Báo Cáo Thực Tập Ứng Dụng Các Kỹ Thuật Sắc Ký Để Phân Tích Chất Độc Gây Ảo Giác Và Kích Động Mạnh ‘‘Ketamine.pdf

Dé tính nồng độ kháng nguyên trong mẫu, cân chuẩn bị đường chuẩn sử dụng dung địch có nồng độ đã biết.. Việc tiếp tục thực hiện những nghiên cứu sâu hơn về ketamine là cần thiết để có th

BAO CAO THUC TAP

UNG DUNG CAC KY THUAT SAC KY DE PHAN TICH CHAT DOC GAY AO GIAC VA KICH DONG MANH “‘KETAMINE”

3 PHÂN TÍCH, SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG KETAMINE

VÀ DAN XUẤT CÓ TRONG MÂU DỊCH SINH HỌC (MÁU, HUYẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ HIỆN DAI (SAC KY LONG, SAC KY

KHÍ - 56 + SE E12 1 TH nàng 1110111420101 xe 6

3.3 Phương pháp Sắc kí lỏng - ¿5+ 5c 5t 2k2 E211 11 2711 221 E.t pc ey 18 3.4 So sánh các phương pháp định tính, định lượng Ketamine và các chấtchuyên hóa của chúng có

01901581)190803010)08 5A 23

Tiêng Anh ác LH HH Hà kh tà TH kh tà Tà kh TT KH TT HH TT HT Tà TH Tà TT Tà ii

chất chuân nội bằng chế độ SIM 2-22- 222 27+22222212212211221221121112212212211221 221.2, 11

Bảng 2 Thời gian lưu và các ion được chọn để xác nhận và định lượng GC —- MS 12 Bảng 3 Các thông số được tối ưu hóa cho Ketamine và Norketamine 19

Bảng 4 Đặc điểm phân tích của phương pháp LC-ESI-MS-MS đối với Ketamine và

Norketamine trong nước tiỂu -2- 2-22 ©2+2+222222E22E1EEE122122122212212112122112212221 22c 20 Bảng 5 So sánh các phương pháp định tính, định lượng Ketamine và các chất chuyển hóa của chúng có trong dịch sinh HỌC - +2 **kk*2ESskSsESskEkEkkkkksskrskrskrsrxre 23

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 Phương pháp ELISA Được mô tả ở trên là một ELISA bánh mì, hiện thị các bước trong xét

Hình 3 Một đường cong tiêu chuẩn điển hình Được hiển thi 1a duong cong chuancho IFN-y ELISA Dé tính nồng độ kháng nguyên trong mẫu, cân chuẩn bị đường chuẩn sử dụng dung địch có nồng độ đã biết

¬ §

Hình 4 Sắc kí đồ MS của K, K-d4 NK, NK-d4 và DHNK -: e te 13 Hình 5 Sắc kí đồ của chất chuân K và NK HH HH 14 Hình 6 Sắc kí đồ của mẫu nước tiểu - :- +: 2221111 HH 15

Hình 7 Nồng độ K, NK va DHNK trong mẫu nước tiéu duong timhe.ccccccccccccscessesseecsseeesseesseeesees 16 Hinh 8 Duong cong hiéu chuan cho NK (1) Va K (@®) thu duoc 6 ky thuat ghi SIM trong phan tích GC-

¡6 18

Hình 10 Sắc ký đồ của nước tiêu trang (A), 5 ng / mL Ketamine va Norketaminechuan (B), mẫu trường

1 ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) )

