Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng.

Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lágannhỏ

Tác nhângâybệnh

Trên thế giới, có ba loài sán lá gan thuộc họ Opisthorchiidae gây bệnh cho người làClonorchis sinensis,Opisthorchis viverrinivàOpisthorchisfelineusvới đặc điểm sinh học, vòng đời và lâm sàng tương đối giống nhau [10] Ở Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan nhỏ làClonorchis sinensisvàOpisthorchis viverrini.

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái của sán lá gan nhỏ trưởngthành

Hình 1.1 Hình thể sán lá gan nhỏ trưởng thành [11]

Hình 1.2 Hình ảnh sán lá gan nhỏ trưởng thành C sinensis nhuộm màu với carmine (Nguồn: cdc.gov.vn)

Sán lágannhỏlàloàisán lálưỡngtính, sántrưởng thànhcóhình phẳng,thon dài, hình láhoặcdẹt, kíchthướcphụ thuộc vàotừng loài.O.viverrinilà loàicóhìnhtháinhỏnhất.C.sinensistrưởng thành kích thướclớnnhất [12] Trênthân sáncócả bộphận sinhdục đựcvà cái.Haitinh hoàn nằm ở phía sau, chianhiều múi (O. viverrinivàO.felineus)hoặc chia nhiều nhánhnhỏ (C. sinensis).Tử cung nhỏ xếp khúc nằm ở giữa thân,hoàngthểhaibên. Ổtrứngh ì n h bầudục, nhỏ,dướiổtrứnglà túi tinh,sautinhhoànlàốngbàitiết[13].

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái trứng sán lá gannhỏ

Trứng sán lá gan nhỏC sinensis,O felineusvàO viverrinirất giống nhau và giống với trứng của các loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae [3] Vì vậy, trong nhiều trường hợp, phân loại dựa vào hình thái gặp nhiều khó khăn và có thể bị nhầm lẫn. Trứng hình bầu dục, dài khoảng 19 - 35μm và rộng khoảng 10 - 20μm Trứng có mộtm và rộng khoảng 10 - 20μm và rộng khoảng 10 - 20μm Trứng có mộtm Trứng có một lớp vỏ mỏng bắt màu vàng nhạt Một đầu trứng có nắp, hai gờ của nắp nổi rõ Đuôi trứng có núm con nhỏ gọi là mấu Các mấu của mỗi loài là khác nhau Bề mặt của vỏ trứng thô và không đều[14].

Hình1.3.Hình thể trứng của cácloàisán lá gann h ỏ

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá gannhỏ

Metacercaria là giai đoạn ấu trùng của sán lá gan được bao bọc trong mô vật chủ (tôm, cá) và truyền sang người và động vật có vú Có kích thước và hình dạng khác nhau tùy theo loài sán lá gan, chẳng hạn như: Metacercaria C sinensis kích thước 0,13-0,14 x 0,09-0,10 mm; Metacercaria O viverrini kích thước 0,19-0,25 x 0,15-0,22mm; Metacercaria O felineus kích thước 0,25-0,30 x 0,19-0,23mm.

Hình1.4.Ấu trùng(Metacercariae) củasán lá gan nhỏ[ 1 7 ]

Vật chủ

Vậtchủchínhcủa sánlágan nhỏ gồmngườivàmộtsốđộng vật cóvúnhưchó,mèo,lợn, chuột (Rattusnorvegicus),mộtsốđộng vậtăn cáhoang dã,có thể cảchim,tuynhiên người đượccoilàvậtchủ dựtrữmầm bệnhquantrọng nhất[12].Tỷ lệnhiễmC.sinensiscaoởđộngvậtcóvúbaogồmchó,mèo (0,8–4,85%)do đókiểm soátlâynhiễm củavậtchủ trongổchứabằng cáchchovậtnuôi ăn thức ănnấuchínhoặc chế biếnđặcbiệtvàcải thiệnviệc quảnlýphâncủa vật nuôicũngđóng vai trò trongphòngchống nhiễm sánởngười[12],[19].

Vật chủ trung gian thứ nhất của sán lá gan nhỏ gồm nhiều loài ốc khác nhau tùy địa điểm nghiên cứu Ở các vùng lưu hành, Ốc nhiễm sán lá gan nhỏ thường được tìm thấy ở các nguồn nước gần làng, trong các hồ nước nông, ruộng lúa và đất ngập nước [20], [21], nơi có mức độ ô nhiễm phân cao [22].

Việt Nam là quốc gia duy nhất lưu hành cảO viverrinivàC sinensis, do đó sự phân bố của ốcP manchouricusở miền bắc vàBithynia spp ở miền Trung - Nam là yếu tố quyết định sự khác biệt về địa lý giữa hai loài sán lá gan nhỏ ở nước ta Cần có nghiên cứu chi tiết hơn về vật chủ trung gian của ốc sên cũng như các vật chủ khác ở các vùng nối giữa các vùng lưu hành bệnh sán lá gannhỏ.

Hình 1.5 Loài ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

(Nguyễn Văn Đề, Đại học Y Hà Nội, 2012)

Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhỏC sinensisgồm nhiều loài cá nước ngọt, chủ yếu là cá họ Cyprinidae (chép) [12] Một nghiên cứu (2020) tại chợ cá tỉnh Yên Bái cho thấy tỷ lệ nhiễmC sinensistrên cá khá cao là 69,7%, cường độ nhiễm là 81,2% metacercariae/cá [23] Ấu trùng sánO.viverriniđược xác định ký sinh trên nhiều loài cá khác nhau, phổ biến nhất là cá diếc (Carassius auratus)với tỷ lệ nhiễm ấu trùng nang là 28,1%, ngoài ra có các loài khác như cá lóc, cá chép,… [24].

Hình1.6.Cá lóc đồng ( C.striata )[ 2 5 ] Hình 1.7 Cá chép ( C carpio ) [26]

Vòng đời của sán lá gannhỏliên quantới hai vậtchủ trung gian nênđặc điểm dịch tễhọccũng liên quantớihaivật chủtrung giannày trong đó vật chủtrung gianthứ nhất (ốc) có vai tròquyếtđịnhđến phânbố của sán do chỉmộts ố í t ố c c ó t h ể n h i ễ m s á n Vaitrò củavậtchủtrung gianthứhai ítquantrọnghơn do rấtnhiều loàicá có thểmangấutrùngsán, tuy nhiên khảnănglây nhiễm vào vậtchủ chínhphụthuộcvào cá.

