Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ và phát triển kit LAMP chẩn đoán tại cộng đồng
MỤC LỤC
Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người
Tùy thuộc vào thời gian mắc bệnh và cường độ nhiễm cũng như các yếu tố ảnh hưởng mà các biểu hiện lâm sàng điển hình hay không điển hình. Năm 2009, sán lá ganClonorchis sinensisđược Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) thuộc Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại "gây ung thư cho người".
Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trênngười
Xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sánlágannhỏ: phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) có độnhạycao, độ đặc hiệu tùy thuộc vàotừng loại testvàcòn nhiều tranh luận,có hiệntượng dương tính kéodài vàdương tínhchéo giữa các loài,khótriển khaitạithựcđịa[73]. Gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thựcđịa.
Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ trênngười
Các bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có ưu điểm là đã được chuẩn hóa, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện đối với các tác nhân gây bệnh, hướng dẫn sử dụng rừ ràng dễ thực hiện nhưng cũng cú một số nhược điểm như giá thành cao, thời gian làm thủ tục nhập khẩu lâu nên hạn sử dụng còn lại ngắn, làm cho các phòng thí nghiệm không chủ động được các hoạt động của mình. Để đánh giá tính ổn định của bộ kit cần tiến hành bảo quản bộ kit trong các điều kiện khác nhau và hàng tháng tiến hành thực hiện xét nghiệm trên các mẫu chuẩnmàmẫu lâm sàng cố định đã được bảo quản trong các điều kiện tối ưu đảm bảo không thay đổi bản chất của mẫu; đánh giá tối thiểu 6 tháng và càng lâu càng tốt, hoạt động đánh giá được dừng lại khi kết quả đánh giá 2 lần liên tiếp không đảm bảo tính ổnđịnh.
![Hình 1.10. Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích [78]](https://media.store123doc.com/figures/003/533/hinh-moi-thiet-ke-vi-bat-cap-dich-3533751.webp)
Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng vàmộtsố yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú
Cácđốitượng nghiêncứuđược xétnghiệmphân bằng phương pháp Kato- Katz đượcthực hiện ngay tạiđịađiểm nghiêncứu, tìmtrứngvà sántrưởng thành trong phân đượcthực hiện ngay tại địa điểmnghiêncứu, đồng thời cácmẫuphânđượcxét nghiệm bằngphương pháp real-timePCR được thựchiệntạiPhòng Thí nghiệm,Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. - Thu thập và bảo quản mẫu theohướng dẫn SOPký hiệu NIMPE.HD 04.PP/31: Quy trình thu thập, bảo quản, vận chuyển mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành trên người của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trungương.
Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễmClonorchis sinensis,Opisthorchis viverrinitrên người ở quymôphòng thínghiệm
- Cỡ mẫu để đánh giá tính ổn định của bộ kít: 06 mẫu trong đó có 01 mẫu chứng âm (nước khử ion), 01 mẫu chứng chuẩn dương ở nồng độ được sử dụng làm ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP, 01 mẫu ADN tách từ con sán lá gan nhỏ trưởng thành, 01 mẫu ADN tách từ mẫu phân dương tính với sán lá gan nhỏ và 02 mẫu tách từ mẫu phân âmtính. - Thiết kế mồi sử dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như Bioedit V.7.2.6.1,Primer Explorerv.5,Primer Blast…đểtìmcác vùng bảo tồntrêncácvùng gene mục tiêu, thiếtkếmồi,kiểmtracác đặc tính củacácmồiđãthiếtkế, hướngdẫn SOPkýhiệu NIMPE.HD 03.PP/37“Quy trình thiếtkế, đánhgiávàlựa chọnbộ mồi sửdụng cho kít LAMP chẩn đoán sánlágannhỏ”.
Đạo đức trong nghiêncứu
- Kiểm soát quá trình phỏng vấn đối tượng nghiên cứu và quy trình xét nghiệm phân theo phương pháp Kato-Katz theo hướng dẫn của WHO (1994), kỹ thuật real time real-timePCR. - Mã hóa số liệu: lô thử nghiệm, đợt thử nghiệm, ngày thử nghiệm, người thửnghiệm.
BÀN LUẬN
Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ởngười 1. Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏ
Một nghiên cứu khác cùng địa điểm của tác giả Đoàn Thúy Hòa tại Yên Khánh và Kim Sơn, Ninh Bình cho thấy phân tích trên hai nhóm trình độ học vấn, từ trung học cơ sở trở xuống và trung học phổ thông trở lên thấy tỷ lệ nhiễm sán khác nhau chưa có ý nghĩa thống kê [63]. Điều này cho thấy các hành vi không an toàn không chỉ do yếu tố thiếu kiến thức, thái độmàcòn do các yếu tố khác trong môi trường sống, đặc biệt trong bối cảnh thói quen ăn cá sống phản ánh văn hóa và quyết định một phần lớn đến thái độ của người dân địa phương[94]. Kết quả này của chúng tôi phù hợp với Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) tại Bắc Giang và Bình Định: những người có thói quen sử dụng phân ủ dưới 6 tháng trong nông nghiệp có nguy cơ bị nhiễm sán lá nhỏ cao hơn 2,6 lần so với những người sử dụng phân ủ trên 6 tháng [40].
