nghiên cứu lên men nước tương từ những nguyên liệu không truyền thống

Vì vậy tôi muốn nghiên cứu sản xuất nước tương theo phương pháp lên men, tận dụng những phế phẩm có nguồn gốc từ đậu nành như: bã okara, bánh dầu đậu nành.. Giới thiệu chung về nước tươn

Giới thiệu chung về nước tương

Nước tương là một loại thực phẩm được chế biến từ nguyên liệu chính là đậu nành rất thông dụng ở các nước Aù châu Nước chấm giàu acid amin vì đó là quá trình thủy phân protein của hạt đậu nành thành các acid amin Thành phần nước chấm thu được chủ yếu là acid amin, peptid có trọng lượng phân tử thấp và NaCl

Tương làm bằng phương pháp lên men được sản xuất ra từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nước và giống nấm mốc Được ủ qua một thời gian từ 3 tới 12 tháng tùy theo loại và quốc gia sản xuất

Quy trình làm nước tương Nhật Bản trải qua ba giai đoạn lên men Nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất nước tương Nhật Bản gồm có đậu tương, lúa mỳ, nước và muối.

• Giai đọan tạo ra koji: koji là hỗn hợp của các enzyme protease phân hủy protein đậu nành thành peptides và acid amin Và các enzyme amylase phân hủy tinh bột của lúa mì thành đường Nguyên liêu đậu nành đưa vào được lấy hết dầu ra hoặc hạt đậu nành con nguyên thì được ngâm trong nước cho trương ra và sau đó nấu ở áp suất cao Lúa mì thì được rang với không khí nóng ở áp suất khí quyển Sau đó lúa mì được làm vỡ ra 4-5 phần Trong quá trình làm nước tương truyền thống đậu nành đã được nấu đem trộn với lúa mì đã rang với tỉ lệ 50-50 và sau đó cấy giống mốc vào ( Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus sojae spores) với tỉ lệ giống 0.1-0.2 % Hỗn hợp sau khi đã cấy giống được ủ ở 25 0 C trong 72g mốc sẽ phát triển và tạo bào tử làm hỗn hợp koji trở nên có màu lục vàng

• Giai đoạn lên men với nước muối: ở giai đọan này nước muối 20% được cho vào koji và tất cả được chuyển qua bồn lên men Và hỗn hợp này được gọi là moromi Giống vi khuẩn lactic ( Pedicoccus halophilus) được cho vào moromi, giữ ở 15 0 C tháng đầu tiên cho đến khi pH giảm tử 6.5 -> 5.0 vì có sự hình thành của acid lactic Sau đó nấm men ( Saccharomyces rouxii và Candida sp) được cho vào để tiếp tục tạo ra alcohol Nhiệt độ của bồn lên men được tăng dần lên 28 0 C cho tới khi qua trình lên men rượu bắt đầu Trong suốt quá trình lên men 80-90% protein và tinh bột bị thủy phân thành acid amin và đường Glutamic và aspartic acid là những acid amin chính có mặt trong nước tương lên men Glutamic acid là thành phần quan trọng tạo nên vị cho nước tương Arabinose, glucose và galactose là các đường có mặt chính trong nước tương

• Giai đọan cuối: Hỗn hợp sau khi lên men được lọc ép, thanh trùng kiểu pasteur (pasteuriza) ở 70-80 0 C trong vài phút và rót chai đóng gói thành phẩm

Sơ đồ 1: qui trình sản xuất nước tương của Nhật

Chất lượng của nước tương được dựa trên các thông số về pH, độ chua, đạm nitơ, nồng độ muối, màu, vi sinh thực phẩm, mùi vị Mùi thơm quan trọng nhất của sản phẩm là HEMF ( 4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3-furanon) và các hợp chất este ketones và furans Các hợp chất ester dễ bay hơi được tạo thành bởi vi sinh vật trong quá trình lên men

TRỘN ĐỀU Đậu nành Lúa mì

Moromi 17-19% muoái Leân men lactic

Nước tương ngon kích thích bao tử tiết ra dịch vị, tạo cảm giác ngon miệng hơn, nó cũng giống như 1 ly rượu vang khai vi

Qui trình sản xuất nước tương truyền thống của Việt Nam.[8]

Nguyên liệu chính của tương bần là hạt đậu nành và đậu phộng, phối trộn với gạo nếp theo tỉ lệ cụ thể Tùy vào công thức chế biến, tỉ lệ nguyên liệu có thể thay đổi, trong đó đậu nành hoặc đậu phộng chiếm từ 70-90%, còn gạo nếp chỉ chiếm từ 10-30%.

