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt Trình tự primer xác định vị trí, kích thước của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs)

- Nồng độ các primer: primer F (Forward primer) và primer R (Reverve primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa

- Tỉ lệ primer/ DNA Template: nếu tỉ lệ này quá cao hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện Ngược lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản

- Nồng độ MgCl2: ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng, người ta thường thay đổi nồng độ của MgCl2 trước tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn vì nó có ảnh hưởng tới nhiệt độ biến tính mạch đôi thành mạch đơn, làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA Template, sự đặc hiệu của sản phẩm PCR (sự nối dài chính xác), hoạt động enzym và sự trung thực của kết quả Thông thường, hàm lượng ion Mg++ cần thiết từ 0,5 – 2,5 mM

- Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định và đặc hiệu 4 loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau

- Những enzym DNA polymerase chịu nhiệt: nên sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/ 25 µl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR Không nên sử dụng enzym ở nồng độ cao hơn 1,25 U/ 25 µl (2,5 nM) Nếu nồng độ này quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, nếu quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không đủ enzym

- Chất ổn định hoạt động enzym (enzym stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA

- Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2 oC, trong đó:

- Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trưng:

• Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp

• Gia tăng thời gian ủ bắt cặp

• Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi

• Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78 oC

• Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 mM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM

• Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP

• Giảm lượng mồi

• Giảm lượng DNA khuôn

• Giảm lượng Taq polymerase

- Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trưng:

• Giảm thời gian ủ bắt cặp

• Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp

• Giảm thời gian kéo dài

• Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68 oC

• Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 mM, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM

• Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP

• Giảm lượng mồi

• Giảm lượng DNA khuôn

• Giảm lượng Taq polymerase

- Không có sản phẩm nào cả:

• Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng

• Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông

• Gia tăng hàm lượng mồi

• Gia tăng hàm lượng DNA khuôn mẫu

• Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10 oC

- Sản phẩm PCR ít:

• Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể

• Gia tăng lượng mồi

• Gia tăng lượng DNA khuôn

• Gia tăng lượng Taq polymerase

2.3.6 Những ứng dụng quan trọng của PCR

Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp,…

- Trong nghiên cứu genome: [3]

• Nhân bản vô tính với PCR

• Recombinant PCR

• Kỹ thuật footprinting DNase I

• Thanh lọc gt11 libraries

• HLA DNA

• Multiplex PCR

- Trong y khoa: [3], [12]

• Xác định quan hệ huyết thống

• Phát hiện tế bào T/ virus gây bệnh ung thư máu

• Phát hiện và định lượng virus viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu

vi C

• Phát hiện nhóm vi khuẩn gây bệnh trong dịch não tủy

• Nhiều ứng dụng khác trong chẩn đoán bệnh: lao, sốt xuất huyết,

u nhú (virus Human Pailloma)

- Trong thực phẩm: [12]

• Phát hiện các loại vi khuẩn gây bệnh trên thực phẩm (Salmonella)

• Phát hiện virus gây bệnh đốm trắng, đầu vàng, tôm còi ở tôm sú

• Phát hiện bệnh dịch tả heo

2.3.7 Những hạn chế của PCR [10]

- Do tính cực nhạy của PCR mà chỉ cần một ít DNA “không mời mà đến” cũng dễ làm tăng lượng và sai lệch kết quả

- Sau vài tuần sử dụng thì phòng thí nghiệm dễ bị nhiễm và người ta đã thu được DNA ngay trong ống kiểm tra lúc đầu không có chất liệu di truyền nào

- Việc khử nhiễm bằng cách sử dụng Uraxin (bình thường không tham gia vào kiến trúc DNA để sản xuất các bản sao từ phân tử xuất phát) Vì vậy, DNA được tăng lượng chứa các Uraxin (thay cho các Timidin), không làm ảnh hưởng

gì phần lớn các phân tích Kỹ thuật khéo léo này sau đó cho phép loại bỏ các đoạn DNA tạo ra, trước khi thực hiện lần tăng lượng mới Muốn vậy chỉ cần sử lý các tiêu bản chất liệu di truyền bằng một loại enzym vi khuẩn để loại bỏ các phân tử DNA chứa Uraxin Do đó, bất kỳ DNA nào gây nhiễm bắt nguồn từ lần

tăng lượng trước đều bị tiêu hủy Vì enzym mẫn cảm với nhiệt độ nên nó bị mất hoạt tính trong lần PCR tiếp theo và do đó không xâm phạm DNA mà người ta muốn tăng lượng (Nguyễn Ngọc Hải, 1997)

