luận án tiến sĩ nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc ninh bình phú yên và chế tạo kit lamp ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chÁ t¿o bá kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi .... Mát sá ứng dāng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhß á ng°ßi .

VIÆN SæT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ¯¡NG -* -

H°áng d¿n khoa hãc:

1 PGS TS Trần Thanh D°¡ng 2 TS Tr°¡ng Vn H¿nh

LâI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện d°ới sự h°ớng dẫn trực tiÁp của PGS.TS Trần Thanh D°¡ng, TS Tr°¡ng Vn H¿nh và các thầy cô là giÁng viên cán bá của Viện Sát rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung °¡ng Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đ°ÿc Chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đề tài cho phép sử dāng mẫu và mát

phần sá liệu của đề tài cÃp nhà n°ớc: <Nghiên cứu chế tạo các bộ kít LAMP

để chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa.= Các sá liệu và kÁt quÁ trong luận án là hoàn toàn

trung thực, ch°a đ°ÿc công bá á bÃt kỳ công trình nào khác Các b°ớc tiÁn hành của đề tài đúng nh° đề c°¡ng nghiên cứu, chÃp hành các quy định đ¿o đức trong tiÁn hành nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kÁt này

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giÁ

Ph¿m Thá Hà Trang

LâI CÀM ¡N

Với lòng chân thành, tôi xin bày tß lòng biÁt ¡n sâu sắc tới PGS TS Trần Thanh D°¡ng, TS Tr°¡ng Vn H¿nh đã h°ớng dẫn và giúp đỡ tận tình trong suát quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lßi cÁm ¡n sâu sắc tới TS Hoàng Đình CÁnh, Viện tr°áng cùng Ban Lãnh đ¿o Viện Sát rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung °¡ng, các Khoa Sinh học phân tử, Ký sinh trùng đã t¿o điều kiện giúp đỡ tôi trong suát quá trình học tập Xin trân trọng cÁm ¡n PGS TS Cao Bá Lÿi cùng các cán bá của Phòng Khoa học và Đào t¿o, đã t¿o điều kiện thuận lÿi và giúp đỡ tôi nhiệt tình trong thßi gian nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lßi cÁm ¡n chân thành đÁn Ban Lãnh đ¿o, cán bá y tÁ của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Ninh Bình và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Phú Yên, cán bá y tÁ t¿i Trung tâm y tÁ huyện Kim S¡n, huyện Tuy An và Tr¿m Y tÁ của hai điểm nghiên cứu đã hÿp tác, t¿o điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu t¿i thực địa

Xin chân thành cÁm ¡n Ban Giám đác Sá Y tÁ Hà Nái, phòng QuÁn lý hành nghề y d°ÿc t° nhân và toàn thể b¿n bè, đßng nghiệp đã đáng viên, khuyÁn khích và hß trÿ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

Cuái cùng tôi xin bày tß lòng biÁt ¡n sâu sắc tới gia đình, bá, mẹ, chßng, con đã luôn khuyÁn khích, chia sẻ, đáng viên, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khn để hoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giÁ

Ph¿m Thá Hà Trang

DANH MĂC CÁC CHĀ VI¾T TT

phân

IARC International Agency for Research on Cancer

C¡ quan nghiên cứu ung th° quác tÁ

ITS Internal Transcribed Spacer

Practices

KiÁn thức, Thái đá, Thực hành LAMP Loop-Mediated Isothermal

Amplification

KhuÁch đ¿i đẳng nhiệt m¿ch vòng

PCR Polymerase Chain Reaction PhÁn ứng chußi Polymerase TCCN,

MĂC LĂC

Đ¾T VÂN ĐÀ 1

CH¯¡NG 1: TêNG QUAN TÀI LIÆU 3

1.1 Mát sá đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhß 3

1.2.3 Điều trị bệnh sán lá gan nhß trên ng°ßi 20

1.3 Các ph°¡ng pháp xét nghiệm xác định tình tr¿ng nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi 20

1.4 Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chÁ t¿o bá kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi 22

1.4.1 Nguyên lý của kỹ thuật LAMP 22

1.4.2 Thành phần phÁn ứng LAMP 22

1.4.3 C¡ chÁ của phÁn ứng LAMP 23

1.4.4 Đánh giá kÁt quÁ của LAMP 25

1.4.5 Quy trình thực hiện LAMP 26

1.4.6 Tính °u việt của kỹ thuật LAMP 27

1.4.7 Mát sá h¿n chÁ của kỹ thuật LAMP 27

1.4.8 Mát sá ứng dāng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhß á ng°ßi 28

1.4.9 ChÁ t¿o và chuẩn hóa bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 30

CH¯¡NG 2: ĐæI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 36

2.1 Māc tiêu 1: Mô tÁ thực tr¿ng và mát sá yÁu tá liên quan nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi t¿i hai xã trọng điểm thuác tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) 36

2.1.1 Đái t°ÿng, thßi gian và địa điểm nghiên cứu 36

2.3 Đ¿o đức trong nghiên cứu 58

CH¯¡NG 3: K¾T QUÀ NGHIÊN CĆU 59

3.1 Thực tr¿ng và mát sá yÁu tá liên quan nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi t¿i hai xã trọng điểm thuác tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) 59

3.1.1 Đặc điểm của đái t°ÿng nghiên cứu 59

3.1.2 Tỷ lệ nhiễm và c°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi t¿i địa điểm nghiên cứu 60

3.1.3 Mát sá yÁu tá liên quan đÁn tình tr¿ng nhiễm sán lá gan nhß á ng°ßi 70

3.2 ChÁ t¿o kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên ng°ßi á quy mô phòng thí nghiệm 78

3.2.1 ThiÁt kÁ, đánh giá lựa chọn các bá mßi LAMP 78

3.2.2 Đánh giá tính đặc hiệu và khÁ nng ho¿t đáng của bá mßi LAMP thiÁt kÁ 79

3.2.3 KhÁo sát, tái °u hóa các điều kiện phÁn ứng LAMP 81

3.2.4 Đóng gói thành phẩm bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 87

3.3 KÁt quÁ đánh giá đá nh¿y, đá đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán sán lá

gan nhß, so sánh bá mßi 88

3.3.1 Đá nh¿y, đá đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O viverrini t¿i phòng thí nghiệm 88

3.3.2 Đá nh¿y, đá đặc hiệu của bá kit LAMP chẩn đoán C sinensis 88

3.3.3 KÁt quÁ so sánh bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß với bá mßi có cùng māc đích 89

3.3.4 Đánh giá đá án định của bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 90 3.4 KÁt quÁ đánh giá bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß t¿i thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình 95

3.4.1 Đánh giá bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß O viverrini t¿i thực địa tỉnh Phú Yên 95

3.4.2 KÁt quÁ đánh giá bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß C sinensis t¿i thực địa tỉnh Ninh Bình 96

3.5 Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm định các bá kít LAMP 98

3.5.1 Xây dựng tiêu chuẩn c¡ sá 98

3.5.2 KÁt quÁ kiểm định các bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 99

CH¯¡NG 4: BÀN LUÀN 100

4.1 Mô tÁ thực tr¿ng và mát sá yÁu tá liên quan nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi t¿i hai xã trọng điểm thuác Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) 100

4.1.1 Đặc điểm của đái t°ÿng nghiên cứu 100

4.1.2 KÁt quÁ nghiên cứu tỷ lệ, c°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi 102

4.2 Mát sá yÁu tá liên quan đÁn tình tr¿ng nhiễm sán lá gan nhß á ng°ßi 107

4.2.1 Liên quan giữa tuái và tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß 107

4.2.2 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và giới tính 109

4.2.3 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và nghề nghiệp 111

4.2.4 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và trình đá học vÃn 112

4.2.5 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và việc sử dāng nhà tiêu 114

4.2.6 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và việc sử dāng phân

t°¡i để chn nuôi, trßng trọt 115

4.2.7 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và có nuôi chó mèo 116

4.2.8 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và tình tr¿ng n gßi cá 118

4.2.9 Mát sá yÁu tá khác liên quan đÁn tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß 119

4.3 ChÁ t¿o kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên ng°ßi á quy mô phòng thí nghiệm 122

4.3.1 KhÁo sát vùng bÁo thủ của gen đích, thiÁt kÁ và lựa chọn mßi LAMP 122

4.3.2 Tái °u thành phần và điều kiện ho¿t đáng của phÁn ứng LAMP 125

4.3.3 KhÁo sát ng°ỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 130

4.3.4 Đánh giá đá nh¿y, đá đặc hiệu, đá án định của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß, so sánh kít LAMP với bá mßi cùng māc tiêu 131

4.3.5 Đánh giá bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß t¿i thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình 133

