(Luận văn) thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen crprx phân lập từ cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM lu an n va p ie gh tn to THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) d oa nl w lu nf va an LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC z at nh oi lm ul z m co l gm @ http://www.ltc.tnu.edu.vn n va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN an Lu THÁI NGUYÊN – 2016 ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM lu an n va gh tn to THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) p ie Chuyên ngành: Di truyền học d oa nl w Mã số: 60.42.01.21 nf va an lu LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC z at nh oi lm ul z Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN – 2016 n va http://www.ltc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiê ̣n dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng năm 2016 Tác giả lu an Đào Thị Nhâm n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va http://www.ltc.tnu.edu.vn ac th i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN si LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Ban chủ nhiê ̣m K hoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, Ths Hồ Mạnh Tường cán lu bơ ̣ Phòng DNA ứng du ̣ng , Phịng thí nghiệm Trọng điểm C ông nghê ̣ gen , Viê ̣n an n va Công nghê ̣ S inh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam ta ̣o Tôi xin cảm ơn động viên , khích lệ của gia đình bạn bè suốt gh tn to điề u kiê ̣n và giúp đỡ tiế n hành các thí nghiê ̣m của đề tài luận văn p ie thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài luận văn w Đề tài luâ ̣n văn th uô ̣c chương triǹ h đào ta ̣o nghiên cứu sinh và cao ho ̣c oa nl Bộ môn Di t ruyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Khoa Sinh học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư d phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên nf va an lu Tác giả z at nh oi lm ul Thái Nguyên, tháng năm 2016 z m co l gm @ Đào Thị Nhâm an Lu n va http://www.ltc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – iiĐHTN si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU lu an Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu va n Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU gh tn to Giới thiệu dừa cạn 1.1 ie 1.1.1 Nguồn gốc phân loại p 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn nl w 1.1.3 Tác dụng dừa cạn Hợp chất alkaloid tác dụng d oa 1.2 an lu 1.2.1 Alkaloid nf va 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 10 1.3 lm ul 1.2.3 Peroxidase gen mã hóa peroxidase 14 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine z at nh oi vincristine dừa cạn 17 1.3.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine z dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 17 @ l gm 1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 19 co m Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 an Lu 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 22 n va http://www.ltc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu –iii ĐHTN si 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị 22 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2 2.2.1 Thiết kế cặp mồi nhân gen 27 2.2.2 Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số 28 2.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA 28 2.2.4 Nhân gen CrPrx kĩ thuật RT-PCR 29 2.2.5 Phương pháp tinh sản phẩm RT-PCR 30 2.2.6 Kỹ thuật tách dòng gen 31 lu 2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx 34 an 2.2.8 Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx 34 va n 2.2.9 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 37 tn to Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 gh Kết phân lập tách dòng gen CrPrx 38 3.1 ie p 3.1.1 Kết khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA 38 nl w 3.1.2 Kết ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng 39 Xác định trình tự gen CrPrx 43 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx 47 d oa 3.2 an lu nf va 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) 48 3.4 lm ul 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 51 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx 54 z at nh oi KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 z m co l gm @ an Lu n va http://www.ltc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh ABA Abscisic acid A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Tiếng Việt Axit Absisic Bp CaMV 35S Cặp bazơ nitơ base pairs Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter Cộng Cs Gen mã hóa peroidase dừa cạn Cây dừa cạn lu Catharanthus roseus peroxidase C roseus Catharanthus roseus (L.) G Don DAT Deacetylvindoline DNA E coli tranferase Deoxyribonucleic acid Escherichia coli Axit Deoxyribonucleic Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assa Xét nghiệm ELISA an CrPrx n va tn to p ie gh EDTA ELISA Isopropyl β-D-1Thiogalactopyranoside Luria Bertami d LB oa nl w IPTG 4-O-acetyl Gen DAT an lu Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn Vùng cắt gắn đa vị Multi Cloning Site Neomycin phosphotransferase gene PCR Kb SDS RT-PCR Polymerase chain reaction Kilo base Sodium dodecyl sulphate Reverse transcription - Polymerase Phản ứng chuỗi polymerase -phiên mã ngược X-gal Chain Reaction 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betaDgalacto-pyranoside nf va MCS NptII z at nh oi lm ul Phản ứng chuỗi polymerase z l gm @ Vòng/ phút m co V/p an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN ac th si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx 29 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx 30 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT 31 Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn 32 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR 32 Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid 33 Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx pRTRA7/3 35 Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 gen CrPrx 35 lu Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx pBI121 36 an n va Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác hai trình tự gen CrPrx LN809932 46 p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu – vĐHTN ac th si DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine vincristine 12 Hình 1.3: Cơng thức hóa học vinblastine 13 Hình 1.4: Cơng thức hóa học vincristine 13 Hình 2.1: Vector tách dòng pBT 23 Hình 2.2: Vector pRTRA7/3 23 Hình 2.3: Vector pBI121 23 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm phân lập thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx 26 lu an Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn cDNA CrPrx 38 n va Hình 3.2: Đĩa ni cấy dịng tế bào khả biến E coli DH5 chứa vector tái tổ hợp tn to mang đoạn gen CrPrx 40 gh Hình 3.3: Kế t quả điê ̣n di sản hẩ p m colony- PCR từ khuẩ n lạc 41 p ie Hình 3.4: Kết điện sản phẩm DNA tinh sau cắt plasmid w NcoI/NotI 43 oa nl Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid gen CrPrx với trình tự gen mang mã số d LN809932 45 an lu Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx 47 nf va Hình 3.7: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vịng NcoI/NotI 49 lm ul Hình 3.8: Kết PCR dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx 50 z at nh oi Hình 3.9: Kết cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx 52 z Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 53 @ gm Hình 3.11: Kết điện di colony-PCR vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx 54 m co l Hình 3.12: Kết điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen 55 an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu – viĐHTN ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nước ta nước nhiệt đới với điều kiện khí hậu thuận lợi, nguồn tài ngun thiên nhiên phong phú đa dạng Cùng với y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta biết sử dụng loài cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh có hiệu Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng lu Sự thay đổi khí hậu tồn cầu dẫn tới khắc nghiệt thời tiết, môi an trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt người thay đổi, thực phẩm va n khơng an tồn… Những yếu tố tác động đến sức khỏe người, làm gh tn to gia tăng nguy mắc bệnh, có nguy tế bào bị biến đổi Đây p ie nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày tăng Vì thế, nhiệm vụ hàng đầu nhà khoa học nghiên cứu, d người bệnh oa nl w cải tiến biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho lu an Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) nf va có khả sản xuất indol alkaloid có dược tính quan trọng chế tạo lm ul loại thuốc chống ung thư, đặc biệt ung thư máu Trong indol alkaloid z at nh oi có mặt dừa cạn, hai loại alkaloid vinblastine, vincristine sử dụng nhiều Nhưng chất lại có hàm lượng nhỏ dừa z cạn, khoảng nửa khô chiết 1g vinblastine cho sản xuất dược @ gm phẩm (Noble, 1990) [21] Các chất không thể tổng hợp đường l hóa học có cấu trúc phức tạp Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN an Lu cứu quan tâm nhiều nhà khoa học giới m co