Khoa Học Tự Nhiên - Kinh tế - Thương mại - Y dược - Sinh học TRỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- TRẦN THỊ KIM QUỲNH ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 05 năm 2018 TRỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Tên đề tài: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ KIM QUỲNH MSSV: 2114022731 CHUYÊN NGÀNH: S PHẠM SINH HỌC - KTNN KHÓA 2014 – 2018 Cán bộ hƣớng dẫn Th.S Hồ Thị Kim Cúc MSCB: Quảng Nam, tháng 5 năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kế t quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bấ t kì công trình nào khác. Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam, tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng nhƣ thực hành thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Hồ Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị làm việc tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam – nơi tôi thực hiện đề tài đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, động viên tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, luôn động viên và khích lệ tôi để tôi đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4-D 2,4 – Diclorophenoxy Acetic Acid BA 6-benzyl adenine cs Cộng sự CT Công thức IBA Indole 3-butyric acid MS Môi trƣờng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) NAA α-naphthalen acetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các công thức môi trƣờng khảo sát sự ảnh hƣởng của Javen đối với mẫu khử 20 2.2 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp 21 2.3 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi 21 2.4 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 22 3.1 Kết quả sử dụng Javen để khử trùng mẫu cấy 25 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp 27 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi 29 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 32 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Ảnh hƣởng của Javen đối với mẫu khử 26 3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp 28 3.3 Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi 30 3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.2 Cây Hà thủ ô đỏ 12 1.3 Củ Hà thủ ô đỏ 12 3.1 Mẫu cấy đã thích ứng với môi trƣờng 27 3.2 Tái sinh chồi sau 2 tuần 29 3.3 Tái sinh chồi sau 3 tuần 29 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng nhân nhanh chồi 31 3.5 Rễ Hà thủ ô sau 1 tuần 33 3.6 Rễ Hà thủ ô sau 2 tuần 33 3.7 Rễ Hà thủ ô sau 3 tuần 34 3.8 Rễ Hà thủ ô sau 4 tuần 34 MỤC LỤC I. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1 Lý do chọn đề tài .............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu...................................................................................... 2 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 2 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 2 1.3.3. Thời gian nghiên cứu ................................................................................... 2 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 3 CHƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................. 3 1.1.1. Khái niệm ..................................................................................................... 3 1.1.2. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật ................................................... 3 1.1.3. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ............................................................ 3 1.1.4. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giố ng cây trồng ....................................................................................................................... 4 1.1.4.1. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giố ng cây trồng trên thế giới ................................................................................................... 4 1.1.4.2 . Sơ lƣợc lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giố ng cây trồng tại Việt Nam .................................................................................................. 6 1.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dƣợc liệu............................. 8 1.2. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ............................................................. 10 1.2.1. Tên khoa học .............................................................................................. 10 1.2.2. Nguồn gốc và phân bố................................................................................ 10 1.2.3. Phân loại ..................................................................................................... 