K¾T LUÀN 136

KI¾N NGHà 138

H¾N CH¾ CĄA LUÀN ÁN 139

NHĀNG ĐÓNG GÓP MàI CĄA LUÀN ÁN 140

LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN ĐÃ Đ¯ĀC CÔNG Bæ

PHĂ LĂC

DANH MĂC BÀNG

BÁng 2.1 Phân lo¿i c°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß 41

BÁng 2.2 Yêu cầu về đá dài của mßi 50

BÁng 2.3 Yêu cầu về nhiệt đá nóng chÁy của từng mßi 51

BÁng 3.1 Đặc điểm nhân khẩu học của đái t°ÿng nghiên cứu 59

BÁng 3.2 Đặc điểm gia đình của đái t°ÿng nghiên cứu 60

BÁng 3.3 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi 60

BÁng 3.4 Tỷ lệ ng°ßi nhiễm sán lá gan nhß theo nhóm tuái 61

BÁng 3.5 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß theo giới tính 62

BÁng 3.6 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß theo nghề nghiệp 63

BÁng 3.7 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß theo trình đá học vÃn 64

BÁng 3.8 C°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß t¿i điểm nghiên cứu 65

BÁng 3.9 C°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß theo nhóm tuái 66

BÁng 3.10 C°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß theo giới tính 67

BÁng 3.11 C°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß theo nghề nghiệp 68

BÁng 3.12 C°ßng đá nhiễm sán lá gan nhß theo trình đá học vÃn 69

BÁng 3.13 Lý do n gßi cá của ng°ßi dân t¿i địa điểm nghiên cứu 70

BÁng 3.14 Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhß và tiền sử n gßi cá sáng 71

BÁng 3.15 Liên quan giữa n gßi cá và nhiễm sán lá gan nhß á nam giới 71

BÁng 3.16 Liên quan giữa n gßi cá và nhiễm sán lá gan nhß á nữ giới 72

BÁng 3.17 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và tần suÃt n gßi cá sáng 73

BÁng 3.18 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và ngußn cá sử dāng n gßi 73

BÁng 3.19 Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß và sử dāng há xi hÿp

BÁng 3.22 Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhß và có ao nuôi cá 76

BÁng 3.23 Mô hình hßi quy đa biÁn 77

BÁng 3.24 Trình tự mßi LAMP thiÁt kÁ để chẩn đoán O viverrini 78

BÁng 3.25 Trình tự mßi LAMP thiÁt kÁ để chẩn đoán C sinensis 79

BÁng 3.26 KÁt quÁ đánh giá sự chuyển màu của mẫu âm tính, d°¡ng tính với các nßng đá HNB sử dāng cho phÁn ứng LAMP 84

BÁng 3.27 Đá nh¿y, đá đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán O viverrini 88

BÁng 3.28 Đá nh¿y, đá đặc hiệu của kít LAMP chẩn đoán C sinensis 88

BÁng 3.29 So sánh đá t°¡ng đßng kÁt quÁ xét nghiệm giữa bá kit LAMP chÁ t¿o với kỹ thuật LAMP sử dāng bá mßi theo Lê Thanh Hòa và cs 89

BÁng 3.30 So sánh đá t°¡ng đßng kÁt quÁ xét nghiệm giữa bá kit LAMP chÁ t¿o với kỹ thuật LAMP sử dāng bá mßi của Rahman và cs 90

BÁng 3.31 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß O viverrini sau 6 tháng bÁo quÁn 91

BÁng 3.32 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß O viverrini sau 4 lần làm tan và đông đá 91

BÁng 3.33 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá Kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß O viverrini sau 12 tháng bÁo quÁn 92

BÁng 3.34 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß C sinensis sau 6 tháng bÁo quÁn 93

BÁng 3.35 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß C sinensis sau 4 lần làm tan và đông đá 94

BÁng 3.36 KÁt quÁ khÁo sát đá án định của bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß C sinensis sau 12 tháng bÁo quÁn 94

BÁng 3.37 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß O viverrini phát hiện bằng Kato-Katz và bá kít LAMP 95

BÁng 3.38 So sánh hệ sá t°¡ng đßng kÁt quÁ xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhß O viverrini bằng bá kít LAMP và real time PCR 96

BÁng 3.39 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß C sinensis phát hiện bằng Kato-Katz và

bá kít LAMP 97BÁng 3.40 So sánh hệ sá t°¡ng đßng kÁt quÁ xét nghiệm phát hiện sán lá gan

nhß C sinensis bằng bá kít LAMP và real time PCR 97BÁng 3.41 Tiêu chuẩn c¡ sá của bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß

Opisthorchis viverrini 98BÁng 3.42 Tiêu chuẩn c¡ sá của bá kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß

Clonorchis sinensis 98

Hình 1.3 Hình thể trứng của các loài sán lá gan nhß 4

Hình 1.4 Âu trùng (Metacercariae) của sán lá gan nhß 5

Hình 1.5 Loài ác mang Ãu trùng sán lá gan nhß t¿i Việt Nam 6

Hình 1.6 Cá lóc đßng 6

Hình 1.7 Cá chép 6

Hình 1.8 Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhß C sinensis 8

Hình 1.9 Phân bá của sán lá gan nhß t¿i Việt Nam 14

Hình 1.10 Các mßi thiÁt kÁ và vị trí bắt cặp trên gen đích 23

Hình 1.11 S¡ đß phÁn ứng LAMP á giai đo¿n t¿o vật liệu khái đầu 24

Hình 1.12 S¡ đß phÁn ứng LAMP giai đo¿n tái bÁn và kéo dài chußi 24

Hình 1.13 Hình Ánh điện di sÁn phẩm LAMP 25

Hình 1.14 SÁn phẩm LAMP khi quan sát bằng mắt th°ßng 25

Hình 1.15 Hình Ánh sÁn phẩm LAMP nhuám bằng SYBR green 26

Hình 1.16 Quy trình thực hiện LAMP 26

Hình 2.1 BÁn đß địa điểm nghiên cứu t¿i Ninh Bình 37

Hình 2.2 BÁn đß địa điểm nghiên cứu t¿i Phú Yên 37

Hình 2.3 S¡ đß thiÁt kÁ nghiên cứu chÁ t¿o bá kít LAMP chẩn đoán sán lá

gan nhß 45

Hình 3.1 Tỷ lệ ng°ßi dân n gßi cá 70

Hình 3.2 SÁn phẩm PCR sử dāng cặp mßi F3-B3 của O viverrini 80

Hình 3.3 SÁn phẩm LAMP điện di trên gel agarose 2% sử dāng bá mßi thiÁt kÁ đặc hiệu cho sán lá gan nhß O viverrini và C sinensis 81

Hình 3.4 Ành điện di sÁn phẩm khÁo sát nhiệt đá ủ mßi của phÁn ứng LAMP chẩn đoán O viverrini 82

Hình 3.5 Ành điện di sÁn phẩm LAMP khÁo sát với các nßng đá MgSO4 82

Hình 3.6 Ành điện di sÁn phẩm khÁo sát thßi gian của phÁn ứng LAMP 83

Hình 3.7 Ành sÁn phẩm LAMP với các nßng đá HNB khÁo sát khi quan sát bằng mắt th°ßng 84

Hình 3.8 Ành điện di sÁn phẩm LAMP trên gel agarose 2% xác định ng°ỡng phát hiện s¡ cÃp của kít LAMP 85

Hình 3.9 Ành sÁn phẩm LAMP quan sát bằng mắt th°ßng xác định ng°ỡng phát hiện s¡ cÃp của kít LAMP 86

Hình 3.10 Biểu đß ng°ỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß O viverrini 86

Hình 3.11 Biểu đß ng°ỡng phát hiện thứ cÃp của kít LAMP chẩn đoán

sán lá gan nhß C sinensis 87

Hình 3.12 Hình Ánh bá kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhß 87

Hình 3.13 Hình Ánh điện di sÁn phẩm LAMP chẩn đoán O viverrini sau 1 tháng 92

Hình 3.14 Hình Ánh điện di sÁn phẩm LAMP chẩn đoán O viverrini sau 6 tháng 92

Hình 3.15 Hình Ánh sÁn phẩm LAMP chẩn đoán O viverrini sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu 92

Hình 3.16 Hình Ánh sÁn phẩm LAMP chẩn đoán O viverrini sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu 92

Hình 3.17 Hình Ánh điện di sÁn phẩm LAMP chẩn đoán C sinensis sau 1 tháng 93

Hình 3.18 Hình Ánh điện di sÁn phẩm LAMP chẩn đoán C sinensis sau 6 tháng 93

Hình 3.19 Hình Ánh sÁn phẩm LAMP chẩn đoán C sinensis sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu 94

Hình 3.20 Hình Ánh sÁn phẩm LAMP chẩn đoán C sinenis sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu 94

Đ¾T VÂN ĐÀ

Nhiễm sán lá gan nhß là bệnh truyền nhiễm qua đ°ßng n uáng gây Ánh h°áng lớn đÁn sức khße cáng đßng Sán lá gan nhß gây bệnh á ng°ßi có 3

loài đó là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis felineus

phân bá á nhiều n¡i trên thÁ giới trÁi dài từ Đông và Đông Nam châu Á đÁn châu Âu [1]

Việt Nam thuác vùng khí hậu nhiệt đới, điều kiện tự nhiên, xã hái và tập quán n uáng, canh tác, sinh ho¿t thuận lÿi cho sự l°u hành bệnh giun sán, trong đó có bệnh sán lá gan nhß Việt Nam ghi nhận hai loài sán lá gan nhß là

