Tên đề tàiXây dựng quy trình chiết xuất nhóm hợp chất saponin từ dược liệu Tam thấtpanax pseudoginseng bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn.Panax pseudoginseng là một trong những ngu
NỘI DUNG
Cơ sở xây dựng đề án
2.1.1 Tổng quan về nhóm Saponin
Saponin hay saponosid là một nhóm glycosid có phần genin có cấu trúc triterpen hay steroid gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy trong động vật thân mềm ở biển như Hải sâm, Sao biển.
Theo truyền thông, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này là:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
- Độc vổi cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên…
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxy steroid khác.
Tuy nhiên, không phải tất cả các saponin đều thể hiện đầy đủ các tính chất trên.Ngày nay, saponin thường được định nghĩa trên cơ sở cấu trúc hóa học đó là các triterpen glycosid hay các 27-C steroid glycosid 14
2.1.1.2 Cấu trúc hóa học và phân loại saponin
Trước đây, dựa vào khả năng tạo tủa trong các môi trường khác nhau, người ta chia saponin thành 2 loại là saponin trung tính và saponin acid Theo cách chia này thì:
Saponin trung tính: cho tủa với dung dịch Ba (OH)2 và chì acetat kiềm.
Saponin acid: tan trong dung dịch kiềm, cho tủa với dung dịch chì acetat, ammonium sulfat.
Ngoài ra người ta cũng có thể chia saponin thành 3 loại:
- Saponin acid: trong phân tử có nhóm –COOH
- Saponin kiềm: trong phân tử có N, không có nhóm –COOH
Hiện nay, dựa vào cấu trúc hóa học, người ta chia saponin thành 2 loại chính: saponin triterpenoid và saponin steroid, được trình bày trong sơ đồ sau 15 :
Cấu trúc của Saponin triterpenoid rất đa dạng, dựa vào cấu trúc của genin người ta chia thành 4 nhóm chính 16,17 :
Dưới đây là một số khung cơ bản
Trừ hợp chất Criptogenin (có cấu trúc 4 vòng) tất cả các saponin steroid đều có đặc điểm chung cấu trúc là hệ thống vòng spiroxetal (vòng E và F) nối nhau qua C22. Các hợp chất này chỉ khác nhau 3 điểm:
- Ở C5 vòng A/B: Hydro có thể có cấu hình α và β hoặc dây nối đôi giữa C5- C6
- Tuỳ theo cấu trúc của R1 và R2 (thường là H hoặc CH3) mà chúng có thể là đồng phân iso (cấu hình C25 là R) hoặc đồng phân neo (C25 có cấu hình S).
- Về số nhóm thế: tất cả các saponin streroid đều có nhóm OH ở C3; một số ít còn có OH ở C2 hay C6 (hoặc cả hai) Vài sapogenin còn có thêm C=O ở C12.
Sự phân bố saponin trong tự nhiên
Saponin phân bố rất rộng trong thực vật (500 loài/90 họ) Saponin triterpenoid thường gặp ở cây thuộc lớp hai lá mầm và saponin steroid thường gặp ở cây thuộc lớp một lá mầm.
– Các họ cây thường chứa saponin triterpenoid:
+ Họ Nhân sâm (Araliaceae) + Họ Cà phê (Rubiaceae) + Họ Đậu (Fabaceae) + Họ Viễn chí (Polygalaceae) + Họ Rau dền (Amaranthaceae) + Họ Bồ hòn (Sapindaceae) + Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) + Họ Cải (Brassicaceae) – Các họ cây thường chứa saponin steroid:
+ Họ Hành tỏi (Liliaceae) + Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) + Họ Cà (Solanaceae)
+ Họ Kim cang (Smilacaceae) + Họ Củ mài (Dioscoreacea) + Họ Dứa dại (Agavaceae) Bên cạnh đó Saponin còn có ở một số động vật như các loài:
Hải sâm (Actinopyga agassizi, Holothuria vagabunda, H polii, H scabra, H. leucospilota, H librica, Stichopus japonicus, S chloronotus…).
Sao biển, Hải quỳ (Acanthaster planci, Asterina pectinifera, A forbesi, Patiria miniata, Pisaster ochraceus, P brevispinus, Pycnopodia helianthoides…).
2.1.1.3 Công dụng chung của nhóm saponin
- Tác dụng bồi bổ, tăng cường sinh lực (nhân sâm)
- Tác dụng long đờm, dịu ho (cam thảo, cam thảo đất…)
- Giảm đau khớp xương (ngưu tất, cỏ xước)
- Hạ cholesterol trong máu (ngưu tất, cỏ xước)
- Riêng nhóm saponin steroid là nguồn nguyên liệu quan trọng bán tổng hợp các thuốc cocticoid và thuốc hạn chế sinh đẻ.
