THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN pBI121-ipHP1 MANG GEN CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY MUỐNG BIỂN .docx

Trong điều kiện khắc nghiệt ở môi trường biển đảo khó có thể trồng các loại rau xanh chính vì thế cần ứng dụng công nghệ trong việc chọn tạo giống cây trồng có khả năng thích nghi trong điều kiện khí hậu khô hạn. Mục tiêu của đề tài là thiết kế được vector chuyển gen mang gen kháng hạn tách dòng từ cây muống biển phục vụ cho chuyển gen chịu hạn. Kết quả là từ mẫu rau muống biển chúng tôi đã tách dòng thành công gen ipHP1 và so sánh với gen ipHP1 trên NCBI có mã số MF680610.1. cho ra kết quả độ tương đồng lên tới 99%, độ bao phủ là 664/671 nu. Chúng tôi đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pBI121 mang promoter CaMV35S và cấu trúc chứa gen đích ipHP1. Biến nạp thành công vector tái tổ hợp pBI121/35S/ipHP1/Nos vào vi khuẩn A. tumefaciens. Từ dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp, đây sẽ là bước trung gian để có thể chuyển cấu trúc mang gen vào rau muống nhà.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

- -

🕮🙜 -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN pBI121-ipHP1 MANG

GEN CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY MUỐNG BIỂN

Sinh viên thực hiệnLớp

Mã sinh viên

Giảng viên hướng dẫn

Bộ mônKhoa

: Tôn Sơn Bách: K63CNSHD: 637307

: PGS.TS Đỗ Thị Huyền T.S Ninh Thị Thảo

: Công nghệ sinh học Thực vật: Công nghệ Sinh học

Hà Nội, 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả được trình bày trong bản khoá luậnnày là hoàn toàn trung thực Kết quả được thu thập dựa vào quá trình nghiên cứukhoa học của tôi tại phòng Di truyền tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học, việnHàn lâm và khoa học Việt Nam

Tôi xin cam đoan mọi thông tin tham khảo có trong bài khoá luận này đã đượcghi rõ nguồn gốc tại mục tài liệu tham khảo.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022Sinh viên

Tôn Sơn Bách

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới ban Giám đốc Học viện, thầy côKhoa Công nghệ sinh học và các thầy, cô đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốtquá trình học tập, rèn luyện, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các cô PGS.TS Đỗ Thị Huyền, TS LêThị Bích Thủy đã tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệpcủa mình tại phòng Di truyền tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học và các anh chịlà cán bộ của phòng Di truyền tế bào thực vật.

Em cũng ĩn được bày tỏ lòng biết ơn tới TS Ninh Thị Thảo, giảng viên bộ mônCông nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn emtrong quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành khoá luận.

Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm đến gia đình, anh chị, bạn bè đã động viên,khích lệ tinh thần em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận Em xin chân thànhcảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022Sinh viên

Tôn Sơn Bách

1.1.Tổng quan về cây rau muống và muống biển. 3

1.1.1 Giới thiệu về cây rau muống. 3

1.1.2 Giới thiệu về cây muống biển. 3

1.1.3.Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước. 4

1.2.Sự biến đổi khí hậu và mối đe doạ hạn mặn đối với an ninh lương thực toàn cầu. 6

1.2.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu và hạn mặn đối với nông nghiệp. 7

1.2.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu và hạn mặn đối với an ninh lương thực. 9

1.3.Thành tựu chọn tạo giống cây trồng bằng chuyển gen. 10

1.4.Một số gen chống chịu hạn, mặn ở thực vật. 12

1.5.Các phương pháp chuyển gen ở thực vật. 13

1.5.1 Vector chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens. 14

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU20

2.3.1 Phương pháp tách dòng gen. 22

2.3.1.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu gen ipHP1. 22

2.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch RNA. 22

2.3.1.3 Phương pháp tổng hợp cDNA. 23

2.3.2 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5αα bằng sốc

2.3.2.1 Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR. 23

2.3.2.2 Phương pháp điện di DNA. 23

2.3.2.4 Phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp. 25

2.3.2.5 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E Coli. 25

2.3.2.6 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn E coli. 26

2.3.2.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide. 27

2.3.2.8 Phương pháp biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến A tumefaciens bằng

3.1. Kết quả nhân dòng gen ipHP1 từ cây rau muống biển. 29

3.1.2 Kết quả phân lập gen ipHP1. 29

3.1.3 Kết quả tạo vector pJET1.2 blunt tái tổ hợp mang gen ipHP1. 30

3.1.4 Kết quả xác định trình tự gen ipHP1 33

3.2. Thiết kế vector pBI121/35αS/ipHP1/Nos với sự điều khiển của promoter CaMV 35αS

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: Số lượng người thiếu dinh dưỡng trên thế giới qua các năm 10

Hình 2.1: Cây muống biển sử dụng trong thí nghiệm……… 20

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen ipHP1……… 30Hình 3 2: Ảnh điện di kiểm tra vector tách dòng pJET1.2 blunt/ipHP1 bằng phương

Hình 3.4: Ảnh điện di sản phẩm cắt vector tách dòng pJET1.2 blunt/ipHP1 bằng

Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen ipHP1 phân lập từ cây rau

muống biển với gen ipHP1có mã số MF680610.1 trên ngân hàng Genbank

Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự amino acid của gen ipHP1 phân lập từ cây rau muống biển và gen ipHP1 (hypothetical protein) có mã số AWW16520.1

Hình 3.7: Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen PBI121/35αS/ ipHP1/Nos. 36

Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121/35αS/Gus/Nos và pJET1.2

blunt/ipHP1 bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và SacI. 37

Hình 3.9: Ảnh điện di kiểm tra vector chuyển gen pBI121/35αS/ ipHP1/Nos bằng sản

Hình 3.10: Ảnh điện di kiểm tra vector chuyển gen pBI121/35αS/ ipHP1/Nos bằng

Hình 3.11: Dòng khuẩn lạc thu được 41Hình 3.12: Ảnh điện di sản phẩm PCR colony thể biến nạp A tumefaciens 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Trình tự và thông số cặp mồi ipHP1-R/F. 33

Bảng 3.2: Vị trí sai khác trong trình tự amino acid của gen ipHP1 và gen ipHP1

(hypothetical protein) mang mã số AWW16520.1. 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắtGiải nghĩa

ABA Abscisic acid

BAH Betaine aldehyde dehydrogenaseCOD Chemical Oxygen Demand

DEPC Diethyl pyrocarbonate

GMO Genetically Modified Organism (Sinh vật biến đổi gen)

