luận án tiến sĩ nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài dứa dạipandanus tonkinensis mart ex b stone bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ và rß loài Pandanus tonkinensis .... Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ loài Pandanus tonkinensis .... Xác đánh

VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

H àC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà

-

NGHIÊN CĄU PHÂN TÍCH THÀNH PHÄN, CÂU TRÚC HÓA

tonkinensis MART.EX B.STONE) B ÆNG CÁC PH¯¡NG PHÁP

HÓA LÝ HIàN Đ¾I

LU ÂN ÁN TI¾N SĨ HÓA HàC

Hà Nßi - 2023

VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

H àC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà

-

ĐINH THÞ HUYÀN TRANG

NGHIÊN CĄU PHÂN TÍCH THÀNH PHÄN, CÂU TRÚC HÓA HàC CĂA CÁC HþP CHÂT TĆ LOÀI

D ĄA D¾I (Pandanus tonkinensis MART.EX B.STONE)

B ÆNG CÁC PH¯¡NG PHÁP HÓA LÝ HIàN Đ¾I

LU ÂN ÁN TI¾N SĨ HÓA HàC Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số: 9 44 01 18

NG¯âI H¯àNG DÀN KHOA HàC PGS TS D°¢ng Hßng Anh PGS TS Ngô Quốc Anh

Hà Nßi - 2023

LâI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận án này là công trình nghiên

c ứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất Đồng

th ời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào Các số liệu,

k ết quả nêu trong luận án là trung thực, nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Tác giÁ luÃn án

NCS Đinh Thß HuyÁn Trang

LâI CÀM ¡N

LuÁn án này đ°ÿc hoàn thành t¿i Phòng thí nghiám trãng điểm Công nghá phân tích phāc vā Kiểm đánh môi tr°ång và an toàn thực phẩm - Tr°ång Đ¿i hãc Khoa hãc tự nhiên - Đ¿i hãc Quác gia Hà Nái, Vián Hóa sinh biển - Vián Hàn lâm Khoa hãc & Công nghá Viát Nam và Tr°ång Đ¿i hãc Vinh Trong quá trình nghiên cąu, tác giÁ đã nhÁn đ°ÿc sự giúp đỡ quý báu căa các thÅy cô, các nhà khoa hãc, các đßng nghiáp, b¿n bè và gia đình

Tôi xin bày tß låi cÁm ¢n sâu sÃc, sự cÁm phāc và kính trãng nhÃt tãi PGS

TS D°¢ng Hßng Anh và PGS TS Ngô Quác Anh đã đánh h°ãng, tÁn tâm h°ãng

d¿n khoa hãc, đáng viên và t¿o mãi điều kián thuÁn lÿi cho tôi trong suát thåi gian thực hián luÁn án

Tôi xin trân trãng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Hãc vián Khoa hãc và Công nghá, đßng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Vián Hóa hãc cùng tÁp thể cán bá căa Vián đã quan tâm, giúp đỡ và t¿o mãi điều kián thuÁn lÿi cho tôi trong suát quá trình hãc tÁp và nghiên

cąu

Tôi xin chân thành cÁm ¢n tÁp thể phòng Nghiên cąu cÃu trúc - Vián Hóa sinh biển đã t¿o điều kián về thåi gian, c¢ sç vÁt chÃt, trang thiÁt bá hián đ¿i cho tôi thực hián luÁn án

Tôi xin trân trãng cÁm ¢n ban lãnh đ¿o Tr°ång Đ¿i hãc Vinh đặc biát là các thÅy cô Khoa Hóa hãc - Tr°ång s° ph¿m - Tr°ång Đ¿i hãc Vinh đã quan tâm giúp

đỡ, đóng góp các ý kiÁn quý báu để tôi hoàn thành luÁn án

Tôi xin chân thành cÁm ¢n Phòng thí nghiám trãng điểm cÃp Đ¿i hãc quác gia <Công nghá phân tích phāc vā kiểm đánh môi tr°ång và an toàn thực phẩm= KLATEFOS đặc biát là GS TS Ph¿m Hùng Viát đã đóng góp cho tôi nhāng kiÁn thąc quý báu và t¿o điều kián thuÁn lÿi cho tôi thực hián đề tài này

Tôi xin bày tß lòng biÁt ¢n chân thành và sâu sÃc nhÃt tãi toàn thể gia đình, b¿n bè và nhāng ng°åi thân đã luôn luôn quan tâm, khích lá, đáng viên tôi trong suát quá trình hãc tÁp và nghiên cąu Xin trân trãng cÁm ¢n!

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Tác giÁ luÃn án

NCS Đinh Thß HuyÁn Trang

MĀC LĀC

LäI CAM ĐOAN i

LäI CÀM ¡N ii

MĀC LĀC iii

DANH MĀC BÀNG vi

DANH MĀC HÌNH viii

DANH MĀC CÁC CHĀ VIÀT TÂT xi

Mæ ĐÄU 1

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN 3

1.1.Giãi thiáu s¢ l°ÿc về chi Pandanus 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái chung căa chi Pandanus 3

1.1.2 Chi Pandanus ç Viát Nam và s¢ bá về phân bá các loài 4

1.1.3 Giãi thiáu về loài Pandanus tonkinensis Martelli ex B.C Stone 8

1.1.4 Tình hình nghiên cąu về thành phÅn hóa hãc căa chi Pandanus 8

1.1.5 Các nghiên cąu về ho¿t tính sinh hãc căa dách chiÁt và các chÃt phân lÁp từ chi Pandanus 15

1.2 Các ph°¢ng pháp hóa lý dùng để chiÁt tách, phân lÁp, xác đánh cÃu trúc các chÃt tinh khiÁt từ d°ÿc liáu 16

1.2.1 Ph°¢ng pháp chiÁt m¿u thực vÁt 16

1.2.2 Ph°¢ng pháp phân lÁp các chÃt tinh khiÁt 17

1.2.3 Các ph°¢ng pháp phân tích xác đánh cÃu trúc các chÃt phân lÁp đ°ÿc 17

1.3 Đánh giá ho¿t tính sinh hãc theo đánh h°ãng bÁo vá gan 18

1.3.1 Viêm và mát sá yÁu tá quan trãng trong phÁn ąng viêm 19

1.3.2 S¢ l°ÿc về ho¿t tính cháng oxy hóa 20

1.4 ChÃt đánh dÃu hóa hãc và ph°¢ng pháp lựa chãn chÃt đánh dÃu hóa hãc căa d°ÿc liáu 21

1.5 Tóm tÃt các vÃn đề đề tài luÁn án cÅn giÁi quyÁt 22

CH¯¡NG 2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 23

2.1 Đái t°ÿng nghiên cąu 23

2.2 Hóa chÃt, dāng cā và thiÁt bá nghiên cąu 23

2.2.1 Hóa chÃt , dāng cā 23

2.2.2 ThiÁt bá nghiên cąu 24

2.3 Ph°¢ng pháp nghiên cąu 25

2.3.1 Xÿ lí m¿u 25

2.3.2 ChiÁt xuÃt d°ÿc liáu 25

2.3.3 Ph°¢ng pháp phân lÁp các hÿp chÃt 26

2.3.4 Ph°¢ng pháp xác đánh cÃu trúc 26

2.3.5 Ph°¢ng pháp đánh giá ho¿t tính sinh hãc 27

2.3.6 Ph°¢ng pháp lựa chãn, chiÁt xuÃt- tinh chÁ chÃt đánh dÃu, xây dựng và thẩm đánh quy trình phân tích đánh l°ÿng chÃt đánh dÃu 29

2.4 Phân lÁp các hÿp chÃt 30

2.4.1 Phân lÁp các hÿp chÃt từ quÁ loài Pandanus tonkinensis 30

2.4.2 Phân lÁp các hÿp chÃt từ rß loài Pandanus tonkinensis 33

CH¯¡NG 3 KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN 35

3.1 Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ và rß loài Pandanus tonkinensis 35

3.1.1 Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ loài Pandanus tonkinensis 35

3.1.2 Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ rß loài Pandanus tonkinensis 36

3.2 Đánh giá ho¿t tính sinh hãc căa các hÿp chÃt phân lÁp đ°ÿc 58

3.2.1 Ho¿t tính kháng viêm căa các chÃt đã phân lÁp thông qua ąc chÁ quá trình sÁn sinh NO trên tÁ bào RAW 264,7 đ°ÿc kích thích bçi LPS 58

3.2.2 Ho¿t tính cháng oxy hóa căa các chÃt đã phân lÁp thông qua ąc chÁ quá trình peroxy hoá lipid màng tÁ bào 59

3.3 ChÃt đánh dÃu (marker) 60

3.3.1 Lựa chãn chÃt đánh dÃu 60

3.3.2 ChiÁt xuÃt, tinh chÁ chÃt đánh dÃu từ d°ÿc liáu 62

3.3.3 Tinh chÁ chÃt đánh dÃu 65

3.3.4 Tóm tÃt qui trình chiÁt xuÃt và tinh chÁ hai chÃt đánh dÃu 66

3.3.5 Xác nhÁn l¿i cÃu trúc và đá tinh khiÁt căa chÃt đánh dÃu 67

3.4 Xây dựng và thẩm đánh quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside và chÃt vladinol F trong loài dąa d¿i Pandanus tonkinensis 81

3.4.1 KhÁo sát quy trình xÿ lý m¿u tr°ãc khi phân tích đánh l°ÿng chÃt đánh dÃu

81

3.4.2 Quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside và chÃt vladinol F trong d°ÿc liáu dąa d¿i Pandanus tonkinensis 84

3.4.3 Thẩm đánh quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside và chÃt vladinol F trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis 85

3.5 Giãi h¿n phát hián và giãi h¿n đánh l°ÿng căa ph°¢ng pháp 93

3.6 Đánh l°ÿng pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6) trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis thu thÁp ç 1 sá đáa ph°¢ng 95