2.1.2 Giới thiệu về cây Tam thất
2.1.2.1 Phân loại khoa học của cây Tam thất
Tên Việt Nam: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất 18,19 Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F H Chen
Ngành (Division): Thực vật hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp (Class): Thực vật hai mầm (Magnoliopsida)
Bộ (Order): Hoa tán (Apiales)
Họ (Family): Nhân Sâm (Araliaceae) Chi (Genus): Sâm (Panax) Loài (Species): Tam thất (pseudoginseng) Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var notoginseng Burkill; Panax pseudoginseng var notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng hoặc Panax pseudoginseng Wall
Hình 2.1 Cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F H Chen
2.1.2.2 Phân bố của cây Tam thất
Tam thất có nguồn gốc ở phía nam Trung Quốc, được trồng từ lâu đời và không còn được tìm thấy trong trạng thái mọc trong tự nhiên Cây được nuôi trồng nhiều nhất ở tỉnh Vân Nam, sau đó là Quảng Tây và ở một số quốc gia khác như Đài Loan,
Nhật Bản, Triều Tiên 19 Sự nhạy cảm với ánh sáng của cây hạn chế sự phân bố của Tam thất tại Trung Quốc 20 Ở Việt Nam, Tam thất là một loại cây được nhập trồng từ Trung Quốc 19 được trồng với số lượng ít tại một số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng tại các vùng núi cao 1200 – 1500 m 18
2.1.2.3 Đặc điểm thực vật của Tam thất
Tam thất là cây thân thảo, sống nhiều năm Thân Tam thất mọc thẳng, không phân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, 3 – 4 lá mọc vòng, cuống lá dài 3 – 6 cm, mỗi cuống lá gồm 5 – 7 lá chét hình mác, cuống lá chét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thuôn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lông cứng ở gân, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt 19
Cụm hoa hoàn chỉnh có đường kính 5 – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ 5 – 45 mm Cuống nhỏ ở một đầu và đầu còn lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–230 hoa Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính cùng tồn tại Hoa màu lục vàng nhạt, đài 5 răng ngắn, màu xanh, tràng 5 cánh rộng ở phía dưới, nhị 5, bầu 2 ô Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ, trong có hai hạt hình cầu, màu trắng 19
Rễ chính có hình nón hoặc trụ, với chiều dài từ 1 – 6 cm, có màu vàng hoặc nâu với các vết nhăn và nếp rễ Cây thường được thu hoạch vào mùa thu, trong thời gian trước khi nở hoa và có thể được nghiền thành bột sử dụng cho đường uống hoặc kết hợp với các thảo dược khác 19
Theo các nghiên cứu, hơn 200 thành phần hoá học đã được phân lập từ Tam thất Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) 19 chiếm hàm lượng lớn và được coi là thành phần chính, ngoài ra trong tam thất còn chứa những thành phần khác như flavonoid,các peptit vòng, đường saccarid và các nguyên tố vô cơ Những thành phần phân bố trong các bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, hoa và lá với tỉ lệ khác nhau.Saponin được coi là thành phần chính trong Panax pseudoginseng (PPG) Trong thực tế, đã có hơn 100 loại saponin được phân lập và xác định, thuộc ba nhóm ginsenosid, notoginsenosid và gypenosid Hầu hết các saponin trong cây Tam thất là các triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon là 20(S)-protopanaxadiol (nhóm Rb) hoặc 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg) PPG có thành phần không chứa bất cứ saponin nào có nhóm axit oleanolic (nhóm Ro), đây là một khác biệt lớn so với cây Panax ginseng C A Meyer và Panax quinquefolius L Mỗi bộ phận khác nhau của Tam thất sẽ chứa thành phần và tỉ lệ saponin khác nhau tuỳ theo từng bộ phận cụ thể Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb1 có nhiều trong tất cả các bộ phận của cây, trong khi Rg1 giàu trong thân và rễ Rg3 - một chất được báo cáo về khả năng bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn trong nụ hoa Tam thất Thông thường, năm loại saponin chính là notoginsenosid R1 (7 - 10%), ginsenosid Rb1 (30 - 36%), Rg1
Tam thất có chứa hàm lượng saponin cao, trong đó ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg1 và notoginsenosid R1 chiếm tới 90% Các nghiên cứu khoa học tập trung vào việc xác định các sản phẩm thủy phân và biến đổi sinh học của saponin, mở rộng sự đa dạng phân tử của ginsenosid và tìm kiếm các hợp chất hoạt tính sinh học mới Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới cho ứng dụng của Tam thất trong điều trị, hướng đến mục tiêu tìm kiếm các chất có khả năng ứng dụng trong tương lai.