NOS Nopaline synthase

ROS Reactive Oxygen SpeciesSS Settable Solids

WDS Water deficit stress

TÓM TẮT

Trong điều kiện khắc nghiệt ở môi trường biển đảo khó có thể trồng các loạirau xanh chính vì thế cần ứng dụng công nghệ trong việc chọn tạo giống cây trồng cókhả năng thích nghi trong điều kiện khí hậu khô hạn Mục tiêu của đề tài là thiết kếđược vector chuyển gen mang gen kháng hạn tách dòng từ cây muống biển phục vụcho chuyển gen chịu hạn Kết quả là từ mẫu rau muống biển chúng tôi đã tách dòng

thành công gen ipHP1 và so sánh với gen ipHP1 trên NCBI có mã số

MF680610.1 cho ra kết quả độ tương đồng lên tới 99%, độ bao phủ là 664/671 nu.Chúng tôi đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pBI121 mang promoter CaMV35S

và cấu trúc chứa gen đích ipHP1 Biến nạp thành công vector tái tổ hợp pBI121/35S/

ipHP1/Nos vào vi khuẩn A tumefaciens

Từ dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp, đây sẽ là bước trung gian để có thểchuyển cấu trúc mang gen vào rau muống nhà.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rau xanh là một loại thức phẩm và hàng hóa không thể thiếu trong cuộc sốngcủa con người Về mặt dinh dưỡng, rau thuộc một trong 4 nhóm thực phẩm chính,giúp cung cấp năng lượng, vitamin, chất xơ, các khoáng chất Xét về góc độ kinh tế,nó không chỉ là mặt hàng nông sản đem lại nhiều lợi nhuận góp phần đáng kể pháttriển kinh tế quốc dân, mà còn là nguyên liệu trong ngành công nghiệp chế biến nhưtrồng rau cải lấy hạt để ép dầu,

Trong đó, rau muống rất được ưa chu ng và phổ biến bởi đ c tính dễ trồng,ộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, ặc tính dễ trồng,dễ canh tác và có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất Ngoài ra, rau muống có giá trịdinh dưỡng cao đ c bi t là vitamin A, C; nguyên tố đa lượng và vi lượng cùng với đóặc tính dễ trồng,là các chất có hoạt tính sinh học cao như β – Carotenoid, Lutein và Zeaxanthin.Chính vì thế, nó có tác dụng làm giảm cholesterol, được sử dụng trong điều trị thiếumáu, vàng da, phòng ngừa các b nh về tim mạch, tiểu đường, …( Deb & cs., 2016)Song dù là cây trồng có giá trị nhưng rau muống lại chưa được nghiên cứu nhiều ởnước ta Ngược lại, rau muống biển có cùng họ với rau muống nhà, chúng thườngmọc hoang ở các ven biển, hải đảo dù không có giá trị thực phẩm nhưng lại đượct p trung nghiên cứu nhờ có chứa các gene chịu hạn, m n và hợp chất sinh học quý.ặc tính dễ trồng,Mới đây, nhóm các nhà khoa học đến từ Trung Quốc đã tạo thư viện cDNA các gen

liên quan đến chịu mặn của I pes-caprae (gen ipSR), trong đó có gen ipHP1 (ipSR24)

là một gen mới, có tiềm năng kháng hạn (Zhang Mei & cs., 2018b)

Trong điều kiện khắc nghiệt ở môi trường biển đảo khiến cho khó có thể trồngcác loại rau Chính vì vậy, nguồn cung rau chính của người dân và bộ đội trên đảo làvận chuyển từ trong đất liền nhưng với khoảng cách, khó khăn do di chuyển và điềukiện thời tiết nên là vô cùng hạn chế Từ đó, đặt ra vấn đề là tập trung ứng dụngcông nghệ để có thể chọn tạo ra giống cây rau biến đổi gen có thể thích nghi trongđiều kiện khô hạn và mặn ở địa phương Nếu chúng ta có thể tách dòng gen kháng

chịu hạn, m n ở rau muống biển rồi chuyển sang rau muống thì có thể chọn tạoặc tính dễ trồng,được giống rau muống vừa có giá trị thực phẩm vừa có khả năng sinh trưởng ở vùngkhô hạn, ven biển Đây là m t hướng đi mới và ứng dụng canh tác ở vùng hạn m n,ộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, ặc tính dễ trồng,vùng ven biển ho c các huy n đảo xa góp phần cải thi n đời sống của bà con tại địaặc tính dễ trồng,phương

Tuy nhiên để làm được điều đó thì cần phải có một vector phù hợp có thểthực hiện chức năng của nó ở trong tế bào chủ Từ những lý do trên, chúng tôi thực

hi n đề tài: ‘‘Thiết kế vector chuyển gen pBI121-ipHP1 mang gen chống chịu hạn của

cây muống biển.’’

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tổng quan về cây rau muống và muống biển.

1.1.1 Giới thiệu về cây rau muống.

Rau muống (Ipomoea Aquas) thuộc họ Convolvulaceae (Bìm bịp), chứa khoảng

500 loài trên thế giới Có hai kiểu gen hoang dã dạng màu đỏ và trắng (Sharma & cs,1994) Rau muống là cây thân thảo, thường mọc bò trên mặt nước hoặc trên cạn.Thân rỗng, dày, có nhiều đốt, có rễ ở các đốt, mặt ngoài nhẵn, lá có hình ba cạnh, đầungọn, đôi khi lá có thể thon dài, hẹp (Gangopadhyay & cs., 2021) Cụm hoa mọc ởnách lá, gồm 1 hoặc nhiều hoa, 4 hạt, có lông màu nâu đỏ (Trần Đức Bình & cs.,2017) Rau muống có tốc độ tăng trưởng tốt và tối đa ở mức 10 cm/ngày, có thể lấpđầy các đầm nước ngọt, ao hồ một cách nhanh chóng Nó phát triển tốt trong môitrường nước bị ô nhiễm hoặc nước thải và có hàm lượng khoáng chất cao, protein,vitamin và chất xơ, trong khi ít carbohydrate (McCann & cs, 1996) Vì tính chất dễsinh trưởng và phát triển nên ở một số nơi, nó trở thành một loại cỏ dại xâm lấn sinhthái (McCann & cs., 1996)

1.1.2 Giới thiệu về cây muống biển.

Muống biển (Ipomoea pes-caprae) thuộc họ Convolvulaceae, hình thái phổ biến

là với thân cây rất dài, bò và hình thành thảm dày trên bãi biển mở; màu xanh lá câyhoặc màu đỏ, mọng nước với mủ sữa, chiều dài thay đổi từ 1 m-3 m Lá: mịn, dày vàmạnh mẽ, lá xen rìa dài 3 cm-14 cm; rộng 2,5 cm-12 cm và trông giống như móngbò Cụm hoa: Các lá đài bên ngoài nách, hình trứng hoặc hình elip và các lá đài bênngoài rộng hơn, buồng trứng nhẵn, nhị hoa được bao quanh bởi các cánh hoa Hoa:tím, lớn, hình kèn, dài 3 cm-5 cm Quả: Hình dạng hình cầu, viên nang 4 địa phương,đường kính 12 mm - 17 mm Hạt giống: màu nâu, bốn hạt dưới màng cứng, có lôngdày đặc, chiều dài 7 mm - 12 mm, đường kính 6 mm - 8 mm (Shinde & Chavan.,2018) Nó được tìm thấy trên những cồn cát, bãi cát ven biển hoặc các khu vực rừngngập mặn bị xâm lấn và dọc theo rừng ngập mặn (Rathnayake & cs., 2020).

Hình 1.1: Cây hoa muống biển.

(Nguồn: https://www.thuocdantoc.org/duoc-lieu/rau-muong-bien)

1.1.3 Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước.