KÀT LUÀN 97

NHĀNG ĐÓNG GÓP MâI CĂA LUÀN ÁN 99

KIÀN NGHà 100

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐÀN LUÀN ÁN 101

TÀI LIàU THAM KHÀO 102

DANH MĀC BÀNG

B ảng 1.1 Tóm tÃt các thông tin c¢ bÁn các loài thuác chi Pandanus 4

ç Viát Nam hián nay 4

B ảng 1.2 Các hÿp chÃt alkaloids phân lÁp từ loài Pandanus amaryllifolius 9

B ảng 1.3 Các hÿp chÃt carotenoid phân lÁp từ loài Pandanus tectorius 11

B ảng 1.4 Các hÿp chÃt terpenoid phân lÁp từ chi Pandanus 11

B ảng 1.5 Các hÿp chÃt d¿n xuÃt carboxylic acid từ chi Pandanus 12

B ảng 1.6 Lignan và các hÿp chÃt khác từ chi Pandanus 13

B ảng 3.1 Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT10 và chÃt so sánh (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9- propanediol-1-O-³-D-glucopyra noside 42

B ảng 3.2 Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT25 và chÃt so sánh cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6’-O-³-L-arabinofuranosyl)-³-D-glucopyranoside 48

B ảng 3.3 Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT26 và chÃt so sánh [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol ³-D-apiofuranosyl(146)-³-D-glucopyranoside 54

B ảng 3.4 Ho¿t tính ąc chÁ sÁn sinh NO căa các chÃt phân lÁp từ dąa d¿i Pandanus tonkinensis 59

B ảng 3.5 Ho¿t tính ąc chÁ peroxy hóa lipid màng tÁ bào căa các chÃt phân lÁp từ dąa d¿i Pandanus tonkinensis 60

B ảng 3.6 Ch°¢ng trình pha đáng acid formic 0,1% / acetonitrile&&&&&& 61 B ảng 3.7 Ch°¢ng trình pha đáng acid formic 0,1% / acetonitrile& &&&&&63 B ảng 3.8 Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt PT2B1A và chÃt so sánh pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside 69

B ảng 3.9 Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt PT2D1A và chÃt so sánh vladinol F 75 B ảng 3.10 KÁt quÁ xác đánh đá tinh khiÁt căa hÿp chÃt PT20 - pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside 80

B ảng 3.11 KÁt quÁ xác đánh đá tinh khiÁt căa hÿp chÃt PT6 3 vladinol F 81

B ảng 3.12 KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong Dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng ethanol 50% 82

B ảng 3.13 KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng methanol 50% 83

B ảng 3.14 KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng ethanol 50% và methanol 50% 83

B ảng 3.15 Ch°¢ng trình pha đáng đánh l°ÿng PT20 và PT6 trong d°ÿc liáu dąa

d¿i Pandanus tonkinensis 84

B ảng 3.16 So sánh thåi gian l°u căa các pic trên sÃc ký đß căa dung dách chuẩn

hßn hÿp, dung dách thÿ và m¿u trÃng 86

B ảng 3.17 KÁt quÁ pic PT20, PT6 thu đ°ÿc trên sÃc ký đß dung dách chuẩn hßn

hÿp (1) và dung dách chuẩn hßn hÿp (2) 88

B ảng 3.18 KÁt quÁ khÁo sát khoÁng đ°ång chuẩn để đánh l°ÿng PT20 và PT6 90

B ảng 3.19 KÁt quÁ khÁo sát đá lặp l¿i 91

B ảng 3.20 KÁt quÁ khÁo sát đá tái lặp căa ph°¢ng pháp 92

BÁng 3.21 KÁt quÁ đánh giá đá đúng căa ph°¢ng pháp 93

B ảng 3.22 KÁt quÁ đánh l°ÿng pinoresinol 4-O-beta-D-glucopyranoside (PT20)

và vladinol F (PT6) trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis lÃy t¿i mát sá đáa

ph°¢ng 96

DANH MĀC HÌNH

Hình 1.1 Hình Ánh mát sá loài thuác chi Pandanus [12] 8

Hình 2.1 M¿u tiêu bÁn quÁ Pandanus tonkinensis Mart ex B Stone 23

Hình 2.2 S¢ đß phân lÁp các hÿp chÃt từ quÁ Pandanus tonkinensis 32

Hình 2.3 S¢ đß phân lÁp các hÿp chÃt từ rß Pandanus tonkinensis 35

Hình 3.1 CÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt đ°ÿc phân lÁp từ quÁ Pandanus tonkinensis 36

Hình 3.2 CÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt đ°ÿc phân lÁp từ rß Pandanus tonkinensis 39

Hình 3.3 CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT10&&&&& 40

Hình 3.4 Phá ECD đ°ÿc tính toán lý thuyÁt căa 2 đßng phân lÁp thể có thể có và CD thÿ nghiám cho hÿp chÃt PT10 41

Hình 3.5 Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT10 43

Hình 3.6 Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT10 43

Hình 3.7 Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT10 44

Hình 3.8 Phá HMBC căa hÿp chÃt PT10 44

Hình 3.9 Phá HSQC căa hÿp chÃt PT10 45

Hình 3.10 Phá CD căa hÿp chÃt PT10 45

Hình 3.11 CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT25 46

Hình 3.12 Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT25 49

Hình 3.13 Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT25 49

Hình 3.14 Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT25 50

Hình 3.15 Phá HMBC căa hÿp chÃt PT25 50

Hình 3.16 Phá HSQC căa hÿp chÃt PT25 51

Hình 3.17 Phá COSY căa hÿp chÃt PT25 51

Hình 3.18 Phá NOESY căa hÿp chÃt PT25 52

Hình 3.19 CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT26 53

Hình 3.20 Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT26 55

Hình 3.21 Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT26 55

Hình 3.22 Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT26 56

Hình 3.23 Phá HMBC căa hÿp chÃt PT26 56

Hình 3.24 Phá HSQC căa hÿp chÃt PT26 57

Hình 3.25 Phá COSY căa hÿp chÃt PT26 57

Hình 3.26 Phá NOESY căa hÿp chÃt PT26 58

Hình 3.27 SÃc ký đß phân tích s¢ bá m¿u d°ÿc liáu và m¿u d°ÿc liáu thêm chuẩn 62

Hình 3.28 SÃc ký đß các phân đo¿n PT2A-D 64

Hình 3.29 So sánh phá UV căa phân đo¿n PT2B và chÃt PT20, phân đo¿n PT2D và chÃt PT6 65

Hình 3.30 SÃc ký đß HPLC căa phân đo¿n PT2B1 65

Hình 3.31 SÃc ký đß HPLC căa phân đo¿n PT2D1 66

Hình 3.32 S¢ đß chiÁt xuÃt và tinh chÁ chÃt đánh dÃu 67

Hình 3.33 CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT2B1A 68

Hình 3.34 Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT2B1A 70

Hình 3.35 Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT2B1A 70

Hình 3.36 Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT2B1A 71

Hình 3.37 Phá HSQC căa hÿp chÃt PT PT2B1A 71

Hình 3.38 Phá HMBC căa hÿp chÃt PT2B1A 72

Hình 3.39 Phá UV căa hÿp chÃt PT2B1A 72

Hình 3.40 Phá IR căa hÿp chÃt PT2B1A 73

Hình 3.41 CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT2D1A 73

Hình 3.42 Phá HR-ESI- MS căa hÿp chÃt PT2D1A 76

Hình 3.43 Phá 1H- NMR căa hÿp chÃt PT2D1A 76

Hình 3.44 Phá 13C- NMR căa hÿp chÃt PT2D1A 77

Hình 3.45 Phá HSQC căa hÿp chÃt PT2D1A 77

Hình 3.46 Phá HMBC căa hÿp chÃt PT2D1A 78

Hình 3.47 Phá UV căa hÿp chÃt PT2D1A 78

Hình 3.48 Phá IR căa hÿp chÃt PT2D1A 79

Hình 3.49 SÃc ký đß phân tích đá tinh khiÁt căa PT20 m¿u b¢m lÅn 1 80

Hình 3.50 SÃc ký đß phân tích đá tinh khiÁt căa PT6 m¿u b¢m lÅn 1 81

Hình 3.51 SÃc ký đß căa dung dách chuẩn hßn hÿp, 86

dung dách thÿ và m¿u trÃng 86

Hình 3.52 Phá UV căa các tín hiáu PT20, PT6 thu đ°ÿc trong sÃc kí đß m¿u

dung dách chuẩn và m¿u dung dách thÿ 87

Hình 3.53 SÃc ký đß dung dách chuẩn hßn hÿp (1) lÅn b¢m 2 89 Hình 3.54 Các đ°ång chuẩn đánh l°ÿng pinoresinol 4-O-beta-D-

CD Circular dichroism Spectroscopy Phá l°ỡng sÃc tròn

13C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance spectroscopy

Phá cáng h°çng từ h¿t nhân

13C COSY Correlation spectroscopy Phá hai chiều t°¢ng quan 1H

3 1H DEPT Distortionless enhancement by

polarization transfer spectroscopy

Phá DEPT

DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl EMA European Medicines Agency C¢ quan D°ÿc phẩm châu Âu

1H NMR Proton nuclear magnetic resonance

spectroscopy

Phá cáng h°çng từ h¿t nhân proton

HMBC Heteronuclear mutiple bond

Ionization Mass Spectrometry

Phá khái l°ÿng phân giÁi cao phun mù đián tÿ

HSQC Heteronuclear single quantum

correlation

Phá t°¢ng tác dá h¿t nhân nhân 13C 3 1H trực tiÁp qua 1 liên kÁt

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nßng đá ąc chÁ 50% đái

t°ÿng thÿ nghiám ICH International Conference on

Harmonization

Hái nghá quác tÁ về hài hòa hóa các thă tāc đăng ký d°ÿc phẩm sÿ dāng cho con ng°åi