C sinensis và O viverrini phân bá á ít nhÃt 32 tỉnh thành [2]

Hai địa ph°¡ng Ninh Bình và Phú Yên đ°ÿc coi là điểm nóng với tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß khá cao với nhiều yÁu tá liên quan nh° thßi tiÁt thuận lÿi, địa hình nhiều sông ngòi, ao hß,&, trong đó, nguyên nhân chính do tập quán n gßi cá của nhân dân đã tßn t¿i lâu đßi [3]

Bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhß th°ßng không có các triệu chứng trong mát thßi gian dài hoặc có triệu chứng nh°ng không rõ ràng, điều này gây khó khn cho việc chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh Điều đáng chú ý là ng°ßi nhiễm sán lá gan nhß lâu ngày có thể bị x¡ gan á nhiều mức đá khác nhau, đặc biệt có nguy c¡ ung th° biểu mô đ°ßng mật [4] Vì vậy việc chẩn đoán sán lá gan nhß là rÃt cần thiÁt

Hiện nay, có rÃt nhiều ph°¡ng pháp xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhß Trong đó, xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz đ°ÿc sử dāng ráng rãi, dễ thực hiện, nhanh chóng và rẻ tiền, có thể °ớc tính c°ßng đá nhiễm trùng Tuy nhiên, đá nh¿y của kỹ thuật Kato-Katz thÃp, đặc biệt là đái với các tr°ßng hÿp nhiễm c°ßng đá nhẹ [5], [6]

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dāng sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân sinh học gây bệnh ngày càng đ°ÿc phát triển, đặc biệt là các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhß

O viverrini hay C sinensis cho đá nh¿y và đá đặc hiệu cao nh°ng gặp nhiều

khó khn khi áp dāng t¿i thực địa, phù hÿp với những trung tâm y học lớn [7] Gần đây, nhiều nghiên cứu có xu h°ớng chuyển sang các ph°¡ng pháp khuÁch đ¿i ADN đẳng nhiệt (trong đó đ°ÿc áp dāng nhiều nhÃt là kỹ thuật khuÁch đ¿i đẳng nhiệt m¿ch vòng trung gian - Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP) với những °u điểm là đá nh¿y và đặc hiệu t°¡ng đ°¡ng kỹ thuật PCR nh°ng chỉ cần các thiÁt bị xét nghiệm đ¡n giÁn, thßi gian xét nghiệm rút ngắn xuáng còn 30 - 60 phút, có khÁ nng phát triển thành các bá sinh phẩm xét nghiệm (sau đây gọi là kit) phân tử cho phép ứng dāng đ°ÿc t¿i thực địa [8], [9] ĐÁn nay, t¿i Việt Nam ch°a có kit LAMP đ°ÿc th°¡ng m¿i hóa để chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi Cần có các nghiên cứu, phát triển ứng dāng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhß trên ng°ßi, giúp khắc phāc đ°ÿc mát sá tßn t¿i của các ph°¡ng pháp chẩn đoán khác nhằm giÁi quyÁt các vÃn đề trong nghiên cứu, đặc biệt có thể áp dāng ráng rãi t¿i thực địa

XuÃt phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi tiÁn hành nghiên cứu đề tài: <Nghiên cću thăc tr¿ng nhiÅm sán lá gan nhå trên ng°ãi å hai xã trãng điÃm thußc Ninh Bình, Phú Yên và ch¿ t¿o kit LAMP ćng dăng trong chÁn đoán t¿i cßng đéng” với các māc tiêu sau:

1 Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020)

2 Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phòng thí nghiệm

CH¯¡NG 1

TêNG QUAN TÀI LIÆU 1.1 Mßt sç đ¿c điÃm dách tÅ hãc nhiÅm sán lá gan nhå

Trên thÁ giới, có ba loài sán lá gan thuác họ Opisthorchiidae gây bệnh

cho ng°ßi là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis

felineus với đặc điểm sinh học, vòng đßi và lâm sàng t°¡ng đái giáng nhau [10] à Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan nhß là

Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái của sán lá gan nhỏ trưởng thành

A: O felineus (7 - 12 x 2 - 3 mm)

B: O viverrini (5,5 - 10 x 0,77 - 1,65 mm) C: C sinensis (10 - 25 x 3 - 5 mm)

loài có hình thái nhß nhÃt C sinensis tr°áng thành kích th°ớc lớn nhÃt [12]

Trên thân sán có cÁ bá phận sinh dāc đực và cái Hai tinh hoàn nằm á phía sau, chia nhiều múi (O viverrini và O felineus) hoặc chia nhiều nhánh nhß (C

sinensis) Tử cung nhß xÁp khúc nằm á giữa thân, hoàng thể hai bên à trứng hình bầu dāc, nhß, d°ới á trứng là túi tinh, sau tinh hoàn là áng bài tiÁt [13]

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái trứng sán lá gan nhỏ

Trứng sán lá gan nhß C sinensis, O felineus và O viverrini rÃt giáng

nhau và giáng với trứng của các loài sán lá ruát nhß thuác họ Heterophyidae

[3] Vì vậy, trong nhiều tr°ßng hÿp, phân lo¿i dựa vào hình thái gặp nhiều khó khn và có thể bị nhầm lẫn Trứng hình bầu dāc, dài khoÁng 19 - 35μm và ráng khoÁng 10 - 20μm Trứng có mát lớp vß mßng bắt màu vàng nh¿t Mát đầu trứng có nắp, hai gß của nắp nái rõ Đuôi trứng có núm con nhß gọi là mÃu Các mÃu của mßi loài là khác nhau Bề mặt của vß trứng thô và không đều [14]

C sinensis [15] O viverrini [16] O felineus [17]

Hình 1.3 Hình thà trćng cąa các loài sán lá gan nhå

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá gan nhỏ

Trong khuôn khá luận án này chỉ đề cập tới giai đo¿n Ãu trùng nang là giai đo¿n Ãu trùng truyền qua cá cho ng°ßi và các đáng vật có vú khác đ°ÿc gọi là metacercaria, nó đ°ÿc bao bọc trong các mô khác nhau của vật chủ (tôm, cá) Metacercaria của các loài sán lá gan nhß hình tròn hoặc bầu dāc,

kích th°ớc khác nhau tùy loài Metacercaria của C sinensis kích th°ớc 0,14 x 0,09-0,10 mm [18] Metacercaria O viverrini kích th°ớc 0,19-0,25 x

0,13-0,15-0,22m [14] Metacercaria O felineus kích th°ớc 0,25-0,30 x 0,23mm [11]

C sinensis O viverrini O felineus

Hình 1.4 Âu trùng (Metacercariae) cąa sán lá gan nhå [17]

- Vật chủ chính:

Vật chủ chính của sán lá gan nhß gßm ng°ßi và mát sá đáng vật có vú nh°

chó, mèo, lÿn, chuát (Rattus norvegicus), mát sá đáng vật n cá hoang dã, có thể

cÁ chim, tuy nhiên ng°ßi đ°ÿc coi là vật chủ dự trữ mầm bệnh quan trọng nhÃt [12] Tỷ lệ nhiễm C sinensis cao á đáng vật có vú bao gßm chó, mèo (0,8 3 4,85%) do đó kiểm soát lây nhiễm của vật chủ trong á chứa bằng cách cho vật nuôi n thức n nÃu chín hoặc chÁ biÁn đặc biệt và cÁi thiện việc quÁn lý phân của vật nuôi cũng đóng vai trò trong phòng cháng nhiễm sán á ng°ßi [12], [19]

- Vật chủ trung gian thứ nhÃt:

Vật chủ trung gian thứ nhÃt của sán lá gan nhß gßm nhiều loài ác khác nhau tùy địa điểm nghiên cứu à các vùng l°u hành, àc nhiễm sán lá gan nhß th°ßng đ°ÿc tìm thÃy á các ngußn n°ớc gần làng, trong các hß n°ớc nông, ruáng lúa và đÃt ngập n°ớc [20], [21], n¡i có mức đá ô nhiễm phân cao [22]

Việt Nam là quác gia duy nhÃt l°u hành cÁ O viverrini và C sinensis,

do đó sự phân bá của ác P manchouricus á miền bắc và Bithynia spp á miền

Trung - Nam là yÁu tá quyÁt định sự khác biệt về địa lý giữa hai loài sán lá gan nhß á n°ớc ta Cần có nghiên cứu chi tiÁt h¡n về vật chủ trung gian của ác sên cũng nh° các vật chủ khác á các vùng nái giữa các vùng l°u hành bệnh sán lá gan nhß

Hình 1.5 Loài çc mang Ãu trùng sán lá gan nhå t¿i ViÇt Nam

(Nguyễn Văn Đề, Đại học Y Hà Nội, 2012)

- Vật chủ trung gian thứ hai:

Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhß C sinensis gßm nhiều loài

cá n°ớc ngọt, chủ yÁu là cá họ Cyprinidae (chép) [12] Mát nghiên cứu (2020) t¿i chÿ cá tỉnh Yên Bái cho thÃy tỷ lệ nhiễm C sinensis trên cá khá cao là 69,7%, c°ßng đá nhiễm là 81,2% metacercariae/cá [23] Âu trùng sán O

viverrini đ°ÿc xác định ký sinh trên nhiều loài cá khác nhau, phá biÁn nhÃt là cá diÁc (Carassius auratus) với tỷ lệ nhiễm Ãu trùng nang là 28,1%, ngoài ra

có các loài khác nh° cá lóc, cá chép,& [24]

Hình 1.6 Cá lóc đéng (C striata) [25] Hình 1.7 Cá chép (C carpio) [26]

Vòng đßi của sán lá gan nhß liên quan tới hai vật chủ trung gian nên đặc điểm dịch tễ học cũng liên quan tới hai vật chủ trung gian này trong đó vật chủ trung gian thứ nhÃt (ác) có vai trò quyÁt định đÁn phân bá của sán do chỉ mát sá ít ác có thể nhiễm sán Vai trò của vật chủ trung gian thứ hai ít quan trọng h¡n do rÃt nhiều loài cá có thể mang Ãu trùng sán, tuy nhiên khÁ nng lây nhiễm vào vật chủ chính phā thuác vào cá

1.1.3 Đường lây và cơ chế lây truyền bệnh

1.1.3.1 Đường lây

n gßi cá hoặc cá ch°a nÃu chín nhiễm nang Ãu trùng sán là nguy c¡ sá 1 gây nhiễm sán lá gan nhß cho ng°ßi [27], tỷ lệ nhiễm cao á những cáng đßng có thói quen n gßi cá Tập quán làm nhà vệ sinh trên ao hß, nuôi cá bằng phân ng°ßi là những yÁu tá góp phần quan trọng lan truyền bệnh Tập quán này gặp á nhiều n°ớc trên thÁ giới [12], [19]

1.1.3.2 Cơ chế lây truyền bệnh:

Vòng đßi sán lá gan nhß phức t¿p, qua nhiều vật chủ [2]:

(1) Giai đo¿n á ng°ßi: Sán tr°ßng thành ký sinh á đ°ßng mật đẻ trứng, trứng theo mật xuáng ruát rßi theo phân phân ra ngo¿i cÁnh Trứng r¡i vào môi tr°ßng n°ớc tiÁp tāc phát triển

(2) Giai đo¿n á ác: Trứng sán bị ác nuát, trong ác trứng ná thành Ãu trùng lông (miracidia), Ãu trùng lông phát triển qua hai giai đo¿n là nang bào tử (sporocysts), bào tử trùng (rediae), sau đó phát triển thành Ãu trùng đuôi (cercariae)

(3) Giai đo¿n á môi tr°ßng n°ớc: Âu trùng đuôi rßi ác b¡i tự do trong n°ớc (4) Giai đo¿n á cá: Âu trùng đuôi xâm nhập vào cá n°ớc ngọt, rāng đuôi, phát triển thành thành Ãu trùng nang ký sinh trong cá (metacercariae)

Giai đo¿n phát triển trên ng°ßi hoặc đáng vật: Khi n phÁi cá có Ãu trùng nang ch°a đ°ÿc nÃu chín thì sau khi n, Ãu trùng này vào trong d¿ dày xuáng tá tràng rßi ng°ÿc theo đ°ßng mật lên gan, phát triển thành sán lá gan tr°áng thành ký sinh và gây bệnh á đ°ßng mật Thßi gian từ khi n phÁi Ãu trùng nang trong cá đÁn khi thành sán tr°áng thành từ 26 3 30 ngày

Sán lá gan nhß có tuái thọ lâu dài trong vật chủ chính là con ng°ßi, mát báo cáo về tr°ßng hÿp C sinensis sáng trong c¡ thể ng°ßi h¡n 26 nm [28]

Để gây nhiễm đ°ÿc cho ng°ßi hay vật chủ khác, sán lá gan nhß phÁi á giai đo¿n Ãu trùng có khÁ nng gây nhiễm (giai đo¿n nang Ãu trùng)

Hình 1.8 Chu kỳ phát triÃn cąa sán lá gan nhå C sinensis

(nguồn USA-CDC 2013)

Mọi ng°ßi đều có thể mắc bệnh khi bị nhiễm sán lá gan nhß Ng°ßi không có miễn dịch tự nhiên với sán lá gan nhß, sau khi nhiễm mầm bệnh có thể dễ dàng bị tái nhiễm [2]

YÁu tá nguy c¡ lớn nhÃt của nhiễm sán lá gan nhß là n gßi cá, n cá nÃu ch°a chín Có nhiều yÁu tá liên quan đÁn hành vi này

1.1.5.1 Tập quán ăn gỏi cá

Thói quen n gßi cá là mát trong các yÁu tá nguy c¡ quan trọng á những ng°ßi nhiễm sán lá gan nhß, điều nay đã đ°ÿc chứng minh á nhiều nghiên cứu t¿i Việt Nam và mát sá n°ớc châu Á khác [29], [30]

Hoàng Quang Vinh (2017): những ng°ßi n gßi cá trong vòng 5 nm có nguy c¡ nhiễm bệnh cao h¡n nhiều so với những ng°ßi không bao giß n gßi

cá (OR = 9,06; 95% CI: 4,36 - 18,83) Những ng°ßi ch°a bao giß n gßi cá cũng bị nhiễm sán [29]

Nghiên cứu (2020) t¿i Yên Bái và Thanh Hóa cho thÃy những ng°ßi có tiền sử n cá sáng trong vòng 12 tháng có nguy c¡ nhiễm cao gÃp 8 lần so với những ng°ßi không n cá sáng Tuy nhiên khoÁng 20,7% ng°ßi nhiễm bệnh nh°ng l¿i trÁ lßi là không n cá sáng, có thể do họ quên hoặc họ không muán thừa nhận việc n cá sáng Mát giÁ thuyÁt khác đ°ÿc đặt ra là có thể do Ãu trùng nang đã lây nhiễm chéo qua dāng cā nÃu n [31]

Mát nghiên cứu khác t¿i Thái Lan (2021) cho thÃy thói quen và tần suÃt n cá sáng hoặc ch°a nÃu chín có tên là Koi pla (gßi cá sặc), mát món n truyền tháng th°ßng thÃy á miền Bắc và Đông Bắc Thái Lan, góp phần làm tỷ lệ nhiễm O viverrini cao h¡n các vùng khác [32]

1.1.5.2 Độ tuổi, giới tính, nghề nghiệp

Tuái: Nói chung nhiễm sán lá gan nhß quan sát thÃy á tÃt cÁ các nhóm tuái, tuy nhiên th°ßng gặp á ng°ßi lớn, hầu hÁt là những ng°ßi trên 20 tuái, đặc biệt á đá tuái lao đáng Tỷ lệ và c°ßng đá nhiễm tng theo tuái [33], [34] Nghiên cứu t¿i Trung Quác (2021) cho thÃy tỷ lệ nhiễm C sinensis cao nhÃt á

nhóm 40 - 49 tuái, gÃp 33,51 lần nhóm 3 - 9 tuái (95% CI: 10,13 - 110,86) [35] Điều này cho thÃy cho thÃy thói quen n gßi cá n°ớc ngọt vẫn phá biÁn á những ng°ßi lớn tuái địa ph°¡ng Nhiễm sán lá gan nhß á trẻ em có thể do các bà mẹ cho con mình n cá sáng [12]

Giới: Nhiều nghiên cứu trên thÁ giới cho thÃy tỷ lệ và c°ßng đá nhiễm á

nam cao h¡n nữ [36] Nam giới làm tng nguy c¡ nhiễm C sinensis gÃp 6,51

lần so với nữ giới (95% CI: 4,67 - 9,08) T°¡ng tự, t¿i Việt Nam đa sá nghiên cứu đều ghi nhận tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß á nam cao h¡n so với nữ Hoàng Quang Vinh (2017) cho thÃy nam có nguy c¡ nhiễm C sinensis cao gÃp 2,33

lần so với nữ (95% CI: 1,37 - 3,61, p <0,001) Ngoài ra, nghiên cứu cũng tìm thÃy mái quan hệ rõ ràng giữa giới tính, thói quen n gßi cá và uáng r°ÿu Tỷ

lệ nhiễm á nam, n cá sáng (67,41%) cao h¡n á nữ (32,59%) Nam (88%) uáng r°ÿu cùng với n cá sáng nhiều h¡n so với nữ (12%, p = 0,000) Điều này phÁn ánh vn hóa Việt Nam, đàn ông khi <nhậu= th°ßng uáng r°ÿu với <đß nhắm= (nh° gßi cá)

Nghề nghiệp: cũng là mát trong các yÁu tá liên quan đÁn tình tr¿ng lây nhiễm sán lá gan nhß Các nhóm ngành nghề có tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß cao nh° là nông dân, ng° dân, đây là những ng°ßi th°ßng xuyên tiÁp xúc với ngußn n°ớc, đÃt và phân [31], [37] Tuy nhiên, mát sá nghiên cứu l¿i không tìm thÃy mái liên hệ giữa nghề nghiệp và nguy c¡ nhiễm sán lá gan nhß [38]

1.1.5.3 Một số yếu tố khác

- YÁu tá kinh tÁ - xã hái:

Kinh tÁ kém phát triển Ánh h°áng đÁn vệ sinh an toàn thực phẩm Dân trí thÃp Ánh h°áng đÁn ý thức và hiểu biÁt về biện pháp phòng cháng bệnh Pháp lệnh an toàn thực phẩm ch°a thực sự có hiệu quÁ, và vệ sinh môi tr°ßng ch°a đ°ÿc quy ho¿ch hÿp lý

Hoàng Quang Vinh (2017) cho thÃy trình đá học vÃn Ánh h°áng đÁn tỷ lệ nhiễm C sinensis, ng°ßi có trình đá học vÃn càng cao thì nguy c¡ nhiễm

càng thÃp Những ng°ßi có trình đá trung học c¡ sá có nguy c¡ nhiễm C

sinensis thÃp h¡n (OR=0,63; 95% CI: 0,38-1,05) so với nhóm có trình đá tiểu

học TÃt cÁ 14 ng°ßi có trình đá cao đẳng, đ¿i học đều không nhiễm sán lá gan nhß [29]

- Tập quán sinh ho¿t và canh tác:

Tình tr¿ng dùng phân t°¡i nuôi cá và đá n°ớc thÁi mang mầm bệnh xuáng ao á các khu vực nông thôn là điều kiện giúp cho mầm bệnh sán lá gan hoàn thành nát chu kì gây bệnh và phát tán ra môi tr°ßng n°ớc xung quanh Nhà có ao nuôi cá cũng đ°ÿc coi là yÁu tá nguy c¡ [39]

Nghiên cứu của tác giÁ Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) cho thÃy những ng°ßi thực hành sử dāng há xí không đ¿t tiêu chuẩn vệ sinh thì có nguy c¡

nhiễm sán lá nhß cao gÃp 2,5 lần so với nhóm sử dāng nhà vệ sinh đ¿t tiêu chuẩn (95% CI: 1,49 - 4,10) Những ng°ßi thực hành sử dāng phân ủ d°ới 6 tháng có nguy c¡ bị nhiễm sán lá nhß gÃp 2,6 lần so với những ng°ßi sử dāng phân ủ trên 6 tháng (95% CI: 1,66 - 4,22) [40]

Ngoài ra, súc vật thÁ rông (chó, mèo, ) và cÁ đáng vật hoang dã chính là á dự trữ mầm bệnh làm ô nhiễm môi tr°ßng, chúng là vật chủ cÁm nhiễm với sán lá gan nhß, do chúng n cá sáng có chứa Ãu trùng sán lá Những há gia

đình nuôi mèo có nguy c¡ nhiễm sán O viverrini gÃp 7 lần so với các há

không nuôi mèo (95% CI: 1,36 3 36,09) [37]

Di biÁn đáng dân c° đã kéo theo mầm bệnh và tập quán n gßi cá từ vùng này sang vùng khác [31]

- YÁu tá môi tr°ßng tự nhiên

YÁu tá khí hậu, nhiệt đá, đá ẩm, l°ÿng m°a có liên quan đÁn sự phát triển của vật chủ trung gian (ác, cá) [41]

Khu hệ đáng vật/thực vật bao gßm các loài n ác, n cá và cÁ những đáng/thực vật làm thức n cho cá đều Ánh h°áng đÁn vật chủ trung gian của sán lá gan nhß [42]

ThÁm họa thiên tai hàng nm cũng gây nên các biÁn đáng sinh thái đái với vật chủ trung gian sán lá gan nhß (ác và cá) và phát tán mầm bệnh [31]

- Không n gßi cá và các lo¿i thực phẩm chÁ biÁn từ cá ch°a nÃu chín - Không dùng phân ng°ßi nuôi cá, không phóng uÁ xuáng ngußn n°ớc - Truyền thông giáo dāc sức khße cho cáng đßng về phòng cháng bệnh sán lá gan nhß

- Định kỳ tẩy sán cho chó, mèo, lÿn

- Điều trị dự phòng t¿i cáng đßng: Áp dāng H°ớng dẫn tẩy sán lá gan nhß t¿i cáng đßng theo quyÁt định sá 1931/QĐ-BYT ngày 19/5/2016 của Bá tr°áng Bá Y tÁ [43]

1.1.7 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ ở người trên thế giới và Việt Nam

1.1.7.1 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới

Bệnh sán lá gan nhß phân bá trên thÁ giới rÃt đa d¿ng và có mặt á nhiều quác gia khác nhau Có khoÁng 680 triệu ng°ßi trên toàn thÁ giới có nguy c¡

bị nhiễm sán lá gan nhß ¯ớc tính cho thÃy 45 triệu ng°ßi sáng á châu Á và châu Âu bị nhiễm bệnh, với khoÁng 35 triệu ng°ßi nhiễm C sinensis, 10 triệu ng°ßi nhiễm O viverrini và 1,2 triệu ng°ßi nhiễm O felineus [44]

C sinensis gây bệnh phá biÁn nhÃt trong sá 3 loài sán lá gan nhß gây bệnh á ng°ßi chủ yÁu á châu Á bao gßm Trung Quác, Hàn Quác, miền bắc Việt Nam và miền Đông n°ớc Nga H¡n nữa, những ng°ßi di c° hoặc du lịch từ các vùng l°u hành bệnh s¿ làm tng nguy c¡ truyền bệnh sang các n°ớc khác [45]

Theo Điều tra Toàn quác về Ký sinh trùng Đ°ßng ruát (NSIP) nm

2012, C sinensis là ký sinh trùng phá biÁn nhÃt á Hàn Quác với tỷ lệ nhiễm là 1,9% dân sá [46].

Mát nghiên cứu (2020) đ°ÿc thực hiện trên 2.521 ng°ßi t¿i mát quận của tỉnh QuÁng Tây, tỷ lệ nhiễm C sinensis vẫn khá cao, lên tới 28,9% Phần lớn

(66,2%) nhiễm c°ßng đá nhẹ Tỷ lệ nam giới nhiễm vừa và nặng (37,5%) cao h¡n á nữ giới (18,1%) (p <0,05) Tỷ lệ nhiễm cao nhÃt á những ng°ßi từ 30 - 59 tuái Tần suÃt tiêu thā cá sáng có liên quan đÁn c°ßng đá nhiễm trùng Điều này cho thÃy thói quen n gßi cá vẫn phá biÁn á 1 sá n¡i trên ThÁ giới, đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á [38]

T°¡ng tự nh° C sinensis, dân c° nhiễm sán O viverrini th°ßng sáng á

những vùng có nhiều ao, hß và dọc những con sông [47] ¯ớc tính có khoÁng 12,39 triệu ng°ßi nhiễm O viverrini t¿i 4 quác gia l°u hành chủ yÁu bao gßm

Thái Lan (6,71 triệu), CHDCND Lào (2,45 triệu), Việt Nam (2,07 triệu) và Campuchia (1,00 triệu) [48]

Myanmar ván không phÁi là vùng l°u hành của O viverrini Mát nghiên

cứu cho thÃy tỷ lệ nhiễm O viverrini á vùng nông thôn H¿ Myanmar là

9,3%, có khÁ nng khu vực l°u hành mới của Myanmar nằm gần các khu vực có tỷ lệ sán lá gan nhß l°u hành cao t¿i Thái Lan và do chính sách má cửa biên giới bắt đầu từ nm 2015 dẫn đÁn việc gia tng di c° giữa các n°ớc Cáng đßng Kinh tÁ ASEAN (AEC) (Thái Lan, Cáng hòa Dân chủ Nhân dân Lào, Campuchia, Việt Nam và Myanmar) [49] Mát cuác khÁo sát khác á ba quận của Yangon cho thÃy tỷ lệ hiện mắc O viverrini là 0,7% [50]

Có mát thực tÁ đáng lo ng¿i là mặc dù các ch°¡ng trình điều trị và kiểm soát nhiễm sán lá gan nhß á ng°ßi đã đ°ÿc thực hiện trong nhiều thập kỷ á tÃt cÁ các quác gia khu vực h¿ l°u sông Mê Kông song mức đá l°u hành cao của

O viverrini và/hoặc C sinensis cũng nh° tỷ lệ mắc ung th° đ°ßng mật vẫn cao đáng báo đáng [51]

Loài O felineus ít phá biÁn nhÃt trong sá 3 loài sán lá gan nhß Nó đã đ°ÿc báo cáo từ các quác gia châu Âu trừ Phần Lan, Na Uy và Thāy Điển KhoÁng 12,5 triệu ng°ßi có nguy c¡ nhiễm O felineus, chủ yÁu gặp á khu vực

Nga, Đông Âu [12] Mát lo¿t các đáng vật có vú nh° mèo, chó, cáo, gÃu đ°ÿc biÁt đÁn là vật chủ chính và là nguyên nhân truyền bệnh cho ác Bithynia [52]

Hầu hÁt các bệnh nhân nhiễm sán không có triệu chứng [53], có bằng chứng cho thÃy O felineus là mát yÁu tá nguy c¡ của ung th° biểu mô đ°ßng

mật (CCA) [54], [55]