Thông thường có thể thay bằng bột mì, bắp hay nguyên liệu giàu tinh bột khác

Chủng nấm mốc được sử dụng phổ biến là Asp.oryzae có màu vàng hoa cau Từ ống giống gốc trong môi trường thạch nghiêng, được nhân sinh khối trong môi trường dinh dưỡng thích hợp trong bình tam giác rồi sau đó nuôi trên khay với khối lượng tăng dần để dùng trong sản xuất đại trà Để nhân giống trong bình tam giác, người ta cho gạo, bắp đã xay nhỏ, cho nước vừa đủ ẩm sau đó hấp chín bằng nồi hấp thanh trùng ở áp lực 1 kg/cm 2 trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội đến nhiệt độ 30-35 o C rồi cấy truyền từ ống gốc vào bình tam giác, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30-35 0 C trong thời gian 40-48giờ

Khi mốc mọc vàng đều trong bình tam giác là lúc có thể nhân giống ra khay bằng cách trộn đều giống trong bình tam giác vô môi trường có thành phần như trên đã được hấp thanh trùng, rồi trải môi trường đã cấy giống thành lớp mỏng 2-3cm và ủ ở nhiệt độ từ 28-32 0 C trong thời gian từ 36-42 giờ, mốc sẽ phát triển xanh vàng hoa cau đều khay

Kỹ thuật lên men tương

Nguyên liệu là đậu nành hoặc phối trộn với đậu phộng, gạo nếp, được ngâm trong nước, vớt ra hấp chín ở 1,2 atm trong thời gian 3-4 giờ cho chín kỹ, lấy ra để nguội đến 30-35 0 C sau đó trộn giống mốc từ khay vào nguyên liệu (tỷ lệ 0,8-1% ) và trải mỏng 2-3 cm, giữ trong không khí ẩm và sạch 90-95% ở nhiệt độ 30-32 0 C Đây là giai đọan quan trọng nhất tạo điều kiện để thủy phân protein đậu nành thành acid amin và tinh bột thành đường khử

Sau khi nguyên liệu đã mọc nấm vàng cau, trộn đều với nước muối 20%, giữ ẩm thường xuyên khoảng 3-4 ngày Sau đó cho tất cả vào thiết bị lên men như bể, chum, khạp, thùng inox… và ủ trong khoảng thời gian cần thiết Sau đó ly trích ta được nước chấm loại 1 Phần bã thu được dùng dung dịch muối khoảng 20-25% cho ngập trong 8-12 giờ rồi trích ly nước chấm ra ta sẽ có nước chấm loại 2, loại 3

Sau đó phối trộn tất cả với nhau và thanh trùng 90-100 0 C và dùng benzoat natri 0,1% để bảo quản, rót chai thu được nước chấm thành phẩm

Sơ đồ 2 : Qui trình sản xuất nước tương của Việt Nam Đậu nành

Caáy gioáng moác Đánh tơi

Giới thiệu chung về nguyên liệu đậu nành

Đậu nành được coi là loại cây trồng quí vì chúng có tác dụng nhiều mặt Hạt đậu nành rất giàu dinh dưỡng đặc biệt là protein và dầu, có vai trò rất lớn trong việc giải quyết bữa ăn cho con người, nguyên liệu cho công nghiệp, thức ăn cho gia sỳc Đậu nành cú nguồn gốc ởứ Trung Hoa từ thời xa xưa, nhưng mãi tới thế kỷ 20, đậu nành mới được trồng phổ biến

Hạt đậu nành có hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹp, trùy dài Màu sắc cũng khác nhau trong đó loại hạt có màu vàng là tốt nhất Hạt đậu nành gồm có 3 bộ phận: vỏ, tử diệp và phôi Trong đó, vỏ hạt chiếm khoảng 8%, phôi chiếm khoảng 2% và tử diệp chiếm khoảng 90% trọng lượng hạt

Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau:

Bảng 1: Thành phần hóa học của hạt đậu nành

Thành phần protein chiếm 1 tỷ lượng lớn, trong đó globulin chiếm 85 – 95% Ngoài ra còn có 1 lượng nhỏ albumin, 1 lượng không đáng kể prolamin và glutein Thành phần hóa học của đậu thay đổi tùy theo từng loại đậu, thời tiết, đất đai, điều kiện trồng trọt và chăm bón Thành phần acid amin của protein đậu nành trừ methionin quá ít còn các acid amin khác có hàm lượng khá cao, tương đương với các acid amin có trong thịt

Bảng 2: Thành phần acid amin trong protein của đậu nành

Trong lipid của đậu nành gồm hai loại acid béo: no và không no

Loại không no có giá trị dinh dưỡng cao là loại acid béo không thay thế, chiếm 60 – 70% chất béo của hạt, gồm các loại acid linoleic (52 – 65%), acid linolenoic (2 – 3%), acid oleic (25 – 36%) Các loại no có acid panmitic (6 – 8%), acid stearic (3 – 5%), acid arachidonic (0.1 – 1.0%)

