nghiên cứu lên men nước tương từ những nguyên liệu không truyền thống

Vì vậy tôi muốn nghiên cứu sản xuất nước tương theo phương pháp lên men, tận dụng những phế phẩm có nguồn gốc từ đậu nành như: bã okara, bánh dầu đậu nành.. Giới thiệu chung về nước tươn

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU LÊN MEN NƯỚC TƯƠNG TỪ

NHỮNG NGUYÊN LIỆU KHÔNG TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN NGÀNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn:

TS Lê Chiến Phương Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Đức Thắng MSSV: 30100737 Niên khóa:2001-2005

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

Thầy Lê Chiến Phương đã tận tình giúp đỡ em hoàn thành cuốn luận văn này

Cô Đỗ Thị Tuyến đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học MơÛ đã truyền đạt cho em vốn kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Viện Sinh học nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện khóa luận

TPHCM, tháng 03 năm 2006 Nguyễn Đức Thắng

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1: 6

1.1 Giới thiệu chung về nước tương 6

1.2 Giới thiệu chung về nguyên liệu đậu nành: 12

1.2.1 Hạt đậu nành 12

1.2.2 Bã đậu nành( Okara ) thu từ qui trình sản xuất sữa đậu nành của Vinamilk: 14

1.2.3 Bánh dầu nành 15

1.3 Gạo lức 16

1.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae (AO) 18

1.5 Vi khuẩn Bacillus subtilis (BS): 18

CHƯƠNG 2: 21

2.1 Vật liệu – Nguyên liệu – Hóa chất – Thiết bị 21

2.1.1 Vật liệu – Nguyên liệu 21

2.1.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.1.2 Môi trường thực hiện 21

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 23

2.2 Phương pháp thực hiện 23

2.2.1 Qui trình kỹ thuật lên men nước tương 23

2.2.2 Qui trình nhân giống 24

2.2.2.1 Qui trình nhân giống B.subtillis 24

2.2.2.2 Qui trình nhân giống A.oryzae 25

2.2.3 Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu 25

2.2.4 Phương pháp ly trích nước tương từ bã lên men 26

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu nồng độ muối thích hợp cho quá trình lên men 27

2.3 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa 27

2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính của amylase 27

2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính của protease 29

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính của lipase 31

2.3.4 Phương pháp xác định đạm tổng số 32

2.3.5 Phương pháp xác định đạm formol 34

2.3.6 Phương pháp xác định đạm amoniac 36

2.3.7 Phương pháp xác định đường tổng 37

2.3.8 Phương pháp xác định đường khử 39

2.3.9 Phương pháp xác định lipid thô 40

LỜI MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài:

Hiện nay nước tương được sản xuất theo 2 phương pháp chính là phương pháp lên men (fermented soy sauce) và phương pháp thủy phân protein (hydrolysed protein) Phương pháp thủy phân bằng axit có thời gian thự hiện ngắn hơn và kinh tế hơn phương pháp lên men, nhưng nó lại tạo ra nhiều chất thuộc nhóm cloropropanol có khả năng gây ung thư cao như: 3-MCPD (3-cloro-1,2-propandiol); 1,3-DCP (1,3-dicloro-2-propanol) Vì vậy tôi muốn nghiên cứu sản xuất nước tương theo phương pháp lên men, tận dụng những phế phẩm có nguồn gốc từ đậu nành như: bã okara, bánh dầu đậu nành

2 Mục đích nghiên cứu:

Tận dụng những phế phẩm từ đậu nành để sản xuất nước tương

3 Khách thể và đối tượng nghiên cứu:

- Khách thể: lên men nước tương từ những nguyên liệu không truyền thống

- Đối tượng: Nguyên liệu làm nước tương không truyền thống: bã okara, bánh dầu đậu nành

Chủng giống mốc nghiên cứu Aspergillus oryzae Chủng giống vi khuẩn nghiên cứu Bacillus subtilis

4 Giới hạn và phạm vi nghiên cứu:

Đề tài này được thực hiện trong vòng 6 tháng tại phòng Công nghệ biến đổi sinh học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới

Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu lên men nước tương từ những phụ phẩm của đậu nành như bã okara và bánh dầu đậu nành

5 Phương pháp nghiên cứu:

Để thực hiện công trình này, tôi sử dụng chủ yếu là phương pháp thí nghiệm và quan sát, đồng thời tôi cũng sử dụng các phương pháp bổ trợ khác là phân tích tổng hợp, nghiên cứu tổng kết kinh nghiệm, lấy ý kiến chuyên gia

6 Tóm tắt công trình ngiên cứu:

Công trình nghiên cứu của tôi bao gồm chương mở đầu, 3 chương chính và lời kết

Trong Lời mở đầu, tôi trình bày lý do chọn đề tài, mục đích nghiên cứu, đối tượng, phạm vi, phương pháp nghiên cứu

Trong chương một tôi cung cấp những khái niệm cơ bản về nguyên liệu và giống sử dụng trong việc nghiên cứu chế biến nước tương nhằm làm tiền đề cho việc thực hiện thí nghiệm , rút ra kết luận cho những chương sau

Chương hai tôi đề cập tới các thiết bị, phương pháp chế biến nước tương, trong đó tôi có đề cập tới những kinh nghiệm của các nước khác trong việc chế biến nước tương nhằm rút ra những thông tin cần thiết để xây dựng quy trình chế biến nước tương

Trong chương ba, với kết quả thu được, tôi đưa ra nhận xét, kết luận quá trình nghiên cứu lên men nước tương từ nguyên liệu không truyền thống

Cuối cùng tôi đưa ra kiến nghị nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm

Mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng bài viết còn có những hạn chế nhất định Em kính mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để bài viết của em được tốt hơn, em xin chân thành cám ơn

CHƯƠNG 1:

1.1 Giới thiệu chung về nước tương:[8]

Nước tương là một loại thực phẩm được chế biến từ nguyên liệu chính là đậu nành rất thông dụng ở các nước Aù châu Nước chấm giàu acid amin vì đó là quá trình thủy phân protein của hạt đậu nành thành các acid amin Thành phần nước chấm thu được chủ yếu là acid amin, peptid có trọng lượng phân tử thấp và NaCl

Tương làm bằng phương pháp lên men được sản xuất ra từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nước và giống nấm mốc Được ủ qua một thời gian từ 3 tới 12 tháng tùy theo loại và quốc gia sản xuất

Qui trình sản xuất nước tương của Nhật.[12]

Ở Nhật có nhiều loại nước tương khác nhau nhưng chủ yếu thì chúng cũng từ những nguyên liệu chủ yếu là hạt đậu nành, lúa mì, nước, muối Quá 1 trình lên men chia làm 3 giai đọan:

• Giai đọan tạo ra koji: koji là hỗn hợp của các enzyme protease phân hủy protein đậu nành thành peptides và acid amin Và các enzyme amylase phân hủy tinh bột của lúa mì thành đường Nguyên liêu đậu nành đưa vào được lấy hết dầu ra hoặc hạt đậu nành con nguyên thì được ngâm trong nước cho trương ra và sau đó nấu ở áp suất cao Lúa mì thì được rang với không khí nóng ở áp suất khí quyển Sau đó lúa mì được làm vỡ ra 4-5 phần Trong quá trình làm nước tương truyền thống đậu nành đã được nấu đem trộn với lúa mì đã rang với tỉ lệ 50-50 và sau đó cấy giống mốc vào ( Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus sojae spores) với tỉ lệ giống 0.1-0.2 % Hỗn hợp sau khi đã cấy giống được ủ ở 250 C trong 72g mốc sẽ phát triển và tạo bào tử làm hỗn hợp koji trở nên có màu lục vàng

