ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG VIỆC NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI GIÀ LÙN (MUSA CAVENDISH SP) TẠO GIỐNG CHUỐI GIÀ LÙN SẠCH BỆNH

Kỹ Thuật - Công Nghệ - Công Nghệ Thông Tin, it, phầm mềm, website, web, mobile app, trí tuệ nhân tạo, blockchain, AI, machine learning - Công nghệ thông tin TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA – SINH ---------- LÊ THỊ KHÁNH LY ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG VIỆC NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CHUỐI GIÀ LÙN (MUSA CAVENDISH SP) TẠO GIỐNG CHUỐI GIÀ LÙN SẠCH BỆNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 4 năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng ai công bố trong bất kì công trình nào khác Tam Kỳ, ngày 15 tháng 4 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Khánh Ly LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp, dưới sự hướng dẫn tận tình của giáo viên hướng dẫn và được phía nhà trường tạo điều kiện thuận lợi, em đã có một quá trình nghiên cứu, tìm hiểu và học tập nghiêm túc để hoàn thành đề tài. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn ThS. Hồ Thị Kim Cúc giảng viên Khoa Lí - Hóa - Sinh, Trường Đại học Quảng Nam, cùng Anh Huỳnh Hữu Thắng - Chủ nhiệm phòng Nuôi cấy mô của Trung tâm ứng dụng và thông tin, khoa học và công nghệ tỉnh Quảng Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn quí thầy cô giáo bộ môn trong khoa Khoa Lí - Hóa - Sinh, Trường Đại học Quảng Nam đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập. Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của gia đình, người thân và những lời chia sẽ, học hỏi của bạn bè đã góp phần lớn giúp tôi hoàn thành tốt bài khóa luận tốt nghiệp. Tam Kỳ, ngày 15 tháng 4 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Khánh Ly MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................... 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu: ................................................................................. 2 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu: ................................................................................... 2 1.3.3. Thời gian nghiên cứu: .................................................................................. 2 1.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 3 Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4 1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 4 1.1.1. Khái niệm ..................................................................................................... 4 1.1.2. Sơ lược lịch sử phát triển ............................................................................. 4 1.1.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro .................................................. 7 1.1.4. Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 8 1.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng ...................................................................... 8 1.1.5.1. Auxin ......................................................................................................... 8 1.1.5.2. Cytokinin ................................................................................................... 9 1.2. Giới thiệu chung về cây chuối....................................................................... 10 1.2.1. Tên khoa học ............................................................................................. 10 1.2.2. Nguồn gốc và phân bố................................................................................ 10 1.2.3. Phân loại ..................................................................................................... 11 1.3. Giới thiệu chung về cây chuối già lùn .......................................................... 14 1.3.1. Đặc điểm sinh thái ..................................................................................... 14 1.3.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 15 1.4. Giá trị của cây chuối già lùn ......................................................................... 17 1.4.1. Giá trị dinh dưỡng ..................................................................................... 17 1.4.2. Giá trị dược liệu ......................................................................................... 18 1.4.3. Giá trị kinh tế ............................................................................................. 18 1.5. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô .................................................................................................................. 19 1.5.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới...................................................................................... 19 1.5.2. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ...................................................................................... 21 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 25 2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu ................................................................................. 25 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................... 25 2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................... 25 2.2. Quy trình nuôi cấy ......................................................................................... 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 27 2.3.1. Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy .......................................... 27 2.3.1.1. Cách chọn mẫu cấy: ................................................................................ 27 2.3.1.2. Khử trùng mẫu ........................................................................................ 27 2.3.2. Chọn môi trường và hấp khử trùng môi trường nuôi cấy .......................... 28 2.3.2.1. Chọn môi trường ..................................................................................... 28 2.3.2.2. Hấp môi trường ....................................................................................... 30 2.3.3. Phương pháp đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy khởi động ............ 30 2.3.4. Tạo mô sẹo ................................................................................................. 31 2.3.5. Tái sinh chồi từ mô sẹo .............................................................................. 31 2.3.6. Nhân nhanh chồi ........................................................................................ 31 2.3.7. Tạo rễ cây ................................................................................................... 32 2.3.8. Chuyển cây ra vườn ươm ........................................................................... 32 2.3.9. Đưa cây ra ruộng ........................................................................................ 32 2.4. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 32 2.5. Các chỉ tiêu quan sát ..................................................................................... 33 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35 3.1. Khảo sát nồng độ cồn trong khử trùng mẫu cấy ........................................... 35 3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy khởi động ...... 36 3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo chuối già lùn................................................................................................... 41 3.3.1. Kết quả nuôi cấy mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng .............................. 