Đường lây và cơ chế lâytruyềnbệnh

1.1.3.1 Đường lây Ăn gỏi cá hoặc cá chưa nấu chín nhiễm nang ấu trùng sán là nguy cơ số 1 gây nhiễm sán lá gan nhỏ cho người [27], tỷ lệ nhiễm cao ở những cộng đồng có thói quen ăn gỏi cá Tập quán làm nhà vệ sinh trên ao hồ, nuôi cá bằng phân người là những yếu tố góp phần quan trọng lan truyền bệnh Tập quán này gặp ở nhiều nước trên thế giới [12],[19].

Vòng đời sán lá gan nhỏ phức tạp, qua nhiều vật chủ [2]:

(1) Giai đoạn ở người: Sán trường thành ký sinh ở đường mật đẻ trứng, trứng theo mật xuống ruột rồi theo phân phân ra ngoại cảnh Trứng rơi vào môi trường nước tiếp tục pháttriển

(2) Giai đoạn ở ốc: Trứng sán bị ốc nuốt, trong ốc trứng nở thành ấu trùng lông (miracidia), ấu trùng lông phát triển qua hai giai đoạn là nang bào tử (sporocysts), bào tử trùng (rediae), sau đó phát triển thành ấu trùng đuôi (cercariae).

(4) Giai đoạnởcá:Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi, phát triển thành thành ấu trùng nang ký sinh trong cá(metacercariae).

Giai đoạn phát triển trên người hoặc động vật: Khi ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín thì sau khi ăn, ấu trùng này vào trong dạ dày xuống tá tràng rồi ngược theo đường mật lên gan, phát triển thành sán lá gan trưởng thành ký sinh và gây bệnh ở đường mật Thời gian từ khi ăn phải ấu trùng nang trong cá đến khi thành sán trưởng thành từ 26 – 30 ngày.

Trong vòng đời của mình, sán lá gan nhỏ có một ấu trùng nang gây nhiễm có thể tồn tại lâu trong cơ thể người, với trường hợp sống trong cơ thể người lên đến 26 năm Để gây nhiễm cho người hoặc động vật vật chủ khác, sán lá gan nhỏ phải ở giai đoạn nang ấu trùng có khả năng gây nhiễm.

Hình 1.8 Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ C sinensis

Sức cảm thụ vàmiễndịch

Bất kỳ ai cũng có thể mắc bệnh khi bị nhiễm sán lá gan nhỏ Nếu chưa có miễn dịch tự nhiên với loại sán này, sau khi bị nhiễm, người bệnh có thể tái nhiễm khi tiếp xúc với mầm bệnh.

Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏtrênngười

Nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ chủ yếu do ăn gỏi cá hoặc ăn cá nấu chưa chín Theo đó, một số yếu tố liên quan đến nguy cơ mắc bệnh gồm có thói quen ăn uống, sinh hoạt không lành mạnh.

Thói quen ăn gỏi cá là một trong các yếu tố nguy cơ quan trọng ở những người nhiễm sán lá gan nhỏ, điều nay đã được chứng minh ở nhiều nghiên cứu tại Việt Nam và một số nước châu Á khác [29],[30].

Hoàng Quang Vinh (2017): những người ăn gỏi cá trong vòng 5 năm có nguy cơ nhiễm bệnh cao hơn nhiều so với những người không bao giờ ăn gỏi cá (OR = 9,06; 95% CI: 4,36 - 18,83) Những người chưa bao giờ ăn gỏi cá cũng bị nhiễm sán [29].

Nghiên cứu (2020) tại Yên Bái và Thanh Hóa cho thấy những người có tiền sử ăn cá sống trong vòng 12 tháng có nguy cơ nhiễm cao gấp 8 lần so với những người không ăn cá sống Tuy nhiên khoảng 20,7% người nhiễm bệnh nhưng lại trả lời là không ăn cá sống, có thể do họ quên hoặc họ không muốn thừa nhận việc ăn cá sống. Một giả thuyết khác được đặt ra là có thể do ấu trùng nang đã lây nhiễm chéo qua dụng cụ nấu ăn [31].

Một nghiên cứu tại Thái Lan (2021) chỉ ra rằng thói quen và tần suất tiêu thụ cá sống hoặc chưa nấu chín, được gọi là Koi pla (gỏi cá sặc), một món ăn truyền thống phổ biến ở miền Bắc và Đông Bắc Thái Lan, có liên quan đến tỷ lệ nhiễm Opisthorchis viverrini cao hơn so với các vùng khác.

1.1.5.2 Độ tuổi, giới tính, nghềnghiệp

Độ tuổi: Nhiễm sán lá gan nhỏ phổ biến ở mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp hơn ở người lớn, đặc biệt là những người trên 20 tuổi Theo nghiên cứu năm 2021 tại Trung Quốc, tỷ lệ nhiễm ở nhóm 40-49 tuổi cao gấp 33,51 lần so với nhóm 3-9 tuổi, cho thấy thói quen ăn gỏi cá phổ biến ở người lớn tuổi trong khu vực Ở trẻ em, nhiễm sán lá gan nhỏ thường do trẻ ăn cá sống từ bố mẹ.

Giới: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ và cường độ nhiễm ở nam cao hơn nữ [36] Nam giới làm tăng nguy cơ nhiễmC sinensisgấp 6,51 lần so với nữ giới (95% CI: 4,67 - 9,08) Tương tự, tại Việt Nam đa số nghiên cứu đều ghi nhận tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ở nam cao hơn so với nữ Hoàng Quang Vinh (2017) cho thấy nam có nguy cơ nhiễmC sinensiscao gấp 2,33 lần so với nữ (95% CI: 1,37 - 3,61, p

95%[83].

