nguyễn đinh bảo trân 21126547 dh21shb cndt2

Đặt vấn đề GMO là từ viết tắt nhằm chỉ các sinh vật biến đổi gen như một loài thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc các sinh vật khác có đặc điểm di truyền đã được biến đổi trong phòng th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

TP.Thủ Đức ngày 16 tháng 6 năm 2024

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2.Phương phác xác định thực phẩm là Non-GMO hoặc GMO 2

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

2.1.Vật liệu 3

2.2.Phương pháp nghiên cứu 3

2.2.1.Quy trình xét nghiệm cơ bản 3

2.2.2.Ly trích DNA 3

2.3.Điện di mẫu DNA sau ly trích 7

2.3.1.Quy trình điện di 7

2.3.2.Kết quả sau khi điện di 9

2.5.PCR khuếch đại vùng trình tự 35S phát hiện thực vật GMO 10

2.5.1.Kết quả phát hiện GMO 11

2.6 Kết luận 11

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2 1 Vật liệu bắp 3

Hình 2 3 Dịch nổi sau khi ly tâm 4

Hình 2 2.Mẫu sau khi nghiền cho vào dung dịch đệm 4

Hình 2 4 Sau ly tâm 5

Hình 2 5 Dung dịch chứa DNA 6

Hình 2 6 Sau khi bảo quản 7

Hình 2 7 Kết quả điện di giếng 27 mẫu 1 9

Hình 2 8 thông số và biểu đồ khi đo OD 10

Hình 2 9 Kết quả điện di khuếch đại vùng 35s 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặt vấn đề

GMO là từ viết tắt nhằm chỉ các sinh vật biến đổi gen như một loài thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc các sinh vật khác có đặc điểm di truyền đã được biến đổi trong phòng thí nghiệm Điều này cho phép kết hợp nhiều đặc điểm của các gen khác nhau vào trong một

cá thể, giúp cá thể này có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với gen truyền thống

Hiện nay các dòng thực phẩm GMO ngày càng được nhiều doanh nghiệp thương mại hoá nhằm tạo ra sản lượng lớn hơn Thí dụ, thịt từ động vật biến đổi gen GMO sẽ ngon hơn hay các giống cây GMO sẽ cho ra nhiều trái hơn các cây thông thường, Tuy nhiên sản phẩm GMO vẫn còn gây ra nhiều tranh cãi bởi sự quan ngại về giá trị dinh dưỡng hay yếu tố di truyền,

GMO Foods là khái niệm tương đối lạ lẫm với nhiều người tiêu dùng, điều này dấy lên sự

e ngại cho người tiêu dùng về sự an toàn cho sức khỏe Tuy nhiên, GMO đã được Cục quản

2

lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ - FDA chấp thuận, một số lợi ích của thực phẩm biến đổi gen GMO cụ thể như sau:

 Thực phẩm chứa nhiều dưỡng chất hơn, ngon hơn

 Khả năng kháng bệnh tốt, ít tiêu tốn tài nguyên môi trường và thuốc trừ sâu

 Cho ra sản lượng lớn hơn

 Rút ngắn thời gian nuôi/ trồng

 Có nhiều gen nổi trội như mong muốn như lai tạo giống khoai tây sản xuất ít chất gây ung thư khi chiên,

Bên cạnh mang lại những giá trị dinh dưỡng cho thực phẩm, GMO còn góp phần giúp cải thiện đời sống của nhiều người nông dân Trong một nghiên cứu của Ngân hàng Phát triển Châu Phi đã cho thấy rằng cây trồng GMO góp phần giảm chi phí sản xuất từ 60% - 90% giúp nông dân đem về lợi nhuận cao hơn 114% so với cây trồng truyền thống