43 3.3.2. Kết quả nuôi cấy mô sẹo gián tiếp từ mẫu chuối đã được nuôi cấy khởi động ...................................................................................................................... 45 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi chuối. 47 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 52 3.1. Kết luận ......................................................................................................... 52 3.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 52 Phần 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 53 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của nhóm chuối tiêu (Cavendish) 17, 18 Bảng 3.1 Kết quả sử dụng cồn để khử trùng mẫu cấy 35 Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của chuối 37 Bảng 3.3 Kết quả các đợt cấy mẫu khởi động 39 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo chuối già lùn 42 Bảng 3.5 Kết quả nuôi cấy mô sẹo trực tiếp theo lát cắt 43 Bảng 3.6 Kết quả nuôi cấy mô sẹo bằng mẫu chuối đã được nuôi cấy vô trùng theo lát cắt 45 Bảng 3.7 So sánh nuôi cấy mô sẹo trực tiếp với nuôi cấy mô sẹo gián tiếp 46 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi chuối 47 Bảng 3.9 Kết quả theo dõi nuôi cấy nhân nhanh cụm chồi trong môi trường đã chọn 50 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Nội dung Trang Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến mẫu cấy 35 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi cây chuối 37 Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ thành công các đợt cấy 39 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và Kinetin khả năng hình thành mô sẹo cây chuối 42 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây chuối 48 DANH MỤC HÌNH Hình Nội dung Trang Hình 3.1 Mẫu ít bị thâm khi khử trùng bằng cồn 70 và 90 36 Hình 3.2 Mẫu bị thâm khi khử trùng bằng cồn 50 36 Hình 3.3 Chồi khỏe (2 mll BA) 38 Hình 3.4 Chồi khỏe, xanh (3 mll BA) 38 Hình 3.5 Chồi khỏe (4 mll BA) 38 Hình 3.6 Chồi yếu (5 mll BA) 38 Hình 3.7 Mẫu bị nhiễm 40 Hình 3.8 Mẫu bị chết nhưng không nhiễm 41 Hình 3.9 Mẫu sống tạo chồi 41 Hình 3.10 Mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng 44 Hình 3.11 Mô sẹo nuôi cấy gián tiếp từ mẫu đã nuôi cấy khởi động 46 Hình 3.12 Chồi xấu 49 Hình 3.13 Chồi trung bình 49 Hình 3.14 Chồi tốt 49 NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit BAP 6 - Benzyl Amino Purin CT Công thức cs Cộng sự IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit TB Trung bình BA 6 - benzyladenin 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa học-công nghệ đang có triển vọng hiện nay. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy trong điều kiện vô trùng các bộ phận tách rời của cơ thể thực vật, người ta đã nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng có giá trị mà trước đây các phương thức nhân giống truyền thống gặp nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, một số kỹ thuật khác cũng đã được ứng dụng có kết quả như: nuôi cấy đơn bội (1n) để tạo dòng thuần chủng phục tráng giống cây trồng, dung hợp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo ra nhiều loài thực vật mang tính trạng mới hữu ích, chọn dòng biến dị soma và biến dị giao tử có khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như nóng- lạnh, phèn-mặn, khô-hạn, sâu-bệnh…, và cuối cùng sản xuất các cây trồng sạch bệnh virus từ những cá thể nhiễm bệnh virus, thiết kế các vector biểu hiện cao và xây dựng các kỹ thuật chuyển gen hiện đại. Song song cùng với công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thì nhu cầu trồng trọt bằng giống cây sạch bệnh, chất lượng cao đang được người dân quan tâm hàng đầu. Xuất phát từ nhu cầu đó nên việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cung cấp giống cây sạch bệnh cho nông dân đang trở thành xu hướng phát triển ở nhiều tỉnh thành trong cả nước. Cây chuối là cây ăn quả và cây lương thực phổ biến ở vùng nhiệt đới. Đồng thời, chuối cũng là loại cây ưa thế của vùng nhiệt đới khi chúng được thâm canh theo quy mô công nghiệp, nhằm mục tiêu xuất khẩu đến thị trường các nước ôn đới không trồng được chuối. Ở nước ta có rất nhiều nhóm chuối ngon, nhưng nhóm có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế nhất là nhóm chuối tiêu (Cavendish ), loài có giá trị nhất trong nhóm này phải kể đến chuối già lùn ( Musa Cavendish sp ). Nhưng hiện nay giống chuối già lùn này đang bị thoái hóa trầm trọng do nhiễm một số bệnh virus như: đùn ngọn, cụp lá, vàng lá,... kết hợp với nhân giống theo phương thức tách chồi truyền thống làm cho số lượng chuối bị nhiễm ngày càng tăng. Trước tình trạng thoái hóa của chuối già lùn như hiện nay việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô này trong nhân giống là cần thiết. 2 Chuối nhân giống theo phương pháp tách chồi truyền thống thấy rõ các nhược điểm: cây con tách ra sẽ sinh trưởng kém, phát triển chậm, các cây không đồng đều, lâu cho thu hoạch, không tập trung. Đồng thời việc vận chuyển cây giống là một vấn đề hết sức khó khăn do cồng kềnh, tốn thời gian nhưng số lượng cho một lần vận chuyển rất ít. Với phương pháp nuôi cấy mô các nhược điểm trên hoàn toàn được khắc phục: cây ra hoa đồng nhất, buồng chuối trổ đồng đều, chất lượng đồng hạng, thu hoạch đồng loạt, đặc biệt cây chuối con hoàn toàn sạch bệnh, cây sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh, thời gian được rút ngắn, tạo ra một lượng giống lớn cho quy mô xuất khẩu, vận chuyển cây giống dễ dàng. Xuất phát từ các lí do trên tôi chọn đề tài : “Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc nhân giống in vitro cây chuối già lùn (Musa Cavendish sp) tạo giống chuối già lùn sạch bệnh” nhằm cải tạo giống chuối già lùn tại xã Duy Phước, Duy Xuyên, Quảng Nam. 1.2. Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cồn trong khử trùng mẫu chuối. - Khảo sát tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy khởi động, tạo mô sẹo, tạo và nhân nhanh cụm chồi, tạo cây in vitro hoàn chỉnh. - Nghiên cứu quy trình tạo mô sẹo từ mẫu chuối trực tiếp và từ mẫu đã được nuôi trong môi trường nhân tạo một thời gian. - Nghiên cứu giá thể và điều kiện thích hợp đưa chuối ra vườn ươm. 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu: Cây chuối già lùn (Musa Cavendish sp) tại xã Duy Phước, huyện Duy Xuyên, Tỉnh Quảng Nam. 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng tỉnh Quảng Nam 1.3.3. Thời gian nghiên cứu: Đề tài được nghiên cứu từ tháng 112015 – 42016 3 1.4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thực nghiệm: các thí nghiệm được tiến hành tại trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng tỉnh Quảng Nam. - Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phương pháp thống kê và xử lí số liệu. 4 Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiện vô trùng.  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc - Dựa vào tính toàn năng của tế bào. - Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.  Ý nghĩa - Nhân nhanh giống cây trồng. - Bảo quản nguồn gen. - Tạo cây sạch bệnh. - Sản xuất các hoạt chất sinh học. - Mang tı́nh công nghiệp. 1.1.2. Sơ lược lịch sử phát triển Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển. Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Các giai đoạn chính của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1, 3, 7, 8: - 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kı́nh hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. - 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. - 1898: Haberlandt là người đầu tiên đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năng của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông: “Mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó”. Vì vậy, khi gặp 5 điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưa thành công. - 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải. - Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy đầu rễ cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng, glucose. - 1934: White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. - 1937: Went và Thimann đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ. - 1938: Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuầnlần. - 1941: Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này, nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4-Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. - 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép in vitro thành công. 6 - 1954: Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin. Cả 2 chất này đều thuộc nhóm Cytokinin. - 1960: Bergman đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm 1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast). - 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. - 1964: Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. - Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền. - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis. - 1971: Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi. - 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. - 1977: Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây. - 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trı̀nh chuyển gen vào tế bào trần. - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui. 0Petrochemicals. - 1985: Cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố. - 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen. - 1994: Là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994, giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Na Uy. 7 Đến nay, đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) 7. 1.1.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro 7, 5 Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỉ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (AuxinCytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi), môi trường có nhiều Auxin sẽ kích thích tạo mô sẹo (AuxinCytokinin > 1: kích thích tạo mô sẹo). Chế độ nuôi cấy thường là 25-270 C và 16h chiếu sángngày, 8 cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin. Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt. - Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. 1.1.4. Môi trường nuôi cấy 2  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản sau: - Muối khoáng đa lượng - Muối khoáng vi lượng - Vitamin - Nguồn cacbon - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, ...) và agar.  Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop. - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS. 1.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng 2 1.1.5.1. Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 9 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn. Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây.  Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. - Đặc tính của auxin.  Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. - Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. - Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). - Tạo phôi soma (2,4-D). 1.1.5.2. Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ auxincytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxincytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non.  Chức năng chủ yếu của các cytokinin: - Kích thích phân chia tế bào. 10 - Tạo và nhân callus. - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô. - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh. - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào. - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài. - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao). - Ức chế sự hình thành rễ. - Ức chế sự kéo dài chồi. - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá. 1.2. Giới thiệu chung về cây chuối 1.2.1. Tên khoa học 23 Bộ (ordo) : Gừng (Zingiberales) Họ (familia) : Chuối (Musaceae) Chi (genus) : Chuối (Musa L.) Loài (species) : Musa sp 1.2.2. Nguồn gốc và phân bố Chuối phát triển đầu tiên là ở New Ghinea (Simonds, 1966) sau đó chuyển đến Châu Á-Thái Bình Dương (từ 4000 năm trước công nguyên). Sự mô tả về chuối một cách rõ ràng và sớm nhất là do người Hy Lạp cổ xưa thực hiện năm 325 trước công nguyên trong cuộc hành trình của Alexander đến Ấn Độ (Rcynolds 1927, Kervegant, 1935). Sau đó khoảng 100 năm sau công nguyên, người Ả Rập đã thống trị mảnh đất từ Ấn Độ-Tây Ban Nha (Kinder và Hilgemann, 1974) 14. Chuối lại được quan tâm và phát triển nhất là chuối ăn tươi và ăn luộc đã được đưa đến Bắc Phi và phát triển rộng ở đây, mặc dù mảnh đất này rất khô cằn, Rcynolds (1927) đã đưa vào những hóa thạch, các bức vẽ trên các hàng động cho rằng chuối cũng đã trồng và phát triển được 15 thế kỷ ở Châu Phi. Trong đó, Đông Phi chủ yếu trồng 2 loại chuối có kiểu gen AA và AAA. Vùng gần xích đạo hơn phát triển chủ yếu chuối ăn luộc mang kiểu gen AAB. Vansina 1984, 1990 20, 15, đã giải thích về sự xuất hiện hai loài chuối có 11 kiểu gen AAB ở Châu Phi và cả ở Ấn Độ là một phần do sự thích nghi về khí hậu song chủ yếu là nhu cầu cấp bách về lương thực ở những nước này. Đến thế kỷ thứ X do ảnh hưởng của nền văn minh Ả Rập, mối quan hệ giữa các nước này được mở rộng, thời kỳ này chuối là mặt hàng được trao đổi mạnh nhất trên thương trường cả ở những nước xa như Trung Quốc (Davidson, 1974) 13. Người ta cho rằng, chuối được di trồng đến Châu Mỹ nhờ người Bồ Đào Nha từ thế kỷ 14, và sau đó phát triển mạnh vào năm 1607 (Kenvegent, 1935) 15. Trong thời gian gần đây sự thu thập nguồn gen và phổ biến các giống chuối có chất lượng ngày một lan rộng, hơn nữa chuối đã được đưa ra thị trường làm mặt hàng xuất khẩu chính, điều này đã gây ra sự chú ý đầu tư của các nhà khoa học về năng suất và chất lượng của các giống chuối ngày nay. Chuối đã được phát triển rộng khắp trên thế giới, không chỉ nó quan trọng do việc xuất khẩu mà còn ở sự đa dạng về hình dáng và chủng loại 14. Như vậy, chuối trồng đã có 1 quá trình phát triển lịch sử lâu dài, đầu tiên là những cây hoang dại rải rác ở New Ghinea, sau đó được thuần hóa và lan rộng, nhờ dân chúng và các nhà thám hiểm, các cuộc chinh chiến. Ở Châu Á chuối đã xuất hiện từ 4000 năm trước công nguyên. Chính vì vậy, có thể nói chuối có nguồn gốc từ Châu Á, điều này không những thể hiện ở sự phát triển mạnh của chuối ăn tươi và chuối ăn luộc do thích hợp khí hậu mà còn ở sự đa dạng các chủng loại chuối: ở Philippin có 80 loài, Malaysia 32 loài, New Ghinea 54 loài, Ấn Độ 57 loại … 13. 1.2.3. Phân loại 1.2.3.1. Phân loại theo tên gọi thường 23 Theo cách gọi thông thường chuối được chia thành các nhóm sau: - Nhóm chuối tiêu (Cavendish): Nhóm này có 3 giống là tiêu lùn, tiêu nhỏ, tiêu cao. Năng suất quả từ trung bình đến rất cao; phẩm chất thơm ngon, thích hợp cho xuất khẩu quả tươi, thích hợp với vùng có khí hậu mùa đông lạnh. Giống chuối tiêu ở Miền Bắc bình quân đạt 13-14kgbuồng, năng suất trung bình đạt 12-15 tấnha. 