Báo cáo thực tập ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân tích tetrahydrocannabinol và các dẫn xuất trong cần sa

16Hình 6: Phổ UV trong khoảng 190–400 nm thu được trong hai hệ thống HPLC có pH axit và pH bazơ...18Hình 7: Sắc ký đồ phân tách và xác định các chất chuyển hóa cannabinoid từ máu người t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

KHOA DƯỢC LIÊN BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM- ĐỘC CHẤT

BÁO CÁO THỰC TẬP

ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH TETRAHYDROCANNABINOL VÀ CÁC

DẪN XUẤT TRONG “CẦN SA”

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

Lớp: Dược 46 - Nhóm: 1

Cần Thơ, ngày 12 tháng 1 năm 2024

4 Nguyễn Ngọc Khôi Nguyên 2053030074 100

5 Nguyễn Hữu Nhân 2053030075 100

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 2

1 Nguồn gốc, tính chất lý hóa 2

1.1 Nguồn gốc 2

1.2 Tính chất lý hóa 3

1.3 Thành phần hóa học 4

2 Độc tính, cơ chế độc tính và xử trí ngộ độc 5

2.1 Độc tính 5

2.2 Cơ chế độc tính 6

2.3 Xử trí ngộ độc 7

3 Phân tích, so sánh các phương pháp định tính, định lượng tetrahydrocannabinol và các dẫn xuất ma túy trong “Cần sa”, mẫu dịch sinh học bằng các kỹ thuật sắc ký hiện tại (GC, LC) 8

3.1 Định tính 8

3.1.1 Xét nghiệm miễn dịch - Enzyme Immunoassay Testing (EIA) 8

3.1.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 9

3.1.3 Test nhanh (Marijuana Drug Test, THC Drug Test) 11

3.2 Định lượng 12

3.2.1 Sắc ký khí (GC) 12

3.2.1.1 Sắc ký khí quang phổ khối (GC-MS) 12

3.2.1.2 Sắc ký khí hai chiều (GC x GC) 15

3.2.2 Sắc ký lỏng (LC) 17

3.2.2.1 HPLC-UV/PDA/MS 17

3.2.2.2 HPLC-MS/MS 19

3.2.3 So sánh giữa GC và LC 21

3.2.4 Kết luận 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

Tiếng Anh 23

Tiếng Việt 26

Website 26

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Quá trình chuyển hóa CBD thành THC 3

Hình 2: Thành phần hóa học của cần sa 4

Hình 3: Que thử nhanh THC 11

Hình 4: Phổ GC-MS của các cannabinoid bị cô lập 13

Hình 5: Sắc ký đồ GCxGC/qMS ion tổng của: (a) phần SFE thứ nhất chứa monoterpen và (b) phần SFE thứ hai chứa cả sesquiterpen và cannabinoid Bốn vùng đồng rửa giải (RoIs) được đánh giá cao đối với sesquiterpenes 16 Hình 6: Phổ UV trong khoảng 190–400 nm thu được trong hai hệ thống HPLC có pH axit và pH bazơ 18

Hình 7: Sắc ký đồ phân tách và xác định các chất chuyển hóa cannabinoid từ máu người trong một lần chạy sắc ký bằng cách sử dụng LC-MS 20

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Giá trị lưu giữ tương đối (Rf) của cannabinoids trong hệ thống TLC phân cực (silica-gel) và không phân cực (C18) 10

Bảng 2: Thời gian lưu tương đối (RRT) của cannabinoids trong GC sử dụng cột không phân cực (DB-1) và cột phân cực trung bình (HP-50) 13

Bảng 3: Tổng quan về các đặc tính chính của phương pháp GC-MS phổ biến để phân tích cannabinoids bằng cột mao quản trong sáu nghiên cứu khác nhau 14

Bảng 4: Các đặc tính chính của phương pháp GC-FID để phân tích cannabinoids bằng cột mao quản trong bốn nghiên cứu khác nhau 14

Bảng 5: Các đặc tính chính của các phương pháp HPLC phổ biến để phân tích cannabinoids trong tám nghiên cứu khác nhau 17

