congngheditruyenchuong 01 cac enzyme

• Vi khuẩn: Pol I, Pol II, Pol III.– Tổng hợp polynucleotide theo 5’  3’.– Hoạt tính 3’- 5’ exonuclease ứng dụng trong sửa sai proofreading– Không tổng hợp chuỗi mới theo 3’-5’– Pol I:

Chương 1 Các enzyme chủ yếu

Nguyễn Vũ Phong

• RE cắt DNA ở vị trí chuyên biệt , có trìnhtự xác định

Enzyme cắt (giới hạn)

Trình tự nhận biết của một số enzym cắt hạn chế

Enzyme cắt (giới hạn)

Gắn các đoạn linker

Enzyme terminal transferase

• MboI và Sau3AI nhận biết cùng trình tự

• Trình tự nhận biết của BamHI

• SalI (G TCGAC) và XhoI (C TCGAG)

Tạo thể lai không bị cắt bởi enzyme sử dụng cắt ban đầu

Methyl hóa (methylation)

Eco RI không cắt được

Methyl hóa (methylation)

• dam (DNA adenine methylase)

• dcm (DNA cytosine methylase)

Phản ứng cắt bằng RE

• Buffer (dung dịch đệm)

– (H): dung dịch đệm hoạt độ ion cao

– (M): hoạt độ ion trung bình

– (L): hoạt độ ion thấp

Thường được chuẩn bị ở dạng stock (X10), giữ ở 4

0C/ 1-2 tuần; -20 0C

Phản ứng cắt bằng RE

Enzyme tổng hợp DNA

(DNA polymerase)

• Tổng hợp chuỗi polymer từ các dNTP.

• Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn.

• Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu mút của chuỗi.

• Hầu hết các polymerase có nguồn gốc từ vi

khuẩn hoặc từ các virus ký sinh vi khuẩn (thực khuẩn thể).

• Vi khuẩn: Pol I, Pol II, Pol III

– Tổng hợp polynucleotide theo 5’  3’.

– Hoạt tính 3’- 5’ exonuclease ứng dụng trong sửa

sai (proofreading)

– Không tổng hợp chuỗi mới theo 3’-5’

– Pol I: sửa chữa DNA

– Pol II: khởi đầu quá trình tổng hợp không có primer – Pol III: enzyme chính điều khiển quá trình tái bản.

DNA polymerase ở Prokaryote

DNA polymerase I (từ E.coli)

DNA Pol I còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

3’ – 5’ exonuclease

Proofreading via exonuclease

activity

is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-Chủ đề:

DNA polymerase, hoạt tính sửa sai, và ứng dụng trong Công nghệ DNA tái tổ hợp

• T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn và primer để hoạt động.

5’  3’ polymerase khi có dNTPs 3’  5’ exonuclease khi không có dNTPs Không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

Có thể sử dụng T4 DNA polymerase trong kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ của DNA sợi đôi.

DNA polymerase ở Prokaryote

Chủ đề:

T4 DNA polymerase, tính chất, hoạt động và ứng dụng.

• DNA polymerase T7 của thực khuẩn thể là công cụ

lí tưởng cho việc giải trình tự DNA Dạng chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer hoá trên 300

nucleotide/giây.

DNA polymerase ở Prokaryote

• Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’-OH của DNA

và không cần khuôn mẫu

TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA.

DNA polymerase ở Prokaryote

Chủ đề:

Terminal deoxynucleotidyl transferase, tính chất, hoạt động và ứng dụng.

DNA polymerase bền nhiệt

Taq polymerase : Thermophilus aquaticus.

DNA polymerase bền nhiệt

Taq polymerase : Ứng dụng trong TA cloning

Chủ đề:

Taq DNA polymerase, tính chất, hoạt động và ứng dụng.

DNA polymerase bền nhiệt có hoạt

tính sửa sai

Hoạt tính 3’  5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai) giúp tăng độ chính xác

• Pfu từ Pyrococcus furiosus có tỉ lệ sai sót là 1,6 x 10-6

• Pow polymerase (từ Pyrococcus woesei) có chu kì bán phân

hủy trên 2 giờ ở 100 oC và tỉ lệ sai sót rất thấp 7,4 x 10-7; chỉhiệu quả đối với khuôn mẫu có kích thước dưới 3,5 kb

Chủ đề:

Pfu DNA polymerase, tính chất, hoạt động và ứng dụng.

M 1 2 3

300 bp

200 bp

DNA polymerase bền nhiệt

• Bst : DNA Pol I, Bacillus stearothermophilus

• Bst Pol I hoạt động tốt nhất ở 65oC, bị bất hoạt ở 75oC/15’

• Hoạt tính 5’  3’ exonuclease đạt mức cao nhất khi có Mg2+nồng độ cao

• Bst Pol I gồm 2 phân đoạn protein Phân đoạn lớn bền nhiệt

và rất hữu dụng trong các phản ứng giải trình tự ở 65 oC

DNA polymerase bền nhiệt

Tth polymerase : Thermus thermophilus, 94 kDa, thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease.

- Xúc tác sao chép DNA:

từ khuôn DNA với Mg2+,

từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+

Retrovirus and Reverse transcriptase

 5’ phân hủy DNA và RNA trong tổ hợp lai

• RT thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease nên có độ chính xác

thấp hơn DNA polymerase

• Tổng hợp DNA cần primer và khuôn mẫu

RNA polymerase

Chủ đề:

Promotor: cấu trúc, tính chất, hoạt động và ứng dụng.

RNA polymerase

• Tổng hợp RNA từ khuôn DNA theo chiều 5’3’.