Tại Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về cây rau muống và rau muống biển.Với cây rau muống các đề tài thường chỉ tập trung vào khả năng hấp thụ kim loạinặng và ứng dụng trong xử lý nước thải Nhóm tác giả của Đại học quốc gia Hà Nộiđã có nghiên cứu bằng cách cho rau muống sinh trưởng trong môi trường nước ônhiễm (nước sông Tô Lịch) và sử dụng phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh hóa vớixử lý số liệu đã cho ra kết quả đáng kinh ngạc, các chỉ số SS, COD, NO2 trong nướcgiảm lần lượt là 86,3%, 70%, 21% sau 14 ngày (Nguyễn Thị Loan., 2007) Ngoài ra cómột số nghiên cứu về hiệu quả của dung dịch dinh dưỡng đến sinh trưởng của câyrau muống trong sản xuất thủy canh (Nguyễn Thị Ngọc Dinh & cs., 2015) Tuy nhiênchưa có một nghiên cứu về chuyển gen hoặc tách dòng gen cây rau muống ở ViệtNam Còn với cây rau muống biển chỉ một số bài báo miêu tả về đặc điểm sinh họcvà phân bố chứ chưa có những nghiên cứu chuyên sâu ( Nguyễn Thị Thu Ngân.,2014) Đây đều là cây có tiềm năng tiềm năng y học cao, song lại thường bị bỏ quado thiếu kiến thức và điều kiện nghiên cứu.

Trên thế giới

Nhóm các nhà khoa học Ấn Độ đã có những nghiên cứu về hàm lượng dinh

dưỡng và dược tính có trong cây rau muống với kết quả đáng kinh ngạc Trong lá củarau muống protein chiếm 3%, chất béo 0,4%, chất xơ 0,9%, chất khoáng 2%, axitnicotinic 0,6 mg/100 g, riboflavin 120 mg/100 g, Vitamin C 137 mg/100 g và vitaminE 11 mg/100 g (Manvar & Desai., 2013) Ngoài ra còn là các hợp chất sinh học quýnhư Alanine, glutamine và glucose được phát hiện từ thân cây; β - carotene đượcphát hiện trong quả; Hentri acontane –một chất có trong thuốc điều trị ung thư ởchâu Á, đặc biệt là Hàn Quốc và đang được nghiên cứu để sử dụng trong thuốcchống viêm (Ncbi) , β - sitosterol và glucoside của β - sitosterol có trong hạt Canxi,phốt pho, sắt, magie và hợp chất sinh học 7 - O - D - gluc opyranosyl -dihydroquercetin 3 - O A - D - glucopyra noside (DHQG) được phát hiện ở lá (Manvar& Desai, 2013) DHQG là một hợp chất sinh học quý có khả năng gây độc cho tế bàoung thư nên ứng dụng trong y học và dược (Prasad & cs., 2005)

Trong y học cổ truyền Ấn Độ, rau muống được sử dụng để điều trị táo bón, đaunửa đầu và các rối loạn liên quan đến giấc ngủ Ngoài ra, nó cũng thường được dùngđể điều trị các rối loạn liên quan đến gan, bệnh tiểu đường, bệnh tâm thần và cácvấn đề về đường ruột Rau muống còn có tính hạ đường huyết, chống tiểu đường,trong một nghiên cứu so sánh với các loại lá khác cho ra kết quả rằng lá rau muốnghiệu quả hơn lá roi, lá mướp và lá khoai (Manvar & Desai, 2013) Ngoài ra raumuống cũng có công dụng điều trị cho chảy máu cam và huyết áp, như một loạithuốc chống sốt và sử dụng làm thuốc giảm đau bằng cách ức chế hệ prostaglandin,chiết xuất của cây rau muống được coi là có hiệu quả chống ngộ độc asen(Gangopadhyay & cs., 2021)

Một số nghiên cứu đã được công bố về việc chuyển gen ở rau muống để cungcấp nguồn nguyên liệu cho y dược, các tác giả đã thành công trong việc chuyển gen

vào rau muống bằng cách sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefacies, cây chuyển

gen phát triển bình thường đến khi trưởng thành và gen GUS biểu hiện ổn định(Khamwan & cs., 2003)

Rau muống biển phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, …, chúng thườngmọc hoang ở các bãi cát ven biển, có tác dụng cố định cát và chống xói lở, có thể thuhái quanh năm làm thuốc hoặc thức ăn cho gia súc Đã có những nghiên cứu đánh giá

tiềm năng kháng u trong điều kiện in-vitro và in-vivo của rau muống biển Ipomoea

pes-caprae trên các tế bào ung thư hắc tố động vật (B16F10), ung thư dạ dày người

(Kato-III) và các dòng tế bào ung thư đại trực tràng ở người (HT-29) Tác dụng gây

độc tế bào của I pes-caprae được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm Trypanblue và MTT Hoạt tính chống oxy hóa của I pes-caprae được đánh giá bằng cách sử

dụng DPPH (chống chất oxy hóa), giảm nồng độ và phương pháp thử nghiệm chấttẩy ion hydroxide (tác dụng với chất oxy hóa) (Manigauha & cs., 2021).Trong quátrình tiến hóa thích nghi với những điều kiện bất lợi, muống biển đã phát triển mộtloạt các cơ chế sinh lý và phân tử để giảm hoặc tránh các tổn thương gây ra bởi quátrình thiếu nước, bảo gồm thay đổi cấu trúc protein, điều hòa quá trình sinh tổng hợpprotein và trao đổi chất Do vậy, muống biển được coi là nguồn nguyên vật liệu quantrọng cho các gen liên quan đến khả năng chịu mặn, hạn ở thực vật (Feng & cs.,2016) Nhóm nghiên cứu đến từ Trung Quốc gồm Zhang và các cộng sự đã sử dụnghệ thống tìm kiếm gen biểu hiện FOX để phân lập các gen liên quan đến khả năngkháng hạn ở muống biển Kết quả, nhóm tác giả đã thu nhận được 38 dòng mangtrình tự gen liên quan đến khả năng kháng mặn ở muống biển Các gen được dự đoánmã hóa cho các protein liên quan đến việc mất nước, khả năng loại bỏ các chất oxyhóa, các enzyme trao chất và các yếu tố di truyền tín hiệu, một số gen quan trọng

trong đó là IpSR26 mã hóa cho protein liên quan đến quá trình hút ẩm (Zhang Mei &cs., 2018b) Ngoài ra có gen ipHP1 (ipSR24) mã hóa cho hypothetical protein, một

loại protein chưa rõ về chức năng, nhưng được dự đoán với khả năng kháng hạn, mặnqua thử nghiệm trên chủng nấm men kiểu hoang dã W303, kết quả cho thấy rằng ở

các chủng W303 mang ipHP1 phát triển tốt hơn so với những chủng đối chứng âm

trong môi trường chứa 0,85 M, 1,28 M và 1,5 M NaCl (Zhang Mei & cs., 2018b)

1.2 Sự biến đổi khí hậu và mối đe doạ hạn mặn đối với an ninh lương thựctoàn cầu.

1.2.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu và hạn mặn đối với nông nghiệp.