Bảng 6: Ưu điểm, nhược điểm đầu dò UV/PDA/MS 19

Bảng 7: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đối với 5 loại cannabinoid phổ biến sử dụng cả sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký khí để định lượng 21

MỞ ĐẦU

Trên thế giới hiện nay, việc sử dung cần sa thường được chia thànhhai mục đích chính, gồm giải trí và y tế (tại Việt Nam, cần sa và các chếphẩm từ cần sa thuộc các chất ma túy tuyệt đối cấm sử dụng trong đời sống

xã hội) Sử dụng cho mục đích y tế, cần sa có tác dụng giảm bớt các triệuchứng như đau, lo âu, mất ngủ, mất cảm giác ngon miệng và hơn thế nữa.Người sử dụng cần sa để có mục đích như giải trí, hưởng thụ, giảm stress

và kích thích sáng tạo Thường khi sử dụng cần sa sẽ đem đến các hiêu ̣ ứngảnh hưởng đến tinh thần cũng như thể chất Do đó, cần sa đang là một trongnhững loại chất kích thích giải trí phổ biến nhất được sử dụng để thay đổitrạng thái của một người sử dụng phụ thuộc Nó thường được sử dụng đểđạt được cảm giác tức thời của sự hưng phấn

Tetrahydrocannabinol (THC) là thành phần chính trong cây cần sa,

là hợp chất tác động lên thần kinh ảnh hưởng đến cảm giác của người sửdụng THC có một loạt các lợi ích trong y tế và thường được sử dụng đểgiảm đau, chống buồn nôn và trầm cảm, trong số nhiều tác dụng khác.Lượng THC trong cần sa phụ thuộc vào giống cây và các điều kiện khácnơi cây cần sa được trồng, phát triển Ngày nay, các một số giống cây chứatrung bình từ 10-30% THC Chính vì vậy mà tội phạm ma tuý tiếp tục tăng,quy mô lớn, tính chất, phương thức, thủ đoạn ngày càng tinh vi, nguy hiểm

và manh động hơn dưới hình thức đưa cần sa vào cuộc sống, chủ yếu tácđộng lớn với giới em gây ra hệ lụy vô cùng to lớn Từ hiện trạng sử dụng vàmức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người sử dụng nó, đồng thời đểphục vụ cho công tác giám định ma túy, bài báo cáo này sẽ tập trung tìmhiểu phương pháp phát hiện Tetrahydrocannabinol và dẫn xuất trong cần sahiệu quả, nhanh chóng nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa

Thành phần hóa học đầu tiên được xác định là oxy-cannabis (1869)(Bolas và Francis, 1869), cannabinoid phân lập (1896), cannabidiol (CBD)(Jacob và Todd, 1940), sau đó là tetrahydrocannabinol (THC) (Gaoni vàMechoulam, 1964; Santavý, 1964), là hoạt chất chính trong cần sa Việcxác định THC giúp phát hiện hệ thống endocannabinoid, thụ thểcannabinoid đầu tiên (CB1) được xác nhận vào năm 1988 (Dvane và cộng

sự, 1988; Russo, 2016) Thụ thể CB1 điều chỉnh cân bằng nội môi của cácchất dẫn truyền thần kinh giúp giảm đau nhưng sẽ gây ngộ đợc nếu dùngquá liều Cơ chế hoạt động của thụ thể CB1 đã làm dấy lên mối lo ngại vềtác động bất lợi của việc sử dụng cần sa Do đó, loài cây này đã bị loại khỏidanh mục thuốc và được phân loại riêng trong danh mục cây thuốc [2]

Tính tới nay, cần sa và các chế phẩm từ cần sa là loại ma túy bị lạmdụng nhiếu nhất trên thị trường ma túy lậu Nhựa cần sa được sản xuất tạikhoảng 65 nước trên thế giới, chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực BắcPhi và Tây-Nam Á, đặc biệt là Afghanistan và Pakistan [3]

Ma-rốc là một những nước nổi tiếng về việc trồng và thu hoạch tráiphép nhựa cần sa Hầu hết nhựa cần sa bắt được ở Châu Âu đều có nguồngốc buôn lậu từ Ma-rốc Afghanistan là nước lớn thứ hai thế giới về sảnxuất nhựa cần sa Nhựa cần sa từ Afghanistan có đặc điểm giống với nhựa

từ các vùng khác của tiểu lục địa Ấn Độ Về cây cần sa, Châu Mỹ chiếmkhoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006, sau đến Châu Phi (khoảng22%) [4]

Cần sa có 3 dạng chính: Marijuana, Hash hay Hashish và Dầu Hashish

- Marijuana gồm lá và hoa khô của cây cần sa (Cannabis).

