Vì vậy, chúng em tiến hành thực hiện đề tài: “Thẩm định phương pháp LC- MS/MS phân tích thuốc X trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học” với các mục tiê
Độ đặc hiệu - chọn lọc
Độ chọn lọc ( Selectivity) : là mức độ mà phương pháp có thể xác định một hợp chất cụ thể trong nền mẫu được phân tích mà không ảnh hưởng bởi các thành phầnnền mẫu. Độđặchiệu ( Specificity) : là khảnăngcủaphương pháp đánh giá một cách rõ ràng chất phân tích khi có mặt các thành phần khác dự kiến sẽ có mặt (vd : tạp chất , sp phân huỷ , thành phầnnền vv…)Độchọn lọc là khảnăngnhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với cácthành phần khác có trong mẫu Phương pháp LC- MS/MS được coi là chọnlọc đốivớichất phân tích (AN) và chuẩnnội (IS) khi:- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng vàkhông bị ảnh hưởng bởi các pic khác.- Trên SKĐ các mẫu trắng (ítnhất6 mẫu có nguồn gốc khác nhau), tín hiệu đo tạithời điểm trùng với thời gian lưu của pic AN phải không vượt quá 20% tín hiệuđo của mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn và tín hiệuđo củamẫutrắng tạivị trí trùng với thời gian lưu của pic IS phải nhỏ hơn 5% so với đáp ứngtrung bình của IS trong các mẫu đường và mẫu kiểm tra (QC).
Ảnh hưởng của nền mẫu
- Ảnh hưởngcủanềnmẫu ( Matrix Effect : ME ) là ảnhhưởng của tấtcả các thành phần khác ngoài chất phân tích có trong mẫu.
- Phương pháp LC-MS/MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15%
- Giá trị MFAN, MFIS của AN và IS được xác định bằng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với cácmẫu phatrong pha động.
Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
- Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng độ của chất phân tích có trong mẫu.
- Khoảngtuyến tính là khoảngnồngđộ có sựtương quan tuyến tính giữanồng độ AN có trong mẫu với tỷ lệ tín hiệu đo của AN và IS.
- Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính, có hệ số tương quan r > 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:
+ Độ đúng nằm trong khoảng 85 - 115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120%
+ Ít nhất 75% số điểm thuộc đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất (LLOQ) và nồng độ cao nhất (ULOQ).
Xác định giới hạn định lượng dưới
Mẫu chuẩn có nồng độ AN thấp nhất củađường chuẩn được coi làmẫugiới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp khi:
- Pic AN đượcnhậndiện rõ ràng, không bịảnhhưởngbởi các thành phần khác và có tín hiệu đo ít nhất bằng 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng có thêm IS (zero).
- Độ đúng (so với nồngđộ thực) phảiđạt từ 80 - 120%, với giá trị CV ≤ 20%.
Độ đúng - độ chính xác trong ngày
- Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ AN định lượng được với nồng độ thực Độchính xác phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt của nồng độ AN định lượng được giữa các lần phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ.
- Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu.
- Độ đúng trong ngày và khác ngày phảiđạt trong khoảng 85 - 115%; độ chính xác trong ngày (độlặp lại) và giữa cácngày (độ tái lặp)với giá trịCV ≤ 15% Riêng nồng độ LLOQ cho phép độ đúng trong khoảng 80 - 120% và các giá trị CV ≤ 20%.
Tỷ lệ thu hồi của phương pháp
- Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khảnăng tìm lại của AN và IS sau quá trình chiết tách, xử lý mẫu bằng các kỹ thuật như tủa protein, chiết lỏng –lỏng hoặc chiết SPE Xác định độ thu hồi AN và ISbằng cách so sánh nồng độ(hoặc hàm lượng, tín hiệu đo) của AN hoặc IS trong các mẫu QC có qua quá trình chiết tách, xử lý với nồng độ (hoặc hàm lượng, tín hiệu đo) tương ứng của các mẫu chuẩn không qua xử lý, chiết tách (mẫu pha trong dung môi).