6 FDA United States Food and Drug Administration

8 IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

11 LC-MS-MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass

Spectrometry

22 TMP Trimethylphosphate

MO DAU Ketamine hay con duoc goi tắt là “ke” ở Việt Nam, có tên thương mại thường gặp là Ketalar và một số tên gọi khác như Special K, Kit Kat, Cat Valium, Dorothy, hoadc Vitamin K Ketamine được sử dụng trong y khoa như một loại thuốc gây mê Ngoài ra,

nó còn có tác dụng giảm đau cấp và mạn tính, kiểm soát chứng trầm cảm kháng trị [4][11] Ban đầu, ketamine được tong hop voi mong muốn thay thé cho phencyclidine Đến năm 1970, nó được chính thức đưa vào sử dụng gây mê cho người dưới sự phê duyét cua FDA [11] Tuy nhiên hiện nay, việc lạm dụng ketamine cho mục đích “phi y

tế” đã khiến nó trở thành một con dao hai lưỡi, một loại thuốc giải trí phố biến do tác

dung gay roi loan tam than

Khi dùng ở liều thấp, ketamine cho tác dụng hưng phấn và phân ly được gọi là “k-

land”; trong khi ở liều cao nó cho cảm giác “k-hole” Sử dụng ketamine quá liều sẽ gây

ức chế hô hấp, ngưng thở; hạ huyết áp, nhịp tim chậm, nhồi máu cơ tim; co giật, hôn mê

[16] Ketamine cũng gây hội chứng lệ thuộc thuốc tương tự morphin, heroin Một thuốc khi sử dụng không đúng mục ổích sẽ trở thành ma tuy va ketamine cting la một trường

hợp như vậy Năm 2020 trên thế giới ghi nhận sô người sử dụng ma tuý lên đến khoảng

284 triệu và chủ yêu rơi vào độ tuôi 15-64, tăng 26% so với thập kỷ trước; 11,2 triệu người trên thế giới đang tiêm chích ma túy, một nửa trong số này sống chung với bệnh viêm gan C, khoảng 1,4 triệu người đang sông chung với HIV và 1,2 triệu người đang

sông chung với cả hai [19] Một thống kê ở Việt Nam vào thời điểm 16/06/2022 cho biết, hiện nay cả nước có trên 217.059 người nghiện ma túy có hồ sơ quán lý (tăng

11.241 so với cuỗi năm 2021); 59.537 người sử dụng trái phép chất ma túy [2] Việc

lạm dụng ketamine thường xáy ra khi kết hợp với các chất khác bao gồm rượu,

amphetamine, MDMA, cocaine va caffein va gap nhiéu ở các nước Đông Nam Á như Đài Loan, Malaysia và Trung Quốc hơn so với các khu vực khác trên thế giới [16] Những hậu quả mà việc sử dụng ma tuý nói chung, ketamine nói riêng đem lại sẽ tạo

thành một gánh nặng lên xã hội về cả tỉnh thần lẫn vật chất Vì vậy, cần có những chiến

lược cụ thê như: triển khai và mở rộng tuyên truyền thích hợp để nâng cao hiểu biết cho

người dân về hậu quả của việc sử dụng chất ma tuý; thắt chặt quản lý, tăng cường giám sát và kiêm soát đối với các dạng thuốc gây nghiện, hướng thần, tiền chất Còn đối với những người sau cai nghiện, tạo điều kiện cho họ tái hoà nhập với cộng đồng sẽ là mục

tiêu cần lưu ý Ketamine sẽ mang lại nhiều lợi ích hơn tác hại nếu chúng ta sử dụng chúng đúng cách Việc tiếp tục thực hiện những nghiên cứu sâu hơn về ketamine là cần thiết để có thê tìm ra được phương pháp giúp phát hiện một cách nhanh chóng và chính xác ketamine trong mẫu dịch sinh học, thực phẩm, góp phân trong việc phát hiện sớm các trường hợp nghiện ma tuý

Năm 1970, được đưa vào thực hành lâm sàng

Trong những năm gần đây, con người sử dụng ketamine (đặc biệt là chất đối quang của nó) đề điều trị tram cam

Năm 1992, ở Pháp Trường hợp lạm dụng ketamine đầu tiên được ghi nhận vào, dẫn đến sự giám sát đặc biệt của các cơ quan y tế

Năm 1997, được đưa vào danh sách các chất gây nghiện [8]