vincristine dừa cạn theo hướng công nghệ gen hướng nghiên ac th si 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx Cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc-DKEL cắt enzyme giới hạn từ vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx, sau gắn vào pBI121 cắt mở vòng chuyển vào E coli DH5α Các vector tái tổ hợp tách plasmid kiểm tra cách sử dụng enzyme giới hạn HindIII Gen CrPrx phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím đưa vào thiết kế vector gồm trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) hai vùng chức I II lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu lm ul Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx z at nh oi Vector pRTRA7/3 sử dụng nghiên cứu chúng tơi có chứa đoạn trình tự quan tâm CaMV35S, Cmyc KDEL CaMV35S z promoter mạnh giúp cho gen biểu mạnh Cmyc KDEL @ l gm thành phần cần thiết để gen chuyển vào Gen CrPrx ghép nối vào vector pRTRA7/3 cắt mở vịng chứa đoạn trình tự cần quan co m tâm Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx phục vụ nghiên cứu thiết kế n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –47 ĐHTN an Lu vector mang cấu trúc CrPrx ac th si 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) Vector trung gian pRTRA7/3 dùng để cung cấp thành phần cần thiết cho việc biểu kiểm tra gen đích CrPrx tế bào thực vật như: (1) CaMV35S promoter mạnh phân lập từ virus khảm súp lơ, có thể khởi động phiên mã gen chuyển tất tế bào mơ thể thực vật; (2) có polyA giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA tế bào chất; (3) đặc biệt pRTRA7/3 cung cấp trình tự xác định chuỗi peptide Cmyc kháng nguyên để có thể dễ dàng xác định có mặt sản phẩm protein đích dùng lu kháng thể tương ứng Western blot ELISA an n va Dựa vào kích thước gen CrPrx trình bày phần 2.1.1 lựa chọn gh tn to gel tinh Gen CrPrx cắt enzyme giới hạn NcoI/NotI trình p ie bày phần 3.1.2.3 (hình 3.4) w Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3 oa nl Vector pRTRA7/3 vector trung gian, vector vừa có hai điểm d cắt enzyme giới hạn NcoI NotI vừa có trình tự nhận biết HindIII an lu nf va Nhưng gen CrPrx trình bày phần 3.1.2.3 cắt cặp enzyme giới hạn lm ul NcoI/NotI Mục đích bước đưa gen CrPrx vào vector trung z at nh oi gian pRTRA7/3 Vì vậy, pRTRA7/3 bắt buộc phải sử dụng enzyme NcoI/NotI để tạo đầu nối pRTRA7/3 CrPrx z Theo tính tốn lý thuyết, sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI NotI @ l gm cắt vector pRTRA7/3 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,9 kb (là đoạn 2SP antiABA không sử dụng) 3,3 kb (kích thước co m vector pRTRA7/3) Trong đó, phân đoạn 3,3 kb đoạn pRTRA7/3 mở an Lu vịng mang trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –48 ĐHTN ac th si Kết điện di hình 3.7A cho thấy, sau cắt mở vịng pRTRA7/3 enzyme NcoI/NotI thu hai phân đoạn 0,9 kb 3,3 kb lý thuyết Phân đoạn có kích thước 3,3 kb thơi gel để thu nhận cấu trúc mở vòng pRTRA7/3 Sản phẩm mang gel thu nhận băng có kích thước ước tính khoảng 3,3 kb (hình 3.7B), sản phẩm dùng để phục vụ phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 3.7: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vòng an lu NcoI/NotI nf va A Sản phẩm điện di plasmid cắt NcoI/NotI lm ul (1) Plasmid pRTRA7/3 không xử lý enzyme (đối chứng) z at nh oi (2) Plasmid pRTRA7/3 sau xử lý enzyme NcoI/NotI B Sản phẩm tinh vector pRTRA7/3 sau gel z gm @ M: Thang DNA 1kb chuẩn; 1: Vector pRTRA7/3 tinh Gắn gen CrPrx vào vector mở vòng pRTRA7/3 l m co Gen CrPrx mang đầu dính cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI gắn an Lu vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ phản ứng ghép nối với xúc tác T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx Vector biến nạp vào n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –49 ĐHTN ac th si tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm biến nạp cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin Kiểm tra dòng khuẩn lạc phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI lu an n va p ie gh tn to w d oa nl Hình 3.8: Kết PCR dịng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp M: Thang DNA 1kb chuẩn nf va an lu pRTRA7/3-CrPrx lm ul - 5: Các dòng khuẩn lạc pRTRA7/3-CrPrx Kết điện di kiểm tra cho thấy, dòng khuẩn lạc có dịng (2, z at nh oi 3, 4, 5) xuất băng DNA đặc hiệu khoảng kb tương ứng với kích thước gen CrPrx Như vậy, dòng khuẩn lạc chọn lọc mang plasmid tái z gm @ tổ hợp mang gen CrPrx Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx sử dụng l để thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx phục vụ phát triển