12 - Nhóm chuối tây (chối sứ, chuối xiêm): gồm các giống chuối tây hồng, tây phấn, tây sứ, được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây cao sinh trưởng khoẻ, không kén đất, chịu hạn nóng và khả năng chịu hạn song dễ bị héo rụi (vàng lá Panama), quả to, mập, ngọt đậm và kém thơm hơn so với giống khác. Buồng nặng 15-20 kg. Chuối sứ không kén đất, chịu được hạn, úng, đất xấu và chịu rét khá hơn chuối tiêu. Do đó, chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi. Khả năng bảo quản, vận chuyển kém. - Nhóm chuối bom (bôm): được trồng phổ biến ở Đông Nam Bộ, trọng lượng buồng thấp, chỉ đạt từ 6-8 kgbuồng. Thời gian sinh trưởng ngắn nên hệ số sản xuất cao (5 buồng trong 20 thánggốc) có thể trồng ở mật độ cao 1200-1500 câyha nên năng suất có thể đạt 25-40 tấnha. Quả được dùng làm ăn tươi, chuối sấy. - Nhóm chuối ngự: Bao gồm chuối ngự tiến, chuối ngự mắn. Cây cao 2,5-3 m, cho quả nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt quả chắc, vị thơm đặc biệt, tuy nhiên năng suất thấp. Cây chuối ngự cao khoảng 2,5-3m, lá xanh mát. Khác với chuối ngự trâu, quả to, ăn nhạt, chuối ngự thóc (hay còn gọi là chuối ngự mít) là loại được tiến vua. Cây chuối ngự mít thấp, trái nhỏ, cuống thanh, vỏ mỏng màu vàng óng, thịt trái mịn, bên ngoài màu vàng nhạt, trong ruột màu vàng sậm, mùi vị thơm và ngọt hơn cả chuối tiêu lùn. - Nhóm chuối ngốp : Bao gồm giống ngốp cao, ngốp thấp. Là nhóm có chiều cao cây từ 3-5 m. Cây sinh trưởng khoẻ, chịu bóng, ít sâu bệnh, chịu hạn khá, thích hợp với vùng đồi. Quả tương đối lớn, vỏ dày, nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua. - Nhóm chuối hột: Bao gồm chuối hột rừng và chuối hột trồng. + Chuối hột rừng Musa balbisiana nhị bội (là loài chuối nhị bội có kiểu gen BB), loài này mọc hoang trong rừng được khai thác làm thuốc. + Chuối hột trồng Musa balbisiana tam bội (là loài tam bội có kiểu gen BBB), loài này được trồng chủ yếu dùng thân và bắp chuối để làm rau, quả to khi 13 chín ăn được, chủ yếu để ngâm rượu thuốc (rượu chuối hột). Hạt của loài này được bán ở dạng nguyên hạt hoặc xay thành bột để làm thuốc. - Nhóm chuối làm cây cảnh : Có rất nhiều loài từ đơn bội đến đa bội. Loài phổ biến nhất là chuối trăm nải (nhóm ABB). Ngoài ra còn các giống chuối mắn, chuối lá, nhưng các giống chuối này có diện tích trồng ít vì giá trị kinh tế thấp. 1.2.3.2. Phân loại dựa theo gen Trước đây theo Linne chuối được chia thành các nhóm 4: Musa sapentum L : trái chín ngọt, ăn tươi. Musa paradiaca L : khi chín phải nấu mới ăn được. Musacavendish, Musa nana : chuối già lùn. Từ năm 1948, Cheesman đã phân biệt 2 nguồn gốc chính của chuối trồng trọt là: M.acuminita colla và M.balbisiana colla. Trong họ phụ Musoidae có 2 giống Enset và Musa 4. Từ năm 1995, Simmonds và Shepherd đã dựa vào số điểm đánh giá 15 đặc điểm ngoại hình của chuối để quy định mức độ lai của các giống chuối trồng trọt đối với 2 dòng Acuminita và Balbisiana , trong gen đều có gen A và B 4. Vakili và Simmon đã phân loại các giống chuối trồng ở Việt Nam trên cơ sở di truyền như sau: Nhóm AA: gồm chuối Cau, chuối Tiêu, chuối Ba thơm... Nhóm nhị bội AA có một bất lợi là quả bé, năng suất thấp 4. Nhóm AAA: gồm nhiều giống trong đó có chuối Già Cui, Già hương, Già lùn, chuối Laba, Bà hương, chuối Cơm, sau này một số giống của Đài Loan được đưa vào Việt Nam nuôi cấy mô. Nhóm chuối Già lùn (Musa cavendish ) thường dùng xuất khẩu quả tươi 4. Nhóm AAB: có các giống chuối như chuối Lá, chuối Bom... Chuối Bom được trồng khá nhiều ở tỉnh Đồng Nai, thích hợp cho việc làm chuối sấy 4. Nhóm ABB: các giống chuối sứ được nhiều người Việt Nam ưa chuộng. Nhóm BB: có nhóm chuối hột mà phần lớn dùng làm rau ăn sống và dùng làm thuốc 4. 14 1.3. Giới thiệu chung về cây chuối già lùn 1.3.1. Đặc điểm sinh thái 8 Cây chuối sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện: Nhiệt độ: chuối sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 15.5-350 C. Dưới 15 0 C và trên 35 0 C hoạt động sinh trưởng của cây bị giảm nhanh. Nhiệt độ bình quân thích hợp của chuối là 24-250 C. Chuối sợ lạnh, nhiệt độ xuống dưới 100 C kéo dài, cây ngừng sinh trưởng, năng suất và phẩm chất trái kém, đặc biệt mả quả xấu. Ở 50 C lá bắt đầu bị ảnh hưởng, nếu kéo dài lá bị khô héo, nhiệt độ xuống đến 00 C thì vườn chuối sẽ bị hại nhiều, nhất là chuối tiêu. Ở Việt Nam không có hoặc rất ít những nơi có nhiệt độ thấp có thể làm chuối chết. Tuy nhiên ở miền Bắc về mùa rét, khi có sương giá có thể làm cho chuối vàng lá hoặc chết nếu là chuối mới trồng. Ở những nơi có nhiệt độ quá cao trên 400 C thì một số giống chuối như chuối tiêu sẽ khó chín vàng, chóng nhão. Hơn nữa, nhiệt và ẩm cao thì trái to, vỏ dày, không có mùi thơm. Ánh sáng : trong thời gian sinh trưởng nếu có trên 60 số ngày nắng thì cây chuối sinh trưởng bình thường. Thiếu ánh sáng thì lá phát triển chậm, quang hợp kém. Ánh sáng quá mạnh làm giảm tuổi thọ của lá, rám cuống buồng làm cho chất lượng chuối kém. Chuối tây chịu nắng hơn chuối tiêu. Trong vườn chuối tiêu, các tàu lá che phủ lên nhau thì sinh trưởng mới tốt. Lượng ánh sáng ở điều kiện nước ta cũng cho phép cây chuối sinh trưởng và phát triển tốt. Nước : hàm lượng nước trong các bộ phận cây chuối rất cao, trong thân già 92.4, trong rễ 96, trong lá 82.6 và trong quả 96. Độ bốc hơi của lá rất lớn, dưới ánh nắng mặt trời, sức tiêu hao nước của chuối từ 40-50 mgdm 2 phút. Với giống chuối tiêu lùn, cần từ 15-20 lít nướcngày tuỳ theo trời râm hay trời nắng. Chú ý vào mùa đông ở nước ta thường khô hanh, ít mưa nên cần có biện pháp tưới ẩm để cung cấp đủ nước cho chuối. Đất : cây chuối thích hợp với đất đồi, đất ruộng, đất phù sa, đất bãi, có độ pH từ 4,5-7,5. Rễ chuối thuộc loại rễ chùm, mềm gặp đá sỏi chùn lại, rễ không đâm thẳng mà ngoằn ngoèo, tốn sức, cho nên đất trồng chuối phải có kết cấu đất thuần không có sỏi đá, tầng đất sét gần mặt đất. 15 Phân bón : rễ chuối sinh trưởng liên tục, do đó cần phải chú ý bón phân cho chuối. Ngoài nguồn phân hữu cơ như phân chuồng, ủ thêm rơm rạ cần phải bón thêm phân hóa học. Các loại khoáng chất trong phân bón có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây chuối. 1.3.2. Đặc điểm hình thái 23 Chuối già lùn (Musa Cavendish sp) có những đặc điểm chung của Chi chuối (Musa ) là những loài thực vật một lá mầm, có hoa, thuộc loại cây thân thảo khổng lồ. - Thân: Thân chuối có hai phần: + Thân thật: còn được gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngăn, khi phát triển đầy đủ có thể rộng 30cm. Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn. Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên. Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn. Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, đồng thời là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra. Do đó củ chuối to mập là cơ sở đảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao. Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con. + Thân giả : Mặc dù nhìn bề ngoài các loài chuối có thân bụi mọc cao nhưng thân chuối thật ra là thân giả do các bẹ lá tạo thành. Các bẹ lá cuốn sát nhau tạo thành một khối hình trụ dẻo dai, gồm những khối sợi và những ô rỗng mọng nước. Thân cây chuối cao từ 3-6 m. - Rễ: rễ chùm, có 2 loại, rễ ngang và rễ thẳng. + Rễ ngang : mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp đất mặt từ 0-30 cm, phần nhiều tập trung ở độ sâu 0,15cm, bề ngang rộng tới 2-3 cm loại rễ này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, đó là loại rễ quan trọng nhất để hút nước và dinh dưỡng nuôi cây. + Rễ thẳng : mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu 1-1,5cm, tác dụng chủ yếu giữ cây đứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy, sức chịu hạn, chịu úng đều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác. 16 - Lá Khi mầm chuối mới mọc lên thì bắt đầu mọc ra những lá vảy (không có thân lá) có tác dụng bảo vệ mầm chuối. Tiếp đó mọc ra loại lá dài và hẹp gọi là “lá kiếm”. Về sau mọc ra những lá to bình thường gọi là lá thật. Đến khi mầm hoa phân hóa thì mọc ra một lá chót nhỏ, ngắn có tác dụng che chở buồng chuối. Lá được sắp xếp theo vòng xoắn và gồm có ba phần: + Bẹ lá: Mọc từ thân chính dưới mặt đất, các bẹ lá cuộn chặt vào nhau tạo nên thân giả. Bẹ lá có nhiều chất xơ và các lỗ rỗng, xốp, mọng nước. Tiết diện của bẹ lá hình vành khăn mỏng, 2 bề mặt của bẹ lá nhẳn bóng. Chiều dài của mỗi bẹ lá quyết định chiều cao của thân chính khi lá đã phát triển. + Cuống lá: Từ phần cuối của bẹ cho đến phiến lá, dày khoảng 20-40 cm. + Phiến lá: Phiến lá đơn, to, rộng, dài 1-2 m, rộng 0.3-0.6 m, có cuốn lá chạy dọc đến chóp lá. Phiến lá dễ bị rách do gió giông, phiến lá được dùng để lót, gói thực phẩm, gói bánh… - Hoa chuối : cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 8-10 tháng bắt đầu hình thành mầm hoa, sau đó khoảng 1 tháng bắt đầu trổ buồng. Hoa chuối thuộc loại hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa đực. + Hoa cái : tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50-100 cm). Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị đực thoái hóa. Chỉ có hoa cái là phát triển thành trái được. Do đó, khi trồng, chọn lọc cây giống tốt, chăm bón kịp thời để hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo đảm năng suất cao. + Hoa lưỡng tính : nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều lắm, về sau sẽ rụng và không hình thành trái được. + Hoa đực : nằm ở phía đầu bắp chuối, nhị cái thoái hóa, nhị đực phát triển, dài bằng nhị cái. Loại hoa đực không thể hình thành trái được sau này sẽ khô đi và rụng dần. Chuối phát hoa mọc từ đỉnh của thân chính (lõi chuối) ở ngọn gọi là “bắp chuối”, khi phát hoa nở và kết quả gọi là “buồng chuối”. Trong mỗi lá đài hoa sắp thành hai hàng tạo để sau này tạo thành “nải chuối”. 17 - Quả Quả chuối được hình thành từ các hoa lưỡng tính ở phần gốc của phát hoa. Bên trong mỗi lá đài có một nải chuối được xếp thành hai hàng, mỗi nải chuối có từ 10-30 quả. Trọng lượng mỗi quả từ 100-300g. Trong phần thịt ăn được của của các loài Chuối Cavendish có khoảng 75 là nước và 25 chất khô. - Hạt: Chuối già lùn (Musa Cavendish sp) là chuối không có hạt. 1.4. Giá trị của cây chuối già lùn 1.4.1. Giá trị dinh dưỡng 22 Thành phần dinh dưỡng của quả chuối ăn tươi (banana) nhóm Cavendish Theo phân tích của Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA) thành phần dinh dưỡng trong 100 gam phần ăn được của quả chuối nhóm Cavendish (chuối tiêu) được xuất khẩu chính trên thị trường thế giới như sau: Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nhóm chuối tiêu (Cavendish) Chuối ăn tươi nhóm Cavendish (chuối tiêu) Giá trị dinh dưỡng trên 100 g quả chín Năng lượng 371 kJ (89 kcal) Carbohydrate 22.84 g - Đường 12.23 g - Chất xơ thực phẩm 2.6 g Chất béo 0.33 g Protein 1.09 g Thiamine (vit. B 1 ) 0.031 mg (3) Riboflavin (vit. B 2 ) 0.073 mg (6) Niacin (vit. B 3 ) 0.665 mg (4) Pantothenic acid (B 5 ) 0.334 mg (7) Vitamin B 6 0.4 mg (31) Folate (vit. B 9 ) 20 mg (5) Choline 9.8 mg (2) Vitamin C 8.7 mg (10) Sắt 0.26 mg (2) Magiê 27 mg (8) Mangan 0.27 mg (13) Phốt pho 22 mg (3) Kali 358 mg (8) Natri 1 mg (0) Kẽm 0.15 mg (2) 18 Florua 2.2 mg Liên kết đến cơ sở dữ liệu Bộ Nông Nghiệp Mỹ USDA Tỷ lệ được khuyến nghị của Mỹ cho người lớn. Nguồn: USDA Cơ sở dữ liệu dinh dưỡng Chuối là loại thực phẩm quan trọng giàu tinh bột và nhiều chất dinh dưỡng không kém các loại thực phẩm khác. Đây cũng là nguồn nguyên liệu rẻ nhất cung cấp cho con người thực phẩm ăn hằng ngày, thực phẩm đóng gói, bánh kẹo, hương liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm.... Chuối già lùn là chuối buồng dài, quả thon, hình dáng đẹp, khi chín có màu vàng tươi, thịt quả có màu vàng sánh, dẻo, ngọt, có mùi thơm đặc trưng 22. Vì vậy, chuối già lùn được xem là thực phẩm rau quả tươi được ưa chuộng hiện nay. 1.4.2. Giá trị dược liệu Theo phân tích khoa học về thành phần dinh dưỡng của chuối chín bao gồm nhiều chất đạm, chất bột, chất xơ, sinh tố và khoáng chất. Đặc biệt chuối có hàm lượng kali rất cao và chứa cả 10 loại aminoaxit thiết yếu của cơ thể 22. Vì vậy, chuối có một số tác dụng y học sau: - Chuối có tác dụng làm hạ huyết áp cao, chữa táo bón và ngăn ngừa ung thư ruột già. - Chuối là nguồn bổ sung năng lượng hoàn hảo cho các hoạt động sống của cơ thể. - Chuối xanh chữa bệnh loét dạ dày, tá tràng. - Chuối có vị ngọt, tính bình, có tác dụng nhuận phế, giải khát, thanh nhiệt, giải độc... 1.4.3. Giá trị kinh tế Vào năm 2013 chuối đứng hàng thứ tư về giá trị tài chính trong các cây lương thực chính trên thế giới (sau gạo, lúa mì và ngô) 22. Nhìn chung cây chuối có thế mạnh xuất khẩu ở các nước nhiệt đới, nếu khai thác tốt thế mạnh này sẽ tạo công ăn việc làm và xóa đói giảm nghèo cho một bộ phận khá lớn dân cư. 19 - So với nhiều cây trồng khác, toàn bộ sản phẩm của cây chuối có thể sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, công nghệ chế biến thực phẩm, làm rượu, làm mứt… - So với các loại rau quả khác, chuối có chu kì kinh tế khá ngắn, mức đầu tư không cao, kỹ thuật không phức tạp. - Thị trường tiêu thụ trong nước và ngoài nước còn đang mở rộng. Theo tính toán kinh tế thì 1 ha trồng chuối đem lại giá trị sản phẩm bằng 3.8 ha trồng lúa hoặc 10 ha trồng lạc hoặc 6 ha trồng ớt 22. Hiện nay trên thế giới có ít nhất 107 quốc gia trồng chuối với nhiều mục đích khác nhau: chủ yếu dùng làm trái cây, kế đến là dùng để lấy sợi, sản xuất rượu chuối và làm cây cảnh 22. 1.5. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô 1.5.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới. Chuối là đối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế hệ kế tiếp. Vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới như Malayxia, Australia, Pháp, Trung Quốc… và đã góp một phần đáng kể phục vụ ngành sản xuất chuối xuất khẩu. Theo Reuveni O (1986), kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số ưu điểm sau (dẫn theo Hoàng Nghĩa Nhạc) 2: - Nhân được số lượng lớn giống từ cây ban đầu đã xác định tính trạng. - Chất lượng cây giống hoàn toàn sạch bệnh, tránh được những sâu hại lây nhiễm qua nguồn đất (tuyến trùng). Vì vậy, tiết kiệm được chi phí hóa chất cho xử lý đất. - Cây nuôi cấy mô có thể trồng một vụ với mức độ thâm canh cao, thời gian sinh trưởng ngắn, có thể điều khiển được thời gian thu hoạch. 20 - Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (>98), khả năng sinh trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách. - Cây giống in vitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt và thời gian thu hoạch ngắn. - So với cây giống từ chồi nách, cây nuôi cấy mô có giá thành rẻ, dễ vận chuyển, dễ nhân giống. - Tiện lợi cho việc trao đổi nguồn gen quốc tế. Theo Viện Nghiên cứu Chuối Quốc tế đặt tại Đài Loan thì nhân giống chuối bằng nuôi cấy mô gồm 4 giai đoạn sau: giai đoạn ban đầu nuôi cấy, giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn ra rễ và giai đoạn chuyển cây ra nhà kính 17. Rodriguez-Enriquez và cộng sự (1987) cho biết từ một chồi chuối ban đầu qua cấy chuyển liên tiếp có thể sinh sản và duy trì được 3 năm trong ống nghiệm 18. Weathers và cộng sự (1988) đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô chuối cải tiến trong hệ phun mù. Các mô hoặc tế bào chuối nuôi cấy được đặt trên giấy lọc bằng vật liệu trơ sinh học, vô trùng và được phun dung dịch dinh dưỡng qua hệ thống phun mù để vừa điều chỉnh độ ẩm vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây. Kết quả cho thấy, chuối non mọc tốt hơn, các mô hoặc tế bào chuối tái sinh cao hơn 4-6 tuần, số lượng chồi lớn hơn 3-20 lần, chu kỳ nhân ngắn hơn 20-50 và chất lượng cây tốt...