Thành phần hydratcacbon chiếm khoảng 20% hạt đậu nành, gồm hai loại: tan và không tan trong nước Loại tan được trong nước chiếm khoảng 70% toàn bộ hydratcacbon Loại không tan trong nước gồm cellulose và hemicellulose

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành, trong đó đáng chú ý nhất là canxi, phospho, mangan, kẽm và sắt

Bảng 3: Thành phần khoáng trong đậu nành

Saét 90 – 150 mg/kg Ngoài ra trong hạt đậu nành còn chứa rất nhiều vitamin khác nhau, trừ vitamin C và vitamin D

Bảng 4: Thành phần vitamin trong đậu nành

Riboflavin 3.4 – 3.6 mg/kg Niaxin 21.4 – 23.0 mg/kg Pyridoxin 7.1 – 12.0 mg/kg

Tuy nhiên đậu nành có một số nhược điểm như chứa chất ức chế enzym trypsin, chất memagglutinin và mùi đậu nành…

1.2.2 Bã đậu nành( Okara ) thu từ qui trình sản xuất sữa đậu nành của

Okara là một thứ bột màu vàng, nó chứa các thành phần không hòa tan trong nước của hạt đậu nành Okara là phụ phẩm thu nhận từ quy trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu nành như sữa đậu nành Okara vẫn còn chứa nhiều chất dinh dưỡng khác như khoáng chất, vitamin và khá đầy đủ các acid amin của đậu nành Hiện nay okara được sử dụng chủ yếu là làm thức ăn cho gia súc

Thành phần bã okara (thông tin do Vinamilk cấp):

❖ Bã okara khô: Độ ẩm 6,7%

❖ Bã okara ướt: Độ ẩm 85%

Sơ đồ 3: Qui trình thu nhận bã OKARA

Bánh dầu nành là sản phẩm phụ của từ qui trình sản xuất dầu ăn, bánh dầu nành hiện nay chủ yếu dùng trong chăn nuôi và trong qui trình sản xuất nước tương hóa giải Bánh dầu đậu nành của Ấn Độ thường có hàm lượng Protein khoảng 45%, chất béo khoảng 1%

Ngâm nước nóng đối lưu 5 phuùt: 85-90 0 C

Gạo lức

Bảng 5: Thành phần dinh dưỡng gạo lức

Thành phần dinh dưỡng của gạo lức: (đơn vị tính theo % nhu cầu dinh dưỡng hàng ngày)

Gạo lức có rất nhiều lợi ích về sức khỏe Câu hỏi được đặt ra là: “Tại sao là gạo lức chứ không phải là gạo trắng được xem là một trong những thực phẩm tốt nhất trên thế giới?” Sự khác biệt giữa gạo lức và gạo trắng không phải là màu sắc mà do quy trình chà xát trong quá trình sản xuất gạo Toàn bộ hạt gạo gồm vài lớp màng bọc Chỉ có lớp vỏ trấu ngoài cùng là được loại bỏ trong quy trình sản xuất gạo lức Quy trình này giúp gạo lức hạn chế tối đa việc mất đi các chất dinh dưỡng có trong lớp cám và phần lớn lớp mầm như quy trình sản xuất gạo trắng

Việc chà xát làm mất đi lớp aleurone – lớp chứa chất béo thiết yếu có lợi cho sức khỏe Nguyên nhân loại bỏ lớp này là do các chất béo một khi để lâu trong không khí sẽ dễ dàng bị oxy hóa, làm rút ngắn thời gian bảo quản sản phẩm Theo nghiên cứu chu trình chà xát, xay xát chuyển từ gạo lức thành gạo trắng đã phá hủy 67% lượng vitamin B3, 80% vitamin B1, 90% vitamin B6, 50% mangan và phosphor, 60% lượng sắt và toàn bộ chất xơ cũng như các chất béo thiết yếu khác

Gạo lức là nguồn mangan dồi dào, giúp xương chắc khỏe và hỗ trợ trao đổi chất Nó cũng chứa nhiều magiê, selen và phốt pho, đóng vai trò quan trọng trong sản xuất năng lượng, chức năng tuyến giáp và sức khỏe xương Ngoài ra, gạo lức cung cấp chất xơ dễ tiêu, thúc đẩy tiêu hóa khỏe mạnh và chứa chất chống oxy hóa glutathion, giúp bảo vệ tế bào khỏi hư hại.