vector chuyển gen m co thực vật an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –50 ĐHTN ac th si 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 Sau tạo cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu kiểm tra hoạt động gen, việc gắn cấu trúc vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp vào hệ gen thực vật Vector pBI121 lựa chọn mang đặc điểm có điểm cắt enzyme giới hạn phù hợp, bờ trái (LB) bờ phải (RB) có gen kháng kanamycin hoạt động tế bào thực vật nhờ Nos promoter Nos terminator, có điểm khởi động tái oriV vi khuẩn, có gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động vi khuẩn, có operon TrfA mang gen vir lu an đảm nhiệm trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật số va n thành phần khác to gh tn Việc ghép nối cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen pBI121 p ie thực phản ứng thu nhận cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc- w KDEL-polyA enzyme giới hạn từ pRTRA7/3-CrPrx, cắt mở vòng vector oa nl pBI121 Sau đó, ghép nối cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA d vào vector pBI121 mở vòng tạo vector chuyển gen thực vật lu pBI121 nf va an Thu nhận cấu trúc vector tái tổ hợp chứa gen CrPrx cắt mở vòng lm ul Cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx pBI121 enzym cắt giới hạn z at nh oi HindIII Gen CrPrx thành phần CaMV35S, Cmyc, KDEL polyA có z kích thước 1844 bp, hai đầu điểm cắt enzyme giới hạn HindIII Xử @ l gm lý vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc co mang gen CrPrx dài 1844 kb phần lại vector pRTRA7/3 dài 2156 m bp Điện di sản phẩm cắt agarose (hình 3.10) nhận băng DNA an Lu băng có kích thước khoảng 1,8 2,2 kb tương ứng với kích thước tính n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –51 ĐHTN ac th si toán Băng DNA có kích thước khoảng kb tương ứng với kích thước pRTRA7/3-CrPrx Băng có kích thước khoảng 1,8 kb gel tinh để thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx cho bước phát triển vector lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu Hình 3.9: Kết cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx HindIII lm ul thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx z at nh oi M: thang chuẩn DNA kb 1: sản phẩm cắt HindIII z 2: plasmid không cắt HindIII gm @ Cắt mở vòng vector pBI121 l Vùng MCS vector pBI121 có điểm cắt enzyme HindIII m co cắt mở vòng sản phẩm cắt tối ưu cho băng vạch khoảng an Lu 12 kb Điện di sản phẩm tinh sau cắt mở vòng plasmid pBI121 gel agarose 1% thu băng DNA có kích thước khoảng 12 kb (Hình 3.10) phù n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –52 ĐHTN ac th si hợp với kích thước tính tốn Trên gel điện di xuất băng nhất, khơng có sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy DNA Sản phẩm DNA tinh đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen lu an n va tn to A Kết điện di sản phẩm plasmid cắt HindIII p ie gh Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 (2) Plasmid pBI121 sau xử lý enzyme hindIII oa nl w (1) Plasmid pBI121 không xử lý enzyme (đối chứng) d B Kết điện di sản phẩm tinh vector pBI121 sau gel nf va an lu M: Thang DNA 1kb chuẩn 1: Vector pBI121 tinh lm ul Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx z at nh oi Ghép nối cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) vào pBI121 cách sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào z plasmid pBI121 mở vòng Sản phẩm tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi @ gm khuẩn khả biến E.coliDH5α sốc nhiệt, sau cấy trải môi l trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, nuôi 37oC 16 m co Trên môi trường nuôi cấy sau 16 37oC xuất nhiều khuẩn lạc, an Lu dòng khuẩn lạc có thể mang hai plasmid tái tổ hợp pBI121-CrPrx pBI121 tự đóng vịng Thực colony-PCR số n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –53 ĐHTN ac th si khuẩn lạc với cặp mồi Prx-NcoI/Prx-NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx lu an Hình 3.11: Kết điện di colony-PCR vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx va n M: Thang DNA 1kb chuẩn tn to 1-4: Các dòng khuẩn lạc pBI121-CrPrx ie gh (+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm p Kết colony-PCR (Hình 3.11) cho thấy, dịng khuẩn lạc âm tính nl w (khơng xuất băng đặc hiệu) có thể chứa plasmid pBI121 tự đóng vịng, d oa kháng kanamycin khơng mang cấu trúc gen CrPrx Các dòng an lu khuẩn lạc 1, 2, 3, dương tính với phản ứng colony-PCR (xuất băng đặc nf va hiệu khoảng kb) có thể chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx lm ul Những dịng khuẩn lạc dương tính nuôi LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (kanamycin) để tách plsamid nhân dòng vector tái tổ hợp cho z at nh oi trình biến nạp vào A.tumefaciens phục vụ chuyển gen 3.4 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx z Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx tách từ sinh khối vi khuẩn @ gm E.coli DH5α biến nạp vào A.tumefaciens EHA105 kỹ thuật xung co l điện Sản phẩm biến nạp sau nuôi phục hồi LB lỏng cấy trải m môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l an Lu rifamycin 50mg/l nuôi 28oC 48 Sau đó, chọn dịng khuẩn lạc n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –54 ĐHTN ac th si riêng rẽ mọc mặt thạch, tiến hành colony-PCR cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI Kết thu hình 3.12 lu an Hình 3.12: Kết điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen va n M: Thang DNA 1kb chuẩn to tn 1-7: dòng khuẩn lạc A.tumefaciens EHA105 chứa vector tái tổ hợp ie gh mang đoạn gen pBI121-CrPrx p (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm nl w Sản phẩm điện di cho thấy, dòng khuẩn dương tính, có d oa kích thước kb với giếng đối chứng dương Giếng đối chứng âm khơng có nf va gen CrPrx an lu băng xuất Chứng tỏ dòng A.tumefaciens mang vector chủn lm ul Các dịng dương tính ni lỏng LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin rifamycin để thu khối lượng lớn phục vụ chuyển gen z at nh oi z m co l gm @ an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –55 ĐHTN ac th si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Phân lập đoạn gen CrPrx có chứa enzyme giới hạn NcoI/NotI Gen CrPrx phân lập từ cDNA vùng mã hóa gồm 993 nucleotide Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx (35SCrPrx-Cmyc) ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen CrPrx vào thuốc dừa cạn lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –56 ĐHTN ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn, 2011 “Nghiên cứu tách chiết Alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định”, Tạp chí KH&CN, Đại học Đà Nẵng, (43), tr 85 – 92 Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dược liệu, Tập 2, Nhà xuất Đại học Dược Hà Nội, tr 5-24 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, “Ảnh hường chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào lu dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển Khoa học & Cơng nghệ, an ĐHQG HCM, tập 9, số 6, tr 59 – 66 n va Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y tn to học Hà Nội gh Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, p ie Nhà xuất Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội w oa nl Tài liệu tiếng Anh d Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden an lu E., Verpoorte R (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on lm ul 18:1955–1964 nf va larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua”, J Chem Ecol, Contin A., van der Heijden R., Lefeber A.W.M., Verpoorte R (1998), “The glucoside z at nh oi iridoid secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture”, FEBS z Lett, 434: 413–416 @ gm Costa MM, Hilliou F, Duarte P, Pereira LG, Almeida I, Leech M, co l Memelink J, Barceló AR, Sottomayor M (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the m 146(2): 403-17 n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –57 ĐHTN an Lu metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, ac th si Fattorusso, E., Taglialatela, O., (2008) Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology Wiley-VCH, Weinheim, Germany 10 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., GilIzquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barceló A.R., Sottomayor M (2011), “Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair”, J Exp Bot, 62(8): 2841-2854 11 Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973), “Isolation of lu saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng”, Chem an Pharm Bull Tokyo, 21(1): 98-101 va n 12 Guggisberg, A., Hesse, M., Alkaloids The University of Zurich Morales, M Teresa Pinol (1998), “Relation Between the Amount of rolC ie gh tn to 13 Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen p Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus nl w Transformed Root Cultures”, Journal of Plant Physiology, 153: 712 d oa 14 Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin an lu Yu (2013), “Enhancement of vindoline and vinblastine production in nf va suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid lm ul elicitation”, MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432 z at nh oi 