• Giai đoạn lên men với nước muối: ở giai đọan này nước muối 20% được cho vào koji và tất cả được chuyển qua bồn lên men Và hỗn hợp này được gọi là moromi Giống vi khuẩn lactic ( Pedicoccus halophilus) được cho vào moromi, giữ ở 150 C tháng đầu tiên cho đến khi pH giảm tử 6.5 -> 5.0 vì có sự hình thành của acid lactic Sau đó nấm men ( Saccharomyces rouxii và Candida sp) được cho vào để tiếp tục tạo ra alcohol Nhiệt độ của bồn lên men được tăng dần lên 280C cho tới khi qua trình lên men rượu bắt đầu Trong suốt quá trình lên men 80-90% protein và tinh bột bị thủy phân thành acid amin và đường Glutamic và aspartic acid là những acid amin chính có mặt trong nước tương lên men Glutamic acid là thành phần quan trọng tạo nên vị cho nước tương Arabinose, glucose và galactose là các đường có mặt chính trong nước tương

• Giai đọan cuối: Hỗn hợp sau khi lên men được lọc ép, thanh trùng kiểu pasteur (pasteuriza) ở 70-800 C trong vài phút và rót chai đóng gói thành phẩm

Sơ đồ 1: qui trình sản xuất nước tương của Nhật

Chất lượng của nước tương được dựa trên các thông số về pH, độ chua, đạm nitơ, nồng độ muối, màu, vi sinh thực phẩm, mùi vị Mùi thơm quan trọng nhất của sản phẩm là HEMF ( 4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3-furanon) và các hợp chất este ketones và furans Các hợp chất ester dễ bay hơi được tạo thành bởi vi sinh vật trong quá trình lên men

TRỘN ĐỀU

Ngâm, hấp, làm nguội

Rang, nghiền Giống

Ủ 25-350C, 72g

Koji

Moromi 17-19% muối Lên men lactic

Lên men rượu

Nước tương ngon kích thích bao tử tiết ra dịch vị, tạo cảm giác ngon miệng hơn, nó cũng giống như 1 ly rượu vang khai vi

Qui trình sản xuất nước tương truyền thống của Việt Nam.[8]

Nguyên liệu chủ yếu là hạt đậu nành,đậu phộng phối hợp với gạo nếp Tỷ lệ phối trộn có thể là đậu nành, hoặc đậu phộng 70-90% và gạo nếp 10-30% Thông thường có thể thay bằng bột mì, bắp hay nguyên liệu giàu tinh bột khác

Chủng nấm mốc được sử dụng phổ biến là Asp.oryzae có màu vàng hoa

cau Từ ống giống gốc trong môi trường thạch nghiêng, được nhân sinh khối trong môi trường dinh dưỡng thích hợp trong bình tam giác rồi sau đó nuôi trên khay với khối lượng tăng dần để dùng trong sản xuất đại trà

Để nhân giống trong bình tam giác, người ta cho gạo, bắp đã xay nhỏ, cho nước vừa đủ ẩm sau đó hấp chín bằng nồi hấp thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm2 trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội đến nhiệt độ 30-35 o C rồi cấy truyền từ ống gốc vào bình tam giác, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30-350C trong thời gian 40-48giờ

Khi mốc mọc vàng đều trong bình tam giác là lúc có thể nhân giống ra khay bằng cách trộn đều giống trong bình tam giác vô môi trường có thành phần như trên đã được hấp thanh trùng, rồi trải môi trường đã cấy giống thành lớp mỏng 2-3cm và ủ ở nhiệt độ từ 28-320C trong thời gian từ 36-42 giờ, mốc sẽ phát triển xanh vàng hoa cau đều khay

Kỹ thuật lên men tương

Nguyên liệu là đậu nành hoặc phối trộn với đậu phộng, gạo nếp, được ngâm trong nước, vớt ra hấp chín ở 1,2 atm trong thời gian 3-4 giờ cho chín kỹ, lấy ra để nguội đến 30-350C sau đó trộn giống mốc từ khay vào nguyên liệu (tỷ lệ 0,8-1% ) và trải mỏng 2-3 cm, giữ trong không khí ẩm và sạch 90-95% ở nhiệt độ 30-320C Đây là giai đọan quan trọng nhất tạo điều kiện để thủy phân protein đậu nành thành acid amin và tinh bột thành đường khử