Chế tạo và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đoán sán lágannhỏ

Các bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có ưu điểm là đã được chuẩn hóa, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện đối với các tác nhân gây bệnh, hướng dẫn sử dụng rõ ràng dễ thực hiện nhưng cũng có một số nhược điểm như giá thành cao, thời gian làm thủ tục nhập khẩu lâu nên hạn sử dụng còn lại ngắn, làm cho các phòng thí nghiệm không chủ động được các hoạt động của mình Do đó nhiều phòng thí nghiệm cóxuhướngtự pháttriểncácbộsinhphẩm,đểcóthểchủđộngcôngviệc. Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm LAMP để chẩn đoán tác nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau:

Quy trình tiến hành phản ứng LAMP bao gồm thiết lập nhiệt độ bám mồi thích hợp, xác định nồng độ tối ưu của các thành phần hóa học phản ứng như ion magie (Mg2+), thuốc nhuộm màu và thời gian hoàn tất phản ứng.

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phảnứngLAMP;

So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ sinh phẩm mới với các phương pháp hiện đang được sử dụng và bộ kit chuẩn đã thương mại hóa trên thị trường là một bước quan trọng trong đánh giá hiệu quả của chúng Độ nhạy phản ánh khả năng phát hiện đúng các mẫu dương tính; độ đặc hiệu cho biết khả năng loại trừ các mẫu âm tính; còn ngưỡng phát hiện là nồng độ hoặc lượng mục tiêu tối thiểu có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy bằng kỹ thuật hoặc bộ sinh phẩm Bằng cách so sánh các đặc điểm này với các phương pháp hiện có, chúng ta có thể xác định được ưu nhược điểm của kỹ thuật và bộ sinh phẩm mới, từ đó đưa ra đánh giá tổng thể về hiệu suất của chúng.

- Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp Thông thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng với các thành phần như: Hỗn hợp phản ứng; Mồi phản ứng; Chứng cho phản ứng (chứng âm và chứng dương); Chất nhuộmmàu;

1.4.9.1 Thiết kế mồi cho phản ứngLAMP

Mồi (Primers) có thể được coi là một trong những thành phần quan trọng nhất và là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của sản phẩm LAMP Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của phản ứng LAMP.

Trong thiết kế mồi cho phản ứng LAMP, cần tuân thủ các tiêu chuẩn sau: Độ dài đoạn khuếch đại dưới 250 bp, khoảng cách giữa các mồi phù hợp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mỗi mồi, tỷ lệ %GC từ 40-65%, thiết kế tránh cấu trúc bậc 2 và vị trí gắn không có trình tự cắt của enzyme giới hạn Tuân thủ các tiêu chí này sẽ đảm bảo độ hiệu quả tối ưu của phản ứng.

Cóthểtựthiếtkếmồi bằng cáchtìmcácđoạntrìnhtựđặc hiệu choloàihoặc giống dựa trên cácđoạntrìnhtựtrên ngân hànggenbằngcáchgióng hànghoặcsửdụng cácphần mềm chuyêndụng.Hoặccó thểlựa chọn cáccặpmồidocáctác giảtrướcđãsử dụngvàkiểm tra xác định lại giá trịsửdụngcủacặpmồivớicác mẫulâm sàngtrongđiềukiện thựctếtạiphòngthínghiệmcủa đơn vị.

1.4.9.2 Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứngLAMP

Dung dịch đệm cho LAMP là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng phản ứng LAMP Đệm LAMP thường chứa muối Tris HCl 10mM, KCl 50mM và MgCl21,5mM Ngoài ra, đệm PCR còn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và tween hay formamide.

Trong các thành phần trên, ảnh hưởng lên phản ứng LAMP nhiều nhất là nồng độ

Việc tối ưu hóa nồng độ ion Mg2+ là điều cần thiết để có được phản ứng PCR nhạy và rõ nét Quá trình này được thực hiện bằng cách xem xét các nồng độ khác nhau của ion Mg2+, tìm kiếm nồng độ phù hợp nhất để cải thiện phản ứng và đảm bảo độ chính xác cao trong kết quả kiểm tra.

Ngoài ra các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng LAMP là nồng độ enzyme BstPolymerase; Nhiệt độ, thời gian thực hiện phản ứng và loại và nồng độ chất nhuộm màu.

1.4.9.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹthuật

Xác định ngưỡng phát hiện hay độ nhạy của mồi bằng mẫu chuẩn ADN tái tổ hợp của đối tượng nghiên cứu – đã biết trước trước nồng độ: pha loãng mẫu ADN đã tách chiết theo lũy thừa của 10 thành nhiều nồng độ khác nhau Tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định Nồng độ thấp nhấtmàphương pháp luôn cho kết quả rõ ràng và chính xác được xác định là ngưỡng phát hiện của kỹthuật.

- Xây dựng chuẩn dương, âm của bộ sinhphẩm Chuẩn dương trong các bộ sinh phẩm ADN thường được xây dựng bằng phương pháp ADN tái tổ hợp: Tách chiết ADN của mẫu chuẩn, khuếch đại bằng cặp mồi bao phủ chiều dài của đoạn ADN cần khuếch đại (kích thước đoạn ADN lớn hơn đoạn ADN cần khuếch đại) Tái tổ hợp vào vector phù hợp, đo nồng độ và pha thành dãy chuẩn dương theo cấp số nhân; chuẩn dương thấp nhất thường cao hơn ngưỡng phát hiện 01 bậc (gấp 10 lần ngưỡng phát hiện).

Tiêu chuẩn âm được sử dụng trong kỹ thuật PCR là nước cất Trong chẩn đoán bệnh lý học, để phát hiện các bệnh ở người, thường được thiết kế các bộ mồi có thể phát hiện ra ADN đặc trưng của người làm chứng nội chuẩn, chứng minh thuốc thử đang hoạt động tốt và quá trình tách chiết đã thu được ADN từ vật chủ.

1.4.9.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kitLAMP

Kết quả của các xét nghiệm cận lâm sàng được coi là các bằng chứng xác định cho việc chẩn đoán bệnh Để đánh giá một phương pháp xét nghiệm cũng như một bộ kit trước khi áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng thì các chỉ số về độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định của xét nghiệm và bộ kit được coi là các chỉ số tiên phong, bắt buộc phải có[84].

- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩnđoán

Theo nghiên cứu Nishikawa và cs (2013) [85] đã nêu rõ các định nghĩa: Độ nhạy(Se - sensitivity): Của một xét nghiệm chẩn đoán là tỉ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính. Độ đặc hiệu(Sp - specificity): Của một xét nghiệm chẩn đoán là tỉ lệ người không mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính. Đểxácđịnh Se,Spngườitasosánh kếtquảchẩnđoán củaphươngphápcần xácđịnhvớiphươngphápchuẩn(đượcgọilàchuẩnvàng,goldstandard)[84].

Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lágan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và PhúYên(2018-2020)

Đối tượng, thời gian và địa điểmnghiêncứu

- Đối tượng nghiên cứu: Người dân sống tại xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình và xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnhPhúYên.

+ Người dân từ 18 tuổi trở lên, sống liên tục trên 1 năm tại địa điểm nghiên cứu, tự nguyện tham gia nghiên cứu.

+ Không phân biệt giới tính, dân tộc, trình độ học vấn, nghề nghiệp. + Có khả năng trả lời phỏng vấn.

+ Đồng ý tham gia nghiên cứu và cung cấp mẫu phân.

+ Người bị bệnh tâm thần.

+ Đã uống thuốc tẩy sán trong 6 tháng gần thời gian điều tra.

2.1.1.2 Thời gian, địa điểm nghiêncứu

+ Năm 2018: điều tra, thu mẫu, phỏng vấn KAP 304 người tại Phú Yên và 309 người tại Ninh Bình.

+ Năm 2019: điều tra, thu mẫu, phỏng vấn KAP 156 người tại Phú Yên + Năm 2020: điều tra, thu mẫu, phỏng vấn KAP 150 người tại Ninh Bình

- Địa điểm nghiêncứu+ Thực địa: xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình và xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên.

AN MỸ Hình 2.1 Bản đồ địa điểm nghiên cứutạiNinhB ì n h

Hình 2.2 Bản đồ địa điểm nghiên cứutạiPhúY ê n

+ Khoa sinh học phân tử, Khoa Ký sinh trùng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.

Phương phápnghiên cứu

2.1.2.1.Thiết kế nghiên cứu:Nghiên cứu mô tả có phân tích với các đợt điều tra cắt ngang.

Sử dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả để xác định một tỷ lệ:

Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu tại mỗi xã của mỗi tỉnh.

Z1—α/2α/2: Hệ số tin cậy, ứng với ngưỡng xác suất α = 0,05 (độ tin cậy 95%) thì Z1—α/2α/

2=1,96. p : Tỷ lệ nhiễm ước đoán, theo báo cáo của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương tỷ lệ này là 0,21 (21%) [62]. d: Sai số tuyệt đối cho phép, chúng tôi chọn d = 0,038.

Thay các tham số đầu vào nêu trên, cỡ mẫu tính được theo công thức là 441 bệnh nhân cho mỗi địa điểm nghiên cứu.

Trên thực tế, số đối tượng nghiên cứu ở xã An Mỹ (huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên) là 460 người, ở xã Yên Lộc (huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình) là 459 người Tổng cộng có 919 đối tượng đưa vào nghiêncứu.

ChọnchủđíchxãYênLộc thuộchuyệnKim Sơn, tỉnhNinh Bìnhvà xã An Mỹ thuộchuyệnTuyAn, tỉnhPhú Yênlà hai xã nằm trong vùngsánlá gan nhỏlưuhànhvới tỷ lệnhiễmcao(đượccoi lànhữngxãtrọngđiểm về tình trạngnhiễmsán lágannhỏ),tạiđây cónhiều aohồnuôicá, dân cư có thóiquenăngỏicá, vị trí giaothông thuận tiện,đa dạngsinh thái,thuậntiệncho tácnhângây bệnh và vật chủ.Chọnmẫutheophương phápchọnmẫuchùm(Cluster Sampling) kếthợpvới phương phápchọnmẫuhệ thống(Systematical Sampling) tạimỗichùm,cụ thể:Tạixã nghiêncứuchọnngẫunhiên3cụmdân cư(thôn/xóm).Tạimỗicụmdân cưđượcchọn,lậpdanhsách cá thểđiều tratheophương pháp ngẫu nhiêncó hệthống(hệ số k).Thumẫuphântheo từngcá thể cho đếnkhiđủ cỡmẫunghiêncứu.

- Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ trên đối tượng nghiêncứu:

Cácđốitượng nghiêncứuđược xétnghiệmphân bằng phương pháp Kato- Katz đượcthực hiện ngay tạiđịađiểm nghiêncứu, tìmtrứngvà sántrưởng thành trong phân đượcthực hiện ngay tại địa điểmnghiêncứu, đồng thời cácmẫuphânđượcxét nghiệm bằngphương pháp real-timePCR được thựchiệntạiPhòng Thí nghiệm,Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.

- Xác định một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gannhỏ:

Tất cả các đối tượng tham gia xét nghiệm phân đều được phỏng vấn bằng bộ câu hỏi chuẩn bị trước để đánh giá đánh giá một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gannhỏ.

2.1.2.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiêncứu

- Kỹ thuật phỏng vấn, điều tra KAP: toàn bộ những người tham gia nghiên cứu vừa được xét nghiệm phân đồng thời vừa được phỏng vấn KAP. Các câu hỏi KAP được thiết kế theo yêu cầu nội dung nghiên cứu, câu hỏi dạng đóng và mở đơn giản, dễ hiểu Hỏi trực tiếp theo mẫu phỏng vấn điều tra liên quan bệnh sán lá gan nhỏ ở người theo bộ câu hỏi phỏng vấnKAP.

- Thu thập và bảo quản mẫu theohướng dẫn SOPký hiệu NIMPE.HD 04.PP/31: Quy trình thu thập, bảo quản, vận chuyển mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành trên người của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trungương.