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuâ ̣t nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t mô tả các phương pháp nuôi cấy các bô ̣ phâ ̣n thực vâ ̣t (tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiê ̣n vô trùng.

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc

- Dựa vào tính toàn năng của tế bào

- Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa

- Nhân nhanh giống cây trồng

- Ta ̣o cây sa ̣ch bê ̣nh

- Sản xuất các hoa ̣t chất sinh ho ̣c

- Mang tı́nh công nghiê ̣p

1.1.2 Sơ lươ ̣c li ̣ch sử phát triển

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của tế bào Có thể thấy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác Các giai đoạn chính của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1, 3, 7, 8]:

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kı́nh hiển vi và đưa ra khái niê ̣m tế bào

- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

Năm 1898, Haberlandt đưa ra thuyết về tính toàn năng của tế bào, dựa trên các giả thuyết của Schleiden và Schwann Ông đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng này.

Theo ông: “Mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó” Vì vậy, khi gặp

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

- Củ chuối mới thu hoạch từ cây 6 tháng tuổi hoặc các cây con sinh ra từ gốc cây chuối mẹ 2-3 tháng tuổi lấy tại thôn Hà Nhuận, Duy Phước, Duy Xuyên, Quảng Nam

- Mô cấy là phần đỉnh sinh trưởng của củ chuối có kích thước 1-2 cm 2 , cao 0.5-0.8 cm, trong mô cấy có nhiều chồi nách tiềm ẩn (chồi bên)

Để đảm bảo môi trường nuôi cấy vô trùng và đảm bảo chất lượng dung dịch mẹ, phòng chuẩn bị môi trường cần trang bị các thiết bị như nồi hấp môi trường, tủ lạnh bảo quản, bếp điện, cân điện tử và cân phân tích chính xác, ống đong, pipet hiệu chuẩn, máy đo pH hiện đại.