• SP6 RNA pol : 96 kDa , từ Salmonella typhimurium LT2 bị xâm nhiễm

bởi thực khuẩn thể SP6

• T7 RNA pol : 98 kDa sản xuất bởi thực khuẩn thể T7

• RNA pol được sử dụng tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo

probe RNA có gắn nhãn

• SP6 và T7 RNA pol cần Mg 2+ và khuôn DNA sợi đôi.

• Mỗi loại SP6 và T7 RNA pol cần promoter đặc hiệu trong phiên

mã DNA

DNA ligase

• Tạo liên kết phosphodiester giữa nhóm 5’ phosphate và 3’-OH

ở vị trí hở sợi đơn của DNA sợi đôi

• Nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu dính, thêm linker/adaptor hay sửa các vị trí hở (nick)

• Không bền nhiệt gồm DNA ligase từ Chlorella virus và thựckhuẩn thể T7 (34 kDa, 41 kDa), thực khuẩn thể T4 (68 kDa)

• DNA ligase bền nhiệt được phân lập từ nguồn vi khuẩn chịunhiệt, hoạt động ở nhiệt độ từ 45 – 80 oC

DNA ligase

• E coli DNA ligase: nối đầu so le

• T4 DNA ligase được sử dụng nhiều nhất trong SHPT, là một

đơn phân có khối lượng 68 kDa cần Mg 2+ và ATP để hoạt động

• T4 DNA ligase có thể nối đầu bằng hoặc đầu so le hay sửa những vị trí hở (nick) sợi đơn trên sợi đôi DNA, RNA hoặc

tổ hợp lai DNA/RNA

RNA ligase

• RNA ligase xúc tác hình thành nối phosphodiester giữađầu 5’ phosphate và 3’-OH của RNA sợi đơn hay phân tử DNA

• T4 RNA ligase

Loại nhóm phosphate

• Alkaline phosphatase (AP)

– Tinh sạch từ E coli hoặc các sinh vật bậc cao,

– Sử dụng để loại nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acidnhằm ngăn chặn sự đóng vòng của DNA vector trong cácthí nghiệm tạo dòng

• AP bị bất hoạt bởi các tác nhân tạo phức (chelating agents) như EGTA, nồng độ thấp của phosphate vô cơ.

Loại nhóm phosphate

Chuyển nhóm phosphate

• T4 polynucleotide kinase xúc tác phản ứng chuyển một nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH của một nucleic acid.

• Hay phosphoryl hoá đầu 3’ của các mononucleotide.

• Phân cắt liên kết phosphodiester trong chuỗi

nucleic acid.

– Exonuclease cắt ở hai đầu phân tử nucleic acid

– Endonuclease phân cắt vùng bên trong của phân tử

• Deoxyribonuclease phân cắt DNA và tạo các khe hở (nicks).

• Ribonuclease cắt RNA.

Nuclease

DNase I (deoxyribonuclease I): endonuclease phân cắt sợiđôi/đơn DNA khi có mặt các ion hóa trị 2 tại vị trí nằm ngay sau

1 base pyrimidine (T, C)

- Có Mg 2+ : enzyme tạo nick trong sợi đôi DNA

- Có Mn 2+ : enzyme cắt cả hai sợi DNA.

DNase I (deoxyribonuclease I): endonuclease phân cắt sợiđôi/đơn DNA khi có mặt các ion hóa trị 2 tại vị trí nằm ngay sau

1 base pyrimidine (T, C)

- Có Mg 2+ : enzyme tạo nick trong sợi đôi DNA

- Có Mn 2+ : enzyme cắt cả hai sợi DNA.

DNase I (deoxyribonuclease I)

• Glycoprotein, 31 kDa , thường ở dạng hỗn hợp gồm 4 isoenzyme (A, B, C, D)

• Bị bất hoạt ở 75 oC trong 5’ với EGTA 5 mM

• Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt ở vị trí 3’ của

pyrimidine (C/T)

• Nick translation

• Cắt ngẫu nhiên đoạn DNA

• Tinh sạch RNA từ tế bào hay hỗn hợp phiên mã

Exonuclease III (exodeoxyribonuclease III)

3’-exonuclease, xúc tác loại bỏ từng nucleotide khỏi đầu

3’-OH của sợi đôi DNA

Phosphatase, loại bỏ gốc phosphate của chuỗi DNA kết

thúc với nhóm 3’-phosphate

Rnase H, phân giải sợi RNA trong tổ hợp lai DNA/RNA.

Endonuclease, phân cắt các base lỗi (apurinic, apyrimidic)

khỏi khung đường phosphate của DNA

endonuclease phân cắt đặc hiệu RNA sợi đơn ở base G.

kết phosphodiester trong RNA.

thành các 5’ mononucleotide

Dùng xác định các dạng lai nucleic acid, đánh dấu vùng DNA sợi đôi, loại vùng sợi đơn của DNA dạng so le.

S1 Nuclease

Phân giải đặc hiệu DNA sợi đơn (từ 2 đầu của phân tử) Dùng để tạo DNA đầu bằng;

Đặc biệt được dùng loại bỏ primer khỏi phản ứng PCR.

Ribonuclease tuỵ (RNAse A)

Cắt sợi đơn RNA ở nucleoside phosphate và

3’-phospho-oligonucleotide kết thúc với Cp/Up

 Giảm nhiễm RNA trong ly trích plasmid DNA

 Lập bản đồ đột biến trong DNA/RNA bằng cách

phân cắt ở những vị trí không tương đồng

RNAse A hoạt động ở những điều kiện rất khác nhau và khó bất hoạt.

Ribonuclease H (RNAse H)

RNAse H có hoạt tính tối đa ở điều kiện pH 7,5 – 9,1 với

Enzyme bị ức chế bởi N-ethylmaleimide và ở mức thấp

hơn bởi nồng độ ion cao.

Rnase H