- Hashish hay Hash là nhựa của cần sa Nhựa cần sa phơi khô và ép lại

thành cục "Hash" thường được trộn với thuốc lá để hút, nhưng cũng

có thể bỏ vào đồ ăn để ăn Hash mạnh hơn marijuana

- Dầu Hashish là chất dầu đặc được chế biến từ Hash, là sản phẩm cần

sa mạnh nhất Dầu Hashish thường được bôi trên đầu điếu thuốc haytrên giấy điếu thuốc lá để hút

Trong ba dạng trên, Marijuana chứa ít chất THC nhất và kém tácdụng nhất [36]

Hình 1: Quá trình chuyển hóa CBD thành THC

1.3 Thành phần hóa học

Hình 2: Thành phần hóa học của cần sa

Cần sa chứa nhiều hợp chất tự nhiên với hơn 560 hợp chất đã được xácđịnh như cannabinoids, phenolics, terpen và alkaloid Trong đó, cáccannabinoid chiếm tỉ lệ chủ yếu với hơn 130 loại cannabinoid đã được phânlập Chúng có thể được phân thành 11 phân lớp dựa trên cấu trúc hóa học,bao gồm ∆9-THC, ∆8-THC, CBG (cannabigerol), CBC(cannabichromene), CBD, CBND (dehydrocannabidiol), CBE(cannabielsoin), CBL (cannabicyclol) , CBN và CBT(dihydroxycannabinol) Cannabinoids tồn tại ở hai dạng hóa học: dạng khửcarboxyl và dạng carboxyl hóa Trong cần sa tươi, dạng carboxyl hóa làdạng chiếm ưu thế Tuy nhiên, thông qua các phản ứng không có enzymenhư làm khô, đun nóng hoặc đốt, cần sa và các chất chiết xuất của nó trảiqua quá trình khử carboxyl của các dạng carboxyl hóa để tạo thành cácdạng khử carboxyl hóa.

THC và CBD là những hợp chất quan trọng nhất trong cần sa Cácnghiên cứu dược lý lâm sàng đã chứng minh rằng THC có đặc tính gây ảogiác và gây nghiện mạnh bằng cách kích hoạt cả thụ thể CB1 và CB2, việctiêu thụ quá nhiều cannabinoids ngoại sinh có thể dẫn đến sự kích thích quámức của thụ thể CB1 và CB2 Ngược lại, CBD, một thành phần không cótác dụng thần kinh của cần sa, hoạt động như một chất đối kháng với THCtrên các các thụ thể, giúp giảm tác dụng gây ảo giác của THC trên cơ thể.CBD có thể được sử dụng để phục hồi ECS, giúp giảm đau, an thần CDB

đã được chứng minh có tác dụng dược lý đa dạng, bao gồm tính khángkhuẩn, chống viêm, giải lo âu và chống động kinh, và nó được coi là antoàn cho con người [5]

2 Độc tính, cơ chế độc tính và xử trí ngộ độc

2.1 Độc tính

2.1.1 Tác dụng đối với tâm trí

Vấn đề về trí nhớ, ảnh hưởng nhận thức, khó khăn trong việc suynghĩ và giải quyết vấn đề, mất khả năng phối hợp vận động cơ và vận độngtâm trí

Tác động mạnh tới cảm xúc, sự phấn khởi tại liều cao [6]

2.1.2 Tác dụng đối với cơ thể

Chóng mặt, buồn nôn, nhịp tim nhanh, đỏ bừng mặt, khô miệng vàrun, ho do kích ứng phổi, tăng thèm ăn và tăng huyết áp, suy giảm trí nhớngắn hạn