- Phòng cấy vô trùng gồm tủ cấy, đèn UV, các du ̣ng cu ̣ đã hấp vô trùng

- Phòng la ̣nh nuôi cấy gồm kê ̣ sắt, đèn chiếu sáng, nhiê ̣t kế, máy điều hòa

- Các du ̣ng cu ̣ gồm đèn cồn, đı̃a peptri, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiê ̣m vô trùng loa ̣i 250 ml, 500 ml, bình tam giác 250ml, giấy vô trùng, dây thun,…

- Hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản sau: + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon: một số các loại đường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

+ Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô,…

- Các loại hóa chất dùng để rửa và khử trùng trong quá trình nuôi cấy:

+ Nước cất, nước cất vô trùng

+ Dung dịch khử trùng: nước javen, dd HgCl2, dd Ca(OCl)2…

Quy trình nuôi cấy

Các bước trong quy trình nhân giống chuối được thể hiện ở sơ đồ sau: Chọn mẫu

Xử lí mẫu Hấp môi trường Đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy

Tạo và nhân nhanh chồi

Tạo rễ cây Ươm chuối trong vườn ươm

Bầu chuối và trồng ra ruộng

Tái sinh chồi trực tiếp

Tái sinh chồi từ mô sẹo

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy

 Chọn lọc cây mẹ đầu dòng

Chọn lọc cây mẹ đầu dòng bao gồm các đặc tính tốt của cây như: Cây sinh trưởng khỏe mạnh, năng suất cao, chất lượng quả ngon và phải đúng giống Đặc biệt ở cây chuối già lùn cần phải chú ý không chọn các cây bị bệnh đùn ngọn, bệnh cụp lá, bệnh vàng lá…

Dùng xẻng đào cây chuối đã được chọn để lấy phần gốc chuối, đào sao cho củ chuối càng ít bị tổn thương càng tốt (do khi bị tổn thương thì các vi sinh vật dễ xâm nhiễm, khi nuôi cấy dễ bị nhiễm)

 Xử lí mẫu chuối trước khi đưa vào phòng thí nghiệm

Rửa sạch củ chuối dưới vòi nước cho sạch toàn bộ đất bám bên ngoài, dùng kéo cắt gọn các rễ ở quanh củ chuối, rửa lại bằng nước xà phòng loãng, tiếp tục rửa lại bằng nước sạch rồi để ráo trước khi đưa vào phòng thí nghiệm

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến khử trùng mẫu cấy Để tìm ra nồng độ cồn thích hợp trong quá trình khử trùng mẫu ta tiến hành khử trùng mẫu với các nồng độ cồn khác nhau là: 50%; 70%; 90%, kiểm tra mức độ nhiễm và mức độ sống của các mẫu làm thí nghiệm, chọn ra nồng độ khử trùng tốt nhất

 Trước khi đưa vào phòng cấy

- Việc tách bỏ các lớp bẹ ngoài cây chuối tiến hành dưới vòi nước sạch

- Rửa củ chuối dưới vòi nước sạch nhiều lần, dùng dao tách bỏ lần lượt từng bẹ một, sau khi tách bẹ phải rửa kĩ dưới vòi nước sạch rồi mới tách bẹ tiếp theo Khi tách bẹ phải đồng thời cắt gọn phần củ chuối, để dễ khử trùng

- Tính từ trong ra ngoài còn khoảng 7-8 bẹ thì dừng, cắt gọn phần củ chuối, rửa lại thật sạch và ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng 15 phút

- Tiếp theo dùng bàn chải đánh thật sạch toàn bộ củ chuối trong vòng 4-5 phút, rồi rửa sạch dưới vòi nước sạch 10 phút, sau đó cho ra đĩa sạch đã lau bằng cồn để tiến hành khử trùng

- Phun cồn cho ướt củ chuối và dùng bông vô trùng lau toàn bộ mẫu trong vòng 2-3 phút, tiếp tục phun cồn và lau tương tự 3 lần và rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiếp tục phun cồn và lau kĩ 2-3 lần nữa, rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng, cho vào đĩa đã khử trùng để mang vào phòng cấy

Các mẫu chuối mang vào sẽ được khử trùng lần lượt: Phun cồn ướt mẫu chuối sau đó dùng bông vô trùng lau mẫu chuối trong vòng 2-3 phút, tiếp tục phun và lau tương tự 2 lần nữa, rửa bằng nước cất vô trùng, tách thêm 2-3 bẹ nữa và cắt gọn phần củ của mẫu cấy (tách bẹ này xong phải rửa bằng nước cất và lau bằng cồn rồi mới tách bẹ tiếp theo), sau khi khử trùng xong ta tiến hành đưa tất cả các mẫu cấy vào trong tủ cấy

Lau lại cồn lần cuối và tiến hành cắt mẫu để đưa vào môi trường nuôi cấy

2.3.2 Chọn môi trường và hấp khử trùng môi trường nuôi cấy

Trong phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không có môi trường nhất định nào cho các loại cây khác nhau Từng loại cây thậm chí từng loại mô khác nhau trên cùng một cây đều có môi trường thích hợp riêng biệt để nuôi cấy và nhân giống Môi trường nuôi cấy cũng như nồng độ các phytohormon có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật Việc tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cũng như khoảng nồng độ các phytohormon mà ở đó chúng thể hiện hiệu quả tác dụng tối ưu đối với việc tăng khối lượng, kích thước, chiều cao,… cũng như sự phân hóa các cơ quan của cơ thể thực vật là vô cùng quan trọng Để tìm hiểu tất cả những ảnh hưởng đó đối với từng đối tượng cây cụ thể Chúng tôi tiến hành khảo sát ở mức độ tái sinh chồi và sinh trưởng của cây con được hình thành từ các mẫu cấy trên môi trường MS cơ bản (1962) có bổ sung vào đó các phytohormon với tỷ lệ và nồng độ khác nhau để từ đó tìm ra môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của đối tượng cần nghiên cứu

Trong các thí nghiệm này sử dụng môi trường MS bổ sung đường (30 g/lít) và agar (8 g/lít), cùng các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ cụ thể Môi trường được điều chỉnh độ pH đạt 5,8 để tạo điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của mẫu vật.

Phương pháp khảo sát gồm 3 thí nghiệm cơ bản sau:

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy khởi động

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo chuối già lùn

Nồng độ chất KTST 2.4-D (ml/l) Kinetin (ml/l)

Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo chồi chuối già lùn

* Số lượng mẫu cho mỗi lô thí nghiệm là 100 mẫu/lần

Sau khi pha chế lượng môi trường vừa đủ ta tiến hành phân phối môi trường vào bình tam giác khoảng 65ml/bình 250ml, đậy nút bông, bọc giấy bên ngoài và cho môi trường vào nồi hấp Chú ý khi phân phối môi trường cần phân phối vừa phải, hợp lí không nên quá mỏng hoặc quá dày Dùng giấy gián đánh dấu rõ môi trường đã được kí hiệu riêng cho mỗi thí nghiệm

Môi trường cần được hấp ở 121 0 C và áp suất 1amt trong thời gian 30-40 phút, sau đó lấy môi trường ra bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.3.3 Phương pháp đưa mẫu chuối vào môi trường nuôi cấy khởi động

- Sau khi mẫu cấy được khử trùng xong đưa vào tủ cấy để tiến hành cấy mẫu

- Dùng dao và panh đã được vô trùng tách 2-3 bẹ chuối, cắt gọn phần củ chuối sao cho còn lại phần đỉnh sinh trưởng với kích thước khoảng 1.5 cm 2

Có thể tách một đỉnh sinh trưởng thành 5-6 mẫu cấy nhỏ theo cách chẻ dọc xung quanh, đảm bảo giữ lại đỉnh sinh trưởng ở giữa Mỗi mẫu nhỏ này được cấy vào một bình tam giác chứa môi trường khởi động.