Biến đổi khí hậu đã đặt ra thách thức đối với an ninh lương thực trên thế giớikhi mà sản lượng cây trồng sụt giảm và bên cạch đó còn vấn đề gia tăng dân số gâyra, với dân số được dự báo là sẽ tăng gấp đôi vào năm 2080 Sự sụt giảm năng suấtcây trồng là do sự thay đổi của điều kiện tự nhiên như nhiệt độ, nồng độ CO2, nồngđộ CH4,…(Okorocha, 2010 ) Điều này đã ảnh hưởng tới bốn thành phần của an ninhlương thực bao gồm sản xuất lương thực và tính sẵn có lương thực; khả năng tiếpcận thực phẩm; sử dụng thực phẩm và sự ổn định của hệ thống thực phẩm Trong

đó sản xuất lương thực là cơ sở của an ninh lương thực vì đây là khâu quyết địnhtrong việc tiếp cận lương thực và hầu hết những thay đổi khí hậu quan sát được ởcác vùng khác nhau ảnh hưởng tiêu cực đến sản xuất lương thực của địa phương vàkhu vực (Ruben D Piacentini, 2019).

Các hoạt động sản xuất lương thực bao gồm nông nghiệp, chăn nuôi và thủysản, trong đó nông nghiệp đóng vai trò then chốt đối với an ninh lương thực Việctăng nồng độ khí CO2 trong khí quyển làm kích thích sự phát triển của thực vật,năng suất của những loài thực vật có hiệu suất quang hợp thấp như C3 (lúa mì, đậutương, …) có thể tăng từ 10-25%, còn những loài thực vật có hiệu suất quang hợpcao như C4 tăng đến 10% Tuy nhiên, đi kèm với đó là làm tăng sự phân bố và khảnăng cạnh tranh của cỏ dại nên vẫn bị đánh giá là bất lợi(Porter & cs., 2014).

Đối với sự gia tăng nhiệt độ trung bình, các tác động dự kiến sẽ khác nhau giữacác loại cây trồng và vùng Ví dụ, nhiệt độ ấm lên vừa phải (1-3 ° C) ở các vùng ônđới được cho là có lợi cho năng suất cây trồng nhưng lại có tác động tiêu cực ở cácvùng nhiệt đới và khô hạn theo mùa, đặc biệt là đối với cây ngũ cốc Tất cả các khuvực trên thế giới sẽ bị ảnh hưởng tiêu cực nếu sự gia tăng nhiệt độ trung bình vượtquá 3° C (Porter & cs., 2014).

Một hậu quả khác của biến đổi khí hậu khác đối với nông nghiệp là sự thay đổidần về lượng mưa như cường độ, thời gian, thời lượng…Sự thay đổi này cho thấygia tăng về tần suất và cường độ bão và lũ lụt ở một số khu vực Ngoài thiệt hại trựctiếp do lũ lụt, lượng mưa dư thừa dẫn đến độ ẩm đất quá cao, làm đất bị thiếu khí,tăng nguy cơ bệnh tật và nhiễm trùng ở cây trồng (Ruben, 2019).

Do những thay đổi của điều kiện khí hậu, năng suất cây trồng (tính theo giá trịtrung bình toàn cầu) có thể bị giảm và do đó, chi phí sản xuất nông có thể tăng lên.Những thay đổi này sẽ không chỉ tác động đến các hệ thống nông - công nghiệp lớnmà còn ảnh hưởng đến các hệ thống sản xuất nông trại nhỏ hơn Do thực tế là

những nhóm nhỏ này có ít nguồn lực kinh tế và khả năng chống chịu để đối mặt vớicác tác động, nên hậu quả đối với chúng sẽ lớn hơn Đây không phải là vấn đề nhỏnếu chúng ta xem xét rằng trên thế giới hiện tại có khoảng 500 triệu trang trại giađình là mô hình nông nghiệp chủ đạo ở các nước đang phát triển và là nhà cung cấpthực phẩm lớn nhất cho cả các nước phát triển và đang phát triển (Bruil, 2014) Vídụ, ở Mỹ Latinh có khoảng 15 triệu trang trại gia đình, chiếm gần 400 triệu ha, sảnxuất 51% ngô, 77% đậu và 61% khoai tây được tiêu thụ trong khu vực(Altieri &Toledo, 2011)

Biến đổi khí hậu đã làm gia tăng nhiệt độ ở các vùng Cực, nơi có độ cao lớn vàhàm lượng nhiệt của nước đại dương khiến cho băng tuyết tan chảy, do đó làm tăngmực nước biển Mực nước biển đã dâng cao gần 20 cm từ cuộc cách mạng côngnghiệp tính đến năm 2014 và dự báo tương lai sẽ còn cao hơn (Zhongming & cs.,2013).

Làm đẩy nhanh quá trình xâm nhập mặn vào các vùng đất màu mỡ do mựcnước biển dâng, và việc khai thác quá mức nước ngầm ở các vùng khô hạn trên thếgiới cũng có thể làm tăng độ mặn của đất và nước ngầm Đất nhiễm mặn đã bao phủ20% tổng diện tích đất canh tác và 33% diện tích đất nông nghiệp được tưới tiêutrên toàn thế giới (Shrivastava & Kumar, 2015) Người ta ước tính rằng khoảng 600triệu người sống ở các vùng ven biển trên khắp thế giới có thể bị ảnh hưởng bởi quátrình nhiễm mặn (Dasgupta & cs., 2015) Đã có những phương pháp khắc phục nhưkhử muối trong nước đã được áp dụng và có hiệu quả rõ rệt trong nước sinh hoạt,tuy nhiên lại tốn kém nếu sử dụng trong tưới tiêu (Mukhopadhyay & cs., 2021)

Việt Nam cũng là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng trực tiếp nếu tìnhhình khí hậu xấu đi khi xếp thứ 5 về chỉ số rủi ro khí hậu toàn cầu năm 2018 và thứ 8về chỉ số rủi ro khí hậu dài hạn (CRI) (Eckstein & cs., 2017) Trong đó vì địa hình nướcta có đường bờ biển dài và nhiều sông suối nên Việt Nam đứng đầu về chỉ số ảnhhưởng bởi xâm nhập mặn, bão lũ Dẫu vậy hạn hán cũng là một vấn đề cần quan

tâm, đặc biệt là sau đợt hạn nghiêm trọng năm 2015-2017 Điều này đã tác độngkhông nhỏ tới nền kinh tế và sự phát triển, tính bền vững nhất là đối với một nướcmà nông nghiệp chiếm tỉ trọng cao như nước ta (Lang, 2021) Theo số liệu của trạmquốc gia Hòn Dấu ghi nhận được trong vòng 50 năm mực nước biển dâng khoảng 20cm Và nếu tình hình này còn kéo dài, khi nước biển dâng thêm 100cm nữa thì ViệtNam sẽ mất 40.000 km2 diện tích đất,10% dân số nước ta bị ảnh hưởng trực tiếp,tổn thất đối với GDP khoảng 10% và dự kiến điều này sẽ xảy ra vào năm 2100 (Điệp,2021).

1.2.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu và hạn mặn đối với an ninh lương thực.