Khảo sát độ ổn định
- Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH…quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng 4 mẫu lớn Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình phân tích và bảo quản mẫu.
- Các nghiên cứu độổn định bao gồm:
- Độ ổnđịnh sau 3 chu kỳ đểđông– rã đông;độổnđịnhthời gian ngắnởnhiệt độ phòng; độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản; độ ổn định của mẫu sau xử lý và độ ổn định ở điều kiện dài ngày.
- Các mẫuđược coi là ổnđịnhởđiềukiện nghiên cứu(trừđộổnđịnhcủa dung dịch) nếu độ đúng của mẫu ổn định nằm trong khoảng 85% - 115% so với nồng độ lý thuyết ban đầu.
Độ nhiễm chéo
- Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình phân tích khi tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu trắng không lớnhơn 20% so với 14 đáp ứng trung bình củamẫu LLOQ và tạithời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của mẫu trắng không được lớn hơn 5% đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ.
KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG
Độ đặc hiệu - chọn lọc
2.1.1 Xác địnhđộ phù hợpcủa hệthốngsắc ký
Chuẩn bị mẫu có nồng độ X khoảng 100 ng/mL trong huyết tương Tiêm lặp lại
6 lần Kết quả ở Bảng 2.1 cho thấy giá trị CV (%) của thời gian lưu X nhỏ hơn 1%, giá trị CV (%) của diện tích pic X và IS, tỷ lệ diện tích pic X/IS nhỏ hơn 5% Hệ thống sắc ký ổn định và phù hợp để tiến hành định lượng các mẫuchứa X.
Bảng 2.1 Kếtquảđánh giá sự phù hợpcủahệ thống:
Diện tích pic Rt Diện tích pic Rt
2.1.2 Đánh giá độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng Rt của X và IS
Diện tích pic Tỉ lệ đáp ứng pic (%)
Blank/LLOQ Mẫu Blank Mẫu
Ảnh hưởng của nền mẫu
Chuẩn bị các mẫu LQC và HQC trong nền mẫu và dung môi pha mẫu, xác định tỷ số MFLISI/MFIS Kết quả được trình bày trong bảng 2.3
Bảng 2.3: Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu
ST T Dung môi pha mẫu Nền mẫu MFX/MFIS
LQC HQC LQC HQC LQC HQC
Kết quả thực nghiệm ở bảng 2.3 cho thấy, tỷsố MFX/MFIS ở cả hai mứcnồng độ thấp và cao (LQC và HQC) có giá trị CV lần lượt là 12.78% và 5.84% (< 15%), đáp ứng yêu cầu của một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học
Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn tronghuyết tương có nồng độ X 1; 2; 5;10; 40; 80; 140; 200 ng/mLđược chuẩn bị ở mục trên Xác định mối tương quan giữa nồng độ X trong huyết tương và tỷlệ diện tích pic X/IS thu được bằng phương pháp hồi quy tuyến tính với hệ số weighting 1/x2 được trình bày trong bảng 2.4
Bảng 2.4: Kếtquả khảo sát đườngchuẩn (X/IS)
(ng/mL) Độ đúng (%) Đường chuẩn 1 Đường chuẩn 2 Đường chuẩn 3 Đường chuẩn 4 Đường chuẩn 5
(ng/mL) Độ đúng (%) Đường chuẩn 1 Đường chuẩn 2 Đường chuẩn 3 Đường chuẩn 4 Đường chuẩn 5
Phương trình hồi quy y=Ax+B
Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng từ 1 - 200 ng/mL có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ X với tỷ lệ diện tích pic của X/IS với hệ số tương quan lớn hơn 0,99 Nồng độ Xxác định từ đườngchuẩnso với giá trịlý thuyết đều nằm trong giớihạn cho phép (85%- 115%) theo qui địnhcủaphương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.