Gạo lức còn có các acid pantotenic, paraaminobenzoic, acid folic, acid philyc, các chất khoáng như Ca, Fe, Mg, K, Na Selenium đã được y học kiểm chứng rằng có khả năng ngăn ngưà ung thư Glutathion thì phòng nhiễm bụi phóng xạ Acid pantotenic giúp tăng cường chức năng của vỏ não chống viêm da, u bứu ác tính

Gạo lức ngâm 22 giờ ở trạng thái nẩy mầm nên nó có chứa rất nhiều chất bổ dưỡng Mầm gạo lức có chứa rất nhiều dinh dưỡng như xơ, chưá gấp 3 lần lysin là acid amin cần thiết cho sự tăng trưởng và bảo trì các mô tế bào cơ thể con người, và chứa gấp 10 lần acid gamma-aminobutylic, một acid tốt bảo vệ thận

Trong mầm gạo lức có chứa một loại enzym, có tác dụng điều hòa các hoạt động ở trung ương não bộ Gạo lức nẩy mầm không chỉ dem lại nhiều chất dinh dưỡng mà còn nấu rất dể dàng và cung ứng cho chúng ta một khẩu vị hơi ngọt vì các enzyme đã tác động vào các chất đường và chất đạm trong hạt gạo Một thành phần quan trọng khác là chất dầu trong vỏ bọc ngoài của gạo lức có tác dụng giảm lượng choleterol trong máu, một yếu tố gây nên bệnh tim mạch Các nhà khoa học tìm thấy trong chất cám bọc ngoài gạo lức có chất dầu tên là tocotrienol factor (TRF) có tác dụng khử những chất hóa học gây đông máu và giảm cholesterol Ngoài ra trong lớp cám bọc ngoài còn có một chất khác nửa có khả năng chống lại chất xúc tác enzyme HMG-CoA, một chất có khuynh hướng gia tăng lượng cholesterol xấu LDL.

Naám moác Aspergillus oryzae (AO)

Phân loại theo Bergey Aspergillus oryzae thuộc:

Giới : nấm Lớp : Eurotiomycetes Họ : Trichocomaceae Gioáng: Aspergillus

Cơ thể sinh trưởng là một hệ sợi, bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang từ 5 – 7 àm, phõn nhỏnh rất nhiều và cú vỏch ngang chia sợi thành nhiều tế bào (nấm đa bào) A.oryzae là loài đã được sử dụng 1000 năm nay để sản xuất thực phẩm và đồ uống lên men cổ truyền của Nhật Bản

A.oryzae là một vi sinh vật có khả năng tạo nhiều enzym Chính nhờ có sự hiện diện của các loại enzym này mà A.oryzae đóng vai trò hết sức quan trọng trong công nghiệp thực phẩm Hệ nấm mốc A.oryzae cho ba loại enzym, chủ yếu là amylase, sau đó là protease và oxy hoá khử Điều kiện sinh trưởng: môi trường có độ ẩm 45% là điều kiện thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử để làm giống, còn để hình thành enzym là 55 – 58%, pH môi trường khoảng 5,5 – 6,5, độ ẩm không khí là 85 – 95% A.oryzae là loại hoàn toàn hiếu khí, khi có đủ oxy thì phát triển rất mạnh

Khi nuôi cấy nấm mốc để làm giống, thời gian tối ưu là 60 - 70 giờ để bào tử hình thành hoàn chỉnh Đối với việc nuôi cấy nấm mốc để sản xuất enzym, thời gian tối ưu thay đổi tùy theo loại enzym mong muốn: 30 - 36 giờ cho enzym amylase cực đại, 36 - 42 giờ cho enzym protease cực đại và một số chủng cho giá trị cực đại kép của hai enzym này là 36 - 60 giờ.

Vi khuaồn Bacillus subtilis (BS)

Theo phân loại của Bergey Bacillus subtilis thuộc Giới : Bacteria

Họ : Bacilaceae Gioáng : Bacillus Loài : B subtilis

BS nhuộm Gram BS nhuộm bào tử

Họ Bacilaceae là những trực khuẩn không tạo chuỗi, có nội bào tử khác biệt với tế bào dinh dưỡng về khả năng khúc xạ ánh sáng, nhuộm màu và độ bền trước nhiệt và các yếu tố phá hủy Bào tử chứa acid dipicolinic, được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài Các vi khuẩn này có thể hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý, thường có dạng thẳng hoặc gần thẳng với kích thước 0,3-2,2x1,2x7,0 micromet Phần lớn có khả năng di động và tạo ra một nội bào tử bền nhiệt trong mỗi tế bào.