Kỹ thuật Kato-Katz được sử dụng để xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá nhỏ trong phân người Sau khi thu thập mẫu, kỹ thuật này kết hợp các thủ tục chuẩn của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương với phương pháp Kato-Katz do WHO khuyến cáo (1994) để kiểm tra từng loài sán trong phân chỉ sau 12 giờ thu mẫu.

Áp dụng quy trình kỹ thuật theo hướng dẫn SOP ký hiệu NIMPE.HD03.PP/60, sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit để thực hiện quy trình tách chiết ADN từ mẫu phân Mục đích của quá trình này là phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ.

+ Xác định nhiễm sán lá gan nhỏO viverrinitheo Suksumek N và cộng sự [86] gen mồi có trình tự sau:

Probe 5’-FAM-AAT CTG CTG GCG ACT GAA ACA TGA GG –BHQ1-3’ + Xác định nhiễm sán lá gan nhỏC sinensistheo Cai X.Q và cs [87], sử dụng gen mồi có trình tự sau:

Probe CSFQ-5’-FAM- CGCTCCACCGTAGGCAGACAAC-BHQ1-3’ Tổngthểtớchcủa phảnứnglà20àl: nướckhử ion 6àl;2XFastgeneProbe 10àl;

0,8àlmồixuụi vàmồivàmồi ngược; Probe:0,4 àl;DNA:2,0àl. Tổng thời gian thực được đặt như sau: 95°C 05 phút đầu, sau đó thực hiện 45 chu kỳ 15 giây ở 95°C và 40 giây ở 60°C.

- Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ tại địa điểm nghiêncứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ trên đối tượng nghiêncứu + Tỷ lệ nhiễm chung sán lá gan nhỏ ở người dân:

+ Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi, giới, nghề nghiệp, trình độ học vấn: Được đánh giá bằng số trường hợp xét nghiệm dương tính của từng nhóm chia cho tổng số trường hợp xét nghiệm của nhóm tương ứng.

+ Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ là số trứng/gram phân.

+ Cường độ nhiễm trung bình: số trứng trung bình/gram phân.

Bảng 2.1 Phân loại cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ (Maleewong, 1992) [88]

Cường độ nhiễm Số trứng/1 gram phân (EPG)

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ở nhóm đối tượng có liên quan mật thiết đến tiền sử tiếp xúc với nguồn lây nhiễm Những người có thói quen ăn các loại thực phẩm có nguy cơ mang ấu trùng sán lá gan nhỏ ở giai đoạn ấu trùng như rau thủy sinh sống, cá nước ngọt chưa nấu chín hoặc nấu không kỹ sẽ có nguy cơ mắc bệnh cao hơn đáng kể Do đó, tránh tiếp xúc với các nguồn lây là biện pháp phòng ngừa hiệu quả để giảm nguy cơ mắc sán lá gan nhỏ.

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ có mối liên hệ chặt chẽ với thói quen sử dụng phân người hoặc phân gia súc trong canh tác thủy sản và nông nghiệp Ngoài ra, việc sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh và nuôi thú cưng (chó, mèo) cũng là yếu tố ảnh hưởng đến nguy cơ nhiễm bệnh.

TT Tên biến Định nghĩa biến số Phân loại Phương pháp thu thập Biến độc lập

1 Tuổi Là tuổi của người dân tham gia trả lời phỏng vấn ≥18 tuổi Rời rạc Phỏng vấn

2 Giới Giới tính của người dân tham gia trả lời phỏng vấn Nhị phân Phỏng vấn

Công việc hiện tại mang lại thu nhập cao nhất của người dân tham gia trả lời phỏng vấn Định danh Phỏng vấn

Trình độ học vấn của người dân tham gia trả lời phỏng vấn Thứ hạng Phỏng vấn 5

Người dân tham gia phỏng vấn có sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh (tự hoại/2 ngăn) không Nhị phân

6 Hộ gia đình có ao nuôi cá Người dân có ao nuôi cá không Nhị phân Phỏng vấn

TT Tên biến Định nghĩa biến số Phân loại Phương pháp thu thập

Thực hành về sử dụng phân tươi trong canh tác

Người dân có sử dụng phân ủ dưới 6 tháng để canh tác không Nhị phân Phỏng vấn

Thực trạng nuôi vật nuôi trong giađình của ngườidân

Người dân có nuôi chó, mèo không Nhị phân Phỏng vấn

9 Tiền sử ăn gỏi cá (cá sống)

Biến số mô tả thực trạng người dân tham gia phỏng vấn đã từng ăn gỏi cá (cá sống)

10 Tần suất ăn cá sống

Biến số mô tả mức độ thường xuyên ăn gỏi cá (cá sống) của người dân tham gia phỏng vấn

11 Lý do ăn gỏi cá

Biến số mô tả nguyên nhân người dân tham gia phỏng vấn lựa chọn ăn gỏi cá (cá sống) Định danh Phỏng vấn

Nguồn gốccásử dụng đểăn gỏi (cásống)

Biến số mô tả nguồn gốc cá lấy để ăn gỏi cá (cá sống) Định danh Phỏng vấn

13 Ca nhiễm sán lá gan nhỏ

Người dân tham gia nghiên cứu được xác định nhiễm sán lá gan nhỏ bằng kỹ thuật realtime-PCR

Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ

Mật độ trứng sán lá gan nhỏ trong 1gram phân của mẫu phân người dân được xét nghiệm dương tính xác định bằng kỹ thuật Kato-Katz

2.1.2.8 Phương pháp thống kê và xử lý sốliệu:

+ Xử lý thống kê bằng phương pháp y sinh học.

+ Sử dụng phần mềm SPSS 22.0 tính toán các giá trị số trung bình, tỷ lệ, tỷ suất chênh (OR), khoảng tin cậy 95% (95% CI).

Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễmClonorchis sinensis,Opisthorchis viverrinitrên người ở quymôphòngthí nghiệm

Đối tượng, thời gian và địa điểmnghiêncứu

+ Sán lá gan nhỏO viverrini, sán lá gan nhỏC.sinensis.