Ginsenosid Re Ngoài các loại saponin, các thành phần khác cũng được báo cáo có mặt trong
Panax pseudoginseng (PPG) Trong PPG các peptit vòng được tìm thấy có cấu trúc là các hợp chất mạch vòng hình thành dựa trên các liên kết peptit do 2 – 37 protein hoặc axit amin không phải protein tạo nên Chúng được tìm thấy trong các thực vật thuộc họ Caryophyllaceae và Rhamnaceae và được phân chia thành hai lớp, năm lớp phụ và tám loại Đã có 14 loại peptit vòng được phân lập và xác định về cấu trúc dựa trên phương pháp quang phổ, đó là các peptit vòng sáu: cyclo- (Leu-Thr), cyclo-(LeuIle), cyclo- (Leu-Val), cyclo- (Ile-Val), cyclo- (Leu-Ser), cyclo- (Leu-Tyr),cyclo- (Val-Pro), cyclo- (Ala-Pro), cyclo- (Phe-Tyr), cyclo- (Phe-Ala), cyclo- (Phe-Val), cyclo- (Leu-Ala), cyclo- (Ile-Ala) và cyclo- (Val-Ala).
Nội dung của đề án
- Kiểm tra chất lượng dược liệu đầu vào cho quá trình chiết xuất.
- Khảo sát các thông số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởng đến hàm lượng saponin trong cao chiết từ dược liệu Tam thất.
- Tối ưu hóa quy trình chiết và nâng cấp cỡ lô.
- Tiêu chuẩn hóa cao chiết Tam thất thu được.
2.2.2 Giải pháp để thực hiện đề án
2.2.2.1 Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất đầu vào
Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất theo chuyên luận Tam thất (Panax pseudoginseng) – DĐVN V, bao gồm các chỉ tiêu:
- Mất khối lượng làm khô
- Tro không tan trong acid
- Chất chiết được trong dược liệu
2.2.2.2 Khảo sát các thông số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởng đến hàm lượng saponin thu được từ dược liệu Tam thất
Các thông số quy trình điều chế được khảo sát:
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lần lượt ở các mức 35 o C, 40 o C, 45 o C,
- Khảo sát ảnh hưởng của áp suất lần lượt ở các mức 200 bar, 250 bar, 300 bar,
- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dung môi ethanol 96 % phối trộn lần lượt ở các mức 0,3 ml/phút; 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút và 1,2 ml/phút
- Khảo sát thời gian chiết lần lượt trong 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ và 8 giờ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), các hợp chất saponin notoginsenosid-R1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 đã được định lượng trong cao chiết xuất.
2.2.2.3 Nâng cấp cỡ lô chiết xuất
- Lựa chọn điều kiện chiết cho hàm lượng các saponin notoginsenosid-R1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid- Rg1 lớn nhất và khối lượng cắn nhiều nhất Từ đó đưa ra quy trình hoàn chỉnh.
- Tiến hành chiết xuất trên quy mô 200 g dược liệu Với điều kiện đã được khảo sát ở mục 2.2.2.2
- Đánh giá kết quả khảo sát: định lượng hợp chất saponin notoginsenosid-R1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid- Rg1 trong cao thu được bẳng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2.2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao chiết Tam thất Đánh giá chất lượng 3 lô cao Tam thất ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên tham khảo các yêu cầu chất lượng của cao thuốc được quy định trong DĐVN V Thực hiện kiểm tra chất lượng 3 lô cao chiết Tam thất theo các chỉ tiêu sau:
- Mất khối lượng làm khô
- Tổng hợp các chỉ tiêu chất lượng của cao chiết
Tổ chức thực hiện đề án
2.3.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Danh sách các hóa chất, dung môi được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3 Bảng các chất đối chiếu và một số hóa chất
Phân loại Tên Nguồn gốc
Chất đối chiếu Ginsenosid-Rb1 93,71% (C54H92O23)
Trung tâm khoa học công nghệ Dược Sài Gòn
Hóa chất Ethanol tuyệt đối VWR, Pháp
Nước cất Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Ethyl format Sigma-Aldrich n-butanol Merck, Đức
2.3.2 Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Danh sách các thiết bị, máy móc sử dụng trong quá trình nghiên cứu chiết xuất, kiểm nghiệm được trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4 Danh mục trang thiết bị Tên trang thiết bị, dụng cụ Hãng, nguồn gốc
Bộ rây dược liệu Anh
Cân kỹ thuật BD 202 Mettler, Thụy Sỹ
Cân phân tích 4 chữ số AT – 200 Mettler Toledo, Thụy Sỹ
Cân phân tích 6 chữ số XP86 Mettler Toledo, Thụy Sỹ
Bể siêu âm gia nhiệt Elma Sonic, Đức
Bếp cách thủy Memmert WMB 40, Đức
Bể điều nhiệt Thermostate Jeio Tech, Hàn
Quốc Kính hiển vi quang học Eclipse 80i
Tủ sấy đối lưu tự nhiên
Nikon Eclipse 80i, Nhật Bản Nabertherm, Đức
JSR, Hàn Quốc Máy chiết xuất siêu tới hạn Model: 7071
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA
Applied separations, MỹWater, Mỹ
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao UFLC-UFLC-
Các thiết bị phân tích được đặt tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh (200 Cô Bắc, phường Cô Giang, quận 1, TP Hồ Chí Minh) đã được hiệu chuẩn theo quy định Các dụng cụ đều đạt tiêu chuẩn phòng kiểm nghiệm Danh sách các dụng cụ được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5 Danh mục dụng cụ
- Chén cân, - Bình triển khai sắc ký
- Pipet chính xác - Cốc có mỏ (becher)
- Pipet khác vạch - Bình nón (erlen)
- Ống đong - Bình định mức
- Bản mỏng GF254 - Các dụng cụ khác
2.3.3 Kiểm nghiệm dược liệu Tam thất làm nguyên liệu cho chiết xuất
Kiểm tra chất lượng dược liệu Tam thất theo chuyên luận Tam thất (Panax pseudoginseng) – DĐVN V, bao gồm các chỉ tiêu:
Bột khô màu vàng nhạt, mùi thơm.