Bacillus subtilis Là loài trực khuần G(+),hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào tồn tại riêng rẽ hay dính lại với nhau tạo thành chuỗi ngắn Khi còn non có khả năng di động nhờ tiên mao,về sau khi tiên mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ hình thành nha bào tử Kích thước của nha bào tử không lớn hơn kích thước tế bào nên vi khuẩn vẫn giữ nguyên hình dạng khi hình thành nha bào tử

Bacillus subtilis có mặt khắp nơi trong tự nhiên,chúng có nhiều trong rơm cỏ cho gia súc ăn nên có tên gọi là trực khuẩn rơm cỏ,chúng còn phân bố rộng rãi trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó.Trong bột mì Bacillus subtilis chiếm khoảng 75-95% số vi khuẩn tạo bào tử Người ta nhận thấy rằng vi khuẩn nhóm Bacillus subtilis có mặt khắp nơi và đóng vai trò có lợi cũng như có hại trong quá trình biến đổi sinh học Từ các nguyên vật liệu dùng để sản xuất như bột mì,bột gạo,muối hột….tới các sản phẩm truyền thống như nước mắm các loại, tương, mẻ ,chao…

Do có bào tử chịu nhiệt cao nên Bacillus subtilis có thể gây hỏng một số thực phẩm hộp Đồ hộp lúc đó có mùi thối chua rất khó chịu, không tạo gaz hoặc tạo gaz trong môi trường có đường Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các sản phẩm sữa,bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân nhất là các sản phẩm trên được bảo quản ở nhiệt độ nóng Bacillus subtilis gây bệnh chảy nhớt khoai tây và bệnh chảy nhớt bánh mì do Laurent phát hiện đầu tiên năm 1885 nên cũng từ đó có tên gọi là trực khuẩn khoai tây

Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều loại kháng sinh kháng với nhiều loại vi trùng gây bệnh như subtilin (Humfeld và Feustel,1943),eumycin (Johnson và Burdon, 1946), bacilin (Foster và Woodruff, 1946) bacillomin (Shtikell và Poplavskii, 1955) Ngoài subtilin từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis còn có thể thu được nhiều loại kháng sinh khác nữa Trong số kháng sinh đó có những loại qúy như Polimixin diệt được trực khuẩn mủ xanh (P.aeruginosa) từng kháng rất nhiều kháng sinh Polimixin dùng điều trị các bệnh viêm não, các vết thương nhiễm trùng và bệnh ngoài da Bacitracin có tác dụng chống vi khuẩn gram dương hiếu và kị khí cũng như nấm men gây bệnh.

Vật liệu – Nguyên liệu – Hóa chất – Thiết bị

Okara: được cung cấp bởi công ty sữa Vinamilk

Bánh dầu đậu nành Hạt đậu nành Gạo lức, gạo nếp

+ Môi trường PGA ( giữ giống AO) - Glucose 10g

- Khoai taây 200g - Agar 20g - Nước cất đủ 1000 ml Haáp 121 0 C – 30 phuùt

+ Môi trường CP( giữ giống BS)

-Nước cất đủ 500 ml Haáp 121 0 C – 30 phuùt

+ Môi trường sữa đậu nành nhân giống BS

- Sữa đậu nành(1 kg đậu xay cho 15 lít sữa) 1 lít

+ Môi trường Okara nhân giống AO

- Nước cất 60 ml Haáp 121 0 c – 30 phuùt

• Môi trường dùng để định lượng sơ bộ hệ enzyme của BS và AO

-NaNO3 3.5g - K2HPO4 1.5g - MgSO4 0.5g - KCL 0.5g - Đường 30g - Okara 12.5g - Nước cất đủ 1000ml - pH 6.5-7,0

- Cồn 96 0 và 80 0 - Thuốc thử Antron - Glucose 0.01%

- HCL10% và 1N - Dung dòch Na2S2O3 0.01N - Dung dich axetate 2M, pH 5.5 - Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH 7 - Dung dòch casein 1%

- Dung dòch TCA 0.4 M - Thuốc thử Folin

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Cân điện tử - Noài haáp - Beồ ủieàu nhieọt - Máy ly tâm - Máy quang phổ - Kớnh hieồn vi - Máy cất đạm bán tự động - Máy Soxhlet

- Máy lắc - Máy đo pH - Tuû saáy - Máy xay sinh tố

Phương pháp thực hiện

2.2.1 Qui trình kỹ thuật lên men nước tương

Sơ đồ 4: Qui trình kỹ thuật lên men nước tương

2.2.2 Qui trình nhaân gioáng 2.2.2.1 Qui trình nhaân gioáng Bacilus subtillis

Caáy gioáng 5% Caáy gioáng 5% Ủ 3-5 ngày ơÛ nhiệt độ phòng Ủ 3-5 ngày ơÛ nhiệt độ phòng

Leân men 2-3 tháng ở nhiệt độ phòng

Sơ đồ 5: Qui trình nhân giống BS

Mục đích: Nhân sinh khối vi khuẩn trong môi trường sữa đậu nành và sinh khối này dùng để cấy vào nguyên liệu để lên men