1.2 Phương phác xác định thực phẩm là Non-GMO hoặc GMO

Kiểm định thực phẩm biến đổi gen cần được thực hiện thường xuyên vì các sản phẩm nông nghiệp biến đổi gen có thể vô tình được trộn lẫn với thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen Nói cách khác, sự tồn tại của sinh vật biến đổi gen cần phải được kiểm chứng trong toàn bộ chuỗi cung ứng để các sinh vật này không vô tình xâm nhập vào quá trình sản xuât thực phẩm và thức ăn chăn nuôi không biến đổi gen

Promoter 35S từ CaMV là nhân tố điều hòa khơi đầu phiên mã, dùng để biểu hiện gen chuyển, thường được sử dụng trong thực vật biến đổi gen (Genetically modified organism, GMO) được phê duyệt bởi Liên minh châu Âu (EU), thực vật tự nhiên không có trình tự này CaMV P-35S được sử dụng rộng rãi trong quá trình sàng lọc vật liệu chuyển gen trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và dược phẩm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Các dụng cụ cần và đủ cho phản ứng PCR và điện di như:

 Mẫu cần đánh giá là mẫu số 01, mẫu bắp thương mại hóa

 Đối với phản ứng PCR cần có: mồi 35s (Xuôi và Ngược), Master mix DNA khuôn mẫu (sau khi ly trích) và khuếch đại trên máy PCR trong vòng 2 giờ

Đối với điện di mẫu trước và sau khi PCR cần có: Bồn điện di, micropipet, tube, dung dịch đệm, gel agarose, gel red, loading dye, và một số hóa chất dùng trong ly trích DNA

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình xét nghiệm cơ bản

Bước 1: Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA

Bước 2: Nhân bản vùng trình tự muc tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu

huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR

Bước 3: Phân tích kết quả

2.2.2 Ly trích DNA

Bước 1: Lấy 0.05g mẫu cho vào 600l dịch trích

Hình 2 1 Vật liệu bắp

4

Hình 2 3.Mẫu sau khi nghiền cho vào dung

dịch đệm

Hình 2 2 Dịch nổi sau khi ly tâm

Bước 2: Ly tâm 10000 vòng trong 5 phút, hút dịch nổi bỏ sang tube khác

Bước 3: Cho 1V PCI trộn đều ly tâm 10000 vòng trong 5 phút hút dịch nổi bỏ vào tube

mới

Bước 4: Thêm 1V CI trộn đều ly tâm 10000 vòng trong 5 phút hút dịch nổi sang tube

mới thêm 0,6V iso propanol ủ ở 20˚C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút, bỏ dịch nổi

Hình 2 4 Sau ly tâm

6

Bước 5: Thêm 500l Ethanol 70˚, ly tâm 10000 vòng trong 3 phút ( lập lại bước 5)

Hình 2 5 Dung dịch chứa DNA

Bước 6: Pha thêm 50l TE vào bảo quản - 20˚C

2.3 Điện di mẫu DNA sau ly trích

2.3.1 Quy trình điện di

Bước 1:Thu nhận vật liệu di truyền DNA đang cần điện di

Bước 2:Chuẩn bị gel Agarose

 Agarose là một loại polysaccharide tự nhiên được chiết tư tảo biển Gel agarose sư dung trong điện di thương ơ nồng độ 0.5 ~ 2%, tùy vào kích thước DNA cần phân tách

 Khi đổ gel agarose, một chiếc lược se được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel

đã đông đặc để tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào

 Pha 20ml dung dịch Gel agarose 1% pha tư 0,2g agarose và 20ml TBE 0,5X Đun trong lò vi sóng sau đó đợi hổn hợp gel tương đối nguội lại,sơ vào có cảm giác hơi âm,tiến hành rót vào khay và đợi 30p để gel đặc lại thành mảng

Lưu ý: Không nên để gel quá nguội có thể gây nên tình trạng vón cục và miếng gel khi

đem đi điện di sẽ ảnh hưởng đến kết quả không mong muốn

 Mix 5µL DNA và 15µL thuốc nhuộm (Tỉ lệ 1 gel red:0,5 loading dye)