Hiện tượng thời tiết cực đoan khiến ít nhất 3.500 người đã thiệt mạng vì ảnhhưởng của thiên tai, và hơn 13,5 triệu người mất nhà cửa Không chỉ vậy, tính riêngmười thảm họa thời tiết khủng khiếp nhất trong năm 2020 đã gây nên thiệt hại lênđến 150 tỷ USD trên toàn thế giới, ảnh hưởng nặng nề đến các nước, đặc biệt là cácnước có thu nhập thấp và khả năng hồi phục kinh tế chậm Điều này dẫn đến hệ lụymất an ninh lương thực gia tăng trở lại kể từ năm 2014 Theo số liệu của Tổ chứcNông lương Liên Hợp Quốc (FAO), gần 609 triệu người, tương đương 8.3% dân sốthế giới, bị suy dinh dưỡng con số này duy trì ở những năm tiếp theo Tuy nhiên đếnnăm 2019 thì số lượng tăng vọt một phần do ảnh hưởng của dịch bệnh COVID-19 Sốngười rơi vào tình trạng khủng hoảng, khẩn cấp và đói kém đã tăng lên gần 135 triệungười trên 55 quốc gia Và dự báo sẽ có khoảng 1,8 tỷ người trên thế giới sẽ khókhăn về nước sạch và 600 triệu người bị suy dinh dưỡng vì thiếu lương thực trongnhững năm tới (Fao, 2021).

Hình 1.2: Số lượng người thiếu dinh dưỡng trên thế giới qua các năm.

Vậy nên ưu tiên hàng đầu là áp dụng sinh học trong bảo tồn đất hoặc chọn tạocác giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu, sinh trưởng được trong nhữngmôi trường khắc nghiệt Từ đó, vừa đảm bảo được nguồn cung lương thực vừa giảmthiểu ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đối với con người.

1.3 Thành tựu chọn tạo giống cây trồng bằng chuyển gen.

Trong hàng ngàn năm, con người đã sử dụng các phương pháp truyền thốngnhư nhân giống chọn lọc để sinh sản thực vật và động vật với những đặc điểm mongmuốn hơn Ví dụ, nông dân sớm đã phát triển các phương pháp lai tạo chéo đểtrồng ngô với một loạt các màu sắc, kích cỡ và sử dụng Dâu tây ngày nay là sự giaothoa giữa một loài dâu có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và một loài dâu có nguồn gốc từNam Mỹ (Hummer & Hancock, 2009) Hầu hết các loại thực phẩm chúng ta ăn ngàynay được tạo ra thông qua các phương pháp nhân giống truyền thống Nhưng việcthay đổi thực vật và động vật thông qua nhân giống truyền thống có thể mất nhiềuthời gian, và rất khó để thực hiện những thay đổi rất cụ thể Sau khi các nhà khoahọc phát triển kỹ thuật di truyền vào những năm 1970, họ có thể thực hiện nhữngthay đổi tương tự theo cách cụ thể hơn và trong một khoảng thời gian ngắn hơn

(Daubenmire, 2019)

Mặc dù nước đi đầu trong việc phát triển GMO là Mỹ và nước châu Âu nhưngTrung Quốc lại là quốc gia đầu tiên cho phép thương mại hóa cây thuốc lá biến đổigen kháng virút vào năm 1992 Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận chobán tại Mỹ năm 1994 là cây cà chua FlavrSavr có thời gian bảo quản lâu hơn bằngcách ngăn chặn hình thành tích lũy polygalacturonase – một enzyme có khả nănghòa tan pectin ở thành tế bào làm mềm hoa quả Trong 20 năm qua, cây trồng GMđã trải qua sự gia tăng bùng nổ và đạt được nhiều thành tựu đáng kinh ngạc Từnăm 1996 đến 2016, tổng diện tích cây trồng GM được trồng trên thế giới tăng từ1,7 lên 185.1 triệu ha, tương đương khoảng 13,2% đất trồng trọt trên thế giới(WangXingchun & cs., 2017) Tổng cộng có 26 quốc gia, 19 quốc gia đang phát triển và 7quốc gia đang phát triển Mười quốc gia có diện tích trồng GMO đứng đầu bởi HoaKỳ, 72,9 triệu ha (39% Tổng, tương tự như năm 2015), Brazil với 49,1 triệu ha (27%),Argentina với 23,8 triệu ha (13%), Canada với 11,1 triệu ha (6%), Ấn Độ với 10,8triệu ha (6%), Paraguay với 3,6 triệu ha (2%), Pakistan với 2,9 triệu ha (2%), TrungQuốc với 2,8 triệu ha (2%), Nam Phi với 2,7 triệu ha (1%) và Uruguay với 1,3 triệu ha(1%)(Isaaa, 2016a) Việt Nam đã thương mại hóa cây trồng công nghệ sinh học đầutiên, ngô, với diện tích tối thiểu 3.500 ha vào năm 2015 Tuy nhiên năm 2016, nôngdân đã áp dụng công nghệ khá nhanh với mức tăng ước tính gấp 10 lần lên 35.000ha Có một sự tăng trưởng vượt bậc như vậy một phần là do sản lượng của cây trồngbiến đổi gen tăng từ 16,5% đến 25% so với cây trồng không biến đổi gen (Isaaa,2016b).

Ngoài những thành tựu trên, công nghệ biến đổi gen đã chọn tạo được câytrồng chuyển gen có những đặc tính quý như tính chịu hạn, tính đề kháng với thuốctrừ sâu, khả năng kháng sâu bệnh và đặc biệt là cá thể biến đổi gen có đặc tínhmong muốn, ổn định trong thời gian dài Về mặt kháng sâu bệnh: đã tạo được câytrồng biến đổi gen Bt kháng sâu hại lá Sâu hại lá là một trong số các sâu bệnh chủ

yếu của cây trồng Nếu không sử dụng thuốc trừ sâu, năng suất của cây trồng sẽ bịgiảm, nhưng sử dụng thuốc trừ sâu sẽ làm tăng chi phí sản xuất, đẩy giá thành củasản phẩm lên cao, gây tác hại đến môi trường và ảnh hưởng sức khỏe của người tiêudùng Nhưng các cây biến đổi gen Bt (ngô, bông, đậu tương,… ) có thể kháng lại sâuhại lá vì chúng có chứa protein của một loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis(Saxena &Stotzky, 2000) Loại vi khuẩn này tiết ra các protein là độc tố nhưng chỉ có tác dụngtrên với một số loài sâu hại lá chính mà không ảnh hưởng tới các loại côn trùng,động vật cũng như con người Vì vậy, cây biến đổi gen Bt có thể mang lại nhiều lợiích như giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu, giảm giá thành và đảm bảo năng suấtcho người nông dân cũng như sức khỏe cho người tiêu dùng (giảm nguy cơ có lẫnthuốc trừ sâu trong thực phẩm) (Bullock & Nitsi, 2001) Về mặt dinh dưỡng: Bệnhmù mắt do thiếu vitamin A là bệnh thường gặp ở các nước thế giới thứ ba Theo báocáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm ước tính trên thế giới có 500.000trường hợp mù mắt do thiếu vitamin A và 2 triệu người chết vì các biến chứng dothiếu vitamin A(Who, 2009) Các nhà khoa học của Viện công nghệ cây trồng - Việnkhoa học liên bang Thụy Sĩ đã tạo ra giống gạo vàng có chứa hàm lượng cao chất β-carotene bằng công nghệ biến đổi gen Ước tính là 72g gạo này sẽ cung cấp 50%lượng vitamin A hàng ngày của trẻ 1-3 tuổi (Guangwen Tang, 2009) Điều đáng quýhơn nữa là giống gạo vàng này được phát triển cho nông dân ở những nước nghèotrên thế giới và công nghệ này được phát triển không nhằm mục đích thu lợi nhuậnnên sẽ được sử dụng miễn phí Hiện nay, viện này đang có kế hoạch nghiên cứu làmtăng hàm lượng sắt có trong giống gạo vàng nói trên Về mặt kinh tế : một loại hoahồng tím đã được tạo ra bằng cách chuyển một cấu trúc bao gồm bốn loại gen khácnhau cùng lúc trong đó có gen delphinidin vốn tạo ra màu xanh trong một loài hoakhác (Katsumoto & cs., 2007) Điều này mang lại nhiều lợi nhuận cho các nhà sảnxuất hoa hồng do người tiêu dùng rất ưa chuộng loại hoa hồng tím với màu sắc chưatừng có này Về mặt y học: Vắc xin và thuốc thường đòi hỏi chi phí cao để sản xuấtvà bảo quản Các nhà khoa học đã tạo ra giống khoai tây và cà chua biến đổi gen có