Nghiên cứu của tác giÁ Olga S Fedorova (2020) và cáng sự t¿i phía Tây

Siberia, Liên bang Nga cho thÃy tỷ lệ nhiễm O felineus trong cáng đßng là

60,2% Mát trong các yÁu tá nguy c¡ là n gßi cá n°ớc ngọt [52]

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß khác nhau á từng vùng địa lý Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu quy mô trong quá khứ nhằm māc đích lập bÁn đß phân bá các loài sán lá gan nhß á ng°ßi tuy nhiên sá liệu trên toàn cầu còn nhiều phức t¿p và khác nhau á các nghiên cứu do nhiều lý do Dựa trên xét nghiệm PCR

đ°ÿc phát triển trong hai thập kỷ gần đây đã phát hiện C sinensis trong

các khu vực l°u hành truyền tháng của O viverrini và O felineus [56] Dữ

liệu ban đầu liên quan đÁn bệnh sán lá gan nhß á mát sá khu vực bị đánh giá thÃp, việc thiÁu hāt các dữ liệu trong quá khứ á mát sá n°ớc nh° Hong Kong, Macau, Việt Nam, Nga đặc biệt là Cáng hòa dân chủ nhân dân Triều Tiên dẫn đÁn sự không chính xác khi °ớc tính tình tr¿ng nhiễm bệnh trong t°¡ng lai Mát sá nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß có thể đang gia tng và má ráng tới nhiều khu vực địa lý ván không phÁi vùng l°u hành truyền tháng Điều này do nhiều nguyên nhân nh°: thói quen n uáng khó thay đái và dân sá ngày càng tng trong các khu vực l°u hành bệnh, gia tng buôn bán quác tÁ các sÁn phẩm nuôi trßng thủy sÁn n°ớc ngọt làm lây lan sán lá gan nhß cũng nh° các loài ký sinh trùng truyền từ đáng vật sang cá khác [57]

1.1.7.2 Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

T¿i Việt Nam, C sinensis nhiễm trên

ng°ßi lần đầu tiên đ°ÿc báo cáo nm 1887 [58] Sau đó, Thành phá Sài Gòn thông báo có 291 ng°ßi nhiễm C sinensis, nh°ng chủ

yÁu những ng°ßi này có ngußn gác từ miền Bắc di c° vào Nam [59] Mãi sau này (nm 1994), ca nhiễm sán O viverrini đầu tiên

mới đ°ÿc phát hiện trên những c° dân á Phú Yên, miền Trung Việt Nam [60] Từ đó đÁn nay, có rÃt nhiều nghiên cứu về tình tr¿ng nhiễm C sinensis và O viverrini trong các

khu vực l°u hành

Hình 1.9 Phân bç cąa sán lá gan nhå t¿i ViÇt Nam [3]

Việt Nam là n°ớc đang phát triển, miền bắc có khí hậu cận nhiệt đới gió mùa với 4 mùa riêng biệt Miền nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa khí hậu nóng và ẩm quanh nm với 2 mùa Hai đới khí hậu khác biệt là điều kiện thuận lÿi cho cho sự xuÃt hiện và phân bá của 2 loài sán lá gan nhß: C

sinensis l°u hành á ít nhÃt 21 tỉnh miền bắc và O viverrini l°u hành á ít nhÃt

11 tỉnh miền trung và khu vực Tây Nguyên, tỷ lệ nhiễm khác nhau tùy địa

điểm [43]

Các tỉnh: Nam Định (n¡i cao nhÃt là 26,0337,5%), Ninh Bình (tỷ lệ nhiễm dao đáng từ 23,5331,0%), Phú Yên, Bình Định đ°ÿc coi là điểm nóng nhiễm sán lá gan nhß, tập quán n gßi cá của nhân dân đã tßn t¿i lâu đßi [3]

Tr°ớc đây, chẩn đoán nhiễm C sinensis và O viverrini chỉ dựa vào xét

nghiệm tìm trứng trong phân có thể đã dẫn đÁn xác định sai á cÃp đá loài Trên thực tÁ rÃt khó phân biệt trứng sán lá gan nhß Opisthorchiidae spp (giữa

C sinensis và O viverrini) và trứng sán lá ruát nhß Heterophyidae spp Tỷ lệ nhiễm H pumilio và H taichui phá biÁn h¡n C sinensis và O viverrini và

chúng th°ßng đßng lây nhiễm á ng°ßi Các cuác khÁo sát t¿i Nam Định và Ninh Bình cho thÃy tỷ lệ nhiễm trứng sán lá gan nhß trong phân lần l°ÿt là 22,7 3 64,9% và 9,4 3 30,9% dân c° Đáng ng¿c nhiên là các mẫu sán lá sau

tẩy đ°ÿc xác định là sán lá ruát, ng°ÿc l¿i tỷ lệ sán xác định là C sinensis l¿i

rÃt thÃp Vì vậy, các báo cáo tr°ớc đây về tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß á Việt Nam có thể đã cao h¡n thực tÁ [3]

Mát báo cáo về 76 tr°ßng hÿp nhiễm C sinensis trên ng°ßi đ°ÿc ghi

nhận t¿i Xã Thuận H¿nh, tỉnh Đắk Nông, miền Trung Việt Nam gần Campuchia Tuy nhiên, tÃt cÁ những ng°ßi bị nhiễm bệnh đều di c° từ các tỉnh Nam Định và Ninh Bình [61]

Ch°a có báo cáo về tình tr¿ng nhiễm O viverrini trên ng°ßi t¿i khu vực miền Nam, mặc dù tìm thÃy Ãu trùng sán lá gan nhß trên cá lóc Channa

striata(Channidae) á An Giang và sán tr°áng thành trên mèo á Tây Ninh [3]

Các nghiên cứu trong 20 nm gần đây đã đi sâu xác định loài bằng hình thái phái hÿp với các ph°¡ng pháp sinh học phân tử đã cho thÃy rõ thành phần loài á các khu vực nhiễm bệnh

Điều tra cắt ngang (2020) của Nguyễn Thị Bích ThÁo t¿i 4 xã l°u hành sán lá gan nhß của Yên Bái và Thanh Hóa cho thÃy tỷ lệ nhiễm C sinensis

khá cao 40,4%, dao đáng từ 26,5% - 53,3% Các yÁu tá nguy c¡ bao gßm: giới tính nam, tiền sử n gßi cá trong vòng 12 tháng, học vÃn thÃp, ch°a điều trị, 19-39 tuái, nhà tiêu không hÿp vệ sinh [31]

Sá liệu điều tra 5 nm gần đây của Viện Sát rét 3 Ký sinh trùng 3 Côn trùng Trung °¡ng cho thÃy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß t¿i Bình Định là 6,8%; QuÁng Trị 8,9%; Đk Lk 4,8%; Phú Yên 15,3%; QuÁng Nam 4,3%; Hòa Bình 24,4%; Nam Định 11,8%; Ninh Bình 21%, Thanh Hóa 21,6%, Yên Bái 23 3 64,7%, S¡n La < 1% [62] Tuy nhiên, còn rÃt nhiều địa ph°¡ng mà ng°ßi dân có thói quen n gßi cá nh°ng ch°a đ°ÿc đánh giá và ch°a có sá liệu về thực tr¿ng nhiễm sán lá gan nhß để có thể tiÁn hành các biện pháp can thiệp và phòng cháng bệnh nh° t¿i vùng lòng hß Thác Bà thuác tỉnh Yên Bái, mát sá huyện của tỉnh Ninh Bình, tỉnh Phú Yên và Bình Định

1.1.7.3 Một số đặc điểm về tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại hai xã của Ninh Bình và Phú Yên

- Mát sá đặc điểm tự nhiên về địa điểm nghiên cứu + Xã Yên Lác, huyện Kim S¡n, tỉnh Ninh Bình:

Táng diện tích tự nhiên: 712,84 ha trong đó đÃt nông nghiệp 533,2 ha Dân sá: 8.709 ng°ßi, trong đó có 4.904 ng°ßi trong đá tuái lao đáng Địa hình xã Yên Lác t°¡ng đái bằng phẳng, có vị trí giao thông thuận lÿi (nằm trên quác lá 10, cách trung tâm huyện 3km) ĐÃt đai mầu mỡ, cÁnh quan thiên nhiên t°¡i đẹp, thuác vùng nhiệt đới gió mùa khí hậu ôn hoà, chÁ đá thủy triều lên xuáng đều đặn thuận lÿi cho cây trßng Có nhiều ao, sông, ngòi là điều kiện thuận lÿi cho phát triển nghề nuôi cá và chn nuôi gia sức gia cầm

+ Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên:

Táng diện tích đÃt tự nhiên khoÁng 1.354,5 ha, táng dân sá 10.710 ng°ßi Mật đá dân sá 789 ng°ßi/km2, đô thị lo¿i V chuyên ngành, tiểu vùng phía Nam của huyện Tuy An Là cửa ngõ, đầu mái phía Đông, nằm t¿i giao đ°ßng DT643 và Quác lá 1, đóng vai trò kÁt nái giao th°¡ng với các đô thị Vân Hòa, Trà Kê Đßng thßi, là đô thị cửa ngõ phía Bắc của thành phá Tuy Hòa Địa hình đa d¿ng: đßng bằng, ven biển và đßi núi, đ°ÿc thiên nhiên °u đãi t¿o nên nhiều cÁnh quan

- Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại địa phương

+ T¿i Ninh Bình:

Nghiên cứu của tác giÁ Đoàn Thúy Hòa t¿i Yên Khánh, Ninh Bình cho

thÃy: Tỷ lệ nhiễm C sinensis là 19,5% Tỷ lệ nhiễm và c°ßng đá nhiễm sán

trung bình á nam cao h¡n á nữ (p< 0,001; OR = 3,994) Ng°ßi n gßi cá có nguy c¡ nhiễm sán cao gÃp 5,8 lần không n gßi cá (p<0,001) Đa sá (87,2%) nhiễm nhẹ, không có ca nhiễm nặng [63]

Nghiên cứu của tác giÁ Hoàng Quang Vinh t¿i xã Gia Thịnh, Ninh Bình (2017) trên 510 ng°ßi (bao gßm cÁ ng° dân và ng°ßi kinh doanh cá) cho

thÃy: tỷ lệ nhiễm C sinensis trung bình là 16,5% (từ 2% đÁn 34,4%) YÁu tá

liên quan bao gßm nam giới, trình đá học vÃn thÃp, tần suÃt tiêu thā cá sáng và n¡i sinh sáng Tỷ lệ nhiễm bệnh á ng°ßi n cá sáng đánh bắt từ sông cao h¡n đáng kể so với những ng°ßi n cá từ ao nuôi (P <0,05) [29]

Điều tra của Đoàn Thúy Hòa (2020) t¿i Kim S¡n và Yên Khánh, Ninh Bình cho thÃy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhß là 20,1% Tỷ lệ nhiễm á nam giới (26,6%) cao h¡n á nữ (8,3%) (p< 0,001) Đa sá (87,2%) nhiễm nhẹ, không có đái t°ÿng nào nhiễm mức đá nặng [63]

+ T¿i Phú Yên:

Nm 2008, Nguyễn Vn Ch°¡ng và công sự nghiên cứu tỷ lệ nhiễm O

viverrini Phú Yên và Bình Định từ 3,92% - 7,67% [64]

Các điều tra từ nm 2015-2018 của Viện Sát rét 3 Ký sinh trùng và Côn

trùng Trung °¡ng cho thÃy O viverrini phân bá á các tỉnh miền Trung và khu

vực Tây Nguyên, trong đó Phú Yên là 15,3%

Gần đây, không có nhiều điều tra về thực tr¿ng nhiễm sán lá gan nhß đ°ÿc thực hiện t¿i Phú Yên Mát sá nghiên cứu tiÁn hành t¿i Bình Định, địa

ph°¡ng tiÁp giáp với Phú Yên và cũng đ°ÿc coi là vùng l°u hành O viverrini

với tỷ lệ nhiễm cao

Đào Thị Hà Thanh và Bùi Vn TuÃn (2015) điều tra t¿i Bình Định trên 254 ng°ßi bằng kỹ thuật Kato-Katz KÁt quÁ cho thÃy: Tỷ lệ hiện mắc là 11,4% (95%CI: 8-16), giới tính nam và việc tiêu thā cá sáng (Carassius auratus) là những yÁu tá nguy c¡ Sán tr°áng thành thu đ°ÿc là O viverrini [65]

KÁt quÁ nghiên cứu định loài bằng PCR và Real-time PCR của tác giÁ

Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) phát hiện sán C sinensis có mặt t¿i Bình Định bên c¿nh sán O viverrini, tỷ lệ nhiễm 2 loài sán lá gan nhß C sinensis là

3,0% và O viverrini là 21,3% Đây đ°ÿc xem nh° lần đầu tiên phát hiện

C sinensis á Nam Trung bá Điều này có thể giÁi thích là do hiện t°ÿng biÁn đáng dân c° với sự giao l°u của hai miền Bắc và Nam, bệnh nhân có thể mang mầm bệnh từ miền Bắc vào miền Nam và ng°ÿc l¿i Điều này thúc đẩy việc tiÁp tāc nghiên cứu xác định sự phân bá các loài sán lá gan nhß á ng°ßi trong tình hình hiện nay, đặc biệt á những vùng ván không phÁi vùng l°u hành truyền tháng của sán lá gan nhß [40]

1.2 Đ¿c điÃm lâm sàng, chÁn đoán và điÁu trá bÇnh sán lá gan nhå trên ng°ãi

Tùy thuác vào thßi gian mắc bệnh và c°ßng đá nhiễm cũng nh° các yÁu tá Ánh h°áng mà các biểu hiện lâm sàng điển hình hay không điển hình

Đa sá tr°ßng hÿp nhiễm bệnh không có triệu chứng lâm sàng hoặc có mát sá triệu chứng nh°: rái lo¿n tiêu hóa, mệt mßi, chán n, gầy sút&

Nm 2009, sán lá gan Clonorchis sinensis đ°ÿc C¡ quan Nghiên cứu

Ung th° Quác tÁ (IARC) thuác Tá chức Y tÁ ThÁ giới xÁp vào lo¿i "gây ung th° cho ng°ßi" (chÃt gây ung th° nhóm I) dựa trên sự liên quan đÁn cn nguyên của ung th° đ°ßng mật [67]

Ca bệnh nghi ngß có các xét nghiệm sau:

- Tìm thÃy trứng sán lá gan nhß trong phân hoặc dịch tá tràng

- Xét nghiệm miễn dịch d°¡ng tính với kháng nguyên hoặc kháng thể của sán lá gan nhß

1.2.2.3 Chẩn đoán phân biệt

- Áp xe gan do các lo¿i ký sinh trùng khác, viêm gan do vi rút, sßi túi mật, viêm đ°ßng mật, viêm tāy, c¡n đau d¿ dày

- Ung th° đ°ßng mật, ung th° gan nguyên phát

1.2.3 Điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người

Praziquantel đ°ÿc xác định có hiệu quÁ điều trị khßi cao tới 90 - 95% và không xÁy ra tình tr¿ng kháng thuác và tái nhiễm [68]

Praziquantel liều 75mg/kg chia 3 lần/ngày, dùng 1 ngày, uáng cách nhau 4 giß sau n Hoặc Praziquantel liều 75mg/kg x 3 lần/ngày, dùng 1 ngày [2]

Mát sá nghiên cứu cho thÃy: Trong điều trị nhiễm C sinensis á ng°ßi

với liều 25mg/lần x 3 lần/ngày x 1 ngày, tỷ lệ khßi là 85% và tỷ lệ giÁm trứng trong phân là 99,7% trong điều trị O viverrini với liều 40mg/kg thì tỷ lệ khßi

là 90% và tỷ lệ giÁm trứng > 99,7%; điều trị O felineus với liều 25mg/lần x 3

lần/ngày x 1 ngày tỷ lệ khßi là 90% và tỷ lệ giÁm trứng là 100% [12]

1.3 Các ph°¢ng pháp xét nghiÇm xác đánh tình tr¿ng nhiÅm sán lá gan nhå trên ng°ãi

Ph°¡ng pháp Kato-Katz đ°ÿc WHO khuyÁn nghị và sử dāng ráng rãi [69] trong các điều tra dịch tễ học lớn, đánh giá hiệu quÁ của thuác, theo dõi và đánh giá can thiệp,&Ph°¡ng pháp này t°¡ng đái dễ thực hiện, có khÁ nng định l°ÿng và xác định c°ßng đá nhiễm [70] Tuy nhiên, kỹ thuật Kato-Katz cũng nh° các ph°¡ng pháp chẩn đoán dựa vào hình thái học th°ßng có đá nh¿y thÃp, dễ bß sót, đặc biệt á những tr°ßng hÿp nhiễm c°ßng đá nhẹ, nằm trong vùng có tỷ lệ l°u hành thÃp [71]

Ph°¡ng pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và cáng sự (1997) hoặc ly tâm lắng cặn formalin3ether cÁi tiÁn là ph°¡ng pháp tập trung trứng giun sán và bào nang đ¡n bào dựa trên nguyên lý ly tâm lắng cặn có đá chính xác cao, ngoài trứng giun sán có thể phát hiện đ°ÿc đ¡n bào thể kén, dễ dàng kiểm tra l¿i các mẫu nghi ngß do phân có thể đ°ÿc bÁo quÁn

trong Formalin 10% Trong các nghiên cứu kỹ thuật Kato-Katz và ether th°ßng đ°ÿc sử dāng để sàng lọc hàng lo¿t trong vùng l°u hành sán, đ°ÿc coi là có đá nh¿y và đá tin cậy t°¡ng đ°¡ng [72] Tuy vậy, t°¡ng tự nh° ph°¡ng pháp Kato-Katz do l°ÿng trứng trong phân ít nên dễ bß sót bệnh nhân, khó áp dāng trong xét nghiệm t¿i thực địa

formalin-Xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sán lá gan nhß: phÁn ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) có đá nh¿y cao, đá đặc hiệu tùy thuác vào từng lo¿i test và còn nhiều tranh luận, có hiện t°ÿng d°¡ng tính kéo dài và d°¡ng tính chéo giữa các loài, khó triển khai t¿i thực địa [73]