+ Con trưởng thành hoặc ấu trùng thuộc một số loài sán, giun khác thu thập từ người hoặc động vật gồm:H taichui;H pumilo(Sán lá ruột nhỏ);F.gigatica(Sán lá gan lớn);P heterotremus(Sán lá phổi);T solium(Sán dây lợn);An duodenale(giun móc);As lumbricoides(Giunđũa).

+Mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ:

 Con sán lá gan nhỏ trưởng thành loàiO viverrinivàC sinensisđược tẩy đãi từ bệnh nhân xét nghiệm có trứng trong phân bằng kỹ thuật Kato-Katz, được định loài hình thái và thẩm định lại loài bằng kỹ thuật real-timePCR.

Mẫu được coi là phân dương tính với sán lá gan nhỏ khi thực hiện xét nghiệm Kato-Katz phát hiện trứng sán lá gan nhỏ và qua xét nghiệm thẩm định lại bằng kỹ thuật real-time PCR vẫn cho kết quả dương tính.

+Mẫu âm tính và mẫu sử dụng để thử nghiệm để đánh giá khả năng lai chéo của bộ kít.

 Mẫu phân âm tính với sán lá gan nhỏ khi xét nghiệm bằng Kato-Katz không phát hiện có trứng sán lá gan nhỏ và được thẩm định lại bằng xét nghiệm real-time PCR cho kết quả âmtính.

 Mẫu sử dụng để đánh giá khả năng lai chéo của bộ kít: Ấu trùng hoặc con trưởng thành của một số ký sinh trùng đường ruột khác:H taichui(Sán lá ruột nhỏ);H pumilo(Sán lá ruột nhỏ);F gigatica(Sán lá gan lớn);P.heterotremus(Sán lá phổi);T solium(Sán dây lợn);An duodenale(giun móc);As lumbricoides(Giun đũa) đã được khẳng định loài, do Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương cungcấp.

+ Mẫu chứng trắng: Nước cất khử ion.

+ Mẫu chuẩn dương: ADN tái tổ hợp mang đoạn gen đích đặc hiệu với sán lá gan nhỏ có nồng độ xác định.

- Tiêu chuẩn loại trừ: Các mẫu bệnh phẩm không bảo đảm yêu cầu về kỹ thuật trong giữ gìn, bảoquản

2.2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiêncứu

+ Năm 2018 - 2019: Nghiên cứu chế tạo kit LAMP + Năm 2019: Đánh giá kit LAMP trên 156 mẫu tại xã An Mỹ (PhúYên); +Năm2020:ĐánhgiákitLAMPtrên159mẫutạixãYênLộc(NinhBình).

+ Tháng 8/2020: Kiểm định sản phẩm bộ kit tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc- xin và sinh phẩm y tế, Bộ Ytế.

- Địa điểm nghiêncứu + Thực địa: xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình và xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên.

+ Khoa sinh học phân tử, Khoa Ký sinh trùng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.

+ Kiểm định kit LAMP tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc-xin và sinh phẩm y tế,

- Thiết kế bộ mồi LAMP xác định sán lá gannhỏ.

- Kiểm nghiệm độ chính xác và khả năng hoạt động của bộ mồi thiếtkế

Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng

LAMP: Nhiệt độ, nồng độ MgSO4, thời gian phản ứng, chỉ thị màu.

Tạo chứng chuẩn dương plasmid tái tổ hợp mang gen của các tác nhân đích sán lá gan nhỏ(sản phẩm đề tàinghiên cứu khoa học cấp quốc gia).

- Đánh giá bộ kít tại thựcđịa.

- So sánh bộ kít với bộ mồi có mục đích tươngtự

- Đánh giá ngoại kiểm kítLAMP Đóng gói thành phẩm bộ kítXây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định kit

Phương phápnghiên cứu

2.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:Thực nghiệm trong Phòng Thí nghiệm và trên thựcđịa.

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chế tạo các bộ kít LAMP như hình 2.3

- Xác định ngưỡng phát hiện của bộkít

- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộkít

- Xác định điều kiện bảo quản, tính ổn định củakit

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoánsán lá gan nhỏ

- Mẫu sử dụng nghiên cứu chế tạo bộ kítLAMP:

Lấy mẫu đại diện 3 mẫu từ mỗi loại Opisthorchis viverrini và Clonorchis sinensis trưởng thành tẩy từ người bệnh sau xét nghiệm Kato-Katz phát hiện có trứng sán lá gan nhỏ trong phân Các con trưởng thành được định danh hình thái và thẩm định bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược theo thời gian thực (real-time PCR).

03 mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ loàiO. viverrinivà 03 mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ loàiC sinensiscủa những bệnh nhân tẩy được sán lá gan nhỏ trưởng thành Các mẫu trong nghiên cứu này đều được thu thập tại 2 xã của Ninh Bình và Phú Yên.

+ Mẫu sử dụng để kiểm tra sự dương tính chéo của bộ kít: Mỗi loài chọn

01 mẫu sán lá trưởng thành hoặc ấu trùng gồm: sán lá ruột nhỏH. taichui,H.pumilo,sán lá gan lớnF gigatica, sán lá phổiP heterotremus, sán dây lợnT.solium, giun mócAn duodenale, giun đũaAs lumbricoides.

- Mẫu dùng so sánh độ nhạy độ đặc hiệu của bộkít:

Các mẫu phân dương tính và âm tính thu thập từ người dân được xét nghiệm bằng kỹ thuật Kato-Katz và được thẩm định kết quả xác định loài bằng kỹ thuật real- timePCR.

Cỡ mẫu trong nghiên cứu độ nhạy, độ đặc hiệu: Chúng tôi sử dụng các công thức sau:

Cỡ mẫu để xác đinh độ nhạy (nse): z 2 1−α/2α/2 Pse (1−α/2 Pse) nse W 2 P = 72,9

Cỡ mẫu để xác định độ đặc hiệu (nsp): z 2 1−α/2α/2 Pse (1−α/2 Pse) nsp= W 2 ( 1 −α/2 P ) $,3 Trong đó: z1-α/2: Hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95% thì z1-α/2=1,96 Ước tính tỷ lệ dương tính với sán lá gan nhỏlà (P):

25%Độ nhạy mong đợi của kítLAMP (Pse): 95% Độ đặc hiệu mong đợi của kítLAMP(Psp):

95%Sai số tuyệt đối cho phép của độ nhạy và độ đặc hiệu (W):10%

Thay số vào công thức tính được cỡ mẫu tối thiểu cho xác định độ nhạy là 72,9 và độ đặc hiệu là 24,3.