chứa vắc xin Những vấn đề như vận chuyển, bảo quản hay quản lý các vắc xin cótrong các loại củ quả sẽ trở nên dễ dàng và kinh tế hơn nhiều so với phương thứctruyền thống (Langridge, 2000; Kauffmann & cs., 2019).

1.4.Một số gen chống chịu hạn, mặn ở thực vật.

Trước tình hình biển đổi khí hậu, đe dọa của hạn, mặn; rất nhiều nhà khoa họcđã chọn hướng nghiên cứu các dòng gen chống chịu hạn, mặn ở một số giống câyđặc thù để có thể chọn tạo giống có khả năng sinh trưởng trong những điều kiện bấtlợi mà vẫn cho năng suất cao Mới đây, một nhóm nhà khoa học đã công bố một số

gen liên quan tới khả năng chịu hạn và mặn của cây muống biển (gen IpDHN) Bằng

cách chuyển một trong các gen này vào cây mô hình Arabidopsis cho thấy cho thấysự tăng cường đáng kể trong khả năng chống chịu với mặn, hạn hán, cũng như ít tíchtụ hydrogen peroxide (H2O2) và gốc superoxide (O2 -), đi kèm với việc gia tăng hoạtđộng của hệ thống enzyme chống oxy hóa của các cá thể được chuyển gen (ZhangHui & cs., 2018a) Một nhóm gen khác cũng được ghi nhận có đóng góp đến tính

kháng hạn, mặn ở thực vật là ASR Các gen ASR (axit abscisic) là các họ gen nhỏ đặc

trưng ở thực vật, liên quan đến khả năng kháng các điều kiện bất lợi (chủ yếu là hạnvà mặn) Các gen này mã hóa cho các protein có tính ưu nước Tất cả các protein nàyđều có domain ABA/WDS như 1 đặc điểm chung Domain này có thể liên quan đếnchức năng sinh học trong phản ứng của thực vật với sự mất nước hoặc con đường

tín hiệu ABA (Iusem & cs., 1993) Ngoài ra, gen OsLea21 thuộc nhóm LEA_5, trong họ

protein LEA, một họ lớn được biết tới như là một protein bảo vệ liên quan đến sựmất nước ở hạt và mô thực vật, được các nhà khoa học Việt Nam nhân dòng gen,giải trình tự và đánh giá khả năng chịu hạn, mặn của các giống lúa, kết quả nhóm tácgiả đã chọn được giống lúa Cườm có khả năng kháng mặn rất cao (Trần Xuân An &cs., 2014).

Cùng với đó là có rất nhiều gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn, mặncây đã được phát hiện tuy nhiên chúng thường là hai loại chính Một là các yếu tố

truyền tín hiệu, bao gồm kinase protein và các yếu tố phiên mã và hai là các yếu tốchức năng, bao gồm các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất, điều hòathẩm thấu, thay đổi protein, sửa đổi protein, khử và vận chuyển ROS (Wang Jingyi &cs., 2021)

1.5.Các phương pháp chuyển gene ở thực v t.ật.

Các phương pháp chuyển gene ở thực v t luôn phát triển xong hành với kỹthu t nuôi cấy mô và tế bào thực v t Nó đã trở thành m t phương ti n quan trọngộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,trong nghiên cứu về sinh học thực v t và mang lại triển vọng về kinh tế của cácgiống cây trồng Phương pháp chuyển gene bao gồm cả trực tiếp lẫn gián tiếp, mỗiphương pháp đều có những ưu nhược điểm khác nhau, các nhà nghiên cứu sẽ tuỳvào đối tượng mà chọn lựa phương pháp thích hợp Tuy nhiên, phương pháp

chuyển gene gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens vẫn được sử dụng rộng rãi

nhờ những ưu điểm như không yêu cầu máy móc chuyên dụng, ổn định ở những thế

hệ sau, dễ thao tác trong thí nghiệm, chi phí thấp…

1.5.1 Vector chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens.

A.tumefaciens là vi khuẩn dạng que, gram âm trong đất, được biết tới với khảnăng xâm nhập vào cây hai lá mầm thông qua những tổn thương trên cây và tạo racác khối u tại những vị trí đó (Citovsky, 2019) Điều này đặc biệt ở chỗ là khối u vẫnphát triển kể cả khi đã tiêu diệt hết vi khuẩn, chứng tỏ vi khuẩn đã chuyển vào vật

chủ dưới dạng vật chất di truyền (DNA) A tumefaciens có khả năng này là bởi cấu

trúc gene gồm 3 phần là T-DNA là đoạn DNA chuyển từ tế bào vi khuẩn sang tế bàochủ, T-DNA xâm nhập ổn định vào bộ gen của vật chủ và không mã hóa cho các sảnphẩm trợ giúp cho quá trình chuyển nạp Tiếp đến là vùng vir có độ dài 35kb, làmnhiệm vụ như một ‘’cái cửa’’ điều tiết quá trình chuyển nạp T-DNA từ Ti-plasmidsang tế bào thực vật nhờ nhận biết dấu hiện tổn thương của cây thông qua các tínhiệu hóa học từ vết thương(Nguyễn Đức Thành, 2003) Gen vir mã hóa cho một tậphợp các protein với các chức năng khác nhau như nhận biết tín hiệu hóa học từ vết

thương của cây (virA,virG); cắt bỏ và xử lý DNA (virC và virD); lớp phủ và bảo vệ DNA trong quá trình chuyển (virE); hình thành hệ thống bài tiết loại IV (T4SS) chịu

T-trách nhiệm Giao T-DNA cho các tế bào thực vật (operon virB) và tích hợp T-DNA vào

nhân thực vật (virE2 và virD4) (Gelvin, 2013) Thành phần thứ ba trong quá trìnhchuyển T-DNA là ba gene chvA, chvb và pscA rất cần thiết cho quá trình gắn

A.tumefaciens vào tế bào thực vật (G a Cangelosi 1989) Có hai hệ thống vector

được sử dụng trong chuyển gene gián tiếp qua vi khuẩn A tumefaciens là vector liên

hợp và vector nhị thể.