10 1.2.4. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 11 1.2.5. Đặc điểm sinh thái ...................................................................................... 12 1.2.6. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ô đỏ ............................................... 12 1.2.7. Giá trị dƣợc liệu của cây Hà thủ ô đỏ ........................................................ 13 1.2.8. Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ. ........... 14 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 16 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu ................................................................................. 16 2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................... 16 2.1.4. Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 16 2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................... 17 2.2. Quy trình nhân giống .................................................................................... 19 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 20 2.3.1. Phƣơng pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy .......................................... 20 2.3.1.1. Phƣơng pháp chọn mẫu cấy .................................................................... 20 2.3.1.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử.................. 20 2.3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trự c tiếp ........................................................................................................................ 21 2.3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi ....................................................................................................................... 21 2.3.5. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ .................... 22 2.4. Các chỉ tiêu quan sát ..................................................................................... 22 CHƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 24 3.1 Khảo sát nồng độ javen trong khử trùng mẫu cấy ......................................... 24 3.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong môi trƣờng tái sinh chồi trực tiếp ..... 25 3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng nhân nhanh chồi ............................................................................................................ 27 3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA trong môi trƣờng ra rễ ................. 30 III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 33 3.1 Kết luận .......................................................................................................... 33 3.2 Kiến nghị ........................................................................................................ 33 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 34 1 I. MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa họ c công nghệ có triển vọng nhất hiện nay. Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp những kĩ thuật đƣợc sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng, môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng với nhữ ng thành phần xác định. Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật tạ o ra lợi thế nhất định so với phƣơng pháp truyền thống nhƣ: tạo ra số lƣợng lớ n cây giống từ bất kì bộ phận nào của cây, hạn chế tối đa khả năng phát tán sâu bệ nh, bảo tồn các nguồn gen thực vật quý hiếm.3 Thảo dƣợc là nguồn thực vật quý giá để sản xuất và chế biến các loạ i thuốc hữu ích phục vụ việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con ngƣờ i. Vì vậy, nhu cầu trồng trọt các giống dƣợc liệu quý hiếm ngày càng tăng lên. Xuấ t phát từ nhu cầu đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vậ t cung cấp các giống dƣợc liệu cho nông dân đang trở thành xu hƣớng phát triển ở nhiề u tỉnh thành trong cả nƣớc.4 Hà Thủ Ô đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm. Theo Đông y, Hà Thủ Ô đỏ có tác dụng làm đen tóc, bổ máu, an thần, dƣỡng can, ích thận, nhuậ n tràng và kéo dài tuổi thọ. Y học hiện đại xác nhận rằng hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ huyế t áp, chống xơ cứng động mạch, làm giảm lƣợng đƣờng trong máu, tăng cƣờ ng miễn dịch, máu, làm giãn mạch máu, tốt cho tim mạch, thúc đẩy chức năng tuyến thƣợng thận, và thúc đẩy nhu động đƣờng tiêu hóa, bảo vệ tim và mạ ch máu não, bảo vệ gan, tăng trƣởng tóc, chống lão hóa, và kháng khuẩ n. Trong cây Hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng nhƣ: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… 4 Trƣớc đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nƣớc ta khá dồi dào nhƣng do bị khai thác quá mức và nạn phá rừng đã làm cho số lƣợng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút đáng kể, không cung cấp đủ cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữ a bệnh cho con ngƣời. Do đó, việc nhân nhanh Hà thủ ô đỏ với số lƣợng lớn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào là việc làm hết sức cần thiết. 