J Coupling constant Hằng sá ghép

Ph°¢ng pháp đánh l°ÿng tÁ bào sáng bằng ph°¢ng pháp

so màu NOESY Nuclear Overhauser Enhancement

Spectroscopy

Phá cáng h°çng từ tăng c°ång do hiáu ąng Nuclear Overhauser

RAW 264.7 Mammalian cell line Dòng tÁ bào đ¿i thực bào

RAW 264.7 RSD Relative Standard Deviation Đá lách chuẩn t°¢ng đái

TLC Thin layer chromatography SÃc ký lãp mßng

USFDA United States Food and Drug

Administration

Cāc d°ÿc phẩm và thực phẩm

Mỹ

WHO World Health Organization Tá chąc Y tÁ thÁ giãi

Mä ĐÄU

Là mát trong nhāng quác gia nằm trong vùng khí hÁu nhiát đãi gió mùa, Viát Nam có há thực vÁt đa d¿ng và phong phú, cây làm thuác chiÁm khoÁng 30% Nhiều công trình nghiên cąu về cây thuác căa há thực vÁt Viát Nam mang l¿i nhiều đóng góp to lãn cho viác bÁo vá sąc khße con ng°åi Loài thực vÁt có tác dāng chāa

bánh cho con ng°åi thì để l¿i ít tác dāng phā h¢n so vãi thuác có ngußn gác táng hÿp Do đó vãi tình tr¿ng ngày càng gia tăng về bánh tÁt nh° tim m¿ch, ung th°, gan&thì viác nghiên cąu về các loài thực vÁt để làm thuác có tính ý nghĩa về khoa hãc và thåi sự [1]

Dąa d¿i (Pandanaceae) là mát hã thực vÁt có hoa có ngußn gác từ vùng nhiát

đãi và cÁn nhiát đãi, phân bá từ Tây Phi đÁn Thái Bình D°¢ng Trong đó Pandanus

là chi lãn và quan trãng nhÃt vãi khoÁng 600 loài, có thể dùng làm ngußn thực phẩm và làm thuác æ Viát Nam, hã Dąa d¿i (Pandanaceae) gßm 23 loài thuác 2 chi

là Freycinetia (3 loài) và Pandanus (20 loài) Theo các tài liáu y hãc cá truyền, có 9 loài thuác chi Pandanus đ°ÿc dùng làm thuác ç Viát Nam, chă yÁu có tác dāng vãi

các bánh về thÁn (lÿi tiểu, chāa sßi thÁn, sßi mÁt, viêm đ°ång tiÁt niáu,&), các bánh

về gan (viêm gan, x¢ gan cá tr°ãng), thanh nhiát, h¿ sát, bánh ngoài da,&[2], [3]

Loài dąa d¿i Pandanus tonkinensis Mart ex B Stone còn gãi là dąa BÃc bá

có mặt từ vùng núi trung du BÃc bá tãi miền Trung, Tây Nguyên, Bình ThuÁn, Long An là mát trong 9 loài nói trên mà đãt non, lá, rß và quÁ có thể dùng làm thuác [2] Trong ch°¢ng trình Khoa hãc công nghá phát triển bền vāng vùng Tây bÃc, đã công bá kÁt quÁ điều tra, nghiên cąu về bài thuác điều trá bánh gan mÁt,

trong đó dách chiÁt n°ãc căa bài thuác vãi hai vá Trąng quác (Stixis suaveolens) và

Dąa d¿i (Pandanus tonkinensis) đã đ°ÿc chąng minh là có hiáu quÁ bÁo vá gan tát, cao h¢n so vãi sylimarin [4] Hián nay ch°a có nghiên cąu nào về thành phÅn hóa hãc và tác dāng d°ÿc lý căa loài dąa d¿i Pandanus tonkinensis [5] Để có đ°ÿc nhāng bằng chąng khoa hãc về thành phÅn, ho¿t tính sinh hãc cũng nh° kiểm soát chÃt l°ÿng d°ÿc liáu và các sÁn phẩm bào chÁ theo h°ãng bÁo vá gan, luÁn án vãi tên đề tài: <Nghiên cąu phân tích thành phÅn, cÃu trúc hóa hãc căa các hÿp chÃt từ

loài Dąa d¿i (Pandanus tonkinensis Mart.ex B.Stone) bằng các ph°¢ng pháp hóa lý

hián đ¿i= đã đ°ÿc đề xuÃt và thực hián

M āc tiêu căa luÃn án:

- Phân tích đ°ÿc thành phÅn, cÃu trúc hóa hãc và ho¿t tính đánh h°ãng bÁo vá gan căa các hÿp chÃt từ loài Pandanus tonkinensis

- Xác đánh đ°ÿc chÃt đánh dÃu từ loài Pandanus tonkinensis theo h°ãng bÁo

vá gan và xây dựng đ°ÿc quy trình phân tích đánh l°ÿng các chÃt đánh dÃu trong

d°ÿc liáu phāc vā viác kiểm soát chÃt l°ÿng và phát triển chÁ phẩm từ d°ÿc liáu này

N ßi dung luÃn án bao gßm:

- Sÿ dāng các kỹ thuÁt tách chiÁt, phân lÁp, các ph°¢ng pháp hóa lý sinh hián đ¿i để phân tích thành phÅn, cÃu trúc hóa hãc và ho¿t tính sinh hãc căa các hÿp chÃt

đ°ÿc phân lÁp từ loài Pandanus tonkinensis

- Lựa chãn chÃt đánh dÃu cho loài Pandanus tonkinensis theo h°ãng bÁo vá

gan; chiÁt xuÃt, tinh chÁ, phân tích kiểm tra đá tinh khiÁt căa chÃt đánh dÃu từ d°ÿc liáu này

- Xây dựng và thẩm đánh quy trình phân tích đánh l°ÿng các chÃt đánh dÃu

trong d°ÿc liáu Pandanus tonkinensis Áp dāng quy trình, phân tích hàm l°ÿng chÃt

đánh dÃu trong d°ÿc liáu thu hái t¿i mát sá đáa ph°¢ng

CH¯¡NG 1 TàNG QUAN 1.1. Giái thiáu s¢ l°ÿc vÁ chi Pandanus

Theo há tháng phân lo¿i thực vÁt có hoa APG IV (2018) [6] đ°ÿc phát triển bçi Angiosperm Phylogeny Group, chi Pandanus có vá trí phân lo¿i nh° sau:

Giãi (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta

nghiên cąu hián nay đã tháng kê đ°ÿc hã này có 5 chi, 982 loài trong đó Pandanus

là chi lãn và quan trãng nhÃt, vãi khoÁng 600 loài, gßm các loài đ°ÿc sÿ dāng làm ngußn thực phẩm quan trãng nh° dąa th¢m (Pandanus amaryllifolius) và dąa julian (Pandanus julianettii); và nhiều loài khác đ°ÿc sÿ dāng làm thuác Đây là mát hã

cá có niên đ¿i từ đÅu đÁn giāa kỷ PhÃn trÃng và đây cũng là mát hã ch°a đ°ÿc

nghiên cąu kỹ đÅy đă [7,8,9,10,11]

Hã Pandanaceae bao gßm cây gß, cây bāi, bāi tr°ån, dây leo, cây thÁo, sáng lâu năm Thân có thể là thân đ¢n hoặc phân nhánh thành các bāi lãn và có thể có rß

cháng trên không Thân có các vÁt sẹo nái rõ do các lá rāng để l¿i Lá đ¢n mãc cách theo hình xoÃn ác, phiÁn lá rÃt dài và hẹp, có bẹ, không cuáng, không chia thùy, có các gân song song; mép lá và gân chính giāa th°ång có gai Cây thuác lo¿i đ¢n tính Cām hoa d¿ng chùm đ¢n hoặc kép, mãc ç đßnh thân hoặc nách lá, hoa th°ång màu trÃng hoặc có thể có màu sÃc rực rỡ Hoa nhß và không có bao hoa Hoa đực chąa nhiều nhá hoa vãi các chß nhá råi hoặc hÿp nhÃt Hoa cái có mát hoa, không có vòi nhāy, th°ång gßm nhiều lá noãn xÁp thành vòng, nh°ng có thể giÁm thành mát hàng lá noãn hoặc mát lá noãn QuÁ mãng hoặc quÁ h¿ch, th°ång gßm nhiều quÁ xÁp sít vãi nhau [7,8,9]

Trên thÁ giãi, hã Pandanaceae bao gßm năm chi: Benstonea, Freycinetia, Martellidendron, Pandanus và Sararanga Benstonea (nh° chi phā "Acrostigma")

và Martellidendron tr°ãc đây đ°ÿc coi là chi phā căa Pandanus, nh°ng đ°ÿc công

nhÁn là các chi riêng biát dựa trên giÁi trình tự DNA [7,8,9]

1.1.2 Chi Pandanus ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố các loài

æ Viát Nam, hã Dąa d¿i (Pandanaceae) gßm 23 loài thuác 2 chi là

Freycinetia (3 loài) và Pandanus (20 loài) [10,11,12] Có 2 loài thuác chi Pandanus

ç Viát Nam đ°ÿc nhÁp trßng làm cÁnh là Pandanus utilis và Pandanus furcatus; 18

loài là cây mãc tự nhiên, trong đó có tãi 8 loài là đặc hāu ç Viát Nam nh° Dąa chót chẻ - P bipollicaris (mãi thÃy ç núi B¿ch Mã 3 Thừa Thiên HuÁ); Dąa nha trang -

P ceratostigma (Nha Trang 3 Khánh Hòa); Dąa sừng - P cornifer (Phú Yên, Khánh Hòa); Dąa nhẵn - P laevis (Nam Bá); Dąa đ¢n - P monodon (Đà Nẵng);

Dąa nhiều chân - P multidrupaceus (Lâm Đßng và Đßng Nai); Dąa gß - P

tectorius (ven biển nhiều tßnh ç Viát Nam) và Dąa BÃc bá - P tonkinensis (mãc rÁi

rác ç các tßnh miền núi phía BÃc tãi Khánh Hòa BÁng 1.1 trình bày về phân bá và

đặc điểm sinh thái căa chi Pandanus ç Viát Nam hián nay

Bảng 1.1 Tóm tÃt các thông tin c¢ bÁn các loài thuác chi Pandanus

ç Viát Nam hián nay

Mãc thành bāi ç vùng núi, trung du

ç đá cao 1.400m

1.200-4 Dąa nhiÁm - P

capusii Mart

Bình D°¢ng (Thă DÅu Mát, Thá Tính, Lái Thiêu), Tây Ninh, thành phá Hß Chí Minh, Đßng Nai (Biên Hòa), còn có ç Thái Lan,

Mãc thành bāi ç vùng núi, trung du, trong rừng, trÁng cß, ven bå sông suái Có

và ven biển, trong trÁng cß, đÅm lÅy

bằng và ven biển

10 Dąa núi - P

humilis Lour

Hà Nam, Ninh Bình, QuÁng Bình, QuÁng Trá, Thừa Thiên HuÁ, Đà Nẵng, QuÁng Nam (Hái Mít), Khánh Hòa (Nha Trang, Ph°ãc Thành), Lâm Đßng (BÁo Lác), Tây Ninh, Đßng Nai (Biên Hòa, BÁo Chánh, TrÁng Bom), Bà Ráa Vũng Tàu (Bà Ráa) Còn có ç Lào, Thái Lan, Campuchia và Malaisia