Thựctế, chúngtôiđã tiếnhành đánhgiá trêntổngsố100mẫu:73mẫuphân dươngtínhvới sánlá gannhỏvà 27mẫu phânâm tínhvới sánlá gan nhỏ.

- Cỡ mẫu để đánh giá tính ổn định của bộ kít: 06 mẫu trong đó có 01 mẫu chứng âm (nước khử ion), 01 mẫu chứng chuẩn dương ở nồng độ được sử dụng làm ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP, 01 mẫu ADN tách từ con sán lá gan nhỏ trưởng thành, 01 mẫu ADN tách từ mẫu phân dương tính với sán lá gan nhỏ và 02 mẫu tách từ mẫu phân âmtính.

2.2.2.3 Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiêncứu

- Thu thậpvàbảoquảnmẫutheo hướngdẫnSOPkýhiệuNIMPE.HD 04.PP/31:Quy trình thu thập,bảoquản, vậnchuyển mẫuphân,mẫuSánlágan nhỏtrưởng thành trênngười.

- Xử lý mẫu và tách chiếtADN:

+ Tách chiết ADN từ mẫu phân theohướngdẫnSOPký hiệu NIMPE.HD 03.PP/60: Quy trình kỹ thuật tách chiết ADN tổng số từ mẫu phân bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ.

Quy trình kỹ thuật tách chiết ADN tổng số từ mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành bằng Chelex-100 được hướng dẫn chi tiết trong SOP ký hiệu NIMPE.HD 03.PP/61 Quy trình này giúp tách chiết ADN hiệu quả từ mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành, tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo về sinh học phân tử và di truyền học của loài ký sinh trùng này.

- Thiết kế mồi sử dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như Bioedit V.7.2.6.1,Primer Explorerv.5,Primer Blast…đểtìmcác vùng bảo tồntrêncácvùng gene mục tiêu, thiếtkếmồi,kiểmtracác đặc tính củacácmồiđãthiếtkế, hướngdẫn SOPkýhiệu NIMPE.HD 03.PP/37“Quy trình thiếtkế, đánhgiávàlựa chọnbộ mồi sửdụng cho kít LAMP chẩn đoán sánlágannhỏ”.

- Xét nghiệm phân để soi đếm trứng sán lá gan nhỏ bằng phương pháp Kato-Katz theohướngdẫnSOPký hiệu NIMPE.HD 04.PP/05: Quy trình xét nghiệm phân bằng kỹ thuậtKato-Katz.

- Kỹ thuật real-time PCR xác định sán lá gan nhỏO viverrinitheoSuksumek N và cs 2008 [86] Kỹ thuật real-time PCR xác định nhiễm sán lá gan nhỏC sinensistheo Cai X.Q và cs 2012[87].

- Phương pháp tạo dòng: Trình tự ADN đích cần tạo dòng được chuyển vào plasmid tạo dòng Plasmid tái tổ hợp mang đoạn trình tự đích sau đó được biến nạp vàoE coliDH5α,hướngdẫnSOPký hiệu NIMPE.HD 03.PP/68: “Quy trình tạo chứng dương cho bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ trên người bằng công nghệ ADN tái tổhợp”.

- Kỹ thuật giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI3500.

- Hóa chất sử dụng trong thu thập mẫu

Lọ đựng mẫu phân, bộ Kato-Katz xét nghiệm phân, ống Eppendorf 1,5 ml, ống 2 ml có nắp xoáy, găng tay Y tế

- Hóa chất sử dụng trong táchADN Chelex-100 resin, QIAamp DNA Stool mini Kit, Ethanol tuyệt đối, Proteinase K, PBS buffer, Đệm điện di TBE 10X, Red safe, Ladder 100bp, nước khử ion, agarose2,0%.

- Hóa chất sử dụng trong tạo chứng dương chuẩn bằng công nghệ ADN tái tổ hợp cho các bộ kítLAMP

Materials utilized in this study included primers, QIAquick gel extraction kit for PCR product purification, TOPO® TA cloning kit with pCRII™ - TOPO® vector, One Shot® DH5α™- T1R, PureLink® Quick Plasmid Miniprep Kit for plasmid purification, 50 bp, 100 bp 1 mL, and 1 Kb ladders, BSA standard, DMSO, Anode Buffer Container (ABC) 3500 Series, Cathode Buffer Container (CBC) 3500 Series, POP-7 Polymer 3500, BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, and Hi-Di Formamide.

- Hóa chất sử dụng trong thiết kế mồi, đánh giá tính đặc hiệu và khả năng hoạt độngmồi

Mồi (Primer); Bst DNA Polymerase; Nucleotit tự do (dNTPs mix 10mM), đệm điện di TBE 10X, Red safe, Ladder 100bp, nước khử ion, agarose 2,0%.

- Hóa chất sử dụng để khảo sát tối ưu các điều kiện của phảnứngLAMPMồi( P r i m e r ) ; B s t DNAP o l y m e r a s e ; N u c l e o t i t t ự d o ( d

N T P s m i x 10mM),Betaine,Xanhmalachite,HydroxylNaptholBlue,đệm điệndiTBE 10X, Red safe, Ladder 100bp, nước khử ion, agarose 2,0%.

- Hóa chất sử dụng để chế tạo bộ kítLAMP Mồi (Primer); Bst DNA Polymerase; Nucleotit tự do (dNTPs mix 10mM), Betaine, Xanh malachite, Hydroxyl Napthol Blue, đệm điện di TBE 10X, Red safe, Ladder 100bp, nước khử ion, agarose 2,0%.

- Hóa chất sử dụng đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của các bộ kítLAMP

Đạo đức trongnghiêncứu

Đề cương nghiên cứu đã được thông qua Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (Quyết định số 87/QĐ- VSR ngày 09/01/2017).