2 Xuất phát từ lí do trên, tôi thực hiện đề tài: “ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)”. 1.2. Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen trong khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA đến tái sinh chồi trực tiếp Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ BA và NAA thích hợ p cho nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ IBA thích hợp cho nuôi cấy tạ o rễ cây Hà thủ ô đỏ. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quả ng Nam. 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam. 1.3.3. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc nghiên cứu thừ tháng 112017 – 32018. 1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp thực nghiệm - Phƣơng pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu. 3 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đề u là thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong điều kiệ n vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: Dựa vào tính toàn năng của tế bào. Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.8 1.1.2. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật Nhân giống in vitro ở thực vật có ý nghĩa và vai trò to lớn đối với việ c nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời góp phần trực tiếp cho thực tiễ n sản xuất và đời sống. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn về việc tìm hiểu sâu sắc bản chấ t của sự sống, thực tế đã cho phép nuôi cấy các mô phân sinh, mô sẹo củ a cây có thể kích thích tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Từ đó, phƣơng pháp nhân giố ng nuôi cấy mô đƣợc sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giố ng cây quý, có giá trị kinh tế cao. Nhân giống in vitro ở thực vật giúp sản xuất số lƣợng lớ n các cây giống cần thiết phục vụ cho nhu cầu hàng ngày của con ngƣời cũng nhƣ trong nông nghiệp, y học. Việc nhân giống in vitro ở thực vật đã mở ra một thời kỳ mớ i cho ngành nông nghiệp của thế giới, một hƣớng đi hoàn toàn mới mẻ và hiện đại.3 1.1.3. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đố i với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiế p cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đƣợc ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ: 4 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phƣơng pháp dung hợ p (nuôi cấy tế bào trần). Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trƣờng lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp nhƣ alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩ m, những chất kìm hãm sự sinh trƣởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp. Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triể n thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn). Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn). Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thƣơng mại. Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. Nuôi cấy phôi sinh dƣỡng, phôi hợp tử. Nuôi cấy quang tự dƣỡng.16 1.1.4. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 1.1.4.1. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới Cuối thế kỉ 19, nhà khoa học ngƣời Đức Haberlandt (1982) là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kì cơ thể sinh vật nào đề u mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cả sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiệ n thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.3 Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thự c vật, khi White ngƣời Mỹ nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng, glucose, và nƣớc chiế t nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nƣớc chiết nấ m men bằng hỗn hợp ba loạ i vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinicaxit. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã đƣợc tiến hành trên nhiều loạ i cây khác nhau.6 5 Năm 1941, Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trƣở ng của nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura). Sau đó năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nƣớc dừa trên mô sẹo cà rốt, trong thời gian này nhiề u chất sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã đƣợc nghiên cứu và tổng hợ p hóa học thành công. 3 Trong thời gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã đƣợc phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách đƣa lắc trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục đƣợc mộ t huyền phù tế bào đơn cây đậu.12 Đến những năm 60, khi đồng thờ i Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo tế bào cà rốt khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đã tạ o thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống nhƣ quá trình tạo phôi bình thƣờng ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng đƣợ c khẳng định.17 Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã đƣợc thông báo, hầu nhƣ tất cả các cơ quan đều có thể phát triể n phôi. Ngày nay, bằng kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, ngƣời ta đã nhân giố ng và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị nhƣ khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lƣơng thực, cây ăn quả…Việc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô đã trở thành công nghệ và đã đƣợc áp dụng ở nhiều nƣớc trên thế giới. Vào đầu những năm 1960, Morel là ngƣời đầu tiên áp dụng thành công kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống lan trong ống nghiệm. Morel và Martin (1952) đã tạo đƣợc cây Thƣợc dƣợc sạch virut bằng cách dùng đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy. Năm 1960, Cooking ở đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thƣc vật, kết quả thu đƣợc các tế bào tròn, không có vỏ bọc gọi là protoplast. Từ năm 1980 - 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật đƣợ c công bố. Nhờ có plasmid, phân tử AND vòng thƣờng có trong tế bào vi khuẩn đƣợc 6 lắp ghép cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thự c hiện thành công hàng loạt công trình chuyển gen ngoại lai vào thực vật.7 Việc ứng dụng nuôi cấy mô ở thực vật trong nhân giống đƣợ c Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách củ a cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệ m. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà đã đƣợc thực hiện ở quy mô thƣơng mại đối với hàng loạ t cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao nhƣ chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả , cây cảnh…Và có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới.14 Hiện nay, rất nhiều loài hoa nhƣ: hoa Lan, Cúc, Đồng tiền…và các loài cây cảnh có giá trị khác cũng đƣợc nhân giống theo phƣơng pháp nuôi cấ y mô. Hiện có khoảng 30 chi phong lan đƣợc nhân giống phổ biến theo con đƣờ ng nuôi cấy mô. Ở Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan…việ c nhân giống theo con đƣờng này đã trở nên rất phổ biến trên các đối tƣợng là hoa nhằ m mục đích thƣơng mại, điển hình nhƣ: Hà Lan là quốc gia có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phát triển, nƣớc này đã ứng dụng lĩnh vực này vào việc nhân và lai tạo giống cây trồng mới đặc biệt là các loài hoa với đa dạng về chủng loại và màu sắc. Thái Lan đã sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân tạ o các loại giống hoa Phong Lan rất thành công.12 1.1.4.2 . Sơ lược lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giố ng cây trồng tại Việt Nam Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm 1975. Ý thức đƣợc triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọ n giống và nhân giống cây trồng bắt đầu ứng dụng công nghệ này. Trong những năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam cũng đã đạt đƣợc những thành tựu nhất định, có rất nhiều tỉ nh thành trong cả nƣớc đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bƣớc đầu đã nhân giống thành 7 công một số loài hoa nhƣ: Cúc, Đồng tiền, Lan, Hồng…có hệ số nhân giố ng cao và cây con có chất lƣợng tốt. Năm 2008 ở nƣớc ta công nghệ nuôi cấy mô đã có những bƣớc độ t phá mới. Một số địa phƣơng nhân giống hoa bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô để thƣơng mại, ngoài ra còn khôi phục nhiều loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng nhƣ các loài lan rừng quý hiếm (Lan Hài Hồng) tại phân viên sinh học Đà Lạt. Đà Lạt là địa phƣơng có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào phát triển rất mạ nh. Việc lai tạo giống thông qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào đƣợc phổ biế n khá rộng rãi. Tại đây các cơ sở nuôi cấy mô của nhà nƣớc và tƣ nhân đều phát triể n mạnh và nuôi cấy rất nhiều giống cây khác nhau, trong đó chủ yếu là các loạ i hoa, hầu nhƣ nông dân trồng hoa ở Lâm Đồng đều sử dụng cây con giống từ cây nuôi cấy mô và đã trồng hoa với các kĩ thuật mới nên đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao.10 Tại những tỉnh thành khác của cả nƣớc cũng đã tiến hành nghiên cứu sả n xuất thử nghiệm các giống cây bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và bƣớc đầu thu đƣợc một số kết quả đáng kể, cụ thể nhƣ: Phòng nuôi cấy mô của trung tâm giống và kĩ thuật cây trồng tỉ nh Phú Yên hằng năm có thể tạo ra hơn 100.000 cây chuối cấy mô theo yêu cầu củ a khách hàng. Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống bạch đàn nuôi cấy mô. Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công việc nhân giống cây Lô Hội bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô đây là một loại dƣợc liệu quý của địa phƣơng. Viện sinh học Nông nghiệp của trƣờng Đại học Nông Nghiệp I Hà Nộ i là một trong 50 cơ sở chuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật, bƣớc đầu cơ sở này đạt đƣợc những kết quả tốt nhƣ nuôi cấy các loài Phong Lan, Dứ a Cayen, khoai tây sạch bệnh, đặc biệt là các loài hoa có giá trị (Lan, Đồng tiền, Cúc…). Hầu hế t các phòng nuôi cấy mô đều có ƣu thế là có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định. 8 Hiện nay công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bƣớc phát triể n nhảy vọt để phục vụ cho nền nông nghiệp. Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định luôn đẩy mạnh việc triển khai ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học về nuôi cấ y mô thực vật để nhân giống phục vụ công tác giống cây trồng t ại địa phƣơng. Trung tâm đã nghiên cứu và hoàn thiện đƣợc nhiều quy trình vi nhân giố ng cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệ p, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Đị nh và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên nhƣ: chuối, đu đủ, dứa, mía, bạch đàn, keo lai…và một số loại Phong Lan (Dendrobium, hồ điệp ngọc điểm), lay ơn, hoa cúc, hoa huệ, đồng tiền… So với các nƣớc phát triển trên thế giới, công nghệ sinh học của Việ t Nam còn một khoảng cách khá xa. Chúng ta đang bƣớc vào giai đoạn phát triển thứ tƣ của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậ c cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó, đang phát triển có những đóng góp tích cực vào lí luận sinh học cây trồ ng và vào thực tiễn phát triển ngành Nông – Lâm nghiệp của nƣớc nhà. 9 1.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dược liệu Một số nghiên cứu trên thế giới: Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài lan Kim Tuyế n ( Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trƣờng vào mẫ u là: 12 MS + 0,2 than hoạt tính + 8 dịch chiết chuối. Môi trƣờng đƣợc sử dụng để nhân chồi là: 12MS + 0,2 than hoạt tính + 8 dịch chiết chuối + 2mgl BAP + 0,5 mgl NAA 1. Năm 2002, Tsay và cs đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trƣờng MS lỏ ng dung tích 500 ml + 2mgl BAP + 0,5 mgl NAA + 2 than hoạt tính 11. Một số nghiên cứu trong nƣớc: 9 Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đƣa ra quy trình nhân giố ng in vitro thành công cho loài lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trƣờng tạo vật liệu ban đầu là H3 ( Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1gl + 20N-20P-20K 1gl) + 2gl peptone. Môi trƣờng nhân nhanh là: H3 + 1 mgl BAP (hoặ c 1-2 mgl TDZ) + 1 than hoạt tính 1. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành đã thành công quy trình nhân giống loài lan Kim Tuyến bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô 4. Năm 2010, Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tƣ đã nghiên cứu nhân giố ng in vitro cây Ba Kích ( Morinda Officinalis How) với môi trƣờng tái sinh chồ i in vitro là MS có bổ sung 0,25 mgL KIN. Môi trƣờng đƣợc sử dụng để nhân nhanh chồi là: MS bổ sung 3,5 mgL BA và 0,2 mgL IBA (với 15,00 chồi mẫu cấ y). Chồi đƣợc tạo rễ tốt nhất trên môi trƣờng MS bổ sung 0,2 - 0,25 mgL IBA. Cây in vitro đƣa ra nhà lƣới đạt 97,9 cây sống sót và sinh trƣởng tố t sau 30 ngày tuổi trồng trên cơ chất đất cát pha 1. Năm 2014, Lê Tiến Vinh và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Đan Sâm (Salvia Miltiorrhiza Bunge) từ hạt với tỉ lệ nảy mầm sau 2 tuần nuôi cấy là 40,43 trên môi trƣờng cơ bản MS + 1,0 mgL GA3. Đoạn thân từ cây đan sâm nảy mầm đƣợc sử dụng làm vật liệu nhân nhanh, môi trƣờng nhân chồi tốt nhấ t là MS + 0,5mgL BA với hệ số nhân chồi đạt cao nhất(5,05 chồimẫu cấy). Môi trƣờng ra rễ thích hợp nhất là môi trƣờng MS có bổ sung 0,75 mgL IAA, cho tỉ lệ ra rễ đạt 100, cây in vitro trên môi trƣờng ra rễ 30 ngày là thích hợp để chuyển cây ra ngoài vƣờn ƣơm thích nghi. Trên giá thể chứa 50 xơ dừ a và 50 cát tỉ lệ cây sống đạt 100, cây sinh trƣởng và phát triển tốt 18. Bùi Văn Thắng và cs đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống cây Đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. F. Et Thomson) bằng kỹ thuậ t nuôi cấy mô, cảm ứng tạo cụm chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mgL kinetin + 0,2 mgL NAA cho hệ số nhân chồi 16,55 lầnchu kỳ nhân (3 tuần), tỉ lệ chồi hữu hiệu là 91,09. Chồi ra rễ khi nuôi trên môi trƣờng MS bổ sung 0,3 mgL IBA, 20 gL sucrose và 7 gL agar với tỉ lệ chồi ra rễ là 100, số rễ 6,17 10 rễcây, chiều cao trung bình 1,07 cm. Cây Đảng sâm con in vitro hoàn chỉnh sinh trƣởng và phát triển tốt sau 4 tuần trồng trên giá thể 100 cát vàng cho tỉ lệ số ng 98,89 11. Phan Thị Thảo Nhi (2016) đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống cây đinh lăng nuôi cấy mô bằng con đƣờng trực tiếp từ phôi soma, môi trƣờ ng nhân nhanh chồi là MS bổ sung 3 mgL BAP. 1.2. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ 1.2.1. Tên khoa học - Bộ (ordo): Cẩm chƣớng (Caryophyllales) - Họ (familia): Rau răm (Polygonaceae) - Chi (genus): Fallopia - Loài ( species): F. multiflora21 1.2.2. Nguồn gốc và phân bố Hà thủ ô đỏ đƣợc tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713. Trên thế giớ i, Hà thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Ấn Độ. Ở Việ t Nam, cây Hà thủ ô đỏ phân bố chủ yếu ở vùng núi phía Bắc nhƣ: Hà Gi ang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… Hiện nay, Hà Thủ Ô Đỏ đƣợc trồng ở nhiều vùng ở phía Bắc và cả ở phía Nam, cây mọc tốt ở Lâm Đồng, Đắk Lắk, Phú Yên, Bình Định.1 1.2.3. Phân loại Hà thủ ô chia làm 2 loại là hà thủ ô đỏ và Hà thủ ô trắng. Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas): là cây thảo thuộc dạng cây leo, dài đến 2m hoặc hơn, thân màu nâu đỏ có nhiều lông, càng non càng nhiều lông. Lá mọc đối, mép nguyên, gân lá hình lông chim, có nhiều lông. Lá mọc đối, mép nguyên lá hình lông chim, có nhiều lông. Toàn cây có nhựa mủ trắng hay còn gọi là hà thủ ô nhựa trắng. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tím, mọc thành xim ngắn. Quả hình thoi. Cây thƣờng mọc hoang ở vùng đồi núi. Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora): còn có tên là dạ giao đằng, dạ hợp, địa tinh, khua lình (dân tộc Thái), mằn năng ón. Trong y học điều trị bệnh, Hà thủ ô đỏ đƣợc dùng nhiều và thông dụng hơn hẳn so với hà thủ ô trắng bởi hàm lƣợng 11 hoạt chất điều trị bệnh có trong Hà thủ ô đỏ là cao hơn, giúp cho khả năng điều trị bệnh của Hà thủ ô đỏ tốt hơn hẳn. Hà thủ ô trắng cũng có công dụng tốt, tuy nhiên so với Hà thủ ô đỏ thì nó không đƣợc nổi trội bằng. Cả hai loại này đều là loại cây có thân leo dạng dây nhỏ, sống lâu năm và thƣờng mọc đan xen lẫn vào những cây khác. Đặc tính của Hà thủ ô đỏ thƣờng có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm, mùi đặc trƣng giúp phân biệt loại cây thuốc này. Đặc điểm bên ngoài khó nhận biết bởi Hà thủ ô đỏ vàHhà thủ ô trắng rất giống nhau. Tên gọi phân biệt là ở màu sắc của ruột củ Hà thủ ô. Củ Hà thủ ô trắng có ruột màu trắng trong khi ruột của củ Hà thủ ô đỏ là màu đỏ. Về công dụng thì chúng khác nhau rất nhiều, nếu Hà thủ ô đỏ đƣợc nh...
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1.1 Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:
Dựa vào tính toàn năng của tế bào
Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.[8]
1.1.2 Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật
Nhân giống in vitro ở thực vật có ý nghĩa và vai trò to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời góp phần trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn về việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống, thực tế đã cho phép nuôi cấy các mô phân sinh, mô sẹo của cây có thể kích thích tái sinh thành cây hoàn chỉnh Từ đó, phương pháp nhân giống nuôi cấy mô đƣợc sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao Nhân giống in vitro ở thực vật giúp sản xuất số lƣợng lớn các cây giống cần thiết phục vụ cho nhu cầu hàng ngày của con người cũng như trong nông nghiệp, y học Việc nhân giống in vitro ở thực vật đã mở ra một thời kỳ mới cho ngành nông nghiệp của thế giới, một hướng đi hoàn toàn mới mẻ và hiện đại.[3]
1.1.3 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đƣợc ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
- Cây Hà thủ ô đỏ đƣợc tuyển chọn tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam
- Mô cấy là phần đoạn thân (1.0 – 1.5 cm) mang một mắt lá của cây Hà thủ ô đỏ trưởng thành ngoài tự nhiên
- Hóa chất để pha môi trường nuôi cấy cần có các thành phần cơ bản sau: + Các muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng
+ Nguồn cacbon: một số loại đường
+ Các chất điều hòa sinh trưởng: BA: 6 – benzyladenin, NAA: α – Napthalen Axetic Axit, IBA: 3 – Indol Butyric Axit
+ Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nước men, dịch chiết khoai tây, chuối khô…
- Các loại hóa chất dùng để rửa và khử trùng trong quá trình nuôi cấy: + Cồn 70 0
+ Nước cất, nước cất vô trùng
+ Dung dịch khử trùng: nước Javen
+ Dung dịch xà phòng loãng
Tất cả các thí nghiệm đƣợc đặt trong phòng nuôi cấy đảm bảo điều kiện:
- Dụng cụ và môi trường làm việc phải tuyệt đối vô trùng
- Thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày
- Cường độ chiếu sáng: 2500 – 3000 lux
Môi trường được sử dụng là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) có bổ sung thêm đường saccarose (30g/l), agar (8g/l) và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Tùy theo mục đích của các thí nghiệm mà môi trường có thể được bổ sung riêng lẽ hoặc kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng ở những nồng độ khác nhau
Các loại môi trường trên sau khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) và hấp khử trùng trong 25 phút ở nhiệt độ 121 0 C và áp suất 1 atm
THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS
Tên chất Thành phần Nồng độ(mg/l)
Khoáng đa lƣợng NH 4 NO 3 1650
Quy trình nhân giống
Chọn mẫu Chọn môi trường
Xử lí mẫu Hấp môi trường Đƣa Hà thủ ô đỏ vào môi trường nuôi cấy
Tái sinh chồi trực tiếp
Tạo và nhân nhanh chồi
Ra rễ cây Đƣa vào bầu và trồng ra ruộng Đưa ra vườn ươm
Sơ đồ 2.2 Quy trình nhân giống Hà thủ ô đỏ
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy
2.3.1.1 Phương pháp chọn mẫu cấy
- Chọn lọc cây mẹ: cây mẹ khỏe, sạch bệnh
- Chọn mẫu cấy: chọn những đoạn thân mang một mắt lá của cây Hà thủ ô đỏ trưởng thành ngoài tự nhiên
2.3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử
* Mục đích thí nghiệm: Xác định đƣợc nồng độ Javen thích hợp để khử trùng mẫu cấy
+ Đặt mẫu dưới vòi nước chảy trong 10 phút để rửa sạch bụi và chất bẩn bám trên mẫu
+ Ngâm mẫu vào dung dịch xà phòng loãng từ 5 – 10 phút
+ Rửa lại từ 2 – 3 lần với nước cất Sau đó đặt vào cốc vô trùng và đem vào tủ cấy
- Khử trùng bên trong tủ cấy
+ Chuyển mẫu sang một cốc vô trùng khác
+ Dùng cồn 70 0 lắc trong vòng 30s
+ Tiếp tục lắc khử mẫu bằng dung dịch javen với nồng độ: 0.3%, 0.5%,0.7%
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần
Bảng 2.1 Các công thức môi trường khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ
Javen đối với mẫu khử
Công thức môi trường Nồng độ Javen (%)
2.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp
* Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ BA thích hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp của Hà thủ ô đỏ
* Tiến hành thí nghiệm: Mẫu Hà thủ ô đỏ được đặt trong môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2
Bảng 2.2 Công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp
Công thức Nồng độ BA (mg/l)
2.3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
* Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp trong nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ
* Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng kết quả của thí nghiệm 2, chọn nồng độ
BA tối ƣu, sau đó cố định BA ở nồng độ tối ƣu và thay đổi nồng độ NAA
Bảng 2.3 Công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
Công thức Nồng độ BA(mg/l) Nồng độ NAA(mg/l)
2.3.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
* Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ Hà thủ ô đỏ
* Tiến hành thí nghiệm: Mẫu Hà thủ ô đỏ ở công thức tối ƣu nhất trong thí nghiệm 3 được lựa chọn và đưa vào môi trường ra rễ với các nồng độ IBA khác nhau
Bảng 2.4 Công thức khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
CT môi trường Nồng độ IBA (mg/l)
Các chỉ tiêu quan sát
Đếm số chồi: tổng số chồi hình thành Đếm số lá: tổng số lá hoàn chỉnh của chồi
Chiều cao thân cây: đo từ rễ lên hết thân
Chiều dài rễ, đo rễ dài nhất, tính theo trung bình cộng
Số rễ hình thành mới trên thân cây tính theo trung bình cộng
Các chỉ tiêu khảo sát gồm:
Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng
- Chất lƣợng chồi ở mức xấu nhất (+): một số chồi dị dạng, số lƣợng chồi bất định nhiều Phát triển chậm, chồi vàng có kích thước bé
- Chất lƣợng chồi ở mức trung bình (++): số lƣợng chồi nhỏ và chồi trung bình nhiều, chồi phát triển chậm, chồi xanh
- Chất lượng chồi ở mức tốt nhất (+++): số lượng chồi có kích thước lớn nhiều, chồi phát triển xanh tốt
Các số liệu được tính toán theo phương pháp thống kê toán học Quá trình xử lí được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 2010 và được mô phỏng bằng các bảng biểu và hình