Mãc thành bāi ç vùng núi đá, trong rừng, ç đá cao 1.000-1.500m

11 Dąa kaida - P

kaida Kurz

Tp Hß Chí Minh, Hà Nái (BÃt B¿t),

Hà Nam (Kim BÁng, Kián Khê)

Còn có ç Campuchia và HÁi Nam

(Trung Quác)

Mãc thành bāi ç vùng núi, trung du, trong rừng, trÁng cß

12 Dąa nhẵn - P

miền núi, trong rừng

Mũi Né), Đßng Nai (Biên Hòa), Bà Ráa 3 Vũng Tàu (Ph°ãc Tuy), Kiên Giang (PhúQuác) Còn có ç Ân Đá, Mianma, Trung Quác, Đài Loan,

NhÁt BÁn, Lào, Campuchia, Thái Lan, Xri Lanca, Malaixia và

Philippin

Mãc thành bāi, ç đßng bằng, ven biển, vùng n°ãc mặn, đÃt

Mãc thành bāi ç vùng núi, trong rừng,

ç đá cao 600 - 1.200

m Mùa hoa quÁ tháng 2 - 5

Bāi cao 1 3 2 m, mãc thành bāi ç vùng núi, trong rừng, ven sông suái, ç đá cao tãi 1.200 m

20 Dąa d¿i - P

utilis Bory

Trßng ç Tp Hß Chí Minh Ngußn gác có l¿ từ Madagasca Bāi thÃp

Dąa nhiÁm- P.capussi Mart Dąa d¿i - P odoratissimus L.f

Dąa gai- P kaida Kurz Dąa gß - P tectorius Parkins

Dąa cam - P affinis Kurz Dąa th¢m 3 P.amaryllifolius Roxb

Hình 1.1 Hình Ánh mát sá loài thuác chi Pandanus [12]

1.1.3 Giới thiệu về loài Pandanus tonkinensis Martelli ex B.C Stone

Tên khoa hãc: Pandanus tonkinensis Martelli ex B.C Stone

Tên thông th°ång: Dąa BÃc bá, dąa gai, dąa gß

Chi: Pandanus

Hã: Pandanaceae

Mô tả về thực vật [11]: Loài P tonkinensis có mát sá tên tiÁng Viát là Dąa

BÃc bá, dąa gai, dąa gß Cây nhß, cao khoÁng từ 1 3 2 m Thân gß nhiều ngÃn ngang, phân nhánh Lá cąng hình dÁi, mãc nhiều ç ngãn thân, dài 0,7 3 0,8 m, ráng

4 cm, đÅu có mũi nhãn sÃc mép, gác thành bẹ to và gân giāa có gai cąng, mặt trên

màu lāc s¿m nóng, mặt d°ãi nh¿t

æ ngãn thân hay k¿ lá cām hoa mãc gßm hoa đực và hoa cái hãp thành bông bao bãc trong mo d¿ng lá ngÃn, sãm rāng, bao hoa có mùi th¢m, hoa cái có mát sá

lá noãn, hoa đực có nhiều nhá

QuÁ phąc to 55 x 50 cm hoặc h¢n, cuáng mÁp khi chín màu vàng QuÁ h¿ch hình trąng ng°ÿc, 17 x10 3 11 mm ç gác và 25 3 27 x 10 mm ç đßnh; nhāy ç giāa,

thẳng đÁn xiên hoặc cong, màu nâu đß, dẹt hoặc gÅn hình trā, dài 4 3 5 mm, đ¢n hoặc h¢i chẻ đôi 1 chút ç đÅu

Sinh thái : Mãc thành bāi ç vùng núi, trong rừng, ç đá cao 600 3 1200 m Công dụng trong y học cổ truyền: Chāa bánh đái rÃt, đái ra sßi., lÿi tiểu Giã

đÃp chāa gãy x°¢ng, lòi dom khi dùng bên ngoài Dùng đãt non để chāa sßi thÁn và kinh phong ç trẻ em

Phân bố : æ các tßnh miền núi hoặc trung du phía BÃc vào đÁn Khánh Hòa

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Pandanus

Đã có nhiều công trình trong và ngoài n°ãc căa các nhà khoa hãc nghiên cąu

về thành phÅn hóa hãc căa các loài thuác chi Pandanus Các nghiên cąu đã chß ra sự

Dąa BÃc Bá - P tonkinensis Mart

có mặt căa các d¿n xuÃt carboxyl acid, carotene, lignan, alkaloids, terpenoid Tuy

nhiên vãi loài Pandanus tonkinensis ch°a có công bá nào về thành phÅn hóa hãc

1.1.4 1 Các hợp chất alkaloids

Nhāng hÿp chÃt có chąa dá vòng nitrogen, có tính base, th°ång gặp trong nhiều lo¿i thực vÁt, đôi khi còn tìm thÃy trong mát vài đáng vÁt đ°ÿc gãi là alkaloids Có mát sá ít alkaloids ngoài hÿp chÃt dá vòng có nguyên tÿ nitrogen nằm

ç ngoài vòng (nh° hordenin, colchixin, &) Đái vãi c¢ thể ng°åi và đáng vÁt, nhÃt

là đái vãi há thÅn kinh thì alkaloids có tính chÃt ho¿t đáng sinh lý cao Là lo¿i thuác đặc hiáu nÁu là l°ÿng nhß, phù hÿp nh°ng nó là chÃt đác gây chÁt ng°åi nÁu là mát

l°ÿng lãn Từ lá, rß, cây loài Pandanus amaryllifolius [13-21] đã tìm thÃy các hÿp

chÃt alkaloids nh° liát kê trong bÁng 1.2

B ảng 1.2 Các hÿp chÃt alkaloids phân lÁp từ loài Pandanus amaryllifolius

ç pha n°ãc hoặc hòa tan trong m¿u Trong mát sá hoa màu vàng, da cam, đß căa nhiều lo¿i vi sinh vÁt thì chúng là nhāng chÃt màu chính Từ quÁ loài Pandanus tectorius, nhóm tác giÁ Lois Englberger [22] đã tìm thÃy các hÿp chÃt carotenoid nh° trong bÁng 1.3

Bảng 1.3 Các hÿp chÃt carotenoid phân lÁp từ loài Pandanus tectorius

Pandanus tectorius [23,24], Pandanus boninensis [25] và Pandanus simplex [26]

Bảng 1.4 Các hÿp chÃt terpenoid phân lÁp từ chi Pandanus

59 (+)-Dehydrovomifoliol Cây Pandanus simplex [26]

1.1.4.4 Các hợp chất dẫn xuất carboxylic acid

Khi thay thÁ nhóm - OH căa acid carboxylic bằng nhāng nhóm thÁ khác nhau thu đ°ÿc các d¿n xuÃt ç nhóm chąc căa acid carboxylic BÁng 1.5 liát kê các d¿n xuÃt

căa acid carboxylic đã tìm đ°ÿc từ các loài Pandanus tectorius [22,24], Pandanus amaryllifolius [27,31,32], Pandanus odoratissimus [28], Pandanus kaida Kurz [29]

Bảng 1.5 Các hÿp chÃt d¿n xuÃt carboxylic acid từ chi Pandanus

ph Ãn

62 Benzyl salicylate QuÁ Pandanus tectorius [24]

64 Isopentenyl acetate QuÁ Pandanus tectorius [24]

65 Dimethylallyl acetate QuÁ Pandanus tectorius [24]

68 4-hydroxybenzoic acid Rß Pandanus amaryllifolius [27]

72 Methyl caffeate QuÁ Pandanus kaida Kurz [29]

74 Acid cinnamic Cây Pandanus amaryllifolius [30]

75 Acid ferulic Cây Pandanus amaryllifolius [30]

76 3,4 Dihydroxybenzoic acid Lá Pandanus amaryllifolius [31]

77 Acid p coumaric Lá Pandanus amaryllifolius [32]

1.1.4.5 Các hợp chất khác

Ngoài alkaloids và terpenoid, từ các loài thuác chi Pandanus ng°åi ta đã tách

đ°ÿc mát sá hÿp chÃt lignan /neolignan, vitamin, sterol và các hÿp chÃt khác [16,

23, 24, 26-29, 31, 33-36] nh° liát kê trong bÁng 1.6

Bảng 1.6 Lignan và các hÿp chÃt khác từ chi Pandanus

TL

TK

85 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)phenol Lá Pandanus amaryllifolius [16]

88

3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)tetrahydrofuran

Rß Pandanus odoratissimus [28]

91 (±)-Divanillyltetrahydrofuran QuÁ Pandanus kaida Kurz [27]

93 (+)-Syringaresinol QuÁ Pandanus kaida Kurz [29]

95 (+)-Isolariciresinol QuÁ Pandanus kaida Kurz [29]

96 (-) Secoisolariciresinol QuÁ Pandanus kaida Kurz [29]

hydroxycoumarin)

107 (S)-2,3- dihydroluteolin QuÁ Pandanus tectorius [33]

108

2,3-bis-(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-3-metoxypropanol

QuÁ Pandanus tectorius [33]

110 P-hydroxycinamalde Hyde QuÁ Pandanus tectorius [33]

111 1-O-(28-hydroxyoctacosanoyl)

glycerol

QuÁ Pandanus tectorius [33]

112 Methyl-d-fructopyranoside QuÁ Pandanus tectorius [33]

Thân Pandanus tectorius [36]

1.1.5 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của dịch chiết và các chất phân lập

từ chi Pandanus

Các công trình nghiên cąu về nhāng hÿp chÃt phân lÁp từ chi Pandanus đã

chß ra các hÿp chÃt có khÁ năng kháng khuẩn, cháng ung th°, cháng oxy hóa và cháng viêm Cā thể nh° sau:

1.1.5.1 Kh ả năng kháng khuẩn

Năm 2008 từ lá Pandanus tectorius Soland Mario A Tan và cáng sự đã

công bá kÁt quÁ phân lÁp đ°ÿc các hÿp chÃt: hßn hÿp stigmasterol, ³-sitosterol, 24,24-dimethyl-5³-tirucall-9, squalene, 25-dien-3-one Qua thí nghiám 24,24-dimethyl-5³-tirucall-9, 25-dien-3-one có tác dāng ąc chÁ sinh tr°çng

Mycobacterium tuberculosis – vi khuẩn lao H37Rv vãi MIC 64 µg/ml; trong khi

squalene và stigmasterol, ³-sitosterol có MIC lÅn l°ÿt 100 và 128 µg/ml [21] Cao chiÁt methanol căa rß non và lá loài Pandanus tectorius thể hián ho¿t tính ąc chÁ tát vãi sự phát triển căa chăng vi sinh vÁt Gram (+) Bacillus subtilis và

Staphylococcus aureus vãi giá trá IC50 lÅn l°ÿt là 40,73 µg/ml và 88,47µg/ml, đái vãi rß non 26,0 µg/ml và 80,0 µg/ml đái vãi lá [35]

1.1.5.2 Tác dụng hạ đường huyết

Từ cao ethanol căa lá cây dąa Pandanus amaryfollius, Sasidharan S công bá

có sự có mặt căa flavonoid, saponin, alkaloid và tannin; cao có hiáu quÁ h¿ đ°ång huyÁt khi thÿ nghiám mô hình chuát bá tiểu đ°ång do streptozotocin [37] Từ dách chiÁt ethyl acetate căa quÁ Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi t¿i Viát Nam, các tác giÁ đã phân lÁp đ°ÿc 16 hÿp chÃt thuác các nhóm furanocoumarin, lignan/neolignan, flavonoids, phenolics, monoglyceride và monosaccharide 14/16

chÃt phân lÁp đ°ÿc thể hián ho¿t tính ąc chÁ alpha-glucosidase tát h¢n chÃt chuẩn tham chiÁu acarbose [33]

1.1.5.3 Kh ả năng chống ung thư

Gunti Gowtham Raj đã tiÁn hành nghiên cąu ho¿t tính cháng ung th° căa dách chiÁt n°ãc từ rß và lá căa loài Pandanus Odoratissimus f ferreus (Y Kimura)

sÿ dāng mô hình in vitro cytotoxic và sàng lãc antimitotic Các kÁt quÁ cho thÃy dách chiÁt n°ãc căa rß và lá Pandanus odoratissimus thể hián ho¿t tính cytotoxic

và antimitotic h¢n so vãi chuẩn so sánh podophyllotoxin, cyclophosphamide [40]

1.1.5.4 Ho ạt tính chống oxy hóa

Từ rß căa Pandanus odoratissimus, Ting Ting Jong đã phân lÁp đ°ÿc pinoresinol có ho¿t tính cháng oxy hóa trung bình, 3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxy-benzyl)-tetrahydrofuran có ho¿t tính cháng oxy hóa m¿nh t°¢ng đ°¢ng BHA [28] Theo các nghiên cąu căa Viát Nam, mát sá hÿp chÃt lignan nh° secoisolariciresinol,

(+)-pinoresinol và (+)-medioresinol đ°ÿc tách từ phân đo¿n chiÁt bằng cloroform

từ quÁ dąa kaida (Pandanus kaida) và dąa gß (Pandanus odoratissimus) là nhāng chÃt có ho¿t tính cháng oxy hóa [29]

1.1.5.5 Ho ạt tính kháng viêm

Năm 2015 Ramesh Londonkar đã công bá kÁt quÁ nghiên cąu ho¿t tính cháng viêm căa dách chiÁt methanol lá loài Pandanus odoratissimus Dách chiÁt methanol căa lá Pandanus odoratissimus liều 100µg/kg thể hián tác dāng cháng viêm đáng kể, đ¿t đßnh sau 3 giå, giÁm mąc đá phù bàn chân chuát là 64,2% trong

mô hình gây viêm m¿n bằng formalin, 68% trong mô hình gây viêm cÃp bằng carageenan [39]

1.1.5.6 Tác dụng bảo vệ gan trên mô hình in vivo

Garima Mishra và các cáng sự tiÁn hành nghiên cąu tác dāng bÁo vá gan căa dách chiÁt ethanol căa rß loài Pandanus odoratissimus trên mô hình chuát gây tán th°¢ng gan bằng paracetamol ç liều 200 và 400 mg/kg làm giÁm có ý nghĩa (p < 0,05) SGOT, SGPT, ALP, bilirubin và triglycerides [38] Các tác giÁ đã công bá cao

toàn phÅn và phân đo¿n ethylacetate căa quÁ loài Pandanus odoratissimus (ç liều

7,2 mg/kg và 14,4 mg/kg) có tác dāng bÁo vá gan và phāc hßi th°¢ng tán gan (t°¢ng đ°¢ng vãi silymarin 70 mg/kg) trên mô hình đáng vÁt gây th°¢ng tán gan bằng paracetamol [41]

Nghiên cąu căa các tác giÁ t¿i Đ¿i hãc quác gia Hà Nái và Vián Hóa hãc, Vián Hàn lâm KH &CN VN [4] về dách chiÁt n°ãc bài thuác dân gian gßm 2 vá

Stixis suaveolens và Pandanus tonkinensis trên mô hình in vitro cũng nh° in vivo đã chąng minh tác dāng bÁo vá gan căa dách chiÁt này Liều uáng cao nhÃt căa dách chiÁt n°ãc t°¢ng đ°¢ng 29,6 g/kg không gây đác cÃp Nghiên cąu mô bánh hãc cho thÃy sÿ dāng dách chiÁt n°ãc có tác dāng bÁo vá gan khßi tác h¿i do CCl4 gây ra ç chuát Dách chiÁt n°ãc làm giÁm đáng kể nßng đá men ALT và AST, nßng đá MDA, TNF-³ và IFN-´ ç chuát bá gây đác bçi CCl4 so vãi nhóm bánh đái chąng

1.2 Các ph°¢ng pháp hóa lý dùng để chi¿t tách, phân lÃp, xác đßnh cÃu trúc các chÃt tinh khi¿t tć d°ÿc liáu

Để xác đánh cÃu trúc các hÿp chÃt tinh khiÁt từ d°ÿc liáu tr°ãc hÁt cÅn tách chiÁt m¿u TiÁp theo phân lÁp tách riêng các hÿp chÃt tinh khiÁt ra khßi hßn hÿp bằng các ph°¢ng pháp sÃc ký

1.2 1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

ChiÁt bằng dung môi là mát kỹ thuÁt đáng tin cÁy đã đ°ÿc ghi nhÁn từ lâu đåi Nó đ°ÿc sÿ dāng nh° mát kỹ thuÁt chuẩn bá m¿u trong đó các chÃt tan đ°ÿc lÃy

ra khßi các mô thực vÁt bằng dung môi

Trong nghiên cąu này s¿ sÿ dāng ph°¢ng pháp chiÁt vãi sự hß trÿ căa siêu

âm để chiÁt d°ÿc liáu và dung môi sÿ dāng là methanol

1.2 2 Phương pháp phân lập các chất tinh khiết

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

SÃc ký lãp mßng (TLC) là mát kỹ thuÁt tách các chÃt đ°ÿc thực hián trên mát tÃm TLC đ°ÿc t¿o thành từ chÃt rÃn không phÁn ąng đ°ÿc phă mát lãp vÁt liáu hÃp phā mßng (pha tĩnh) M¿u đ°ÿc đặt trên tÃm TLC, đ°ÿc rÿa giÁi bằng dung môi hoặc hßn hÿp dung môi (pha đáng) Dung môi này sau đó di chuyển lên tÃm TLC thông qua ho¿t đáng mao d¿n Các hÿp chÃt khác nhau di chuyển lên tÃm TLC

vãi tác đá khác nhau và bá tách ra TLC nhanh chóng, đ¢n giÁn và có đá nh¿y cao

vãi chi phí t°¢ng đái thÃp

Phương pháp sắc ký cột (CC)

Kỹ thuÁt này đ°ÿc áp dāng ráng rãi vì nhiều chÃt hÃp phā khác nhau (pha th°ång, pha đÁo hoặc các chÃt khác) có thể đ°ÿc sÿ dāng vãi nhiều lo¿i dung môi SÃc ký cát là chi phí t°¢ng đái thÃp và ngăn ngừa ô nhißm chéo và suy thoái pha tĩnh do tái chÁ SÃc ký cát có thể đ°ÿc thực hián bằng cách sÿ dāng trãng lực để di chuyển dung môi hoặc sÿ dāng khí nén để đẩy dung môi qua cát

S ắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

SÃc ký lßng hiáu năng cao (HPLC) là mát kỹ thuÁt trong hóa hãc phân tích đ°ÿc dùng để tách, xác đánh và đánh l°ÿng các thành phÅn cā thể trong hßn hÿp Các hßn hÿp này có thể có ngußn gác từ thực phẩm, hóa chÃt, d°ÿc phẩm[1], sinh hãc, môi tr°ång và nông nghiáp, v.v., đã đ°ÿc hòa tan thành dung dách lßng Nó dựa vào máy b¢m áp suÃt cao, cung cÃp hßn hÿp các dung môi khác nhau, đ°ÿc gãi

là pha đáng, chÁy qua há tháng, thu thÁp hßn hÿp m¿u trên đ°ång đi, đ°a nó vào mát hình trā, gãi là cát, chąa đÅy các h¿t rÃn, đ°ÿc làm bằng chÃt hÃp phā gãi là pha tĩnh ĐÅu ra căa máy dò là mát biểu đß, đ°ÿc gãi là sÃc ký đß, hiển thá các đßnh, mßi đßnh đ¿i dián cho mát thành phÅn căa m¿u, xuÃt hián theo thåi gian t°¢ng ąng, đ°ÿc gãi là thåi gian l°u giā, có dián tích tỷ lá vãi hàm l°ÿng căa nó

So vãi ph°¢ng pháp sÃc ký cát, sÃc ký lßng hiáu năng cao điều chÁ có khÁ năng phân tách, tinh chÁ chÃt tát h¢n