Công thức hoá học: C¡:H¡¿CINO

Tén IUPAC: 2-(2-chlorophenyl)-2-(methylamino) cyclohexan- 1-one

Hình 1 Cấu trúc hoá học của Ketamine

1.2 Tính chất lý hoá

Ketamine tồn tại dưới dạng tinh thê màu trắng, có điểm nóng cháy là 92,5°C Tan trong nước Dạng muối cloride của nó tan trong nước với độ hòa tan là 20g/100mL, tan tự do trong metanol, tan trong rượu, hòa tan ít trong cloroform Ketamine có pKa = 7,5, pH dung dịch=3.5

Màu sắc của dung dịch có thể thay đối từ không màu đến hơi vàng và có thể sãm

lại khi tiếp xúc lâu với ánh sáng Sự sẫm màu này không ảnh hưởng đến hiệu lực Không

sử dụng nếu xuất hiện kết tủa Khi bị đun nóng, ketamine phân huỷ tạo thành khói độc

là clorua va oxid nito [12]

1.3 Điều chế tổng hợp Ketamin

Được điều chế bằng cách brom hóa o-clorophenyl xiclopentyl xeton, sau đó phản ứng với metylamin để tạo ra rượu metylimino Nhiệt phân imino hydrochloride tạo ra ketamine bằng cách mở rộng vòng.[20]

2 ĐỘC TÍNH, CƠ CHÉ GÂY ĐỘC, XỬ TRÍ NGỘ ĐỘC

2.1 Độc tính

Triệu chứng ngộ độc đặc trưng của Ketamm là cảm giác sảng khoái khi dùng với liều thấp; hưng phấn thường đi kèm với những cơn lo lắng hoặc tâm trạng lười biếng

Quá liều gây trạng thái cai nghiện với mắt nhân cách và mắt phối hợp; khi liều

vẫn cao hơn, sự mắt phối hợp có thê trở nên trầm trọng và phản ứng với các kích thích

bên ngoài bị suy giảm, với khả năng chiến đấu, mất điều hòa, loạn nhịp, phi dai cơ,

rung giật nhãn cầu, tăng phản ứng và các cơn giật cơ Với liều lượng rất cao, nhiễm toan, tăng thân nhiệt, nhịp tim nhanh, cao huyết áp nặng, co giật, và hôn mê có thê xảy ra; thậm chí là tử vong

-_ Tác dụng cấp tính thường nhanh chóng mờ đi và nhiều bệnh nhân lấy lại ý thức bình thường trong 45 phút đến vải giờ

vân nếu chúng xảy ra Hành vi kích động có thể đáp ứng với việc hạn chế kích thích

cảm giác nhưng có thể cần an thần với liều cao benzodiazepin (midazolam, lorazepam, hoặc diazepam) và haloperidol hoặc các thuốc chống loạn thần khác Trong xử trí ban đầu đối với một bệnh nhân cực kỳ kích động, có thể tiêm bắp midazolam hoặc haloperidol nếu không có đường truyền tĩnh mạch Theo dõi nhiệt độ và các dấu hiệu sinh tôn khác trong tôi thiểu 6 giờ và thu nhận tất cả bệnh nhân bị tăng thân nhiệt hoặc các bằng chứng nhiễm độc đáng kể khác.[ 14]

Thuốc đặc hiệu và thuốc giải độc: Không có thuốc giải độc dac hiéu Clonidine bằng đường uống đã được sử dụng đề làm giảm tác dụng cường giao cảm của ketamine khi gây mê.[15]

Khử nhiễm: Không cần thực hiện các biện pháp khử nhiễm sau khi hít thở, hút thuốc hoặc tiêm PCP hoặc ketamine Đối với nuốt phải, cho uống than hoạt nếu điều kiện thích hợp Không cần rửa dạ dày sau khi uống một lượng nhỏ đến trung bình nếu có thê cho uống than hoạt kịp thời.[15]

Sơ cứu ngay lập tức: Đảm bảo rằng đã tiên hành khử nhiễm đầy đủ Nếu bệnh nhân

không thở, bắt đầu hô hấp nhân tạo, tốt nhất là bằng dụng cụ hồi sức van câu, thiết bị túi-van-mặt nạ hoặc mặt nạ bỏ túi, như đã được huấn luyện Thực hiện hô hấp nhân tạo nêu cần thiết Rửa ngay mắt bị nhiễm bân bằng nước cháy nhẹ Không gây ói mửa Nếu bị nôn, hãy nghiêng bệnh nhân về phía trước hoặc nằm nghiêng sang bên trái (tư thế cúi đầu, nếu có thể) dé duy trì đường thở thông thoáng và ngăn chặn tình trạng hit phải Giữ cho bệnh nhân yên tĩnh và duy trì nhiệt độ cơ thê bình thường [3]

Dùng quá liều có thể gây ức chế hô hấp, vì vậy nên dùng biện pháp thông khí để hỗ

trợ Trợ hô hấp bằng máy đề duy trì độ bão hòa oxygen thích hợp trong máu và đào thải carbondioxyd thường được sử dụng hơn là dùng thuốc hồi sức.[ 1]

Ketamin có độ an toàn lớn, một số trường hợp dùng quá liều ketamin không chủ định (gấp 10 lần liều thường dùng) đã được theo dõi trong một thời gian dài song vẫn được hồi phục hoàn toàn

3 PHÂN TÍCH, SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

KETAMINE VÀ DÂN XUẤT CÓ TRONG MÂU DỊCH SINH HỌC (MAU, HUYẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SAC

KY HIEN DAI (SAC KY LONG, SAC KY KHi)

3.1 Phuong phap ELISA

Dé xác định ketamin và các chất chuyển hóa của nó, ta thực hiện trên mẫu nước tiểu với phương pháp ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) là một xét nghiệm miễn dịch thường được sử dụng để đo các kháng thể, kháng nguyên, protein va glycoprotein trong các mẫu sinh học, là một kỹ thuật miễn dịch có tính đơn giản, độ nhạy và độ đặc hiệu được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như an toàn thực phẩm, sức khỏe cộng đồng, và bảo vệ môi trường

3.1.1 Nguyên lý [20]

substrate (4)

enzyme labelled (3

À detection antibody

Hình 2 Phương pháp ELISA Được mô tả ở trén 1a mot ELISA banh mi, hiển thị các

bước trong xét nghiệm, được đánh số theo thứ tự 1-4

Bước đầu tiên là phủ lên đĩa ELISA bằng kháng thể bắt giữ, mọi kháng thể dư thừa,

chưa liên kết sau đó sẽ được rửa sạch khỏi đĩa Kháng thể bắt giữ là kháng thể được nâng lên chồng lại kháng nguyên quan tâm

Tiếp theo, mẫu (ví dụ như nước tiểu, huyết thanh hoặc chất nôi trên tế bảo) được thêm vào Bất kỳ kháng nguyên nào được tìm thấy trong mẫu sẽ liên kết với kháng thể bắt giữ đã phủ trên đĩa Các mẫu thường được thêm vào hai lần hoặc ba lần (để cho phép phân tích thống kê), và ở các nồng độ khác nhau để đảm bảo mẫn nằm trong mức phát hiện của xét nghiệm Một lần nữa bắt kỳ mẫu thừa nào cũng được rửa sạch khỏi đĩa Trong bước 3, kháng thể phát hiện được thêm vào Kháng thê này được đánh dấu bằng một loại enzym, thường là peroxidase của củ cải ngựa hoặc phosphatase kiềm Kháng

thé phát hiện liên kết với bất kỳ kháng nguyên đích nào đã được gắn vào đĩa Cuồi cùng,

một chất nền được thêm vào đĩa Các xét nghiệm ELISA thường mang màu sắc bằng cách sử dụng phản ứng chuyển đôi chất nền (ví dụ TMB hoặc ABTS) thành một sản phẩm có màu có thê được đo bằng cách sử dụng máy đọc đĩa Việc xác định nồng độ kháng nguyên trong một mẫu yêu cầu tạo ra một đường chuẩn sử dụng các kháng nguyên có nồng độ đã biết trước (thê hiện trong Hình 3 ) Sau đó, nồng độ kháng nguyên trong mẫu có thê được tính toán bằng cách sử dụng mật độ quang học (OD)

3.1.3 Cach tién hanh [18]

Các mẫu nước tiêu được thử nghiệm theo quy trình Neogen, băng cách sử dụng máy Anthos awl aufomatic microplate washes