Yêu cầu: Hình thái của dược liệu phải đúng với mô tả theo DĐVN V.
Dược liệu được xay thành bột mịn bằng cối xay, rây qua rây 355µm rồi quan sát dưới kính hiển vi tại các vật kính 10x và 40x Những đặc điểm quan sát được được ghi chép và chụp ảnh lại.
Yêu cầu: Bột dược liệu phải có cảm quan và có các cấu tử như mô tả trong DĐVN V
Mất khối lượng do làm khô
Thực hiện theo Phụ lục 9.6 Xác định mất khối lượng do làm khô – DĐVN V.Tiến hành trong bình hút ẩm, thực hiên cân chính xác khoảng 1,0 g bột Tam thất cho vào chén sứ Đặt chén sứ vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 o C trong 5 giờ Sau đó mỗi giờ đem ra cân một lần Đọc kết quả 3 lần cân liên tiếp mà số cân lệch nhau không quá 5 mg thì ghi nhận kết quả và tính toán lượng khối lượng mất do sấy Thực hiện lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Ghi chú: Mỗi lần lấy chén sứ ra khỏi tủ sấy thì đặt vào bình hút ẩm ổn định trong 5 phút rồi cân Theo quy định của DĐVN V thì số đo giữa 2 lần liên tiếp không lệch quá 5 mg.
Phương pháp tính toán: Hàm lượng ẩm được tính theo công thức
𝑃 × 100 Trong đó H: độ ẩm (%) a: khối lượng cốc để mẫu sau sấy b: khối lượng cốc để mẫu trước sấy P: khối lượng bột
Yêu cầu: độ ẩm không quá 14,0%.
Thực hiện theo Phương pháp 1 Phụ lục 9.8 Xác định tro toàn phần – DĐVN V. Tiến hành nung chén sứ đến khối lượng không đổi Cân vào chén sứ 1,0 g bột Tam thất. Đốt trên bếp điện đến khi cao không còn khói, sấy ở nhiệt độ 105 o C trong 1 giờ. Tiếp tục cho mẫu vào lò nung ở nhiệt độ 450 o C trong 8 giờ Để nguội trong bình hút ẩm và tiến hành cân khối lượng. Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung trong khoảng 1 giờ Lặp lại các bước cho đến khi độ chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân không quá 5 mg Tiến hành thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Phương pháp tính toán: Tro toàn phần được tính theo công thức
𝑃 × 100 Trong đó: X: tro toàn phần (%) a: khối lượng bì b: khối lượng troP: khối lượng bột
Yêu cầu: hàm lượng tro toàn phần không quá 6,0%.
Tro không tan trong acid
Thực hiện theo Phụ lục 9.7 Xác định tro không tan trong acid, phương pháp 1 – DĐVN V Lượng mẫu thử: 2,0g.
Tiến hành cho 25 ml dung dịch acid hydrochloric 2M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rữa bằng nước nóng sau đó nung ở 500 o C đến khối lượng không đổi Tính tỉ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong không khí Thực hiện lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình.
Phương pháp tính toán: Tro không tan trong acid được tính theo công thức
𝑃 × 100 Trong đó X: tro không tan trong acid (%) a: khối lượng bì b: khối lượng tro không tan trong acid P: khối lượng bột
Yêu cầu: hàm lượng tro không tan trong acid không quá 3%.