1.2 3 Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập được

1.2.3.1 Ph ổ khối lượng (MS)

Phá khái là biểu đß biểu dißn c°ång đá so vãi tỷ lá khái l°ÿng trên đián tích (m/z) trong m¿u hóa hãc, th°ång thu đ°ÿc bằng cách sÿ dāng mát dāng cā gãi là máy quang phá khái Không phÁi tÃt cÁ khái phá căa mát chÃt nhÃt đánh đều giáng nhau; ví dā, mát sá máy quang phá khái phá vỡ các phân tÿ phân tích thành các

mÁnh; nhāng ng°åi khác quan sát khái l°ÿng phân tÿ nguyên vẹn vãi ít sự phân mÁnh Phá khái có thể biểu thá nhiều lo¿i thông tin khác nhau dựa trên lo¿i máy đo khái phá và thí nghiám cā thể đ°ÿc áp dāng

1.2.3.2 Ph ổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Ph ổ proton 1 H-NMR: Sá l°ÿng các hÃp thu khác nhau cho biÁt có bao nhiêu lo¿i proton trong phân tÿ Đá chuyển dách hóa hãc căa proton trong khoÁng 0-14 ppm Đá chuyển dách căa proton cho biÁt proton gÃn vào nguyên tÿ nào ( C, O, H&) Sự tách mũi tín hiáu cho biÁt có bao nhiêu proton hián dián kề bên proton khÁo sát Hằng sá ghép đ°ÿc tính bằng khoÁng cách giāa các pic doublet, triplet và quartet rßi nhân vãi tÅn sá máy theo công thąc 1.2 J (Hz) = (·1- ·2) þmáy

Ph ổ 13 C-NMR: Cung cÃp thông tin trực tiÁp bá khung cacbon căa phân tÿ, sá nguyên tÿ cacbon, nhóm chąc trong phân tÿ Đá chuyển dách căa cacbon trong khoÁng 1- 220ppm Chiều cao căa pic tỷ lá thuÁn vãi sá nguyên tÿ cacbon t°¢ng đ°¢ng

Ph ổ DEPT: Xác đánh bÁc căa nguyên tÿ cacbon Phá DEPT-90 cho các pic

h°ãng lên căa CH, phá DEPT-135 cho thÃy các pic h°ãng lên căa CH và CH3, đßng thåi các pic h°ãng xuáng căa CH2

Ph ổ HSQC: Các t°¢ng tác trực tiÁp 1H và 13C giúp ta gán đ°ÿc đá dách chuyển hóa hãc căa cacbon vãi proton t°¢ng ąng

Ph ổ HMBC: Sự t°¢ng quanthông qua sự kÁt nái đá dách chuyển hóa hãc 1H

và 13C - NMR qua hai, ba liên kÁt giúp xác đánh gián tiÁp t°¢ng quan cacbon- cacbon và các t°¢ng quan giāa cacbon bÁc 4 vãi proton xung quanh

Ph ổ COSY: Các nguyên tÿ H ghép cặp vãi nhau dựa trên kÁt quÁ phá 1NMR giúp xác đánh các nguyên tÿ H ghép cặp này căa mát cacbon hay các H ghép cặp này căa hai cacbon ç gÅn nhau

H-Ph ổ NOESY: Cho thÃy các t°¢ng tác không gian bên trong phân tÿ

1.2.3.3 Ph ổ lưỡng sắc tròn

L°ỡng sÃc tròn (CD) là l°ỡng sÃc liên quan đÁn ánh sáng phân cực tròn, tąc

là sự hÃp thā vi sai căa ánh sáng thuÁn tay trái và tay phÁi Ánh sáng phân cực tròn bên trái (LHC) và ánh sáng phân cực tròn bên phÁi (RHC) biểu thá hai tr¿ng thái đáng l°ÿng góc quay có thể có căa mát photon, và do đó l°ỡng sÃc tròn còn đ°ÿc

gãi là l°ỡng sÃc cho xung l°ÿng góc quay

1.3 Đánh giá ho¿t tính sinh hác theo đßnh h°áng bÁo vá gan

Là mát trong nhāng c¢ quan lãn nhÃt căa c¢ thể gan đÁm nhÁn nhāng chąc năng quan trãng nh°: sÁn xuÃt ra nhiều chÃt cÅn thiÁt, biÁn đái thąc ăn thành nhāng chÃt quan trãng cho sự sáng và phát triển; giÁi đác và bài tiÁt các chÃt đác trong c¢

thể Rái lo¿n chąc năng gan, tăng men gan, viêm gan, áp xe gan, x¢ gan và ung th° gan là nhāng bánh lý th°ång gặp về gan æ Viát Nam ng°åi mÃc bánh gan có xu h°ãng ngày càng tăng v°ÿt ng°ỡng cho phép căa Tá chąc Y tÁ ThÁ Giãi

Mô hình thÿ nghiám in vitro đ°ÿc sÿ dāng để sàng lãc tác dāng bÁo vá gan

căa loài Pandanus tonkinensis Trong luÁn án này, ho¿t tính kháng viêm và ho¿t tính cháng oxy hóa là hai ho¿t tính sinh hãc đ°ÿc sÿ dāng để sàng lãc các chÃt theo đánh h°ãng bÁo vá gan [42-44]

1.3 1 Viêm và một số yếu tố quan trọng trong phản ứng viêm

Tình tr¿ng viêm th°ång xÁy ra khi các vi sinh vÁt truyền nhißm nh° vi khuẩn, vi rút hoặc nÃm xâm nhÁp c¢ thể, c° trú trong các mô cā thể và/ hoặc l°u thông trong máu [45 3 47] Để đáp ąng quá trình tán th°¢ng thì tình tr¿ng viêm cũng có thể xÁy ra [45, 47 3 52] ChÃt cháng viêm và chÃt trung gian gây viêm là hai lo¿i chính gây viêm ChÃt interleukin (IL)-12 là chÃt trung gian vừa có đặc tính gây viêm và cháng viêm [54] Trong sá các chÃt trung gian gây viêm và con đ°ång

tÁ bào đã đ°ÿc nghiên cąu ráng rãi liên quan đÁn tình tr¿ng bánh lý ç ng°åi là các cytokine, chemokine, eicosanoids, » B

YÁu tá ho¿i tÿ khái u (TNF)-³ là mát cytokine tiền viêm quan trãng đ°ÿc tiÁt

ra từ các tÁ bào khác nhau và gây ra nhiều tác dāng cho tÁ bào [55,56] TNF-³ có liên quan đÁn nhiều tình tr¿ng bánh tÁt ç ng°åi, bao gßm các bánh mißn dách và viêm nhißm, ung th°, rái lo¿n tâm thÅn, trong sá nhāng bánh khác Mát cytokine khác chă yÁu thực hián ho¿t đáng gây viêm là IL-1³ [57,58] Nó kích thích sự tiÁt ra các cytokine tiền viêm nh° IL-1³ và TNF-³ [57,58] Tuy nhiên, IL-1³ cũng có liên quan đÁn ho¿t đáng cháng viêm T°¢ng tự nh° IL-1³, IL-6 th°ång ho¿t đáng nh° mát cytokine gây viêm nh°ng nó cũng có mát sá tác dāng cháng viêm Hã cytokine IL-12 (bao gßm IL-12, IL-23, IL-27 và IL-35) có cÁ chąc năng gây viêm và kháng viêm [54,59,60] Mặt khác, IL-10 là mát cytokine cháng viêm m¿nh, ho¿t đáng căa

nó cÁn trç ho¿t đáng căa nhiều chÃt trung gian gây viêm [61363] Bằng cách làm suy yÁu và kiểm soát phÁn ąng viêm, IL-10 giúp duy trì cân bằng nái môi mô và làm giÁm tán th°¢ng có thể xÁy ra do phÁn ąng viêm quá mąc [61363]

Prostaglandin (PG) E2 là PG đ°ÿc nghiên cąu nhiều nhÃt liên quan đÁn tình tr¿ng sinh lý và bánh lý căa con ng°åi [64] Nó có nhiều vai trò sinh lý khác nhau bao gßm điều chßnh nhiát đá c¢ thể bình th°ång, tính toàn vẹn căa niêm m¿c d¿ dày, l°u l°ÿng máu đÁn thÁn và chąc năng căa há tháng sinh sÁn nā Mặt khác, nhāng thay đái trong ho¿t đáng PGE2 có liên quan đÁn các tình tr¿ng bánh lý nh° bánh viêm nhißm, thay đái nhiát đá c¢ thể bÃt th°ång, ung th° đ¿i trực tràng, trong

sá nhāng bánh khác Con đ°ång táng hÿp PG bÃt đÅu bằng viác t¿o ra axit

arachidonic từ phospholipid màng tÁ bào bçi phospholipase A2(PLA2) Sau đó, axit arachidonic đ°ÿc chuyển đái thành PG nhå enzyme cycloogygenase (COX) [64] Trong sá ba đßng d¿ng COX đã biÁt (COX-1, COX-2 và COX-3), enzyme cÁm ąng COX-2 đ°ÿc công nhÁn là ho¿t đáng m¿nh nhÃt trong quá trình viêm Leukotrienes (LTs) nh° LTB4 cũng có liên quan đÁn tình tr¿ng bánh tÁt ç ng°åi bao gßm viêm nhißm, hen suyßn và trÅm cÁm [65367] LTs đ°ÿc sÁn xuÃt bçi enzyme 5-lipooxygenase (5-LOX) [68] Mát lo¿i enzyme khác có liên quan nhiều đÁn tình tr¿ng viêm nhißm là nitric oxide synthase (NOS) t¿o ra oxit nitric (NO) [68] T°¢ng

tự nh° COX-2, NOS cÁm ąng (iNOS) là đßng d¿ng NOS gây viêm nhiều nhÃt YÁu

tá h¿t nhân căa yÁu tá phiên mã » B (NF»B) là yÁu tá điều chßnh nái bÁt các phÁn ąng mißn dách và viêm và có liên quan nhiều đÁn sinh lý bánh ung th° [69371] æ đáng vÁt có vú, bá máy NF»B bao gßm mát sá thành viên (ví dā: p50 và p65) điều chßnh cÁ quá trình sinh lý và bánh lý [69,70] æ điều kián không ho¿t đáng (không

bá kích thích), NF»B c° trú trong tÁ bào chÃt [70] Sau khi đ°ÿc kích ho¿t bçi các kích thích truyền nhißm/viêm/giÁm thiểu khác nhau, các protein NF»B chuyển vá trí vào nhân và t¿o ra sự phiên mã căa các gen liên quan đÁn viêm [70,71]