Tăng cường nhận thức giác quan, trí tưởng tượng tăng cao

Cảm xúc không ổn định, không nhất quán, phiền muộn, suy nghĩ vô

tổ chức, kích động, hoang tưởng, bối rối, bồn chồn, lo lắng, buồn ngủ, vàcác cơn hoảng loạn có thể xảy ra, đặc biệt ở người dùng thiếu kinh nghiệmhoặc ở những người sử dụng liều lượng lớn [6]

Nói chung, nhiễm độc bao gồm cảm giác hưng phấn và thư giãn.Những tác dụng này kéo dài 4 đến 6 giờ sau khi hít phải Sự tập trung, ýthức về thời gian, khả năng phối hợp, nhận thức sâu sắc, khả năng theo dõi

và thời gian phản ứng có thể bị suy giảm tới 24 giờ, tất cả đều nguy hiểmtrong một số tình huống nhất định (ví dụ: lái xe, vận hành thiết bị nặng)[35]

2.1.3 Tác dụng mãn tính

Sử dụng mãn tính có thể ảnh hưởng lâu dài đến nhận thức, "hộichứng Amotivational" (mất năng lượng và ý chí làm việc) và rối loạn hôhấp Hội chứng nôn mửa theo chu kỳ, tăng huyết áp cannabinoid

Nhiễm độc cần sa có thể dẫn đến rối loạn tâm thần cấp tính ở nhiều

cá nhân và có thể tạo ra các đợt cấp ngắn hạn tại các bệnh tâm thần phânliệt [7]

Người hút cần sa có các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng như viêm phếquản, khí thũng, và hen phế quản Việc sử dụng kéo dài có thể gây ức chế

hệ thống miễn dịch [6]

Hội chứng cai: ngừng sử dụng cần sa ở người dùng thường xuyên,nặng có thể gây ra hội chứng cai nghiện nhẹ Thời gian khởi phát các triệuchứng cai nghiện là khác nhau nhưng thường bắt đầu khoảng 12 giờ sau lần

sử dụng cuối cùng Các triệu chứng bao gồm nhức đầu, run rẩy, đổ mồ hôi,đau bụng, mất ngủ, khó chịu, trầm cảm, buồn nôn và chán ăn Các triệuchứng đạt đỉnh điểm sau 2 đến 3 ngày và kéo dài đến 7 ngày [35]

2.2 Cơ chế độc tính

Khi cần sa được hút, thành phần hoạt chất THC đi từ phổi và vàomáu mang chất hóa học đến các cơ quan trên khắp cơ thể, bao gồm cả não.Trong não, THC kết nối với các thụ thể cannabinoid trên tế bào thần kinh

và ảnh hưởng hoạt động của tế bào đó [6] Tác dụng độc hại củacannabinoid là thứ yếu do sự kích thích quá mức của hệ thốngEndocannabinoid bởi cannabinoid ngoại sinh Sự kích thích quá mức nàycủa hệ thống endocannabinoid dẫn đến sự điều tiết chất dẫn truyền thầnkinh thất thường nói trên và có thể dẫn đến độc tính

Cannabinoids, dù là nội sinh hay ngoại sinh, đều tác động lên các thụthể liên kết cannabinoid cụ thể (CB), thụ thể liên kết cannabinoid 1 (CB1)

và thụ thể liên kết cannabinoid 2 (CB2) CB1 chủ yếu nằm ở trung ươngnhưng cũng hiện diện ở ngoại vi, trong khi CB2 thì ngược lại, chủ yếu nằm

ở ngoại vi nhưng cũng được tìm thấy ở trung ương Các thụ thể CB1 chủyếu liên quan đến tác dụng trung ương của cannabinoids, bao gồm các tácđộng lên khả năng học tập, nhận thức về trí nhớ, cảm xúc, chuyển động,nhận thức giác quan và buồn nôn, cũng như các đặc tính tâm sinh lý liênquan đến cannabinoids