Thực hiện lặp lại 3 lần, cho 20! các mẫu (thử, chuẩn hóa, đối chứng) được thêm vào

giếng thích hợp, 180/ liên hợp thuốc-enzym (I:180) pha loãng được thêm vào Tắm được bao phủ, trộn bằng cách lắc nhẹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong 45 phút Mỗi giếng sau đó được rửa năm lần với 3001 đệm rửa pha loãng 150 ¿ của chất nền K-blue được

thêm vào và trộn bằng cách lắc nhẹ, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút 50 dung dịch

stop red của Neogen được thêm vào đề ngăn chặn phản ứng của enzyme Sự hấp thụ sau

đó được đo ở 650nm bằng dau doc vi ban RC Multiskan

3.1.4 Đánh giá kết quả: [18]

Theo nhà sản xuất, I-50 đổi với K và NK lần lượt là 10 và 200 ng / mL Khoảng tuyến

tính là 7-30 ng /mL đối với K và 250-400 ng/ mL đối với NK Đường cong logarit tiếp tục mở rộng khá năng định lượng K lên đến 80 ng / mL Nhung trong hau hét các trường hợp, phạm vi tuyến tính K thấp hơn nhiều so với nồng độ trong mẫu nước tiêu của người dùng K

đã được sản xuất với hệ thông thanh lọc Milli-Q từ Millipore (Bedford, MA, Hoa Kỳ)

Dém natri carbonate — natri bicarbonate (pH 9,5) duoc diéu ché bang cach hda tan 2 g natri carbonate va 9 g natri bicarbonate trong l L nước siêu tĩnh khiét va giữ ở nhiệt độ phòng Dung dịch gốc chuẩn của K, NK và DHNK (100 g/ mL) được điều chế trong etanol và được bảo quản ở -20 sC Hộp mực chiết pha ran Oasis HLB (SPE) (3 CC, 60 mg)

3.2.2 Thiết bị phân tích

Máy phân tích Hewlett-Packard GC (6890) được kết hợp với đầu dò khối phô tứ cực

(5973), được trang bị một bộ lay mẫu tự động và cột HP-5MS (30 m x 0.25 mm), độ dày pha tĩnh 0,25um

3.2.3 Xứ lý mẫu

K-d4 và NK-d4 được sử dụng làm chất nội chuẩn lần lượt cho lượng của K và NK NK-d4 cũng được sử dụng làm chất nội chuẩn cho DHNK do thiếu DHNK Trước tiên, mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu chứng được bổ sung thêm dung dịch chuẩn nội 10uL và sau đó được kiềm hóa bằng 1 mL đệm carbonate — bicarbonate va duoc trén xoáy Quá trình chiết xuất được tiễn hành với các hộp mực Oasis HLB SPE trên hệ thống chiết pha rắn tự động của Zymark (Hopkinton, MA, USA) Đầu tiên, hộp mực được điều hòa bằng

2 mL methanol, tiếp theo là 2 mL nước siêu tỉnh khiết và sau đó là 2 mL đệm carbonate

— bicarbonate Sau khi nạp mẫu, hộp mực được rửa bằng dung dich ra 2 mL Cac chat phân tích được giữ lại sau đó được rửa giải bằng 2 mL methanol sau khi khử nitơ 0,1 phút Dịch rửa giải methanol được làm bay hơi đến khô ở 40 sC dưới dòng nitơ và được

hoàn nguyên bằng 100 uL etyl acetate trước khi phân tích GC-MS

3.2.4 Điều kiện phân tích sắc kí khí khối phố

Chương trình nhiệt độ cột tach: Nhiét d6 16 GC duoc duy tri & 130°C dén 170°C, tang

10°C /phút đến 2000°C, giữ đẳng nhiệt 5 phút, tang 40°C /phút đến 280°C giữ 0,5 phút Công tiêm và nhiệt độ bề mặt được duy trì ở 260%C và 280°C Heli được sử dụng làm

khí mang với tốc độ đòng không đổi ImL / phút Một lượng 2ùL được tiêm ở chế độ

10