15 Junaid Aslam, Abdul Mujib, Seikh A Nasim, Maheshwar Prasad Sharma (2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic z embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L (G) Don”, Scientia gm @ Horticulturae, 119(3): 325-329 co l 16 Kumar S, Dutta A, Sinha AK, Sen J (2007), “Cloning, characterization and m localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus”, n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –58 ĐHTN an Lu FEBS J., 274(5): 1290-1303 ac th si 17 Kumar S, Jaggi M, Taneja J, Sinha AK, (2011), “Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus”, Plant Physiol Biochem, 49 (4): 404-412 18 Marfori E.C and Alejar (1993), “Alkaloid yeild variation in callus culture derived from different plant part of the white rosy – purple periwinke, Catharanthus roseus (L.) G Don”, Philippine Journal of Biotechnology, 4(1): 1-8 19 Maria Manuela R Costa, Frederique Hilliou, Patricia Duarte, Luís Gustavo Pereira, Iolanda Almeida, Mark Leech, Johan Memelink , Alfonso Ros lu Barceló, and Mariana Sottomayor (2008), “Molecular cloning and an characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the va n metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, tn to 146(2): 403–417 ie gh 20 Miyasaka H., Nasu M., and Yoneda K (1999), “Salvia miltiorrhiza: Invitro p production of eryptotanshinone and feruginol In: Biotechnology in nl w agricullture and forestry.7, Medicinal and Aromatic Plants II ed By Bajaj d oa YPS Springer-Verlag Berlin”, Heidelberg, 417-430 an lu 21 Noble RL (1990), “The discovery of the vinca alkaloids - chemotherapeutic nf va agents against cancer” Biochem Cell Biol, 68(12): 1344-51 Chandigarh z at nh oi lm ul 22 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B.Pharm Punjab University 23 Pan Q, Chen Y, Wang Q, Yuan F, Xing S, Tian Y, Zhao J, Sun X, Tang K (2010), “Effect of plant growth regulators on the biosynthesis of vinblastine, z vindoline and catharanthine in Catharanthus roseus”, Plant Growth Regul, gm @ 60(2):133–141 co l 24 Pan Q, Saiman MZ, Mustafa NR, Verpoorte R, Tang K (2016), “A simple m and rapid HPLC-DAD method for simultaneously monitoring the an Lu accumulation of alkaloids and precursors in different parts and different n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –59 ĐHTN ac th si developmental stages of Catharanthus roseus plants”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1014: 10-6 25 Pearce H L., Miller M A (2005), “The evolution of cancer research and drug discovery at Lilly Research Laboratories”, Adv Enzyme Regul, 45: 229–255 26 Pietrosiuk A., Furmanowa M., Zobel A., Kuras M., Michalak A (1999), “Cytological changes in meristematic cells of Allium cepa L root tips treated with extracts from callus of Catharanthus roseus (L.) G Don”, Acta Soc Bot Pol, 68: 109 – 118 lu 27 R H F Manske (1979), The alkaloid, Chemistry and physiology an 28 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A va n Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press gh tn to 29 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ie p 30 Sottomayor M., Lopes Cardoso I., Pereira L G., Ros Barcelo A (2004), nl w “Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal d oa plant Catharanthus roseus (L.) G Don”, Phytochem Rev, 3: 159–171 an lu 31 Tarek Kapiel (2010) “Elicitation of alkaloids by biotic and abiotic stress nf va factors in Catharanthus roseus”, Egypt J Bot, Volume 27-29, pp 207-224 lm ul 32 Tsay H S., Chang W D., Chen C C., and Chang Y S (1994), “The production of imperatorin from Angelica dahurica var formosana by cell z at nh oi suspesion culture”, J Agric Assoc China, 168: 32-48 33 Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R z (2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”, l gm @ Curr Med Chem, 11: 607–628 34 Verpoorte R., Van der Heijden R., Moreno P R H (1997), Biosynthesis of co m terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids, G.A n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –60 ĐHTN an Lu Cordell (Editor) Academic Press, 221–299 ac th si 35 Wang Q, Xing S, Pan Q, Yuan F, Zhao J, Tian Y, Chen Y, Wang G, Tang K (2012), “Development of efficient Catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants”, BMC Biotechnology, 10: 12 – 34 36 Zhao J, Zhu W, Hu Q (2001), “Enhanced catharanthine production in catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol, 28(7-8):673-681 Một số trang web 37 http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n http://www.ltc.tnu.edu.vn va Số hóa Trung tâm Học liệu –61 ĐHTN ac th si