Chất chiết được trong dược liệu
Thực hiện theo Phụ lục 12.10 Xác định các chất chiết được trong dược liệu, sử dụng methanol (TT) làm dung môi Tiến hành theo phương pháp chiết nóng với lượng mẫu thử là 2,0 g bột dược liệu nửa thô.
Tiến hành áp dụng phương pháp chiết nóng Cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml Thêm chính xác 50 ml methanol (TT), đậy kín, cân xác định khối lượng để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu 1 giờ và để nguội, đậy kín và cân xác định lại khối lượng, dung methanol để bổ sung khối lượng bị giảm. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp.
Tiếp tục lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc đã cân bì trước, cô cánh thủy đến cắn khô, và sấy căn ở 105 o C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút,cân xác định khối lượng cắn Tính phân trăm lượng chất chiết được bằng methanol theo dược liệu khô Thực hiện lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình.
Phương pháp tính toán: hiệu suất chất chiết được được tính theo công thức:
𝑃 (1−𝑎)× 100 Trong đó X: hiệu suất chất chiết được (%) a: độ ẩm bột dược liệu b: khối lượng cắn P: khối lượng bột
Yêu cầu: chất chiết được không ít hơn 16% tính theo dược liệu khô kiệt.
A Định tính bằng phản ứng hóa học
Cho một lượng bột nhỏ vào khay sứ, nhỏ 1 - 2 giọt axit axetic băng (TT) và 1 - 2 giọt axit sulfuric đậm đặc (TT) sẽ thấy xuất hiện màu đỏ, để yên từ từ sẽ chuyển màu sẫm dần.
Cân 1,0 g bột dược liệu, thêm 15 ml ethanol 70 % (TT) đun trên bếp cách thủy
10 phút, lọc Lấy khoảng 1 ml dịch lọc pha loãng với nước cất thành 10 ml Lắc mạnh
B Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4 – DĐVN V).
Bản mỏng: pha thường silica gel.
Dung môi khai triển: lắc đều hỗn hợp cloroform – ethyl acetat – methanol – nước (15:40:22:10), gạn lấy lớp dưới.
Dung dịch thử: Cân 1,0 g bột dược liệu, trộn đều với 10 ml nước, thêm 10 ml n-butanol đã bão hòa nước (TT) vào hồn hợp trên, lắc trong 10 phút, để yên trong 2 giờ Lọc lấy địch chiết butanol cho vào bình gạn Thêm vào bình gạn 30 ml nước đã bão hòa butanol (TT), lắc kỹ, để yên cho tách lớp (ly tâm nếu cần) Gạn lấy lớp butanol, cô trên cách thủy đến cạn Hòa tan cắn trong 1 ml methanol (TT)
Dung dịch dược liệu đối chiếu: Cân 1,0 g bột Tam thất (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần dung dịch thử.
Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và notoginsenosid R1 chuẩn trong methanol (TT) để được dung địch chuẩn hỗn hợp có nồng độ mỗi chuẩn khoảng 0,5 mg/ml.
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μl mỗi dung dịch trên Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 12 cm, lấy bản mỏng ra, đổ khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy ở 105 o C cho đến khi xuất hiện rõ vết Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường hoặc dưới đèn tử ngoại ờ bước sóng
Trên sác ký đồ của dung dịch thừ phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đổi chiếu và có các vết cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Phụ lục 5.3 – DĐVN V).
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,6 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào bình nón có nút mài Thêm chính xác 50 ml methanol (TT), đậy nút, cân Tiến hành đun hồi lưu trên cách thủy ở 80 o C trong 2 giờ, để nguội, cân lại và bổ sung methanol (TT) để được khối lượng ban đầu Trộn đều và lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Kết quả của đề án
2.4.1 Kết quả kiểm nghiệm dược liệu Tam thất làm nguyên liệu cho quá trình chiết xuất
Nhận xét cảm quan: kết quả như hình 2.10 Rễ củ có hình dạng hình trụ hoặc hình chùy, cứng; dài 2 - 6 cm, đường kính 1,2 - 3 cm Mặt ngoài màu vàng xám nhạt. Trên mặt có những vết nhăn dọc rất nhỏ Trên đầu có những bướu nhỏ là vết của rễ con, phần dưới có khi phân nhánh Trên đỉnh có vết tích của thân cây Thể chất cứng rắn, khó bẻ, khó cắt Mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt Khi được tán vỡ, phần gỗ và phần vỏ dễ tách rời ra.
Hình 2.10 Hình ảnh về rễ củ Tam thất
Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu xám nhạt, có những chấm nhỏ màu nâu (ống tiết), phần gỗ ở trong màu xám nhạt, mạch gỗ xếp hình tia tỏa tròn.