Hệ thống vector liên hợp

Vector thứ nhất là Ti-plasmid đã loại bỏ vùng gen gây khối u và cùng tạo cáchợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái hoặc bờ phải Những đoạnbị cắt bỏ sẽ được thay bằng những vùng tương đồng của plasmid thứ hai (plasmidtrung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai vector.

Vector thứ hai (Plasmid trung gian) là một loại plasmid tách dòng từ vi khuẩn E.

coli nhưng có thể nhân lên trong vi khuẩn Agrobacterium Plasmid này chứa vùng

gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị giúp chọn lọc tế bào và các đoạn tươngđồng.

Khi cho hai loại plasmid này tương tác với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự traođổi chéo hai đoạn tương dồng và tạo thành vector liên hợp Tuy nhiên do tần suất

đưa plasmid trung gian từ E coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7 đến 10-5) nênhiện nay ít sử dụng hệ thống vector liên hợp (Nguyễn Đức Thành, 2003)

Một trong những hệ thống vector liên hợp cho hiệu quả cao là hệ thống vectorcó đầu chẻ (SEV) Các vector loại này có chuỗi phải và chuỗi trái mỗi chuổi nằm trênmột plasmid độc lập và chúng xêm nhập dồng thời chỉ bằng một lần tái tổ hợp, trongkhi các hệ thống khác có thể phải cần tới hai lần tái tổ hợp Một loại vector SEVthường dùng là plasmid pMON200 (Nguyễn Đức Thành, 2003).

H thống vector nhị thể.ệ thống vector nhị thể.

Gồm hai vector cùng tồn tại trong Agrobacterium: một vector chính mang gen

cần chuyển và một vector hỗ trợ Vector chính là một plasmid khép kín đặc trưnggồm một hoặc cả hai vùng (trái hoặc phải) lặp lại của T-DNA, vùng sao mã và khởi

động có thể hoạt động trong cả E coli và A tumefaciens, gen chỉ thị chọn lọc và

vùng MCS chứa gen chuyển Vector hỗ trợ là một Ti-plasmid đã loại bỏ vùng bờtrái , phải và vùng T-DNA, chỉ giữ lại vùng gen vir hỗ trợ chuyển gen vào tế bào thựcvật (Thành, 2003) Hệ thống vector nhị thể luôn được cải tế để nâng cao năng suất

chuyển gen thông qua Agrobacterium, một trong số đó là vector pBI121.

Hình 1.3: Bản đồ vector pBI121.

Song hành cùng sự phát triển của công nghệ kỹ thuật, các phương pháp chỉnhsửa gen mới cũng được nghiên cứu và phát triển Năm 2002, đánh dấu cột mốc cho

phương pháp chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 lần đầu tiên được công bố và sự bùng nổ

của phương pháp này trong những năm tiếp theo Một hệ thống vector mới đãđược phát triển để chỉnh sửa bộ gen cây một và hai lá mầm, bằng cách sửa đổi cácvectơ, thêm đoạn gen mã hóa kháng streptomycin để sử dụng với chủng

Agrobacterium Tumefaciens và thiết kế gRNA dựa trên trình tự gen đích (Leandro

Vargas Hernández & cs., 2021) Còn tại Việt Nam tác giả Bùi Mạnh Minh và các cộng

sự đã nghiên cứu thiết kế hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 mang gRNA địnhhướng đột biến gen SLIAA9 của cà chua thông qua vi khuẩn A tumefaciens EHA105,kết quả là gen được chuyển vào thành công, kiểm tra sự hiện diện của gen Cas9

bằng phương pháp PCR, cây cà chua tái sinh phát triển bình thường (Bùi Mạnh Minh& cs., 2020) Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào về chuyển gen cây rau muống

bằng hệ thống vector CRISPR/Cas9, đây cũng có thể là một hướng tiếp cận mới, tiềmnăng trong chọn tạo giống cây chống chịu hạn, mặn

1.5.2 Giới thiệu vector pBI121.

Kích thước ngắn khoảng 14kb, có đầy đủ các thành phần chính của m t vectorộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,giúp nó thực hi n chức năng của mình trong tế bào chủ như:

Đoạn khởi đ ng gen (promoter)ộng gen (promoter)

Promoter 35S từ virus khảm hoa súp lơ (viết tắt CaMV 35S) được sử dụng chosự biểu hiện của gen biến nạp ở tất cả các loại mô tế bào Nhưng CaMV 35S-promoter chỉ có khả năng hoạt động mạnh và rộng rãi ở nhiều mô của cây hai lámầm còn đối với cây một lá mầm lại hoạt động kém Tuy nhiên, đối với cây raumuống là cây hai lá mầm thì promoter CaMV 35S là vô cùng thích hợp Trong một đềtài về chuyển gen rau muống, các tác giả cũng chọn promoter CaMV 35S trongvector tái tổ hợp nghiên cứu, thu được kết quả biểu hiện gen chuyển rất khả quan(Khamwan & cs., 2003)

Hình 1.4: Cấu trúc promoter CaMV 35s

CaMV 35S promoter có chiều dài 835bp gồm 3 thành phần chính là: ● Hộp TATA có vị trí -46 đến +8.

● Vùng tăng cường A (enhancer) có vị trí -90 đến -46 tác dụng làm tăngcường biểu hiện gen chuyển ở rễ.

● Vùng tăng cường B có vị trí từ -343 đến -90 giúp tăng cường biểu hiện genchuyển ở lá.

Vùng khởi đ ng sao chép (Ori).ộng gen (promoter)

Để Ti plasmid có thể nhân lên đ c l p trong tế bào ộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, E coli và A tumefaciens

cần gắn thêm điểm khởi đầu sao chép có vai trò là vị trí bắt đầu sao chép.

Vùng pUC ori khởi động sao chép trong E coli được lấy từ vector pUC19.

Vùng pRK2 oriV khởi đ ng sao chép trongộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, A tumefaciens được lấy từ plasmidpRK2.

Vùng kết thúc (terminator)

Vùng kết thúc gồm trình tự cho phép RNA polymerase phát hi n dấu hi ungừng phiên mã và là trình tự kết thúc m t gene, phân bi t giữa gene này với geneộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,khác Các đoạn kết thúc thường có đuôi poly A như AATTAA ho c AACCAA Hiện nayặc tính dễ trồng,các

Vùng Mutil cloning site

Vùng MCS hay vùng tạo dòng chứa nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn, bằngcách sử dụng enzyme cắt tương ứng có thể đưa gene ngoại lai vào Mỗi vector sẽ

chứa số điểm cắt khác nhau như pCAMBIA1301 chứa EcoRI, BamHI, SacI, XbaI,

Hình 1.3: Vùng T-DNA của vector pBI121.

Gen chỉ thị

Chọn lọc các gen chỉ thị phù hợp cho chọn lọc các sản phẩm chuyển gene vàcó tác dụng phối hợp với quy trình nuôi cấy mô và tế bào Có hai loại chỉ thị là chỉ thịchọn lọc và chỉ thị sàng lọc.