Nghiên cứu đã thực hiện nghiêm túc các quy định về đạo đức.

Số liệu, thông tin được đảm bảo tính bí mật, chỉ nhằm mục đích duy nhất phục vụ cho nghiên cứu.

Ngườidânđược thôngbáotrướcvàgiải thíchvềmụcđích,yêu cầu củacuộc điều tra. Ngườitham giatựnguyệnđồngý và tựrút lui khikhông muốnthamgia Những ngườidântừchối không hợptácsẽkhông đưavàonghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu, ý kiến đề xuất được sử dụng vào mục đích phục vụ sức khỏe của người dân, ngoài ra không phục vụ mục đích nào khác.

-Tấtcả những người có kết quảdương tínhvới kýsinh trùng được hướngdẫnđiều trịtại cơ sở y tế địaphương theophác đồ quy địnhcủaBộ Y tế.

Thực trạngvàmộtsốyếutốliên quannhiễm sánlágan nhỏtrên ngườitạihaixãtrọngđiểmthuộctỉnhNinh BìnhvàPhú Yên(2018-2020)

Đặc điểm của đối tượngnghiêncứu

Bảng 3.1 Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng nghiên cứu (n9)

Khác (đi học, buôn bán, tự do…) 99 21,6 86 18,7 185 20,1

Tỷ lệ người dân tham gia nghiên cứu dưới 29 tuổi và trên 60 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất (~12%), nhóm tuổi 30 – 49 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (45,9%) Nữ giới chiếm 55% Người dân tham gia nghiên cứu chủ yếu là nông dân (66,7%), phần lớn có trình độ ở bậc THCS (36,1%) và THPT (31,2%).

Bảng 3.2 Đặc điểm gia đình của đối tượng nghiên cứu (n 9) Phân loại

Ninh Bình (459) Phú Yên (460) Tổng (919) Số lượng

Sử dụng hố xí hợp vệ sinh 363 79,08 361 78,5 724 78,78

Sử dụng phân tươi canh tác 96 20,9 85 18,5 181 19,7

Có 78,78% đối tượng sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh 19,7% người dân sử dụng phân tươi để trồng trọt, chăn nuôi Phần lớn người dân trong gia đình có nuôi chó mèo(59,6%) Chỉ có 39,28% gia đình có ao nuôi cá.

Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại địađiểmnghiêncứu

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người (n 9) KTXN

Nhiễm sán lá gan nhỏ p-value (1-2)

XN Kato-Katz (1) XN real-time PCR (2)

Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) xã Yên Lộc (459)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết quả xác định nhiễm sán lá gan nhỏ bằng real time PCR để phân tích yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ.

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ chung trên người khi xét nghiệm bằng xét nghiệm bằng real-time PCR là 19,80% (tỷ lệ nhiễmC sinensistại xã Yên Lộc

(Ninh Bình): 19,39%; tỷ lệ nhiễmO viverrinitại xã An Mỹ (Phú Yên): 20,22%); khi xét nghiệm bằng kỹ thuật Kato-Katz là 16,10% (xã Yên Lộc (Ninh Bình): 16,33%; xã

Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người bằng kỹ thuật real time PCR cao hơn có ý nghĩa thống kê so với kỹ thuật xét nghiệm Kato- Katz ở các địa điểm nghiên cứu(p 0,05).

TạixãAn Mỹ(Phú Yên),tỷ lệngười nhiễmsánlágannhỏ tăngdầntheonhómtuổi.Nhóm đốitượng trên60tuổi cótỷ lệnhiễm sánlágan nhỏcao nhất(33,3%),tiếpđếnnhóm50- 59tuổi(23,4%),nhóm tuổitừ18-29cótỷ lệthấpnhất(11,1%).Khácbiệt củacácnhóm tuổicó ýnghĩa thốngkêvớip 0,05).

Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn (n 9)

Xã (Tỉnh) Nghề nghiệp Số xét nghiệm

Nhiễm sán lá gan nhỏ p-value

Người có trình độ học vấn càng thấp thì tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ càng cao, tỷ lệ nhiễm cao nhất ở những người có học vấn ở bậc tiểu học (23,7%) Tuy nhiên sự khác biệt giữa các nhóm trình độ học vấn khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Bảng 3.8 Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ tại điểm nghiên cứu (n 8)

Yên Lộc (Ninh Bình) An Mỹ (Phú Yên) Tổng 2 xã

SL(%) CĐN trung bình (EPG) SL(%) CĐN trung bình (EPG) SL(%) CĐN trung bình (EPG)

Nhiễm cường độ nhẹ chiếm 89,9%, nhiễm cường độ trung bình chiếm 10,1%, không có trường hợp nhiễm cường độ nặng Kết quả tương tự tại 2 xã của Ninh Bình và Phú Yên lần lượt là 92% và 87,7% nhiễm cường độ nhẹ, 8,0% và 10,1% nhiễm cường độ trung bình.

Cường độ nhiễm chung tại 2 xã là 395,5±126,8 EPG.

Tại xã Yên Lộc (Ninh Bình), số lượng trứng/gam phân là 241,9±109,0 EPG.

Tại xã An Mỹ (Phú Yên), số lượng trứng/gam phân là 553,3±226,8 EPG.

Bảng 3.9 Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi (n 8)

Xã (Tỉnh) Tuổi Số lượng CĐN trung bình

Tại xã Yên Lộc (Ninh Bình): Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ cao nhất ở nhóm 30-49 tuổi (308,5 ± 182,6 EPG), sự khác biệt giữa các nhóm tuổi không có ý nghĩa thống kê.

Tại xã An Mỹ (Phú Yên): Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ cao nhất ở nhóm 18-

29 tuổi (1.000,6 ± 1.131,4 EPG), sự khác biệt giữa các nhóm tuổi không có ý nghĩa thống kê.

Bảng 3.10 Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới tính (n 8)

Xã (Tỉnh) Giới Số lượng CĐN trung bình(EPG) p-value

Cườngđộnhiễmsán lágannhỏở nam (426,6 ± 139,3EPG)cao hơn ở nữ (336,5 ± 256,9EPG)có ý nghĩathốngkê(p