Hình 2.11 Hình ảnh về mặt cắt ngang của rễ củ Tam thất
Kết luận: Hình thái của mẫu thử đúng với mô tả theo DĐVN V.
Tam thất được xay mịn, rõy qua rõy 355 àm, thu lấy phần bột dưới rõy Bột dược liệu có màu vàng nâu.
Bột được soi dưới kớnh hiển vi ở cỏc vật kớnh 40x (1 vạch = 2,5 àm) Kết quả quan sát được các đặc điểm vi học như hình 2.12.
Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác, vách dày
Mô mềm gồm các tế bào trong suốt, vách nhăn nheo chứa ống tiết
Hạt tinh bột hình chuông, hình tròn, hình nhiều cạnh, đôi khi có hạt kép 2-3, đường kớnh 3-13àm
Mảnh mạch Tinh thể calci oxalat Mô mềm thành mỏng chứa tinh bột
Khối nhựa màu nâu đỏ Sợi Bó sợi
Hình 2.12 Hình ảnh về đặc điểm vi học của bột Tam thất
Kết luận: Mẫu bột đúng theo mô tả của DĐVN V.
Mất khối lượng do làm khô
Tiến hành đánh giá mất khối lượng do làm khô của bột dược liệu cho thấy hàm lượng ẩm trung bình là 10,50% ( bảng 2.11).
Bảng 2.11 Kết quả đánh giá mất khối lượng do làm khô của bột Tam thất
TT Chén (g) Bột (g) Chén + bột đã sấy (g)
Mất khối lượng do làm khô (%) TB (%)
Kết luận: Kết quả mất khối lượng do làm khô 10,50% < 14,0% vì vậy bột Tam thất đạt kết quả chỉ tiêu về mất khối lượng do làm khô theo quy định DĐVN V.
Kết quả hàm lượng tro toàn phần được thể hiện trong bảng 2.12.
Bảng 2.12 Kết quả hàm lượng tro toàn phần của bột Tam thất
TT Chén (g) Bột (g) Chén + bột đã sấy (g)
Kết luận: Hàm lượng tro toàn phần 2,60% < 6,0% vì vậy bột Tam thất đạt kết quả chỉ tiêu về tro toàn phần theo quy định của DĐVN V.
Tro không tan trong acid
Kết quả hàm lượng tro không tan trong HCl được thể hiện trong bảng 2.13.
Bảng 2.13 Kết quả hàm lượng tro không tan trong acid của bột Tam thất
TT Chén (g) Bột (g) Chén + bột đã sấy (g)
Hàm lượng tro không tan trong acid (%)
Kết luận: Hàm lượng hàm lượng tro không tan trong acid là 0,11% < 3,0% theo DĐVN V.
Chất chiết được trong dược liệu
Tiến hành áp dụng phương pháp đun hồi lưu bằng methanol Kết quả được thể hiện trong bảng 2.14.
Bảng 2.14 Kết quả hàm lượng chất chiết được của bột Tam thất
TT Bột (g) Cắn (g) Hiệu suất chiết TB (%)
Kết luận: Hàm lượng cắn chiết được 19,22% lớn hơn 16,0% theo DĐVN V.
1 Định tính bằng phản ứng hóa học
Bảng 2.15 Kết quả định tính bột dược liệu bằng phương pháp tạo bọt
Phương pháp thử Kết quả
Acid acetic băng (TT) và acid sulfuric đậm đặc
- Xuất hiện màu đỏ, để yên sẽ sẫm dần lại ++
- Xuất hiện cột bọt bền sau 20 phút ++
Chú thích: (-) âm tính (+) Dương tính yếu (++) Dương tính mạnh
Nhận xét: Cả 2 thí nghiệm định tính đều cho thấy bột tam thất có chứa saponin đúng theo yêu cầu của DĐVN V.
Kết quả chi tiết được trình bày trong phụ lục 1.
Dung môi khai triển: Cloroform – Ethyl acetat – Methanol – Nước (15:40:22:10)
Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường và dưới đèn tử ngoại ở bước sóng λ 366 nm.
Rg1 Noto Rd Rb1 T CDL Rg1 Noto Rd Rb1 T CDL
Hình 2.13 Kết quả định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Rb 1 : dung dịch chất đối chiếu ginsenoside Rb 1
Rg 1 : dung dịch chất đối chiếu ginsenoside Rg 1
Noto: dung dịch chất đối chiếu notoginsenosid R 1
Rd : dung dịch chất đối chiếu ginsenosid R1
CDL: dung dịch dược liệu đối chiếu
T: dung dịch chiết Tam thất phân tích
Hình a: bản mỏng phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol, sấy ở 105 0 C đến hiện vết, quan sát tự nhiên
Hình b: bản mỏng phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol, sấy ở 105 0 C đến hiện vết, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
Nhận xét: Mẫu rễ củ Tam thất có các vết màu sắc và giá trị Rf tương ứng với vết của các chất chuẩn đối chiếu Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rd, Ginsenosid-Rb1 và Notoginsenosid-R1
Kết luận: Tam thất đạt kết quả chỉ tiêu định tính theo yêu cầu của DĐVN V.