Sau khi nguyên liệu đã mọc nấm vàng cau, trộn đều với nước muối 20%, giữ ẩm thường xuyên khoảng 3-4 ngày Sau đó cho tất cả vào thiết bị lên men như bể, chum, khạp, thùng inox… và ủ trong khoảng thời gian cần thiết Sau đó ly trích ta được nước chấm loại 1 Phần bã thu được dùng dung dịch muối khoảng 20-25% cho ngập trong 8-12 giờ rồi trích ly nước chấm ra ta sẽ có nước chấm loại 2, loại 3 Sau đó phối trộn tất cả với nhau và thanh trùng 90-1000C và dùng benzoat natri 0,1% để bảo quản, rót chai thu được nước chấm thành phẩm

Sơ đồ 2 : Qui trình sản xuất nước tương của Việt Nam

Đậu nành

Ngâm

Gạo nếp

Ngâm Phối trộn

1.2 Giới thiệu chung về nguyên liệu đậu nành:

Đậu nành được coi là loại cây trồng quí vì chúng có tác dụng nhiều mặt Hạt đậu nành rất giàu dinh dưỡng đặc biệt là protein và dầu, có vai trò rất lớn trong việc giải quyết bữa ăn cho con người, nguyên liệu cho công nghiệp, thức ăn cho gia súc Đậu nành có nguồn gốc ởø Trung Hoa từ thời xa xưa, nhưng mãi tới thế kỷ 20, đậu nành mới được trồng phổ biến

1.2.1 Hạt đậu nành [1-4]

Hạt đậu nành có hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹp, trùy dài Màu sắc cũng khác nhau trong đó loại hạt có màu vàng là tốt nhất Hạt đậu nành gồm có 3 bộ phận: vỏ, tử diệp và phôi Trong đó, vỏ hạt chiếm khoảng 8%, phôi chiếm khoảng 2% và tử diệp chiếm khoảng 90% trọng lượng hạt

Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau:

Bảng 1: Thành phần hóa học của hạt đậu nành

Protein 35 – 45% Lipid 15 – 20% Hydratcacbon 15 – 16% Cellulose 4 – 6% Muối khoáng 4.6%

Thành phần protein chiếm 1 tỷ lượng lớn, trong đó globulin chiếm 85 – 95% Ngoài ra còn có 1 lượng nhỏ albumin, 1 lượng không đáng kể prolamin và glutein Thành phần hóa học của đậu thay đổi tùy theo từng loại đậu, thời tiết, đất đai, điều kiện trồng trọt và chăm bón Thành phần acid amin của protein đậu nành trừ methionin quá ít còn các acid amin khác có hàm lượng khá cao, tương đương với các acid amin có trong thịt

Bảng 2: Thành phần acid amin trong protein của đậu nành

Thành phần hydratcacbon chiếm khoảng 20% hạt đậu nành, gồm hai loại: tan và không tan trong nước Loại tan được trong nước chiếm khoảng 70% toàn bộ hydratcacbon Loại không tan trong nước gồm cellulose và hemicellulose

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành, trong đó đáng chú ý nhất là canxi, phospho, mangan, kẽm và sắt

Bảng 3: Thành phần khoáng trong đậu nành

Canxi 0.16 – 0.47% Phospho 0.41 – 0.82% Mangan 0.22 – 0.24%

Kẽm 37 mg/kg Sắt 90 – 150 mg/kg

Ngoài ra trong hạt đậu nành còn chứa rất nhiều vitamin khác nhau, trừ vitamin C và vitamin D

Bảng 4: Thành phần vitamin trong đậu nành

Thiamin 11 – 17.5 mg/kg Riboflavin 3.4 – 3.6 mg/kg Niaxin 21.4 – 23.0 mg/kg Pyridoxin 7.1 – 12.0 mg/kg

Acid Pantothenic 13.0 – 21.5 mg/kg Acid folic 1.9 mg/kg

Inoxiton 2300 mg/kg Vitamin A 0.18 – 2.43 mg/kg Vitamin E 1.4 mg/kg Vitamin K 1.9 mg/kg