Hình 2 6 Sau khi bảo quản

8

 Bơm hỗn hợp vào giếng

 Điện đi 100v -25p

Bước 3:Chạy điện di trên gel

 Miếng gel agarose được đặt trong bồn điện di, chứa dung dịch đệm (buffer) dẫn điện và ổn định pH, thường là Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc TrisBorate-EDTA (TBE) Mẫu DNA được pha với dung dịch nạp mẫu (loading dye) nhằm giữ mẫu chìm trong giếng và cung cấp chỉ thị màu để nhận biết sự điện di

Bước 4: Quan sát DNA sau khi điện di và đưa ra kết luận

 Cần phải nhuộm gel để quan sát do DNA “vô hình” với mắt thường, phổ

 biến nhât là nhuộm bằng hóa chất huỳnh quang, chẳng hạn như Ethidium Bromide (EtBr) Tùy vào loại hóa chất nhuộm huỳnh quang được sử dụng, có thể bổ sung chúng vào agarose trước khi đổ gel hoặc sau khi chạy điện di để nhuộm

 Sau khi điện di và nhuộm gel xong, có thể thực hiện ghi nhận hình ảnh DNA thông qua hệ thống đọc gel (gel document system) hay còn gọi là hệ thống chup ảnh gel

Hệ thống đọc gel gồm nguồn chiếu sáng (illumination source), bộ lọc (filter) để loại

bỏ ánh sáng nền và camera để ghi nhận hình ảnh, đôi khi còn tích hợp PC và trang

bị màn hình cảm ứng

2.3.2 Kết quả sau khi điện di

Kết luận:

Brand mờ nhưng vẫn chứa DNA có thể do lúc thao tác làm DNA bị trôi hoặc lúc hút dịch hút được DNA ít

2.4 Đo hàm lượng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop

Hình 2 7 Kết quả điện di giếng 27 mẫu 1

10

Kết luận:

Có sự hiện diện của DNA trong mẫu với hàm lượng thấp có khả năng do tạp Phenol còn rửa không kĩ

2.5 PCR khuếch đại vùng trình tự 35S phát hiện thực vật GMO

Bảng 1.Cặp primer chuyên biệt cho GMO

Tên Trình tự Kích thước sản Tham khảo

35S-1 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’ 195bp (Hurst et al.,1999)

35S-2 3’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-5’

Bảng 2.Thành phần phản ứng PCR

Hình 2 8 thông số và biểu đồ khi đo OD

Master mix 2x 1x 5.25

2.5.1 Kết quả phát hiện GMO

2.6 Kết luận

Mẫu DNA từ buổi thứ nhất được trữ mẫu và tiến hành phản ứng khuyếch đại với mồi đặc hiệu để khuyếch đại vùng 35s, đây là vùng có tính bảo tồn cao và nó đóng vai trò là yếu tố để sàng lọc các giống biến đổi gen được các nhà nghiên cứu khoa học gắn vào có chủ đích, để nhận biết các chủng GMO

Hình 2 9 Kết quả điện di khuếch đại vùng 35s

12

Kết quả điện di bị nhiễm thang chuẩn do quá trình thao tác không thể đưa ra kết luận mẫu số 05 không phải giống bắp GMO

Mặt khác kết quả điện di có trường hợp ra band ở mẫu Non-GMO rất có thể khi trồng ngoài tự nhiên, cây Non-GMO bị lai tạp với cây GMO nhờ vào một số tác nhân như côn trùng, gió, giao phối gần Trong quá trình thao tác, cần tránh bơm mẫu bị tràn ra khỏi giếng

để tránh kết quả ảnh hưởng đến các các giếng âm tính Trang bị áo blouse, găng tay, khẩu trang để tránh nguy cơ tạp nhiễm mẫu DNA đang khảo sát