Các thụ thể CB2 nằm ở ngoại vi và được cho là có ảnh hưởng đếntình trạng viêm và điều hòa hệ thống miễn dịch Các thụ thể cannabinoid làcác thụ thể liên kết với G-protein có tác dụng ức chế adenylyl cyclase và do

đó ức chế AMP tuần hoàn, ảnh hưởng đến các kênh canxi và kênh kali, dẫnđến giảm tổng thể nồng độ canxi nội bào và kali ngoại bào Điều này dẫnđến giảm dẫn truyền thần kinh Tuy nhiên, tùy thuộc vào vị trí cụ thể củaCB1 và G-protein cụ thể có liên quan, việc kích thích CB1 có thể dẫn đến

ức chế hoặc kích thích các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau, bao gồmacetylcholine, L-glutamate, axit γ-aminobutyric, dopamine, norepinephrine

và 5- hydroxytryptamine Sự điều chế chất dẫn truyền thần kinh này có thểgóp phần vào các tác động trung ương và ngoại vi trong độc tính củacannabinoid Về mặt hóa học, cannabinoids tổng hợp và cannabinoidstruyền thống như THC rất khác nhau Trái ngược với THC, chất chủ vậntừng phần ở thụ thể CB1, cannabinoids tổng hợp là chất chủ vận toàn phần.Chúng thể hiện ái lực cao hơn rõ rệt đối với thụ thể CB Như vậy, tác dụngcủa cannabinoids tổng hợp có thể mạnh hơn THC nhiều, do đó làm tăng tácdụng về mặt sinh lý và độc tính [8]

2.3 Xử trí ngộ độc

Trong trường hợp sử dụng cannabinoid cấp tính, việc khử nhiễmđường tiêu hóa (GI) không được khuyến khích vì độc tính hiếm khi đe dọađến tính mạng Bệnh nhân nên được theo dõi trong 6 giờ để giải quyết cáctriệu chứng và nhập viện để theo dõi khi có biểu hiện suy nhược hệ thầnkinh trung ương, trạng thái tâm thần thay đổi, nhiều cơn động kinh hoặc cácdấu hiệu sinh tồn bất thường kéo dài Thời gian độc tính kéo dài hơn có thểxảy ra với các sản phẩm ăn được và với cannabinoids tổng hợp

Điều trị ngộ độc cannabinoid phần lớn mang tính hỗ trợ và tập trungvào điều triệu chứng Hầu hết bệnh nhân trưởng thành bị nhiễm độc cần sađều tự cải thiện và không cần phải nhập viện Độc tính liên quan đến

cannabinoids tổng hợp có thể nghiêm trọng hơn và cần điều trị tích cựchơn

Kích động hoặc rối loạn tâm thần cấp tính nên được điều trị bằngthuốc benzodiazepin hoặc thuốc chống loạn thần, chẳng hạn nhưhaloperidol hoặc olanzapine Nhịp tim nhanh nên được điều trị bằng thuốcbenzodiazepin và bù nước khi có rối loạn nhịp tim cụ thể

Các cơn động kinh, được ghi nhận rõ ràng khi sử dụng cần sa ở trẻ

em và mọi lứa tuổi sử dụng cannabinoid tổng hợp, nên được điều trị bằngthuốc benzodiazepin Trạng thái động kinh có nhiều khả năng xảy ra hơnkhi sử dụng cannabinoid tổng hợp và cần được điều trị bằng thuốc an thần

và kiểm soát đường thở thích hợp

Hội chứng nôn quá mức cần sa được điều trị bằng cách ngừng sửdụng cần sa và haloperidol đã được chứng minh là hữu ích như một loạithuốc chống nôn được lựa chọn Việc bôi capsaicin qua da cũng có thểmang lại một số lợi ích trong hội chứng tăng huyết áp cannabinoid [8]

3 Phân tích, so sánh các phương pháp định tính, định lượng tetrahydrocannabinol và các dẫn xuất ma túy trong “Cần sa”, mẫu dịch sinh học bằng các kỹ thuật sắc ký hiện tại (GC, LC) 3.1 Định tính