Phát hiện trứng sán lá gan nhß trong phân bằng các ph°¡ng pháp sinh học phân tử đã đ°ÿc phát triển từ nhiều nm tr°ớc đây [74] Kỹ thuật PCR sử dāng các gen đích rÃt đa d¿ng nh° gen ty thể, bá đệm phiên mã nái (Internal

Transcribed Spacer - ITS), cytochrome c oxidase 1 (cox1), NADH dehydrogenase 1 (nad1), có đá nh¿y, đá đặc hiệu cao h¡n kỹ thuật xét nghiệm hình thái học và kỹ thuật miễn dịch ngay cÁ khi c°ßng đá nhiễm sán thÃp Tuy nhiên, các kỹ thuật này khó áp dāng t¿i các c¡ sá y tÁ do phÁi đầu t° hệ tháng phòng thí nghiệm hiện đ¿i, đào t¿o nhân lực và chi phí đắt [7], [75] Gần đây có xu h°ớng chuyển sang các ph°¡ng pháp khuÁch đ¿i ADN đẳng nhiệt với °u điểm là đá nh¿y và đá đặc hiệu t°¡ng đ°¡ng kỹ thuật PCR nh°ng lo¿i bß đ°ÿc các b°ớc luân nhiệt nên chỉ cần các thiÁt bị xét nghiệm đ¡n giÁn, nhß gọn, thßi gian xét nghiệm rút ngắn xuáng còn 30 - 60 phút, có khÁ nng phát triển thành các bá kit phân tử cho phép ứng dāng đ°ÿc t¿i thực địa

Trong các điều tra tr°ớc đây, hầu hÁt, chỉ sử dāng ph°¡ng pháp chẩn đoán dựa vào hình thái học; mát sá nghiên cứu ứng dāng sinh học phân tử chỉ dùng để xác định loài là chính, không xác định đ°ÿc chính xác tỷ lệ nhiễm của từng loài sán

1.4 Kā thuÁt LAMP và nghiên cću ch¿ t¿o bß kít LAMP xét nghiÇm phát hiÇn nhiÅm sán lá gan nhå trên ng°ãi

Kỹ thuật LAMP đ°ÿc phát triển vào nm 2000 bái nhóm tác giÁ T Notomi (Nhật BÁn) [76] Đây là mát ph°¡ng pháp khuÁch đ¿i ADN có tính đặc hiệu, hiệu quÁ cao và thßi gian ngắn, bằng cách tận dāng °u điểm khuÁch

đ¿i của enzyme Bst ADN polymerase và 4 mßi đ°ÿc thiÁt kÁ đặc biệt để nhận

diện 6 vùng trình tự cách xa nhau trên ADN đích

Dù mới đ°ÿc phát triển trong gần 20 nm nh°ng LAMP cũng đã đ°ÿc ứng dāng vào nhiều lĩnh vực nh° phát hiện, chẩn đoán các mầm bệnh trên ng°ßi và trong lĩnh vực thú y, công nghiệp thực phẩm, môi tr°ßng

Kỹ thuật LAMP sử dāng 4 - 6 mßi khác nhau đ°ÿc thiÁt kÁ đặc biệt để nhận ra 6-8 vùng riêng biệt trên gen đích và phÁn ứng diễn ra á mát nhiệt đá duy nhÃt LAMP chỉ xÁy ra khi cÁ 4 chußi mßi, bao gßm các mßi F3, B3, FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám đ°ÿc vào các vị trí đích của khuôn, t¿o ra sÁn phẩm ADN-vòng Thành phần phÁn ứng gßm có ADN khuôn, mßi, enzyme Bst DNA polymerase, dung dịch đệm phÁn ứng Quá trình tái bÁn gen đích chỉ diễn ra trong mát b°ớc duy nhÃt th°ßng á 550C - 650C, hiệu quÁ khuÁch đ¿i cao khoÁng 109 - 1010 bÁn sao trong thßi gian từ 15 - 60 phút SÁn phẩm của phÁn ứng có thể quan sát bằng mắt th°ßng do sự kÁt tủa của muái pyrophotphate (Mg2P2O7) d°ới d¿ng vẩn đāc màu trắng hoặc phát quang khi nhuám bằng các chÃt chỉ thị màu (SYBR green, HNB, Xanhmachit&) Do vậy, LAMP th°ßng đ°ÿc sử dāng để t¿o các kit chẩn đoán nhanh [77]

Kỹ thuật LAMP dựa trên nguyên lý táng hÿp ADN thay thÁ chußi tự

xoay vòng đ°ÿc thực hiện bái sự xúc tác của enzyme Bst ADN polymerase và

hai cặp mßi trong và mßi ngoài đ°ÿc thiÁt kÁ đặc biệt à các b°ớc đầu của

phÁn ứng cÁ 4 mßi đ°ÿc sử dāng, nh°ng sau đó chỉ các mßi trong đ°ÿc sử dāng để táng hÿp ADN thay thÁ chußi [76]

Hình 1.10 Các méi thi¿t k¿ và vá trí bắt c¿p trên gen đích [78]

Cặp mßi trong gßm 2 mßi: Mßi xuôi (forward inner primer- FIP) và mßi ng°ÿc (backward inner primer- BIP) và mßi mßi có chứa hai trình tự riêng biệt t°¡ng ứng với trình tự sense và antisense của ADN đích

ThiÁt kÁ mßi có thể thực hiện tự đáng, sử dāng các phần mềm thiÁt kÁ mßi LAMP trực tuyÁn

Thành phần c¡ bÁn của phÁn ứng LAMP bao gßm: Các cặp mßi, dung dịch đệm, enzym Bst ADN polymerase, ADN khuôn, chÃt nhuám màu (nÁu có)

Gßm ba giai đo¿n chính: t¿o vật liệu khái đầu, tái bÁn và kéo dài chußi, cuái cùng là lặp l¿i chu kỳ [76] Để khái đáng phÁn ứng LAMP, hßn hÿp phÁn ứng LAMP đ°ÿc ủ á nhiệt đá đẳng nhiệt trong khoÁng 60-65°C (nhiệt

đá ho¿t đáng của Bst ADN polymerase) trong 1 giß

Hình 1.11 S¢ đé phÁn ćng LAMP å giai đo¿n t¿o vÁt liÇu khåi đ¿u [78]

- Chu kỳ tái bÁn và kéo dài chußi

Để khái đầu cho chu kì phÁn ứng LAMP, FIP bắt cặp bá sung với ADN đầu vòng á vị trí F2c để tiÁn hành táng hÿp m¿ch bá sung thay thÁ Mặt khác, BIP s¿ bá sung vào đầu kia của m¿ch ADN đầu vòng và xÁy ra quá trình táng hÿp ADN t°¡ng tự KÁt quÁ của phÁn ứng t¿o ra hßn hÿp các sÿi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN māc tiêu với kích th°ớc khác nhau

Hình 1.12 Sơ đồ phÁn ứng LAMP giai đo¿n tái bÁn và kéo dài chuỗi [78]

1.4.4 Đánh giá kết quả của LAMP

- Đánh giá kÁt quÁ bằng điện di [79]: KÁt quÁ d°¡ng tính cho v¿ch smear dài

Hình 1.13 Hình Ánh điÇn di sÁn phÁm LAMP [79]

- Đánh giá kÁt quÁ không bằng điện di [79]:

Do l°ÿng sÁn phẩm của phÁn ứng LAMP rÃt lớn nên ta có thể quan sát bằng mắt th°ßng nÁu có mát sá hóa chÃt nhuám thích hÿp:

KÁt quÁ phÁn ứng LAMP đ°ÿc đánh giá thông qua đá đāc của hßn hÿp phÁn ứng mà không cần điện di Khi ADN đích đ°ÿc khuÁch đ¿i bái LAMP, mát chÃt kÁt tủa trắng bắt ngußn từ magnesium pyrophosphate (mát sÁn phẩm phā của phÁn ứng LAMP) s¿ xuÃt hiện Có thể quan sát và so sánh đá đāc với mẫu âm tính (đāc h¡n là d°¡ng tính), hoặc tiÁn hành đo đá hÃp thā á 650nm

Mát ph°¡ng pháp khác là sử dāng các chÃt nhuám màu cho vào mẫu tr°ớc hoặc sau khi ch¿y LAMP Ví dā: bá sung SYBR Green I, ethidium bromide hay Fluorescent sau khi có sÁn phẩm LAMP, bá sung Hydroxyl Napthol Blue (HNB) vào phÁn ứng LAMP tr°ớc khi tiÁn hành nhân bÁn Rßi quan sát d°ới đèn UV KÁt quÁ d°¡ng tính có hiện màu đặc tr°ng hay phát sáng

a Quan sát dưới đèn UV b Quan sát thông thường

Các b°ớc tiÁn hành phÁn ứng LAMP: LÃy mẫu, tách ADN/ARN, khuÁch đ¿i đẳng nhiệt và phát hiện sÁn phẩm

Hình 1.16 Quy trình thăc hiÇn LAMP

(nguồn Eiken Genome site Việt hóa) [78]