Đây cũng là một khó khăn đối với các phòng thí nghiệm có áp dụng PCR

ở nước ta Cho nên các công trình nghiên cứu phần lớn được áp dụng ở các phòng thí nghiệm tiên tiến ở nước ngoài theo các chương trình hợp tác, phụ thuộc vào vật liệu, hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn và có độ tin cậy cao

2.4 KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

2.4.1 Nguyên tắc chung

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD

ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [3] [8]

Hình 2.3: Nguyên lý kỹ thuật RAPD

2.4.2 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD [2]

Bước 1: Tách chiết DNA có chất lượng tốt, tương đối sạch và không bị gãy nhiều

Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo sản phẩm không chính xác

Bước 3: Điện di phát hiện kết quả PCR – RAPD bằng gel

Sau phản ứng DĐiện di phát hiện sản phẩm

2.4.3 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao

Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [8]

2.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp)

Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [3][8]

2.4.5 Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do

ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp

- Đánh giá đa dạng di truyền: đã được áp dụng trên các đối tượng như cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…

- Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [3][8]

- Xây dựng bản đồ gene: sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995) [3][8]

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập một số giống Điều tại Bình Dương và Đồng Nai

3.1.1 Điều kiện điều tra

- Địa điểm: Công việc thu thập mẫu tiến hành tại Bình Dương và Đồng Nai

- Thời gian: Công việc điều tra tiến hành trong thời gian từ 20/ 07/ 2005 – 20/ 09/ 2005

3.1.2 Phương tiện điều tra

- Chuẩn bị phiếu điều tra tình hình canh tác Điều ở Bình Dương và Đồng Nai

- Chuẩn bị phiếu ghi chú các đặc điểm của mẫu Điều sau khi thu thập được

3.1.3 Phương pháp điều tra

- Áp dụng biện pháp điều tra truyền thống bằng cách phỏng vấn trực tiếp các hộ nông dân theo bảng câu hỏi được soạn sẵn về nội dung, có sự tham gia của nông dân

- Thu thập thông tin về giống, kỹ thuật trồng và những thông tin khác có liên quan

- Ghi nhận các đặc điểm nông học của các giống điều tra

- Lấy mẫu và bảo quản mẫu: chọn những lá tốt, không bị rách hay sâu bệnh (cả lá non, trưởng thành và già), lau sạch rồi cho vào bao nilon ghi đầy đủ thông tin về mẫu, giữ mẫu trong thùng đá trong suốt quá trình vận chuyển từ nơi

lấy mẫu đến Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM và bảo quản trong điều kiện lạnh – 20 oC

- Xử lý các kết quả thu thập, điều tra bằng phần mềm EXCEL

3.2 NỘI DUNG 2: Tách chiết và kiểm tra DNA

3.2.1 Điều kiện nghiên cứu

- Địa điểm: Thí nghiệm tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

- Thời gian: Thí nghiệm tiến hành trong thời gian từ 20/ 09/ 2005 – 20/ 11/

2005

3.2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

- Vật liệu: các mẫu lá Điều thu thập được trong quá trình điều tra

- Thiết bị – Dụng cụ: [1][2][10]

• Kéo (Việt Nam)

• Cân điện tử (Ohaus, Mỹ)

• Chày cối sứ (Đức)

• Ống eppendorf 1,5 ml (Pháp)

• Các loại pipette 0,5 – 10 µl, 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl (Nichiryo, Nhật)

• Các loại đầu tipe 0,5 – 10 µl, 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl (Đức)

• Bao tay

• Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam, Anh)

• Máy vortex (IKA, Đức)

• Tủ ủ mẫu (Memmert, Anh)

• Máy vi ly tâm (Hettich, Đức)

• Tủ – 20 oC (Sanyo, Nhật)

• Nồi hấp autoclave (Tomy, Nhật)

• Tủ sấy (Jencons, Anh)

• Lò viba (Electrolux, Thụy Điển)

• Giếng đổ gel

• Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật)

• Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad, Thụy Điển)

- Hoá chất:

• Dịch trích EB (Extraction buffer)