Mát sá thÿ nghiám invitro d°ãi đây th°ång sÿ dāng để khÁo sát ho¿t tính kháng viêm:

- KhÁ năng tác đáng đÁn biểu hián căa các cyctokine TNF-³, IL-10, IL-6

- KhÁ năng ąc chÁ sÁn sinh NO

- KhÁ năng ąc chÁ biểu hián gen iNOS, COX-2

1.3.2 Sơ lược về hoạt tính chống oxy hóa

Viác nghiên cąu các chÃt cháng oxy hóa đang đ°ÿc cáng đßng khoa hãc quan tâm do vai trò bÁo vá căa chúng trong thực phẩm và d°ÿc phẩm cháng l¿i sự suy giÁm oxy hóa và trong c¢ thể cũng nh° cháng l¿i các quá trình bánh lý do stress oxy hóa gây ra

Vai trò căa các chÃt cháng oxy hóa là vô hiáu hóa các gác tự do trong tÁ bào sinh hãc, các gác tự do có tác đáng xÃu đÁn c¢ thể sáng Mát vai trò đặc biát trong viác vô hiáu hóa các tác đáng căa stress oxy hóa liên quan đÁn sự hián dián căa các gác tự do đ°ÿc thực hián bçi enzyme gãi là superoxyde dismutase (SOD) Nó là mát metaloenzyme vãi tá chąc cÃu trúc tiểu đ¢n vá, là chÃt điều hòa chính căa quá trình oxi hóa trong tÁ bào sinh hãc Enzyme này xúc tác phÁn ąng tái hÿp căa các

gác oxy Áp dāng liáu pháp cháng oxy hóa bằng cách sÿ dāng SOD có hiáu quÁ trong viác điều trá các tr¿ng thái bánh lý khác nhau căa c¢ thể con ng°åi, cũng nh° ngăn ngừa sự xuÃt hián căa chúng (ngăn chặn sự hình thành hydro peroxyde và oxy

bá ba

Stress oxy hóa là mát khái niám t°¢ng đái mãi, đ°ÿc sÿ dāng ráng rãi trong khoa hãc y tÁ trong ba thÁp kỷ qua Nó tham gia tích cực vào sinh lý hãc căa các bánh rÃt phá biÁn, nh° tiểu đ°ång, huyÁt áp cao, tiền sÁn giÁt, x¢ vāa đáng m¿ch, suy thÁn cÃp, Alzheimer và Parkinson Các tÁ bào, thông qua quá trình chuyển hóa oxy, t¿o ra các lo¿i oxy phÁn ąng (ROS), có khÁ năng gây h¿i Trong nhāng tr°ång hÿp bình th°ång, tác đá và biên đá hình thành chÃt oxy hóa đ°ÿc cân bằng bçi tác

đá lo¿i bß chúng Tuy nhiên, mÃt cân bằng giāa pro-oxy hóa và chÃt cháng oxy hóa d¿n đÁn stress oxy hóa Hàm l°ÿng ROS cao trong các tÁ bào sinh hãc có tác đáng lãn đÁn ho¿t đáng căa chúng, d¿n đÁn ho¿t đáng căa tÁ bào bá thiÁu hāt, lão hóa

hoặc bánh tÁt [72]

Mát sá ph°¢ng pháp thÿ nghiám invitro d°ãi đây th°ång đ°ÿc sÿ dāng để

khÁo sát ho¿t tính cháng oxy hóa

- Ph°¢ng pháp ąc chÁ gác tự do DPPH

- Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ năng bÃt gác superoxide O2•

- Ph°¢ng pháp xác đánh hàm l°ÿng MDA

- Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ năng kÁt hÿp vãi ion sÃt II

1.4 ChÃt đánh dÃu hóa hác và ph°¢ng pháp lựa chán chÃt đánh dÃu hóa hác căa d°ÿc liáu

Vãi sự gia tăng liên tāc trong viác sÿ dāng thuác thÁo d°ÿc trên toàn thÁ giãi

và sự mç ráng nhanh chóng căa thá tr°ång toàn cÅu đái vãi chúng Các c¢ quan y

tÁ, ngành công nghiáp d°ÿc phẩm có mái quan tâm là sự an toàn và chÃt l°ÿng căa nguyên liáu thÁo d°ÿc và thành phẩm thÁo d°ÿc Sự an toàn và hiáu quÁ căa thuác thÁo d°ÿc chă yÁu phā thuác vào chÃt l°ÿng căa chúng [73] Để kiểm soát d°ÿc liáu về chÃt l°ÿng bên c¿nh ph°¢ng pháp đánh danh thực vÁt về hình thái, soi bát, xác đánh các thông sá cÁm quan, đá ẩm, đá tro, hàm l°ÿng kim lo¿i năng, vi sinh&

rÃt cÅn thêm các thông sá đánh tính, đánh l°ÿng về mặt hóa hãc Muán vÁy, cÅn phÁi nghiên cąu xác đánh đ°ÿc các thành phÅn chính đặc tr°ng cho d°ÿc liáu và/ hoặc quyÁt đánh tác dāng căa d°ÿc liáu Các thành phÅn chính này đ°ÿc gãi là các chÃt đánh dÃu (marker) căa d°ÿc liáu Theo Tá chąc Y tÁ thÁ giãi, chÃt đánh dÃu căa d°ÿc liáu đ°ÿc xác đánh là thành phÅn về mặt hóa hãc căa d°ÿc liáu Ãy, có thể đóng góp hoặc không đóng góp cho d°ÿc liáu về mặt điều trá [73] Tuy nhiên đái vãi nhiều chÃt, bằng chąng về hiáu quÁ điều trá lâm sàng không phÁi lúc nào cũng sẵn

có cho dù chÃt Ãy góp phÅn vào tác dāng điều trá căa d°ÿc liáu nói chung

Từ các đặc tr°ng và vai trò căa chÃt đánh dÃu, các tiêu chí để lựa chãn chÃt đánh dÃu cho mát d°ÿc liáu s¿ bao gßm [73,74]: (i) Là thành phÅn có hàm l°ÿng đă lãn trong d°ÿc liáu, có khÁ năng xác đánh đánh tính, đánh l°ÿng bằng các ph°¢ng

pháp thông th°ång nh° TLC, HPTLC, HPLC, hoặc GC; (ii) NÁu là chÃt đánh dÃu đánh l°ÿng thì phÁi có tác dāng đặc tr°ng cho h°ãng điều trá căa d°ÿc liáu; NÁu là chÃt đánh dÃu đánh tính d°ÿc liáu thì phÁi đặc tr°ng cho d°ÿc liáu đó hoặc loài căa d°ÿc liáu đó

Sá l°ÿng d°ÿc liáu hián nay rÃt lãn, nh°ng nhāng d°ÿc liáu đã đ°ÿc tìm ra chÃt đánh dÃu và có chÃt đánh dÃu đ°ÿc sÿ dāng để kiểm soát chÃt l°ÿng là ch°a nhiều [2, 3, 9,10] Mát sá chÃt đánh dÃu điển hình đang đ°ÿc sÿ dāng trong các d°ÿc điển [74 3 79], nh°: artemisinin dùng đánh tính và đánh l°ÿng Thanh hao hoa vàng; acid ganoderic A dùng đánh tính và đánh l°ÿng NÃm linh chi; silymarin dùng đánh tính và đánh l°ÿng cao khÁ sāa; curcumin dùng đánh tính và đánh l°ÿng Nghá; notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 dùng đánh tính và đánh l°ÿng Tam thÃt; ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rg1 dùng kiểm tra chÃt l°ÿng d°ÿc liáu nhân sâm;&

ChÃt đánh dÃu th°ång là thành phÅn hóa hãc chính và đ¿i dián cho tác dāng sinh hãc chính căa d°ÿc liáu nên nÁu có ph°¢ng pháp đánh tính, đánh l°ÿng thích hÿp, chÃt đánh dÃu căa d°ÿc liáu mang đÁn nhiều giá trá thực tißn trong ąng dāng phát triển và kiểm soát chÃt l°ÿng d°ÿc liáu cũng nh° sÁn xuÃt chÁ phẩm từ d°ÿc

liáu, phát triển thuác mãi [80]

1.5 Tóm tÅt các vÃn đÁ đÁ tài luÃn án cÅn giÁi quy¿t

Theo tác giÁ TrÅn Văn ¡n, t¿p chí d°ÿc liáu, 2019 thì dąa d¿i Pandanus tonkinensis Mart.ex B.Stone là vá thuác chāa các chąng bánh về gan nh° viêm gan, x¢ gan t¿i mát sá tßnh miền núi phía BÃc vãi kÁt quÁ tát về sá ca chāa và có <hiáu quÁ= Đã có nhiều công trình trong và ngoài n°ãc nghiên cąu về thành phÅn hóa hãc

cũng nh° tác dāng d°ÿc lí căa mát sá loài thuác chi Pandanus Tuy nhiên ch°a có nghiên cąu nào về thành phÅn hóa hãc và ho¿t tính căa loài dąa d¿i Pandanus tonkinensis để có minh chąng về tác dāng chāa gan nh° kinh nghiám dân gian đang

sÿ dāng; đßng thåi nghiên cąu sâu về thành phÅn hóa hãc để xác đánh và đánh l°ÿng chÃt đánh dÃu nhằm kiểm soát d°ÿc liáu, sÁn phẩm bào chÁ Đề tài sÿ dāng các ph°¢ng pháp phân tích hóa lý sinh hián đ¿i để xác đánh cÃu trúc các chÃt phân lÁp

đ°ÿc từ quÁ và rß loài Pandanus tonkinensis; sàng lãcho¿t tính sinh hãc các chÃt phân lÁp đ°ÿc bằng thÿ nghiám invitro đánh giá tính kháng viêm và cháng oxy

hóa; lựa chãn, tách chiÁt và tinh chÁ chÃt đánh dÃu cho d°ÿc liáu, xây dựng quy trình phân tích đánh l°ÿng các chÃt đánh dÃu này

CH¯¡NG 2 PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 2.1 Đối t°ÿng nghiên cąu

QuÁ và rß loài Pandanus tonkinensis đ°ÿc thu vào tháng 02 năm 2021 t¿i

huyán L°¢ng S¢n – Hòa Bình, M°ång Lát – Thanh Hóa, Đánh Hóa – Thái Nguyên,

Cẩm Thăy – Thanh Hóa Tên khoa hãc đ°ÿc giám đánh bçi tiÁn sĩ Đß Thá XuyÁn,

bá môn Thực vÁt, khoa Sinh hãc, Tr°ång đ¿i hãc Khoa hãc Tự nhiên so sánh vãi m¿u tiêu bÁn (HNU 024663) đ°ÿc l°u giā t¿i BÁo tàng sinh hãc, Tr°ång đ¿i hãc Khoa hãc Tự nhiên, Đ¿i hãc Quác gia Hà Nái

Hình 2.1 M¿u tiêu bÁn quÁ Pandanus tonkinensis Mart ex B Stone

2.2 Hóa chÃt, dāng cā và thi¿t bß nghiên cąu

‒ Các lo¿i dung môi acetone (CH3COCH3), acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetat (CH3COOC2H5), n-hexane (Merck)

‒ BÁn mßng silicagel tráng sẵn TLC Silica gel Merck 60G F254, RP18 F254s

‒ Silicagel pha đÁo YMC (150 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.)