Tuy nhiên đậu nành có một số nhược điểm như chứa chất ức chế enzym trypsin, chất memagglutinin và mùi đậu nành…

1.2.2 Bã đậu nành( Okara ) thu từ qui trình sản xuất sữa đậu nành của Vinamilk:[6]

Okara là một thứ bột màu vàng, nó chứa các thành phần không hòa tan trong nước của hạt đậu nành Okara là phụ phẩm thu nhận từ quy trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu nành như sữa đậu nành Okara vẫn còn chứa nhiều chất dinh dưỡng khác như khoáng chất, vitamin và khá đầy đủ các acid amin của đậu nành Hiện nay okara được sử dụng chủ yếu là làm thức ăn cho gia súc

Thành phần bã okara (thông tin do Vinamilk cấp):

❖ Bã okara khô: Độ ẩm 6,7% Lipid 10,59% Protein 34,4% Cellulose 1,99% ❖ Bã okara ướt: Độ ẩm 85%

Lipid 1,5% Protein 3%

Cellulose 0,5% Carbohydrat 5,5% Canxi 0,8%

Hạt đậu nành

Ngâm nước nóng đối lưu 5 phút: 85-900C

Sấy rung

Bã OKARA

Thải bỏ nước nóng

1.3 Gạo lức [11 -14]

Bảng 5: Thành phần dinh dưỡng gạo lức

Thành phần dinh dưỡng của gạo lức: (đơn vị tính theo % nhu cầu dinh dưỡng hàng ngày)

Hệ thống xếp loại thực phẩm đánh giá gạo lức là nguồn mangan rất tốt, cũng là nguồn giàu khoáng magie, selenium, phosphor, cũng như các loại vitamin B1, B3, B6 , chất xơ dễ tiêu và glutathion

Gạo lức còn có các acid pantotenic, paraaminobenzoic, acid folic, acid philyc, các chất khoáng như Ca, Fe, Mg, K, Na Selenium đã được y học kiểm chứng rằng có khả năng ngăn ngưà ung thư Glutathion thì phòng nhiễm bụi phóng xạ Acid pantotenic giúp tăng cường chức năng của vỏ não chống viêm da, u bứu ác tính

Gạo lức ngâm 22 giờ ở trạng thái nẩy mầm nên nó có chứa rất nhiều chất bổ dưỡng Mầm gạo lức có chứa rất nhiều dinh dưỡng như xơ, chưá gấp 3 lần lysin là acid amin cần thiết cho sự tăng trưởng và bảo trì các mô tế bào cơ thể con người, và chứa gấp 10 lần acid gamma-aminobutylic, một acid tốt bảo vệ thận Trong mầm gạo lức có chứa một loại enzym, có tác dụng điều hòa các hoạt động ở trung ương não bộ Gạo lức nẩy mầm không chỉ dem lại nhiều chất dinh dưỡng mà còn nấu rất dể dàng và cung ứng cho chúng ta một khẩu vị hơi ngọt vì các enzyme đã tác động vào các chất đường và chất đạm trong hạt gạo Một thành phần quan trọng khác là chất dầu trong vỏ bọc ngoài của gạo lức có tác dụng giảm lượng choleterol trong máu, một yếu tố gây nên bệnh tim mạch Các nhà khoa học tìm thấy trong chất cám bọc ngoài gạo lức có chất dầu tên là tocotrienol factor (TRF) có tác dụng khử những chất hóa học gây đông máu và giảm cholesterol Ngoài ra trong lớp cám bọc ngoài còn có một chất khác nửa có khả năng chống lại chất xúc tác enzyme HMG-CoA, một chất có khuynh hướng gia tăng lượng cholesterol xấu LDL

1.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae (AO)

Phân loại theo Bergey Aspergillus oryzae thuộc:

Giới : nấm

Lớp : Eurotiomycetes Họ : Trichocomaceae

Giống: Aspergillus Loài : A.oryzae

Cơ thể sinh trưởng là một hệ sợi, bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang từ 5 – 7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào

(nấm đa bào) A.oryzae là loài đã được sử dụng 1000 năm nay để sản xuất thực

phẩm và đồ uống lên men cổ truyền của Nhật Bản

A.oryzae là một vi sinh vật có khả năng tạo nhiều enzym Chính nhờ có sự hiện diện của các loại enzym này mà A.oryzae đóng vai trò hết sức quan trọng trong công nghiệp thực phẩm Hệ nấm mốc A.oryzae cho ba loại enzym, chủ yếu

là amylase, sau đó là protease và oxy hoá khử

Điều kiện sinh trưởng: môi trường có độ ẩm 45% là điều kiện thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử để làm giống, còn để hình thành enzym là 55 –

58%, pH môi trường khoảng 5,5 – 6,5, độ ẩm không khí là 85 – 95% A.oryzae là

loại hoàn toàn hiếu khí, khi có đủ oxy thì phát triển rất mạnh

Thời gian nuôi cấy: khi nuôi nấm mốc làm giống đòi hỏi thời gian từ 60 – 70 giờ, lúc đó bào tử mới hình thành đầy đủ, còn nuôi nấm nấm mốc để có enzym amylase cực đại là 30 – 36 giờ, protease cực đại là 36 – 42 giờ, có một số chủng của loại này cho hai cực đại của enzym là 36 – 60 giờ

1.5 Vi khuẩn Bacillus subtilis (BS):[13]

Theo phân loại của Bergey Bacillus subtilis thuộc

Giới : Bacteria

Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli

Họ : Bacilaceae Giống : Bacillus Loài : B subtilis

BS nhuộm Gram BS nhuộm bào tử

Họ Bacilaceae có những đặc diển là trực khuẩn (tế bào hình que),không tạo chuỗi,có nội bào tư û(nha bào) khác với tế bào dinh dưỡng bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn,khó nhuộm màu hơn, bền hơn đối với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác như kiềm ….Bào tử có chứa acid dipicolinic (5%-10% so với chất khô),được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài hiếu khí hay yếm khí tùy ý.Thường tạo các trực khuẩn thẳng hoặc hầu như thẳng.0.3-2.2x1.2x7.0 micro, phần lớn di động Tạo một nội bào tử bền nhiệt trong mỗi tế bào

Bacillus subtilis Là loài trực khuần G(+),hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào

tồn tại riêng rẽ hay dính lại với nhau tạo thành chuỗi ngắn Khi còn non có khả năng di động nhờ tiên mao,về sau khi tiên mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ hình thành nha bào tử Kích thước của nha bào tử không lớn hơn kích thước tế bào nên vi khuẩn vẫn giữ nguyên hình dạng khi hình thành nha bào tử

Bacillus subtilis có mặt khắp nơi trong tự nhiên,chúng có nhiều trong rơm

cỏ cho gia súc ăn nên có tên gọi là trực khuẩn rơm cỏ,chúng còn phân bố rộng rãi trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó.Trong

bột mì Bacillus subtilis chiếm khoảng 75-95% số vi khuẩn tạo bào tử Người ta nhận thấy rằng vi khuẩn nhóm Bacillus subtilis có mặt khắp nơi và đóng vai trò có

lợi cũng như có hại trong quá trình biến đổi sinh học Từ các nguyên vật liệu dùng để sản xuất như bột mì,bột gạo,muối hột….tới các sản phẩm truyền thống như nước mắm các loại, tương, mẻ ,chao…

Do có bào tử chịu nhiệt cao nên Bacillus subtilis có thể gây hỏng một số

thực phẩm hộp Đồ hộp lúc đó có mùi thối chua rất khó chịu, không tạo gaz hoặc

tạo gaz trong môi trường có đường Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các sản

phẩm sữa,bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân nhất là các sản phẩm trên được bảo

quản ở nhiệt độ nóng Bacillus subtilis gây bệnh chảy nhớt khoai tây và bệnh chảy

nhớt bánh mì do Laurent phát hiện đầu tiên năm 1885 nên cũng từ đó có tên gọi là trực khuẩn khoai tây

Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều loại kháng sinh kháng với nhiều

loại vi trùng gây bệnh như subtilin (Humfeld và Feustel,1943),eumycin (Johnson và Burdon, 1946), bacilin (Foster và Woodruff, 1946) bacillomin (Shtikell và

Poplavskii, 1955) Ngoài subtilin từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis còn có thể thu

được nhiều loại kháng sinh khác nữa Trong số kháng sinh đó có những loại qúy như Polimixin diệt được trực khuẩn mủ xanh (P.aeruginosa) từng kháng rất nhiều kháng sinh Polimixin dùng điều trị các bệnh viêm não, các vết thương nhiễm trùng và bệnh ngoài da Bacitracin có tác dụng chống vi khuẩn gram dương hiếu và kị khí cũng như nấm men gây bệnh

Hạt đậu nành

Gạo lức, gạo nếp

2.1.1.2 Môi trường thực hiện

• Mội trường giữ giống

+ Môi trường PGA ( giữ giống AO)

- Glucose 10g - Khoai tây 200g - Agar 20g - Nước cất đủ 1000 ml Hấp 1210C – 30 phút

+ Môi trường CP( giữ giống BS)

+ Môi trường sữa đậu nành nhân giống BS

- Sữa đậu nành(1 kg đậu xay cho 15 lít sữa) 1 lít

Hấp 1210C – 30 phút

+ Môi trường Okara nhân giống AO

- Nước cất 60 ml Hấp 1210c – 30 phút

• Môi trường dùng để định lượng sơ bộ hệ enzyme của BS và AO

-NaNO3 3.5g - K2HPO4 1.5g - MgSO4 0.5g - KCL 0.5g - Đường 30g - Okara 12.5g - Nước cất đủ 1000ml - pH 6.5-7,0

2.1.2 Hóa chất

- H2SO4 đậm đặc, 1.25% và 72% - Dung dịch NaOH 10%

- Cồn 960 và 800- Thuốc thử Antron - Glucose 0.01% - K3Fe(CN)6 - Fe2(SO4)3 - Gelatin 10% - HCL10% và 1N

- Dung dịch Na2S2O3 0.01N - Dung dich axetate 2M, pH 5.5

- Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH 7 - Dung dịch casein 1%

- Dung dịch TCA 0.4 M - Thuốc thử Folin

- Dung dịch tinh bột 1% - Thuốc thử Lugol

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Cân điện tử - Nồi hấp - Bể điều nhiệt - Máy ly tâm - Máy quang phổ - Kính hiển vi

- Máy cất đạm bán tự động - Máy Soxhlet

- Máy lắc - Máy đo pH - Tủ sấy

- Máy xay sinh tố

2.2 Phương pháp thực hiện

2.2.1 Qui trình kỹ thuật lên men nước tương

Sơ đồ 4: Qui trình kỹ thuật lên men nước tương

2.2.2 Qui trình nhân giống

2.2.2.1 Qui trình nhân giống Bacilus subtillis

Ngâm

Hấp 1000C – ở áp suất thường

Ngâm

Nấu chín

Ủ 3-5 ngày ơÛ nhiệt độ phòng Ủ 3-5 ngày

ơÛ nhiệt độ phòng

Trộn đều, xay

Lọc

Sơ đồ 5: Qui trình nhân giống BS

Mục đích: Nhân sinh khối vi khuẩn trong môi trường sữa đậu nành và sinh khối này dùng để cấy vào nguyên liệu để lên men

2.2.2.2 Qui trình nhân giống A.oryzae

Sơ đồ 6: qui trình nhân giống AO

Mục đích: Nhân sinh khối mốc trong môi trường Okara và dùng làm giống cấy vào nguyên liệu để lên men

2.2.3 Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu

Môi trường sữa đậu nành 3% đường

Hấp 1210C-30 phút

Ủ 48-72giờ ở nhiệt độ thường

Giữ ở 50C

Giống B.subtillis

Môi trường Okara 4-6

Hấp 1210C-30 phút

Ủ 48-72giờ ở nhiệt độ thường

Giữ ở 50C

Giống A.oryzae