- Đă ̣t mẫu vào môi trường

- Đâ ̣y nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, đem vào phòng nuôi mẫu

 Quy trình nuôi cấy mô sẹo từ mẫu chuối trực tiếp

- Khử trùng mẫu (tương tự như cấy vào môi trường khởi động)

- Cắt gọn đến đỉnh sinh trưởng

- Cắt lát mỏng kích thước 0.8×0.8 cm, hoặc lắt tròn thì có bán kính là 0.4 cm

- Đưa mẫu vào môi trường tạo mô sẹo (mỗi bình 3-4 lát)

- Đâ ̣y nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, đem vào phòng nuôi mẫu

 Quy trình nuôi cấy mô sẹo từ mẫu chuối đã được nuôi cấy vô trùng

- Chọn mẫu (là các mẫu chuối sống-sạch lấy từ nuôi cấy khởi động)

- Cắt bỏ phần chuối bị thâm và chết, chỉ lấy chồi được sinh ra

- Chồi thu được tiến hành cắt lát mỏng ngang hoặc dọc

- Đặt các lát chuối đã được cắt vào môi trường (5-6 lát/1 bình)

- Đâ ̣y nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, đem vào phòng nuôi mẫu

2.3.5 Tái sinh chồi từ mô sẹo

- Ta tiến hành cắt khối mô sẹo đã được hình thành từ trên với kích thước khoảng 0.5× 0.5 cm đặt vào môi trường tạo chồi

- Sau khi cấy tiến hành đậy nút, bao gói, ghi tên môi trường, ngày, tháng, năm…

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 21 0 C, cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, độ ẩm 75-80%

Cấy chuyển nhiều lần để tạo số lượng chồi nhất định

 Quy trình nhân nhanh chồi:

- Chọn mẫu (các mẫu chuối sống-sạch đã được nuôi cây vô trùng)

- Cắt bỏ phần chuối bị thâm và chết chỉ lấy chồi chuối được sinh ra từ mẫu đó

- Đặt mẫu vào môi trường nhân nhanh cụm chồi

- Đâ ̣y nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày, tháng, đem vào phòng nuôi mẫu

- Sau khi nhân chồi đủ số lượng ta tiến hành chọn chồi cao khoảng 2-3cm, có đỉnh sinh trưởng đầy đủ đưa vào môi trường tạo rễ để tạo cây hoàn chỉnh in vitro

- Trong điều kiện nuôi cấy bình thường như trên, rễ sẽ phát sinh sau 10-15 ngày Sau 30 ngày có thể đưa chuối ra vườn ươm

2.3.8 Chuyển cây ra vườn ươm

- Khi chuối cấy mô có rễ, có kích thước trung bình từ 6-8 cm (đo cả lá) được lấy ra khỏi bình, rửa sạch thạch và cấy ngay vào luống ươm với khoảng cách 10× 10cm

- Luống ươm thường rộng 1m, cao 15cm, làm với các vật liệu xốp như: bụi dừa, mạt cưa, tro trấu, đất trộn phân hoai đập mịn và giữ ẩm liên tục

- Sau 1 tuần chuối bắt đầu sinh trưởng có thể tưới dung dịch phân khoáng loãng Thời gian ươm lá từ 30-40 ngày

Điều kiện nuôi cấy

Tất cả các thí nghiệm đều đặt trong phòng nuôi cấy đảm bảo các điều kiện: + Dụng cụ và môi trường làm việc phải truyệt đối vô trùng

+ Cường độ chiếu sáng : 2500-3000 lux

+ Thời gian chiếu sáng : 16 giờ/ngày.

Các chỉ tiêu quan sát

- Đo chiều cao cụm chồi: đo từ mặt thạch đến bẹ lá cao nhất của chồi cao nhất

- Đếm số chồi: là tổng số chồi hình thành

- Đếm số lá: là tổng số lá hoàn chỉnh của chồi cao nhất

- Chiều cao cây: đo từ cổ rễ lên hết thân (không tính lá cao nhất của cây)

- Đường kính thân, đo ở vị trí lớn nhất ngay trên cổ rễ

- Chiều dài lá: đo chiều dài của lá lớn nhất, tính trung bình cộng các cây

- Chiều rộng lá: đo chiều rộng của lá lớn nhất, tính trung bình cộng các cây

- Số rễ hình thành mới trên một cây tính theo trung bình cộng

- Chiều dài rễ, đo rễ dài nhất, tính theo trung bình cộng

 Các chỉ tiêu khảo sát gồm:

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = Σ số mẫu nhiễm x 100 Σ số chồi cấy ban đầu

Tỉ lệ mẫu sống (%) = Σ số mẫu sống

X 100 Σ số mẫu cấy ban đầu

Tỉ lệ mẫu chết (%) = Σ số mẫu chết

Tỉ lệ hình thành mô sẹo (%) = Σ số mẫu tạo mô sẹo

X 100 Σ số mẫu cấy ban đầu

Tỉ lệ bật chồi (%) = Σ số mẫu bật chồi

Hệ số bật chồi (chồi/calus) = Σ số lượng chồi bật

X 100 Σ số lượng calus đưa vào

Kích thước chồi trung bình (cm) = Σ kích thước chồi bật Σ số chồi bật

 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng:

- Chất lượng chồi ở mức xấu nhất (+): số chồi dị dạng, số lượng chồi bất định nhiều, phát triển chậm, chồi vàng kích thước bé

- Chất lượng chồi ở mức trung bình (++): số lượng chồi nhỏ và trung bình nhiều, chồi phát triển chậm, chồi xanh

- Chất lượng chồi ở mức tốt nhất (+++): số lượng chồi có kích thước lớn nhiều, chồi phát triển tốt, chồi xanh tốt

- Chất lượng mô sẹo ở mức xấu (*): kích thước mô sẹo nhỏ, màu đen, khô ráp

- Chất lượng mô sẹo ở mức trung bình (**): kích thước mô sẹo trung bình, màu sắc mô sẹo xanh sẫm, bề mặt mô sẹo hơi căng

Chất lượng mô sẹo tốt nhất thường biểu hiện qua kích thước mô sẹo lớn, màu sắc xanh non, bề mặt căng phồng hoặc hình thành nhiều khối bất định.

Các số liệu được tính toán theo phương pháp thống kê toán học Quá trình xử lý được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 9.0 và được mô phỏng bằng các bảng biểu và hình.