2.2.2.2 Qui trình nhaân gioáng A.oryzae

Sơ đồ 6: qui trình nhân giống AO

Mục đích: Nhân sinh khối mốc trong môi trường Okara và dùng làm giống cấy vào nguyên liệu để lên men

2.2.3 Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu

Môi trường sữa đậu nành 3% đường

Haáp 121 0 C-30 phuùt Ủ 48-72giờ ở nhiệt độ thường

Haáp 121 0 C-30 phuùt Ủ 48-72giờ ở nhiệt độ thường

Trong quá trình lên men nước tương, nguyên liệu chủ yếu bao gồm hai thành phần chính: protein và carbohydrate Nguồn protein thường được sử dụng là hạt đậu nành, okara hoặc bánh dầu đậu nành Trong khi đó, nguồn carbohydrate được cung cấp từ gạo nếp và gạo lứt.

Mẫu thí nghiệm chia làm 2 nhóm Nhóm truyền thống gồm các nguyên liệu truyền thống phổ biến như đậu nành hạt và nếp Nhóm không truyền thống có các nguyên liệu chỉ được dùng trong thí nghiệm của đề tài khóa luận như bã okara, bánh dầu nành và gạo lức

Bảng 6: Thành phần nguyên liệu và giống

Truyeàn thoáng Khoâng truyeàn thoáng

Maãu Maãu1 Maãu 2 Maãu 3 Maãu 4

Protein Đậu nành Đậu nành Okara Bánh dầu nành Đường Nếp Nếp Gạo lức Gạo lức

Gioáng AO AO-BS AO-BS AO-BS

Mẫu 1: Là mẫu truyền thống, được dựng đểồ làm mẫu đối chứng so với những mẫu còn lại Qui trình kỹ thuật được áp dụng là sơ đồ 4, chỉ khác sơ ủoă 2 ụỷ choể gioõng vi sinh vaụt chư sửỷ dỳng A.oryzae

Mẫu 2,3,4 : là mẫu không truyền thống ( mẫu thí nghiệm) Qui trình kỹ thuật dùng trong các mẫu này là sơ đồ 4

2.2.4 Phương pháp ly trích nước tương từ bã lên men

Sau quá trình lên men, toàn bộ hỗn hợp được đem đi lọc ép để thu hồi nước tương Bã sau khi ép vẫn còn chứa 1 lượng dinh dưỡng tương đối cao, vì vậy phải ly trích lượng dinh dưỡng đó ra khỏi bã bằng nước muối

Chuẩn bị nước muối nồng độ 16% đã được thanh trùng

Cho nước muối vào bã với tỷ lệ 1-1

Ngâm trong 30 phút và đem đi lọc

2.2.5 Nghiên cứu nồng độ muối thích hợp cho quá trình lên men

Mục đích cho muối vào trong hỗn hợp lên men là để ức chế các vi sinh vật và chỉ để các enzyme họat động Mặt khác muối làm tăng thêm hương vị cho sản phẩm Nhưng nếu nồng độ muối quá cao nó cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men, vị của sản phẩm và sức khỏe

Các nồng độ muối được nghiên cứu

Nước muối được cho vào với thể tích bằng 2/3 thể tích hỗn hợp trước khi lên men Sao cho toàn hỗn hợp sau khi cho muối vào co nồng độ như bảng trên.

Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa

Hoạt tính enzym amylase được xác định theo phương pháp Smith &

Roe (1966) Hoạt tính của amylase biểu thị khả năng của amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50 o C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym đó trong 1g mẵu Khi phản ứng phân hủy tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với Iod và được đo bằng máy so màu quang học

Chuaồn bũ dung dũch enzym maóu

Tiến hành phân tích: lần lượt cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất như sau:

OÁng chuaồn OÁng thớ nghieọm

1 ml nước cất 1 ml dung dịch đệm phosphat 1 ml dung dịch tinh bột 1%

1 ml dung dòch enzym 1 ml dung dịch đệm phosphat 1 ml dung dịch tinh bột 1%

Tất cả đem ủ ở 50 o C trong 30 phút Cho 1 ml HCl 1N vào ngay các ống thí nghiệm để kìm hãm hoạt động cuûa enzym

Thêm nước cất đến 10 ml mỗi ống

Cho vào mỗi ống 1 giọt Lugol, lắc đều rồi đem đi đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm

Hoạt tính enzym amylase được xác định theo công thức:

Eo: mật độ quang của ống chuẩn Et: mật độ quang của ống thử C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10 g)

L: hệ số pha loãng t: thời gian phản ứng (30 phút) a: theồ tớch maóu (1 ml)

2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính của protease[9]

Dùng protein “casein” làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzym protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng cuûa enzyme

•Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50;

60; 70; 80 àg Tyrosin/1 ml HCl 0.1M Theõm 5 ml dung dũch dung dũch Na2CO3 0.4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp

Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 ± 0.5 o C trong 20 phút Đo độ hấp thu dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả As10; As20; As30; As40; As60) Đối với đối mẫu chứng: dùng 1 ml dung dịch acid HCl 0.1M thay cho Tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này làm đối chứng As0)

Dựng đường chuẩn theo hàm lượng àg Tyrosin và đo độ hấp thụ F = {10/(As10 – As0) + 20/(As20 – As0) + 30/(As30 – As0) + 40/(As40 – As0) + 50/(As50 – As0)}/5

•Xác định hoạt tính enzym protease Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1.5% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37 ± 0.5 o C trong 10 – 15 phút Sau thời gian ủ, cho 1 ml dung dịch enzym vào và lắc đều Đem ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37 ± 0.5 o C trong 60 phút Sau đó cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch TCA 0.4M, để ổn định dung dịch trong 25 phút rồi lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Tiếp tục cho 5 ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp này Trộn đều, để yên ở 37 ± 0.5 o C trong 20 phút Khi dung dịch xuất hiện màu xanh đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm (A60)

Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzym và tiến hành các bước tương tự như ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thu ở bước sóng 660 nm

Một đơn vị hoạt tính enzym protease được xác định là lượng enzym để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 àg Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm ẹVHT/ml dung dũch enzym = (A60 – A0)*F*n*1/100 Trong đó:

A60: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm A0: độ hấp thu của mẫu đối chứng F: hệ số tương quan giữa hàm lượng Tyrosin (àg) và độ hấp thu ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn n: hệ số pha loãng của enzym 1/100: hệ số chuyển đổi

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính của lipase[5]

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo

Hoạt độ của enzym lipase được xác định bằng cách chuẩn độ lượng axit được tạo ra bởi phản ứng xúc tác của enzym bằng dung dịch kiềm Hoạt độ enzym được biểu thị bằng lượng kiềm cần thiết để trung hòa lượng axit vừa hình thành Lipid có nguồn gốc từ cùng một đối tượng chứa enzym là cơ chất lý tưởng cho phản ứng do lipase xúc tác.

Hút 1 – 2 ml dung dịch enzym vào bình tam giác, cho thêm 1 ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml dung dịch đệm acetat với vài giọt toluen

Trộn đều hỗn hợp và cho vào tủ ấm 30 o C trong 20 – 24 giờ

Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzym 3 – 5 phút để làm mất hoạt tính của enzym trước khi cho tiếp xúc với cơ chất

Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25 ml cồn 96% và 15 – 25 ml ete Lắc đều, để lắng Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH với 0.5 ml chỉ thị màu thymolphtalein 1% Đối với dịch chiết nguyên liệu thực vật không có màu thì dùng chỉ thị màu phenolphtalein

Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0.1N trong 10g theo công thức:

X: hoạt độ của lipase a: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm b: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra f: heọ soỏ chổnh lyự NaOH 0.1N w: trọng lượng (g) hoặc thể tích mẫu (ml)

2.3.4 Phương pháp xác định đạm tổng số [2]

Chất đạm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác thành muối amonisunfat (NH4)2SO4 Muối này đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng ra NH3

Chất đạm (NH4)2SO4 xúc tác, t O (NH4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4

Sau đó lượng NH3 sinh ra được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3 mà ở đó H3BO3 tự phân ly:

Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2

NH4OH + HBO2 NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một baz mạnh, bởi vậy dung dịch trong bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ Lượng BO2 - được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định lượng BO2 - bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0.25N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu đỏ tím

Cân 100g mẫu đã nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 5g chất xúc tác và 5 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu Khi thời gian phá mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội và bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất

•Chửng caỏt Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32%

Khởi động qui trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu Ngừng chưng cất khi không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ).Tiến hành chuẩn độ bằng HCl 0.25N cho đến khi xuất hiện màu phớt đỏ

Kết quả khảo sát enzyme thủy giải

Thời gian (giờ) A.oryzae B.subtilis

Theo pH: pH A.oryzae B.subtilis

* Nhận xét: Hoạt tính enzym amylase cao nhất ở thời điểm 48g, pH 6 đối với

A.oryzae và 56g, pH 7 đối với B.subtilis

Thời gian (giờ) A.oryzae B.subtilis

Theo pH: pH A.oryzae B.subtilis

❖ Nhận xét: Hoạt tính enzym protease cao nhất ở thời điểm 32g, pH 6 đối với A.oryzae và 32g, pH 7 đối với B.subtilis Hoạt tính enzym protease của B.subtilis có giá trị cao hơn của A.oryzae (gấp 2.5 lần)

* Nhận xét: Ở BS không thấy có khả năng tạo lipase Hoạt tính enzym lipase của AO cao nhất ở thời điểm 48h, pH 6.

Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng

Đạm tổng (%) Đạm formol g/lit Đạm amoniac g/lit Đường toồng àg/ml Đường khử àg/ml

Maãu soá 2 Đạm toồng (%) Đạm formol g/lit Đạm amoniac g/lit Đường toồng àg/ml Đường khử àg/ml

Maãu soá 3 Đạm tổng (%) Đạm formol g/lit Đạm amoniac g/lit Đường toồng àg/ml Đường khử àg/ml

Maãu soá 4 Đạm toồng (%) Đạm formol g/lit Đạm amoniac g/lit Đường toồng àg/ml Đường khử àg/ml

H1: Màu của sản phẩm H2: Sản phẩm trước lọc

- Màu: Mẫu 1 có màu cánh gián nhạt, mẫu 2, 3, 4 độ đậm tăng lên và chuyển dần qua màu đen

Về mùi, tất cả các mẫu đều có mùi thơm đặc trưng của nước tương lên men Riêng mẫu 3 còn có mùi gắt của dầu (lipid) Về vị, tất cả các mẫu đều có vị mặn, vừa Tuy nhiên, mẫu 2, 3 và 4 có vị hơi đắng.

- So sánh giữa mẫu 1 và 2 ta thấy sự thủy phân protein hạt đậu nành ở mẫu số 2 cao hơn so với mẫu số 1 ( Nfor /NTS M1 <

- Đạm tổng: Hàm lượng đạm tổng giảm do vi sinh sử dụng để tăng sinh khối và sử dụng cho hoạt động sống

- Đạm formol: Hàm lượng đạm formol tăng do enzym protease vi sinh vật thủy phân protein trong Okara thành các peptide ngắn và acid amin

- Đạm amoniac: Hàm lượng đạm amoniac cũng tăng do trong quá trình phát triển các vi sinh vật phân hủy protein tạo NH3

- Đường khử: Hàm lượng đường khử tăng do enzym amylase thủy phân tinh bột tạo ra đường Tuy nhiên mẫu 3,4 co hàm lượng đường ít hơn so với mẫu 1,2

- Đường tổng: Hàm lượng đường tổng giảm dần do vi sinh vật sử dụng cho các hoạt động sống

- Tỷ lệ N for / NTS: M3 < M1 < M4 < M2 Từ đó suy ra sự thủy phân của mẫu số 2 mạnh nhất và mẫu số 3 yếu nhất

- Tyỷ leọ N NH3 / N for: M4 < M3 < M2 < M1 Maóu bũ leõn men thoỏi nhiều nhất là mẫu M1, mẫu ít nhất là M4 nhưng tất cả 4 mẫu đều có tỷ lệ NNH3 / Nfor < 0.5

- Màu: Màu đậm dần do các phản ứng sinh hóa( phản ứng oxy hóa), phản ứng maillard giữa các amin và đường khử

- Mùi: Gắt dầu do nguyên liệu bị loại bỏ dầu từ trước và cũng do hê enzym lipase của giống vi sinh vật chưa phân giải được nhieàu lipid

- Vị: Vị đắng do BS phân hủy protein đậu nành đến các đầu mạch ngắn chứa leucine và isoleusine có vị đắng đặc trưng

❖ Thành phần dinh dưỡng: sau thời gian thực hiện đề tài, có thể nói chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc dùng các nguyên liệu không truyền thống để chế biến nước tương bằng phương pháp lên men Thiết lập được một qui trình kỹ thuật cho quá trình lên men

❖ Trong quá trình chế biến sản phẩm:

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên cơ chất phù hợp thúc đẩy khả năng sản xuất enzyme của từng chủng Việc sử dụng hai chủng vi khuẩn AO và BS cùng hai loại cơ chất khác nhau nhằm tối ưu hóa quá trình hình thành enzyme, khai thác tối đa tiềm năng sản sinh enzyme từ mỗi chủng vi khuẩn trên cơ chất thích hợp với chúng.

Trong quá trình ủ, phải tạo điều kiện thoáng khí cho vsv hô haáp

Trong quá trình lên men phải khuấy thường xuyên dịch lên men để enzyme có thể tác động tốt lên cơ chất hơn

+ Hoạt tính protease của AO cao nhất ở 32giờ, pH 6; của BS ở

+ Hoạt tính amylase của AO cao nhất ở 48giờ, pH 6; của BS ở 56giờ, pH 7

+ Hoạt tính lipase của AO cao nhất ở 48giờ, pH 6; của BS không thấy có sự tạo thành của lipase Đề nghị:

- Tăng độ thủy phân của các enzym đối với các cơ chất, đặc biệt là tác dụng của cellulase và lipase

- Nghiên cứu nồng độ muối thích hợp để hỗn hợp lên men và bảo quản mẫu tốt hơn.