‒ Nhựa trao đái ion lo¿i Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd)

‒ VÁt liáu nhßi LiChroprep RP18 kích th°ãc 40-63 µm (Merck, Đąc)

‒ Trolox (Sigma Aldrich)

‒ Đám phosphat hoặc đám KCl, tricloacetic acid (TCA, Fisher)

‒ Thiobarbituric acid (TBA) (Sigma Aldrich), FeSO4, H2O2

‒ Đĩa 96 giÁng nhựa (Corning, USA), pippette (Eppendorf)

‒ Lipopolysaccharides (LPS) (St Louis, MO, USA) Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)

‒ Fetal bovine serum (FBS) (Gaithersburg, MD, USA)

‒ Cát sÃc ký thăy tinh dài 1m (Schott, Đąc)

‒ Các lo¿i pipet, áng hút chia đá, quÁ bóp

‒ Bình đánh mąc (5 ml, 10 ml, 20 ml)

‒ Bình đựng dung môi (các lo¿i)

‒ Bình ch¿y sÃc ký bÁn mßng

‒ Cát sÃc ký (các lo¿i)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

‒ Cân phân tích Toledo Mettle (Thāy Sỹ)

‒ Tă sÃy chân không VO49 Memmert (Đąc)

‒ Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R 3 220 (Thāy sỹ)

‒ Máy cô quay chân không Eyela N 31200AV 3 WD (NhÁt)

‒ Máy hián chÃt bằng đèn tÿ ngo¿i ç hai b°ãc sóng 254 nm và 365 nm

‒ Máy sÃc ký lßng HPLC Agilent 1100HP ghép nái bá dò mÁng diode quang DAD (Mỹ)

‒ Máy sÃc ký lßng điều chÁ Pure C-850 (Buchi, Thāy sỹ)

‒ Máy quang phá hßng ngo¿i biÁn đái fourier Impact 410 NICOLET

‒ Máy sÃc kí lßng hiáu năng cao vãi detector DAD, 20 AB, Shimadzu, NhÁt BÁn

‒ Máy siêu âm Elma Elmasonic S 300H 28 lít (Đąc)

‒ Máy hąng phân đo¿n Fraction collector Eyela DC 3 1500C (NhÁt BÁn)

‒ Máy đo khái phá phân giÁi cao: SCIEX X500 Q 3 TOF LC/MS, Mỹ

‒ Máy đo sÃc kí lßng ghép nái khái phá phân giÁi cao: HPLC 1290 infinity -

6530 Accurate mass QTOF LC/MS, Mỹ

‒ Máy đo sÃc kí khí khái phá ba tą cực: QPMS 3 TQ8050NX Shimadzu, NhÁt

‒ Máy đo phá cáng h°çng từ h¿t nhân: Bruker Avance NEO 600 MHz Spectrometer, Mỹ

‒ Máy đo phá l°ỡng sÃc tròn: Chirascan CD spectrometer, Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK

‒ Máy đo phá quay cực: JASCO P 3 2000 polarimeter, NhÁt BÁn

‒ Máy đo phá tÿ ngo¿i khÁ kiÁn UV 3 Vis, Shimadzu, NhÁt BÁn

‒ Máy đo máy đãc ELISA 96 giÁng (Biotek)

‒ Phá hßng ngo¿i FT 3 IR, Perkin Elmer, Mỹ

2.3.2 Chiết xuất dược liệu

Sÿ dāng methanol làm dung môi để chiÁt d°ÿc liáu bát quÁ và bát rß

Pandanus tonkinensis Sÿ dāng máy siêu âm để chiÁt d°ÿc liáu vãi tỷ lá d°ÿc liáu - dung môi là 1 : 3, không bÁt chÁ đá gia nhiát ChiÁt lặp l¿i 03 lÅn, gom dung dách sau siêu âm để cô quay lo¿i dung môi để thu đ°ÿc cao chiÁt methanol

Cao chiÁt methanol đ°ÿc lÅn l°ÿt chiÁt vãi hßn hÿp các dung môi nh° hexane - n°ãc, dichloromethane - n°ãc và ethyl acetate - n°ãc và n°ãc ChiÁt 3 lÅn

n-ç mßi pha vãi tß lá pha n°ãc và pha dung môi hāu c¢ là 1 : 1

2.3.3 Phương pháp phân lập các hợp chất

Cao chiÁt đ°ÿc ç các phân đo¿n đ°ÿc phân lÁp và tinh chÁ trên các há sÃc ký kÁt hÿp pha thuÁn và pha đÁo (gßm cÁ sÃc ký cát và sÃc ký lßng điều chÁ) Các phân đo¿n đ°ÿc phát hián bằng sÃc ký lãp mßng (TLC) hoặc sÃc ký lßng hiáu năng cao

(HPLC)

2.3.3.1 S ắc ký bản mỏng

Sÿ dāng bÁn mßng Alufolien 60 F254 (0,25 mm, Merck), RP-18 F254s (0,25 mm, Merck) để thực hián sÃc ký bÁn mßng (TLC) Để phát hián chÃt bÃt UV dùng đèn tÿ ngo¿i (b°ãc sóng 254 nm và 365 nm) Để phát hián vÁt dùng dung dách sulfuric acid 10% làm thuác thÿ phun đều lên bÁn mßng rßi h¢ nóng từ từ

Sÿ dāng máy hąng phân đo¿n tự đáng DC-1500C EYELA (Tokyo Rikakikai, NhÁt BÁn) để gom các phân đo¿n VÁt các phân đo¿n đ°ÿc phát hián bằng sÃc ký lãp mßng TCL hoặc bằng thiÁt bá HPLC Shimdazu LC20 A detector PDA (Shimadzu,

NhÁt BÁn) vãi điều kián thÿ thích hÿp

2.3.4.1 Ph ổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS)

Sÿ dāng máy phân tích phá khái phân giÁi cao QTOF LC/MS xác đánh ion phân tÿ ç chÁ đá ion hóa d°¢ng hoặc âm

2.3.4.2 Ph ổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Sÿ dāng máy đo cáng h°çng từ h¿t nhân Bruker AM500 FT-NMR vãi chÃt nái chuẩn là Tetramethyl Silan).Các kỹ thuÁt đo phá cáng h°çng từ sÿ dāng thực hián

luÁn án gßm:

+ Phá cáng h°çng từ h¿t nhân mát chiều: 1H-NMR, 13C NMR và DEPT

+ Phá cáng h°çng từ h¿t nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY Dung môi CD3OD đ°ÿc dùng để hòa tan m¿u thÿ khi đo phá

2.3.4.3 Các phương pháp đo khác

Để hß trÿ cho viác xác đánh cÃu trúc các chÃt đã phân lÁp, mát sá tính chÃt khác căa m¿u nghiên cąu đ°ÿc xác đánh bao gßm: Phá l°ỡng sÃc tròn (CD), đá quay cực ([³]D), phá hßng ngo¿i và phá tÿ ngo¿i

2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.3.5 1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

Thí nghiám đ°ÿc thực hián t¿i Phòng Thÿ nghiám sinh hãc 3 Vián Công nghá sinh hãc 3 Vián Hàn lâm KH và CN Viát Nam

Nguyên tắc: Để xác đánh khÁ năng ąc chÁ peroxy hóa lipid thông qua viác

xác đánh hàm l°ÿng malyl diaonldehyd (MDA) vì sÁn phẩm căa quá trình peroxy hóa lipid màng tÁ bào là MDA Sÿ dāng acid thiobarbituric phÁn ąng vãi MDA để t¿o thành phąc có màu hßng ç b°ãc sóng ¼max = 532 nm

Cách tiến hành: Thực hián theo các tài liáu [81,82,83] có thay đái nhß cho phù hÿp

vãi phòng thí nghiám

• Gan chuát đ°ÿc tách, nghiền và đßng thể hóa trong dung dách đám KH2PO4 K2HPO4 (pH=7,4) ç nhiát đá 0-4oC theo tß lá gan chuát: dung dách đám là 1:10

-• Cą 0,1 ml m¿u thÿ ç các nßng đá khác nhau thêm vào 1 ml dách đßng thể, thêm 0,1 ml há Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15mM theo tß lá 1:1) vào 0,8

ml dung dách đám KH2PO4 -K2HPO4 (pH=7,4) Ă hßn hÿp thu đ°ÿc trong

thåi gian 15 phút ç nhiát đá 37oC

• Cho vào 1 ml tricloacetic acid 10% để dừng phÁn ąng Sau đó cho vào máy li tâm (12000 vòng/ 5 phút)

• Cho 1 ml thiobarbituric acid 0,8% phÁn ąng vãi dách trong thu đ°ÿc (theo tß

lá 2:1), ă 15 phút ç 1000C Sau đó làm l¿nh và tiÁn hành đo quang ç b°ãc sóng ¼ = 532 nm

Sÿ dāng Trolox làm chÃt đái chąng d°¢ng

• KÁt quÁ đ°ÿc tính theo biểu thąc 2.1:

% ąc chÁ = [(ODC 3 ODT)/ODC] × 100