Gene chỉ thị chọn lọc có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn, là đoạn gene mãhoá cho enzyme phân huỷ kháng sinh ho c các chất chọn lọc Sử dụng gen chỉ thịặc tính dễ trồng,chọn lọc cần đạt một số tiêu chí như là chất chọn lọc chỉ ức chế sinh trưởng của tếbào không được biến nạp chứ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của củatế bào biến nạp Ngoài ra còn không được làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởngcủa cây chuyển (Thành, 2003) Cấu trúc vector pBI121 mang đoạn khởi động NOS(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2

(neomycin phospho transferase gene) có nguồn gốc từ vi khuẩn Brucella abortus.

Vậy nên chỉ có những thể biến nạp chứa gen kháng mới sống được trên môi trường

có bổ sung kháng sinh kanamycin.

Gen chỉ thị sàng lọc để phân bi t cá thể chuyển gen được điều khiển bởichuỗi khởi đ ng đ c thù của thực v t và sản phẩm của các gen này có thể phân tíchộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, ặc tính dễ trồng,bằng con đường sinh hoá M t gen chỉ thị sàng lọc thực v t sẽ có m t số đ c điểmộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, ộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng, ặc tính dễ trồng,như sản phẩm của nó là đ c nhất và không gây hại đối với tế bào thực v t chủ, cácộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,enzyme chỉ thị có đ ổn định dịch mã, các phương pháp phân tích sản phẩn của genộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,thu n ti n, đ c thù, rẻ,…và có khả năng kết hợp với polypeptide bên ngoài mà vẫnặc tính dễ trồng,giữ được hoạt tính của enzyme (Thành, 2003) Ví dụ gen Gus cho phép sàng lọc môvà tế bào của cây chuyển gen dựa trên cơ sở kĩ thu t nhu m tế bào bằng X-glucộng và phổ biến bởi đặc tính dễ trồng,(Hull & Devic, 1995).

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu nghiên cứu

V t li u thực v tật liệu thực vật ệ thống vector nhị thể.ật liệu thực vật

Cây rau muống biển cung cấp bởi Trung tâm tài nguyên thực v t.

Hình 2.1: Cây muống biển sử dụng trong thí nghiệm.

V t li u vi khuẩnật liệu thực vật ệ thống vector nhị thể.

Chủng vi khuẩn Escherichia coli (E coli) DH5α được cung cấp bởi phòng Di

truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1 được cung cấp bởi phòng Di

truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.

V t li u tách dòng và chuyển genật liệu thực vật ệ thống vector nhị thể.

Vector tách dòng pJET1.2 blunt và vector chuyển gen pBI121 do phòng Ditruyền tế bào thực vật- Viện Công nghệ sinh học cung cấp Cặp mồi đặc hiệu nhân

gen ipHP1:

Bảng 2 1: Trình tự cặp mồi ipHP1.

ipHP1 – F 5’-CGTGCGTGGATCCATGTCAACTGTTCA-3’ 27

ipHP1 – R 5’-CACCATGAGCTCCTACGACTCGG-3’ 23Cặp mồi này do hãng Macrogen (Hàn Quốc) cung cấp

Hoá chất

Hóa chất tách chiết và tinh sạch plasmid: Sol I (Tris-HCl 25mM, pH 8.0; EDTA10mM, pH 8.0; Glucose 50mM; H2O); Sol II (NaOH 0.2 M; SDS 1%); Sol III (đệmPotassium acetat 3M; Axetic axit 2M; H2O); Isopropanol, Ethanol 70%, dung dịchchloroform: isoamyl alcohol (24:1).

Hóa chất tách và tinh sạch RNA: Nitơ lỏng, trizol, chloroform, hỗn hợpNa3C6H5O7 0,8 M và NaCl 1,2 M, isopropanol, etanol 70 %, nước chứa DEPC.

Hóa chất điện di DNA: Dung dịch đệm TAE 50X (121g, axit acetic glacia 28.6ml; 0.5 M ETDA pH 8.0 -50 ml; nước khử ion vừa đủ 500ml); Agarose 1%, EtBr 0.5µg/ml; Loading dye 6x, Marker 1kb, …

Dung dịch trong phản ứng PCR và RT-PCR: PCR water, đệm master mix 2X, mồi

xuôi/ ngược, đệm buffer tango 10X, enzyme cắt giới hạn BamHI và SacI, enzyme nối

T4 DNA Ligase.

Môi trường nuôi vi khuẩn LB lỏng và đặc: Pepton 10g/l, cao nấm men 5g/l,nacl 10g/l, Agar (cho môi trường đặc) 16g/l, kháng sinh kanamycin, kháng sinhrifamycin.

Thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu sử dụng.

1 Tủ cấy an toàn sinh học cấp I, II 11 Máy điện di

3 Tủ nuôi lắc 28/37ºC 14 Ống Eppendorf (0,2/0,5/1,5ml)

7 Máy cất nước 17 Lò vi sóng

2.2.N i dung nghiên cứu.ội dung nghiên cứu.

Nội dung 1: Tách dòng gen ipHP1 có trong cây rau muống biển.

Nội dung 2: Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α.

2.3Phương pháp nghiên cứu.2.3.1 Phương pháp tách dòng gen.

2.3.1.1 Phương pháp thiết kế mồi đ c hi u gen ặc hiệu gen ệu gen ipHP1.

Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự của gen ipHP1 có mã số MF680610.1

trên NCBI Sử dụng chương trình phân tích BLAST (NCBI) và Clustal W (bioedit) để sosánh và thiết kế mồi đ c hi u cho đoạn gen.ặc tính dễ trồng,

2.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch RNA.

Phương pháp sử dụng Trizol (Chomczynski P và cộng sự năm 1987, 2006) đượcáp dụng và cải tiến để tách RNA tổng số từ phần lá bánh tẻ của rau muống biển.Phần lá sau khi được nghiền trong Nitơ lỏng bằng chày cối sứ thành dạng bột mịn sẽchuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml Thêm 1 ml Trizol vào mỗi ống, đảo đều và ủ 30phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, ly tâm với tốc độ 10.000 v/p trong 15 phút ở 4ºC,loại bỏ cặn lắng ở đáy ống, thu lại phần dịch trong chuyển sang ống eppendorf mớivà ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Bổ sung 200 μl dung dịch chloroform, voltex và ủ 15l dung dịch chloroform, voltex và ủ 15phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, ly tâm 10.000 v/p trong 15 phút ở 4ºC Hút lớp trêncùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung 200 μl dung dịch chloroform, voltex và ủ 15l hỗn hợp muối (Na3C6H5O7 0,8M và NaCl 1,2 M), 300 μl dung dịch chloroform, voltex và ủ 15l isopropanol rồi đảo đều, ủ ở nhiệt độ phòng 20 phút Sauđó, ly tâm tốc độ 10.000 v/p trong 15 phút ở 4ºC Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa.Rửa bằng cồn 70º C, ly tâm với tốc độ 10.000 v/p trong 7 phút ở 4ºC Tủa được đểkhô ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút Bổ sung 40 μl dung dịch chloroform, voltex và ủ 15l nước có chứa DEPC, sau