Một nghiên cứu khác của tác giả Lương Phương Lan (2016) tại thị trấn Rạng Đông, Nghĩa Hưng, Nam Định, những người có dùng phân tươi của người hoặc gia súc để bón ruộng, nuôi cá có nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ cao gấp 6,5 lần so với những người không dùng[89]. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tình trạng ăn gỏicá Tương tự như các trường hợp nhiễm sán lá gan khác,đasố các nghiên cứu về hành vi, thói quen, tập quán nuôi cá, ăn rau sống (thủy sinh) trên thế giới và Việt Nam đều thống nhất, yếu tố chính làm lây nhiễm sán lá gan nhỏ là thói quen ăn cá sống hoặc cá chưa nấu chín của người dân [95]. Một nghiên cứu khác tại Gia Viễn, Ninh Bình cho thấy chưa có sự khác biệt giữa tỷ lệ nhiễm sán ở người ăn cá sống đánh bắt từ ao của họ hay mua ở chợ nhưng tỷ lệ nhiễm sán ở người ăn cá sống đánh bắt ở sông cao hơn rất nhiều so với người ăn cá sống đánh bắt từ ao nuôi (p<0,05) [29].
Chếtạokit
Một số nghiên cứu khác như Chen và cs phát triển kỹ thuật LAMP phát hiệnParagonimus westermanilựa chọn thời gian phản ứng của LAMP ngắn hơn là 45 phút [117] hoặc nghiên cứu của Ai và cs phát triển kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan lớn Fasciola với thời gian ủ phản ứng là 45 phút[118]. Đối với lượng ADN khuôn đưa vào phản ứng, theo một số tác giảkhităng lượng ADN tổng số ban đầu với các mẫu lâm sàng có thể làm tăng độ nhạy, đặc biệt là ở những mẫu có nồng độ ADN đích thấp, tuy nhiên điều này phụ thuộc nhiều vào lượng tế bào ban đầu sử dụng cho tách chiết, cũng như phương pháp tách chiết và lượng dung dịch hòa tan ADN cho vào khi tách chiết. Trong nghiên cứu này, lượng ADN tổng số được tách từ các tế bào trứng sán có trong mẫu phân thường có cường độ thấp, với quy trình tách ADN bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA mini stool kit, lượng buffer hòa tan ADN cố định, việc khảo sát đánh giá lượng ADN khuôn ban đầu đưa vào thử nghiệm để lựa chọn ra thể tích phù hợp được tiến hành với lượng ADN khuôn ban đầu đưa vào từ 2-5 àl.
Kết quả khảo sỏt cho thấy 4 nồng độ ADN tổng số ban đầu đưa vào khảo sỏt đều cho cỏc band diện di rừ nột và hiệu suất tổng hợp khụng cú nhiều khỏc biệt, việc tăng lượng thể tích dung dịch tách chiết ADN tổng số ban đầu vào phản ứng cũng không thấy có sự ức chế phản ứng LAMP (Hình 4-Phụ lục 7). Gần đây, chất chỉ thị màu được sử dụng thêm vào phản ứng LAMP là các chỉ thị nhạy với pH như là hydroxyl napthol Blue (HNB) [124], xanh malachite [125] cho thấy hiệu quả khi các chất chỉ thị này được bổ sung vào đệm LAMP trước khi tiến hành phản ứng không ảnh hưởng đến hoạt động của Bst DNA polymerase, đồng thời loại bỏ nguy cơ tạp nhiễm giữa các mẫu. So với các kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ tại xã Yên Lộc, Kim Sơn, Ninh Bình năm 2020 cho thấy nhiễm sán lá gan nhỏ đã giảm rất nhiều so với thời điểm 2018 trong điều tra của chúng tôi và cũng như kết quả điều tra của một số tác giả khác giai đoạn 2016-2017, [29] điều này có thể do hiệu quả của các biện pháp can thiệp xét nghiệm liên tục và điều trị được thực hiện bởi rất nhiều chương trình, dự án tăng cường phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ tại khu vực, đồng thời cũng có thể do sự thay đổi tập quán ăn gỏi cá của người dân địa phương khi được tuyên truyền nâng cao nhận thức về bệnh sán lá gannhỏ.
Tình hình tiếp xúc với nguồn lây nhiễm
Các trình tự gennad1trên ngân hàng gen NCBI sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏO. No Chủng/Nguốc gốc Mã số trên ngân hàng gen 1 Opthorchis viverrini, Việt Nam MF287778.1. Các trình tự genNad1trên ngân hàng gen sử dụng cho thiết kế bộ mồi LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏC.
Kết quả so sánh độ tương đồng giữa sản phẩm PCRF3-B3với trình tự gen ty thể của sánlágan nhỏ trên ngân hàngg e n. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện thứ cấp của bộ kítLAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏO.viverrini. Kết quả khảo sát ngưỡng phát hiện thứ cấp của bộ kítLAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏC.sinensis.