Theo yêu cầu tiêu chuẩn của DĐVN V dược liệu phải chứa không ít hơn 0,4% notoginsenosid R1 (C47H80O18) và không ít hơn 5,0% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1(C42H72O14), ginsenosid Rb1 (C54H92O23) và notoginsenosid R1 (C47H80O18), tính theo dược liệu khô kiệt Qua đó hàm lượng notoginsenoisid R1 kiểm tra được là 1,0 % và tổng hàm lượng hoạt chất có trong Tam thất là 7,62 % (phụ lục 3) thể hiện ở bảng2.16 bên cạnh đó kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở hình 2.14.
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn
Sắc ký đồ dung dịch mẫu dược liệu Tam thất
Hình 2.14 Sắc ký đồ định lượng dược liệu Tam thất đầu vào Bảng 2.16 Kết quả quả định lượng tính trên dược liệu khô kiệt
Chỉ tiêu Diện tích Thời gian lưu
Hàm lượng trong dược liệu(%)
Kết luận: Tam thất đạt kết quả chỉ tiêu định lượng theo yêu cầu của DĐVN V.
Tổng kết các chỉ tiêu đánh giá chất lượng Tam thất đầu vào
Ngoài các chỉ tiêu mô tả, bột và định tính Tam thất cũng đạt yêu cầu về mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong dược liệu Kết quả tổng hợp được trình bày trong bảng 2.17.
Bảng 2.17 Kết quả đánh giá chất lượng Tam thất đầu vào
Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết quả
Rể củ có hình dạng hình trụ hoặc hình chùy, cứng; dài 2 – 6 cm, đường kính 1,2 – 3 cm Mặt ngoài màu vàng xám nhạt Trên mặt có những vết nhăn dọc rất nhỏ Trên đầu có những bướu nhỏ là vết của rễ con, phần dưới có khi phân nhánh Trên đỉnh có vết tích của thân cây Chất cứng rắn, khó bẻ, khó cắt Mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt. Đúng
Bột màu vàng nâu Soi bột dưới kính hiển vi thấy:
Nhiều hạt tinh bột tròn, hình chuông hay hình nhiều cạnh, đường kính 3 – 13 μm, đôi khi có hạt kép 2 đến 3 Mảnh mô mềm gồm các tế bào nhiều Đúng cạnh, hoặc tròn, thành mỏng, có chứa tinh bột. Đôi khi thấy ống tiết trong có chất tiết màu vàng nâu Đôi khi có tinh thể calci oxalate hình cầu gai.
Mất khối lượng do làm khô
Không quá 14,0 % (Phụ lục 9.6 1 g; 105 °C; 5 giờ) Đạt (10,50 %)
Tro toàn phần Không quá 6,0 % (Phụ lục 9.8) Đạt (2,60 %)
Tro không tan trong acid Không quá 3,0 % (Phụ lục 9.7) Đạt (0,11 %)
Chất chiết được trong dược liệu
Không ít hơn 16,0 % tính theo dược liệu khô kiệt.
Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10).
Dùng methanol (TT) làm dung môi. Đạt (19,22 %)
Kết luận: Tam thất đạt chất lượng để sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu bào chế cao.
2.4.2 Kết quả khảo sát các thông số quy trình chiết xuất siêu tới hạn ảnh hưởng đến hàm lượng saponin thu được từ dược liệu Tam thất
2.4.2.1 Ảnh hưởng của tốc độ dung môi ethanol phối trộn
Tiến hành khảo sát tốc độ dung môi ethanol phối trộn ở tốc độ dòng 0,3 ml/phút; 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút Kết quả phân tích tổng hàm lượng saponin (Phụ lục 4) được trình bày trong bảng 2.18 và sắc ký đồ mẫu thử được thể hiện ở hình 2.15.
Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn
Sắc ký đồ thí nghiệm 5
Hình 2.15 Sắc ký đồ mẫu chuẩn và thí nghiệm 5 Bảng 2.18 Kết quả khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ dung môi chiết xuất
Tổng HL saponin theo dược liệu (%)
Mối liên hệ giữa tốc độ dòng ethanol 96% đến hiệu suất chiết cao và hàm lượng saponin thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 2.16 Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ dòng ethanol 96% đến hiệu suất chiết cao và HL Saponin
0,3 ml/phút 0,5 ml/phút 0,8 ml/phút 1,0 ml/phút 1,2 ml/phút
Tốc độ dòng (ml/phút)
Hiệu suất chiết cao (%) Tổng HL Saponin (%)
Tỷ lệ ethanol phối trộn với CO2 siêu tới hạn ảnh hưởng đến độ phân cực của dung môi chiết xuất, từ đó tác động đến hàm lượng saponin trong Tam thất Tốc độ dòng ethanol 96% đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất hoạt chất tối đa Cụ thể, tốc độ dòng càng cao, độ phân cực dung môi càng lớn và lượng hoạt chất chiết xuất được càng nhiều Nghiên cứu này chỉ ra rằng tốc độ dòng 1,2 ml/phút cho kết quả chiết xuất cao nhất, tương ứng với hàm lượng saponin là 6,78%.
2.4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Tiến hành khảo sát các mức nhiệt độ lần lượt: 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C. Kết quả phân tích tổng hàm lượng saponin (Phụ lục 4) trình bày trong bảng 2.19 và sắc ký đồ mẫu thử được thể hiện ở hình 2.17.
Hình 2.17 Sắc ký đồ mẫu thí nhiệm 7 Bảng 2.19 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết
Tổng HL saponin theo dược liệu (%)
Mối liên hệ giữa nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết cao và hàm lượng saponin thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 2.18 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất đến hiệu suất chiết cao và HL Saponin
Nhận xét: Nhiệt độ chiết ảnh hưởng đến độ phân cực của CO2 siêu tới hạn Nhiệt độ khảo sát phải cao hơn nhiệt độ tới hạn của CO2 (31,04 o C và không được cao hơn nhiệt độ hóa hơi của quy trình (80 o C) Bởi vì, nếu nhiệt độ quá cao có thể sẽ ảnh hưởng đến độ bền của các hoạt chất trong Tam thất Kết quả cho thấy tại 40 o C, thu được lượng cắn và hàm lượng saponin lớn nhất Vì vậy chọn nhiệt độ chiết là 40 o C để tiến hành khảo sát tiếp.
2.4.2.3 Ảnh hưởng của áp suất chiết
Tiến hành khảo sát lần lượt các mức áp suất sau: 200 bar, 250 bar, 300 bar, 350 bar, 400 bar, 450 bar Kết quả phân tích tổng hàm lượng saponin (Phụ lục 5) được trình bày trong bảng 2.20 và sắc ký đồ mẫu thử được thể hiện ở hình 2.19.
Hiệu suất chiết cao (%) Tổng HL Saponin (%)
Hình 2.19 Sắc ký đồ mẫu thí nghiệm 12 Bảng 2.20 Kết quả khảo sát áp suất chiết xuất
Thí nghiệm Áp suất chiết xuất
Tổng HL saponin theo dược liệu (%)
Mối liên hệ giữa áp suất chiết đến hiệu suất chiết cao và hàm lượng saponin thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 2.20 Biểu đồ ảnh hưởng của áp suất chiết xuất đến hiệu suất chiết cao và
200 bar 250 bar 300 bar 350 bar 400 bar 450 bar Áp suất chiết (bar)
Hiệu suất chiết cao (%) Tổng HL Saponin (%)
Nhận xét: Tương tự ảnh hưởng của nhiệt độ chiết, áp suất tác động đến độ phân cực của CO2 siêu tới hạn Áp suất khảo sát phải cao hơn áp suất tới hạn của CO2 (73,8 bar) Kết quả phân tích tổng hàm lượng saponin (Phụ lục 5) được trình bày trong bảng 2.20 Tại áp suất 250 bar, thu được khối lượng cắn lớn nhất, tổng hàm lượng saponin cao nhất Vì vậy, chọn áp suất 250 bar là điều kiện áp suất được lựa chọn.
2.4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết
Tiến hành khảo sát thời gian chiết, xác định thời điểm hoạt chất gần như chiết kiệt sau các mốc 4, 5, 6, 7, 8 giờ Kết quả được trình bày trong hình 2.21.
Hình 2.21 Kết quả định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng theo thời gian chiết
Rb 1 : dung dịch chất đối chiếu ginsenoside Rb 1
Rg 1 : dung dịch chất đối chiếu ginsenoside Rg 1
Not: dung dịch chất đối chiếu notoginsenosid R 1
C: dung dịch dược liệu đối chiếu
4h, 5h, 6h ,7h, 8h: lần lượt tương ứng với từng thời gian chiết
Hình a: bản mỏng phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol, sấy ở 105 0 C đến hiện vết, quan
Rb1 Rg1 Not C 4h 5h 6h 7h 8h Rb1 Rg1 Not C 4h 5h 6h 7h 8h sát tự nhiên
Hình b: bản mỏng phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol, sấy ở 105 0 C đến hiện vết, quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