Xác định giới hạn định lượng dưới
Tiến hành phân tích 06 mẫuchuẩn X pha trong huyết tươngởnồngđộthấpnhất của hoảng tuyến tính (khoảng 1ng/mL) được thực hiện trong 3 ngày Kết quả được trình bày trong bảng 2.5
Bảng 2.5: Kết quả xác địnhgiớihạn địnhlượngdưới trong 3 ngày
X IS Nồng độ (ng/mL) X/IS Độ đúng(%)
X IS Nồng độ (ng/mL) X/IS Độ đúng(%)
TT Mẫu zero X IS Nồng độ (ng/mL) X/IS Độ đúng(%)
Kết quả được trình bày ở bảng 2.5 cho thấy: tại vị trí thời gian lưu của X, diện tích pic trung bình của mẫu chuẩn ở nồng độ khoảng 1 ng/mL lớn hơn 5 lần diện tích pic trung bình của mẫu zero Độ chính xác sau 6 lần phân tích trong 3 ngày đều có giá trị CV (%) < 15%, giá trị trung bình của độ đúng đều nằm trong khoảng 80% đến 120% Như vậy mẫu chuẩn X có nồng độ 1 ng/mL đáp ứng yêu cầu là LLOQ của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học Giá trị LLOQ khoảng
1 ng/mL; xấp xỉ 1/60 – 1/100 giá trị Cmax chứng tỏ phương pháp phân tích đã xây dựng có đủ độ nhạy để định lượng X trong huyết tương người.
Độ đúng - độ chính xác trong ngày
Tiến hành xử lý và phân tích các lô mẫu LLOQ, LQC, SQC, MQC và HQC, mỗi nồng độ gồm 6 mẫu theo phương pháp đã xây dựng
Bảng 2.6: Kết quả khảo sát độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu LLOQ (1,0 ng/mL)
(ng/mL) X/IS Độ đúng(%)
Bảng 2.7: Kết quả khảo sát độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu LQC (3,0 ng/mL)
STT LLOQ: 1,0 ng/mL; PTHQ: y=-0.00175258+0.0122678*x, r = 0.9984
Bảng 2.8: Kết quả khảo sát độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu MQC (101,5 ng/mL)
STT LLOQ: 1,0 ng/mL; PTHQ: y=-0.00175258+0.0122678*x, r = 0.9984
Bảng 2.9: Kết quả khảo sát độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu HQC (162,5 ng/mL)
STT LLOQ: 1,0 ng/mL; PTHQ: y=-0.00175258+0.0122678*x, r = 0.9984
Bảng 2.10: Kết quả khảo sát độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu SQC (24,4 ng/mL)
Bảng 2.11: Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày (n=5)
STT LLOQ (~ 1 ng/mL) LQC (~ 3 ng/mL) MQC (~ 100 ng/mL) HQC (~ 160 ng/mL
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
STT LLOQ (~ 1 ng/mL) LQC (~ 3 ng/mL) MQC (~ 100 ng/mL) HQC (~ 160 ng/mL
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)
Kết quả thẩm định được trình bày ở các bảng (từ bảng 2.5 đến 2.11) cho thấy ở các mức nồng độ thấp, trung bình và cao của các mẫu QC, phương pháp có độ đúng trung bình trong ngày và khác ngày nằm trong khoảng cho phép 85 –115%, độ chính xác trong ngày và khác ngày có giá trị CV < 15%; riêng mẫu LLOQ có độđúng trung bình đềunằm trong giới hạn cho phép 80 – 120%, độ chính xác trong ngày và khác ngày có giá trị CV.
Tỷ lệ thu hồi của phương pháp
Các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC trong huyết tương được chiết tách theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động có nồng độ tương ứng.
Bảng 2.12: Kếtquả khảo sát tỷlệ thu hồicủa IS
STT Đáp ứng pic IS
Trong huyết tương Trong nền mẫu
Bảng 2.13: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của X
Huyết tương Dung môi Huyết tương Dung môi Huyết tương Dung môi
Kết quả định lượng bảng 2.12 và 2.13 cho thấy, ở các khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao, tỷ lệ thu hồi của X đạt từ 14,0 – 17,7 %; tỷ lệ thu hồi của IS là 69,7%; có CV