• Dung dịch CIA (Chloroform: isoamyl alcohol) tỉ lệ 24 : 1

• Enzym RNase 10 mg/ ml

• Dung dịch isopropanol lạnh

• Dung dịch TE 1 X (Tris – HCl và ethylendiamine tetra acetate)

• Muối sodium acetate 3 M

• Nước cất siêu sạch khử ion

Bảng 3.1: Cách pha và tác dụng của các hóa chất để tách chiết DNA [1][10] Hóa chất Cách pha Tác dụng

NaCl 5 M

M = 58,5 g/ mol

Dùng 58,5 g NaCl pha với 200 ml nước cất 2 lần

Là môi trường đệm, tạo thuận lợi cho việc kết tủa DNA

Tris – HCl 1 M

C4H12ClNO3

M = 157,60 g /mol

Dùng 31,5 g bột Tris – HCl pha với

200 ml nước cất 2 lần Chỉnh pH đạt 8,0 Hấp trong nồi Autoclave, 121 oC trong 20 phút trước khi sử dụng

Là dung dịch đệm, đảm bảo pH môi trường ly trích đạt 8,0 (DNA ổn định) Nếu trong môi trường acid, các acid nucleic rất dễ bị loại thải và cầu nối phosphodieste dễ bị phá vỡ, cấu trúc DNA không bền vững

ml nước cất 2 lần

Chỉnh pH đạt 8,0

Hấp trong nồi Autoclave, 121 oC trong 20 phút trước khi sử dụng

Gắn nối các ion hóa trị II (như

Mg++, Ca++) có trong dịch trích mẫu, ngăn chặn sự hoạt động của các enzym phân hủy DNA, vì các enzym này hoạt động rất mạnh nếu có mặt các ion hóa trị II, nhất là Mg++

Là chất tẩy cation

Phá vỡ vách tế bào và màng nhân

Biến tính protein

Thành lập phức hợp với những protein, polysaccharide

Mercaptro ethanol Phá vỡ màng nhân

Ức chế quá trình oxy hóa

Bảo vệ DNA khỏi những quinon, disulfite, peroxidase, polyphenol

oxydase

Chloroform Làm biến tính protein và các sắc

tố có trong mẫu

Chiết xuất protein và những polysaccharide

Isoamyl alcohol Giúp mẫu không bị sủi bọt trong

quá trình vortex hay ly tâm với tốc độ cao

RNase 10 mg/ ml

Ribonuclease

Dùng 10 mg bột RNase pha với 1

ml nước cất 2 lần

Là enzym phân hủy các RNA có trong dịch trích

Isopropanol Kết tủa DNA

Sodium acetate 3 M

CH3COONa

M = 82 g/ mol

Dùng 49,2 g bột sodium acetate pha với 200 ml nước cất 2 lần

Là dung dịch đệm, bảo vệ DNA Làm tăng lực ion trong dịch trích tạo điều kiện tốt cho DNA kết tủa và rửa sạch bằng ethanol 100

% ở – 20 oC

Ethanol 100 % Kết tủa và rửa sạch DNA Có thể

gây hại cho DNA do vậy phải kết hợp với muối

Ethanol 70 % Dùng 100 ml

ethanol 100 % pha với 42,86 ml nước cất 2 lần

Rửa sạch DNA Không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp

Bảng 3.2: Thành phần và cách pha dịch trích EB [1][10]

Thành phần Lượng dùng

Lưu ý: Mercaptro ethanol để lâu dễ bị mất hoạt tính, vì vậy mỗi lần chỉ nên pha

50 ml EB và bọc lọ đựng dung dịch bằng giấy bạc, bảo quản ở điều kiện lạnh 4

o C

Bảng 3.3: Thành phần và cách pha dung dịch TE 1 X [1]

Thành phần Lượng dùng

(pha trong 250 ml)

Tris – HCl 1 M 1 ml EDTA 0,5 M 0,2 ml

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu

3.2.3.1 Tách chiết DNA: dựa theo quy trình tách chiết mẫu tươi của Doyle và Doyle (1988) gồm 12 bước:

- Bước 1: Cân 0,15 g lá, lau sạch, cắt nhỏ, cho vào cối, nghiền mẫu với 1 ml dịch trích EB Chuyển phần dịch nghiền nhuyễn này vào eppendorf 1,5 ml Vortex kỹ Ủ ở 65 oC trong 45 phút