3.1.1 Xét nghiệm miễn dịch - Enzyme Immunoassay Testing (EIA) Nguyên tắc:

Bằng việc sử dụng kháng thể dành riêng cho loại thuốc này Nếu cóphản ứng xảy ra sẽ hình thành enzyme hoạt động Nếu mẫu thay đổi màusắc, điều đó sẽ cho thấy sự hiện diện của enzyme

Sự thay đổi màu sắc này sẽ được theo dõi và đo lường bằng mộtthiết bị được gọi là máy phân tích quang phổ Sự hình thành enzyme cànglớn thì hàm lượng chất phân tích có trong mẫu càng cao Nếu mức enzymevượt quá một giới hạn nhất định, điều này sẽ dẫn đến kết quả xét nghiệm

“dương tính” Độ nhạy của máy phân tích quang phổ sẽ giúp xác định chínhxác những thay đổi mà hầu như không thể xác định được bằng cách khác

- Xét nghiệm nước tiểu là mẫu phổ biến nhất được sử dụng, ít tốn

kém, ít xâm lấn, đồng thời nhạy và chính xác Delta 9 THC thườngđược phát hiện trong nước tiểu trong khoảng ba đến 30 ngày sau khi

sử dụng

- Xét nghiệm nước bọt, ít sử dụng vì có độ chính xác không cao Delta

9 có thể được tìm thấy trong nước bọt tới 72 giờ sau khi sử dụng, tùythuộc vào loại xét nghiệm được sử dụng

- Xét nghiệm máu có thể tốt hơn trong việc chỉ ra tình trạng lạm dụng

chất gây nghiện Delta 9 THC thường được phát hiện trong máukhoảng 36 giờ sau khi sử dụng

Kết quả:

Bất kỳ sự thay đổi màu sắc nào của mẫu trong quá trình thử nghiệmđều cho thấy sự hiện diện của một loại thuốc cụ thể Enzyme hoạt độngcàng lớn thì hàm lượng cụ thể có trong mẫu càng cao Một xét nghiệm đượccoi là “dương tính” khi enzyme phát triển vượt quá một giới hạn nhất định

Tuy nhiên, điều quan trọng cần nhớ là các tổ chức và cơ quan khácnhau có hướng dẫn riêng để xác định lượng chất cụ thể được dung nạp Vìvậy, mặc dù xét nghiệm EIA có thể không cho kết quả “dương tính” nhưngmột số cơ quan hoặc tổ chức có thể xem xét kỹ hơn số lượng các enzyme

- Có thể kém hoạt động hơn vì chúng không thể trộn tự do với cơ chất.

- Việc giải quyết bất kỳ sự ô nhiễm nào đều tốn kém vì toàn bộ hệ

thống sẽ cần phải dừng lại

3.1.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Cách tiến hành:

Các mẫu trong ethanol được chấm trên các tấm silica 10 cm x 20 cm.Hai hệ thống TLC khác nhau đã được sử dụng Đối với hệ thống khôngphân cực, các tấm silicagel pha đảo (C18) F254 số 105559 (Merck,Darmstadt, Đức) được sử dụng với metanol/axit axetic 5% 19: 1 làm dungdịch rửa giải Đối với hệ phân cực, các tấm silicagel pha thuận F254 số

105554 (Merck, Darmstadt, Đức) được sử dụng với cloroform/metanol 19:1làm dung môi rửa giải Các tấm được phát triển trong buồng bão hòa bìnhthường (thời gian bão hòa 15 phút) Sự hấp thụ của các vết sắc ký đượcđánh giá dưới tia UV 254 nm Hiện hình các hợp chất được thực hiện bằngcách phun thuốc thử axit anisaldehyde-sulphuric đã được cải tiến (Harvey,D.J Biomed Mass Spectrom 1977, 4, 88–93) Để đánh giá có chọn lọc cáccannabinoid, tấm TLC được phun muối Fast-Blue B 0,5% (o-dianisidine-bis-(diazotized)-zinc double salt) (Sigma) trong nước, sau đó là NaOH 0,1

M (Corrigan, D.; Lynch, J.J Planta Med 1980, 163–169)

Kết quả: