nguyễn đinh bảo trân 21126547

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC Quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và kiểm tra mật s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

Quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và kiểm tra

mật số bào tử của chế phẩm sinh học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC

ThS.Trần Thị Vân Nguyễn Đinh Bảo Trân 21126547

Tp Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2024

Mục lục

Phần 1 Mở đầu 6

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Phần 2 Tổng quan tài liệu 2

2.1 Tổng quan 2

2.1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma 2

2.1.2 Tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma 3

2.1.2.1 Đối với các tác nhân gây bệnh (vi sinh vật khác ) 3

2.1.2.2 Đối với cây trồng 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3

2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 4

2.1.5 Đặc tính sinh học 4

2.2 Giới thiệu về chế phẩm sinh học 4

2.2.1 Chế phẩm sinh học Trichoderma 5

2.3 Phương pháp kiểm tra mật độ bào tử 5

3.1 Thời gian thực hiện 5

3.2 Vật liệu và đối tượng 6

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 6

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu nghiên cứu 6

3.3 Phương pháp nghiên cứu 6

3.3.1 Quy trình thực hiện 7

Phần 4 Kết quả và thảo luận 10

1.1 Kết quả 10

1.1.1 Kết quả của thí nghiệm tạo chế phẩm sinh học từ vi nấm 10

1.1.2 Kết quả của thí nghiệm kiểm tra mật số bào tử 10

4.2 Thảo luận 12

4.2.1 Thí nghiệm tạo chế phẩm sinh học từ vi nấm 12

4.2.2 Thí nghiệm kiểm tra mật số bào tử 12

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 13

5.1 Kết luận 13

5.1 Kiến nghị 14 Tài liệu tham khảo 15

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA : Potato Dextrose Agar

CMD : Corn Meal Agar

Mục lục hình ảnh

Hình 2 2 Hình ảnh nấm Trichoderma dưới kính hiển vi 3 Hình 3 1 Quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma sp 6 Hình 3 2 Trấu và tấm được trộn 7 Hình 3 3 Quy trình thực hiện nhân giống A) túi đựng sau khi đem hấp B) 25ml dung dịch cho 1 túi C) dung dịch giống cấp 1 8 Hình 3 4 Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 10 o 9 Hình 4 1 Kết quả sau 7 ngày ủ từ lúc thêm dung dịch giống 10 Hình 4 2 Kết quả 6 đĩa petri sau 2 ngày cấy A) Nồng độ 10 -6 đĩa 1, B) nồng độ 10 -6 đĩa 2, C) nồng độ 10 -5 đĩa 1, D) nồng độ 10 -5 đĩa 2, E) nồng độ 10 -4 đĩa 1, F) nồng độ 10 -4 đĩa 2 12

Phần 1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Trichoderma hoặc là Trichoderma reesie Trichoderma QM 6a do Elwyn T.Reese, làm

việc tại viện nghiên cứu Natick với cộng tác của Mary Mandels khám phá ra chủng nấm này

Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh Từ

đó Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp Ngày

nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu theo lĩnh vực này

Tính đối kháng của Trichoderma cũng được biết đến từ rất lâu, ấn phẩm đầu tiên được

xuất bản vào năm 1887 Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về tính đối kháng và khả năng ứng dụng như là phương thức chống lại các tác nhân gây bệnh trên cây trồng chỉ được bắt đầu vào khoảng giữa 2 cuộc thế chiến Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của Trichoderma viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea Ngày nay, người

ta còn biết sử dụng Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở rễ (như Pythium,

Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora, ) và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất

(như Botrytis cinerea) Trichoderma có khả năng đối kháng được với nấm bệnh nhờ vào

nhiều "hoạt động" khác nhau

1.2 Mục tiêu đề tài

Biết được tầm quan trọng của chế phẩm sinh học cho cây trồng, thay thế các loại thuốc trừ sâu hóa học có hại cho đất và người tiêu dùng Thay thế bằng các chế phẩm có lợi cho cây Biết cách sử dụng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma một cách hợp lí, để đặt hiệu quả cao trong trồng trọt Biết kiểm tra mật độ số bào tử đã thí nghiệm, rút ra được kết luận cho các chế phẩm sau này

1.3 Nội dung thực hiện

Nhân giống cấp 1 chủng nấm được chọn làm thí nghiệm và tiến hành tạo chế phẩm sinh học theo quy trình Sau đó pha loãng thành các nồng độ khác nhau, chọn ra nồng độ phù hợp để cấy tiến hành đếm bào tử và tính toán cho ra kết quả một độ bào tử

Phần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Tổng quan

2.1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma

Trichoderma là một chi nấm thuộc họ Hypocreaceae, có mặt ở khắp nơi trên thế giới và

là loài nấm phổ biến nhất trong đất Nhiều loài trong chi này có khả năng tạo thành quan

hệ cộng sinh không gây bệnh với nhiều loại cây trồng Trichoderma cũng là một trong

những loại chế phẩm sinh học chống bệnh nấm đầu tiên được sản xuất thương mại

Đây là một loại chủng nấm có tên đầy đủ là Trichoderma spp, thường sống trong đất ở

vùng rễ cây được chế thành sản phẩm vi sinh Nấm đối kháng Trichoderma có khả năng

tiết các enzyme kiểm soát các loại nấm gây bệnh khác như các loại nấm gây thối

rễ: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium ; đối kháng với nấm Phytopthora spp gây hại trên sầu riêng Cụ thể, các chất do nấm Trichoderma tiết ra làm tan thành tế bào, phá hủy vỏ tế

bào của nấm gây hại và cuối cùng phân giải chúng thành thức ăn Quá trình này tạo ra nhiều chất hữu cơ có ích

Hình 2.1 Ký sinh nấm Trichoderma

(A) Xét nghiệm đối đầu với ký sinh trùng nấm mốc

(B) cuộn sợi nấm Trichoderma (T) xung quanh mầm bệnh thực vật Rhizoctonia solani (R)

2.1.2 Tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma

2.1.2.1 Đối với các tác nhân gây bệnh (vi sinh vật khác )

 Ký sinh trên các nấm gây bệnh

 Tiết ra các chất kháng sinh

 Cạnh tranh với các nấm gây bệnh

2.1.2.2 Đối với cây trồng

 Kích hoạt cơ chế phòng vệ của cây

 Tăng dinh dưỡng cho cây

 Bảo vệ rễ cây khỏi các vi sinh vật có hại

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Khuẩn ty của Trichoderma không màu, ban đầu có màu trắng khi sinh ra bào tử có màu xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng

Hình dạng chủ yếu: Hình cầu, hình elip hoặc oval

Kích thước: Không quá 5µm

Hình 2 1 Hình ảnh nấm Trichoderma dưới kính hiển vi

2.1.4 Điều kiện nuôi cấy

Các môi trường nuôi cấy thường phát triển nhanh ở 25–30 °C (77–86 °F), nhưng một số loài Trichoderma sẽ phát triển ở 45 °C (113 °F) Lúc đầu, khuẩn lạc trong suốt trên môi trường như thạch bột ngô (CMD) hoặc màu trắng trên môi trường giàu hơn như thạch dextrose khoai tây (PDA) Sợi nấm thường không rõ ràng trên CMD, bào tử thường hình thành trong vòng một tuần ở dạng chùm nhỏ hoặc lỏng lẻo có màu xanh lục hoặc vàng hoặc

ít thường xuyên hơn là màu trắng Sắc tố màu vàng có thể được tiết vào môi trường thạch, đặc biệt là trên PDA Một số loài tạo ra mùi ngọt hoặc mùi 'dừa' đặc trưng

2.1.5 Đặc tính sinh học

Trichoderma vừa có khả năng đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật vừa có khả

năng phân hủy cellulose nên việc dùng Trichoderma trong phân bón là lựa chọn tốt vừa bảo

vệ được cây trồng, tăng thêm thu nhập, giảm chi phí đầu tư và bảo vệ môi trường

Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ

60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải, ) Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái Điều không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với

các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy

cellulose mạnh mẽ

2.2 Giới thiệu về chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học là những chế phẩm được điều chế, chiết xuất từ những thành phần nguyên liệu có nguồn gốc từ tài nguyên sinh học tái tạo trong tự nhiên rất an toàn, thân thiện với con người và môi trường Về chế phẩm sinh học nông nghiệp, thành phần hoạt chất của chúng có thể là thực vật, tảo, chiết xuất, vi sinh vật hoặc chất chuyển hóa có hoạt tính Những chế phẩm sinh học này có thể thay thế cho các chất hóa học như thuốc trừ sâu, thuốc tăng trưởng thực vật,… Vì được sản xuất và phát triển từ các tài nguyên thiên nhiên

có lợi nên có thể đảm bảo sức khỏe người dùng và cây trồng cũng như đất trồng

Để phân loại chế phẩm sinh học người ta chia ra: Chế phẩm sinh học truyền thống và chế phẩm sinh học mới Các chế phẩm sinh học truyền thống Ví dụ bao gồm vật liệu xây dựng từ gỗ, giấy và bột giấy, rừng và các sản phẩm từ rừng Các chế phẩm sinh học mới có

thể bao gồm các chế phẩm có nguồn gốc sinh học như: nhiên liệu sinh học, năng lượng sinh học, tinh bột và cellulose ethanol, chất kết dính sinh học, hóa sinh, nhựa sinh học, Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho canh tác cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau có nguồn gốc từ thảo mộc, nấm, vi khuẩn, virus hoặc các tuyến trùng như:

- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ dịch hại trên cây trồng

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp

- Nhóm điều hòa sinh trưởng cây trồng bao gồm nhóm các chất kích thích sinh trưởng

đó cho phép Trichoderma vừa bảo vệ rễ cây, vừa chống lại các loài nấm gây thối rễ Đồng thời, tái tạo, phục hồi lại những rễ bị tổn thương

2.3 Phương pháp kiểm tra mật độ bào tử

Phương pháp đếm bào tử kiểm tra mật số được dùng để ước tính số lượng tế bào nấm trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định Đây là phương pháp được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu và kiểm nghiệm vi sinh, thực phẩm, nông nghiệp và y học

Với phương thức đếm thủ công, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi nấm đích được đếm một lần Để dễ kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một lưới được kẻ, trước đó cần pha loãng thành các nồng độ và cho ra 3 nồng độ thích hợp cấy lên đĩa, tiến hành thay kết quả vào công thức để có mật độ bào tử đối tượng đang làm

Mật số bào tử = C1+C2

(n1+0,1⋅n2)⋅v.10−𝑛

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian thực hiện

Thời gian : 7h30, sáng thứ sáu các ngày 23/2/2024 và 1/3/2024

Địa điểm : Xưởng thực nghiệm vi sinh A2, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Vật liệu và đối tượng

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Tricoderma là đối tượng được chọn làm thí nghiệm

3.2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ: đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác khay đựng vật liệu, bọc nilong trong suốt, dụng cụ múc và đảo trộn, cân, micropipette, cốc thủy tinh, ống nghiệm, phễu, giá đựng.Thiết bị thí nghiệm: tủ cấy, thiết bị hấp, máy lắc

Vật tư tiêu hao: ghim bấm, bông đậy, cồn,

Hóa chất : Nitơ, nước, dung dịch giống cấp 1,

Vật liệu nghiên cứu: trấu, tấm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma

Hình 3 1 Quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma sp

 Đối với quy trình kiểm tra mật số bào tử: Pha mẫu ban đầu với dung dịch nước muối 0,9%, tiến hành pha loãng dung dịch vừa thu được thành các nồng độ khác nhau, chọn ra 3 nồng độ phù hợp cấy trang và kiểm tra mật số bào tử của đối tương nghiên cứu

Bước 3: Tiến hành gấp miệng túi đựng sao cho miệng túi có dạng tròn đường kính 4 –5

cm Cho hỗn hợp vừa trộn vào 20 túi, mỗi túi 400g Đậy nút bông miệng túi và đem đi hấp khử trùng tất cả ở 121oC

Bước 4: Chuẩn bị dung dịch nấm Trichoderma Đổ 25ml dung dịch giống cấp 1 vào mỗi túi

Hình 3 2 Trấu và tấm được trộn

Bước 5: Khi sợi nấm bao phủ lên khối môi trường đồng thời quá trình hình thành bào tử kết thúc, tiến hành thu sinh khối nấm (sau đó sấy khô ở 40oC trong 1 ngày, nghiền mịn thu được chế phẩm Trichoderma)

Bước 6: Tiến hành khử trùng các dụng cụ trong quá trình thí nghiệm đối với tủ cấy, que cấy ( sử dụng cồn), que cấy, đĩa petri ( sử dụng đèn cồn)

Bước 7: Thu dung dịch có nồng độ 10o từ mẫu ban đầu

Trộn đều hỗn hợp túi chứa nấm Trichoderma từ thí nghiệm trước đó Cân 10g mẫu đã trộn cho vào bình tam giác có chứa 90ml dung dịch NaCl 0,9% Đậy nắp bình bằng giấy tiến hành lắc đều trong 15 – 20p thu được dung dịch có nồng độ pha loãng 10o

Hình 3 3 Quy trình thực hiện nhân giống A) túi đựng sau khi đem hấp B) 25ml dung dịch cho

1 túi C) dung dịch giống cấp 1

A

Bước 8: Tiến hành pha loãng dung dịch thành nhiều nồng độ khác nhau

Chuẩn bị 6 ống nghiệm có đánh dấu các nồng độ 10-1, 10-2,10-3,10-4,10-5,10-6, mỗi ống chứa 9ml nước cất đã hấp khử trùng Dùng micropipette hút 1ml dung dịch có nồng độ 10o vừa thu được cho vào ống nghiệm đánh dấu 10-1, trộn đều dung dịch Hút tiếp 1ml dung dịch từ nồng độ 10-1 cho vào ống có đánh dấu 10-2, và làm tương tự cho các ống nghiệm sau cho đến hết Chọn ra 3 ống nghiệm với nồng độ phù hợp (10-4,10-5,10-6) Lưu ý trong quá trình thực hiện cần tiến hành trong tủ cấy và trong phạm vi ngọn lửa đền cồn tránh việc nhiễm các tác nhân không mong muốn

Bước 9: Cấy trang mẫu trên môi trường thạch PDA

Chuẩn bị các đĩa petri có chứa sẵn môi trường thạch PDA: khoai tây rửa sạch, gọt vỏ, cắt lát mỏng Nấu khoai tây, giữ sôi Lọc thu dịch chiết loại bỏ cặn Hòa tan dextrose vào dịch chiết, thêm nước bổ sung agar, hấp khử trùng 121oC và đổ vào các đĩa petri

Hình 3 4 Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 10 o

Nhúng đầu que cấy vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng Sau đó, để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa Sử dụng micropipette hút 1ml từ ống có nồng độ 10-4 sang đĩa petri Dùng đầu que cấy trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch.Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp Tiến hành hút 1ml mỗi ống có nồng độ 10-5,10-6 vào các đĩa và thực hiện cấy trang như trên Mỗi nồng độ tiến hành cấy 2 đĩa

Bước 10: Sau 7 ngày tiến hành ghi nhận kết quả lần 1, hình ảnh từ các túi chứa nấm Sau 24 – 96h ủ 27oC – 30oC sau khi cấy trên PDA tiến hành ghi nhận hình ảnh, kết quả lần 2 - bào tử thu đươc từ 6 đĩa và tính toán mật số bào tử của mẫu ( chọn 2 cặp ống nghiệm

có nồng độ liên tiếp)

Phần 4 Kết quả và thảo luận

1.1 Kết quả

1.1.1 Kết quả của thí nghiệm tạo chế phẩm sinh học từ vi nấm

Sau 7 ngày ủ, hỗn hợp sau khi cho vào dung dịch giống cấp 1, nhận thấy có sự xuất hiện các mảng màu xanh lá trên hỗn hợp Tuy nhiên các mảng xuất hiện không đồng đều và rải rác nhiều chỗ, không phủ kín toàn bộ khối môi trường Có sự khác biệt giữa các túi Mỗi túi có độ phủ các mảng không đồng bộ

1.1.2 Kết quả của thí nghiệm kiểm tra mật số bào tử

Hình 4 1 Kết quả sau 7 ngày ủ từ lúc thêm dung dịch giống

Sau 2 ngày cấy, nhận thấy rõ sự khác nhau ở các đĩa petri cùng nồng độ và khác nồng

độ Ở nồng độ 10-6, đĩa thứ nhất cho ra kết quả tốt, như mong đợi, không xuất hiện các yếu tố nhiễm từ bên ngoài các khuẩn lạc có hình dáng tròn , màu trắng đục, mật độ tường đối cao, có thể đếm được bằng mắt thường, tổng 132 khuẩn lạc Ở đĩa thứ 2 có cùng nồng độ, xuất hiện khuẩn lạc có mật độ cao, màu trắng đục hình tròn có thể nhìn

rõ bằng mắt thường, tuy nhiên có sự nhiễm từ các yếu tố khác xuất hiện các đốm lan màu vàng nhạt nên không thể sử dụng trong tính toán mật số bào tử Ở nồng độ 10-5, đĩa thứ nhất đã xuất hiện các mảng xanh lá bao phủ thạch, xuất hiện các mảng màu nâu xen kẽ trong đĩa, có yếu tố nhiễm Đĩa thứ 2, có các khuẩn lạc hình tròn màu trắng đục số lượng ít và khối mảng màu xanh lá, có sự nhiễm các yếu tố bên ngoài là các đốm nâu Cả 2 đĩa ở nồng độ này đều không thể dùng trong kết luận mật độ bào tử mẫu

Ở nồng độ 10-4, đĩa thứ nhất xuất hiện 1 khuẩn lạc tròn trắng đục, có khối mảng màu xanh phủ trên thạch, xuất hiện các chấm màu nâu đen tạp nhiễm đan xen Ở đĩa thứ 2 xuất hiện ít các chấm tròn, thạch bao phủ bởi 1 lớp trắng đục thể hiện thao tác sai trong quá trình cấy Cả 2 đĩa đều không thể dùng trong tính toán mật độ bào tử