Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Hằng

LUẬN ÁN TIÉN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Hằng

Chuyên ngành: Hóa sinh hoc

Mã số: 62420116

LUẬN ÁN TIÉN SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DAN KHOA HỌC:

PGS.TS Phạm Xuân Hội

Hà Nội - 2018

Tôi xin chịu trách nhiệm vê nghiên cứu của mình.

Hà Noi, ngày 26 tháng 8 năm 2018

Nghiên cứu sinh

Phạm Thu Hằng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội (Viện Ditruyền Nông nghiệp) là người thay đã tận tình hướng dan, giúp đỡ và tạo mọi diéukiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận

Tôi xin được cảm ơn gia đình và người than đã luôn ở bên cạnh tôi, quan

tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án.

Hà Nội ngày 26 tháng 8 năm 2018

Phạm Thu Hằng

DANH MỤC CHỮ VIET TẮTT ¿2 2 +E+E£+E+EE£E£EE2E£EE2EEEEEEEEEEEEEEEEErErrerkeree 1M.9/:811008:79) c7 6DANH MỤC HÌNH -¿ - S213 EEE2E9121211111121111111211111 011111111111 cxe 7MỞ DAU (E1 1E 11111211 1111111111115111111 0110111111111 1111111111111 1c 9Chương 1: TONG QUAN - 55522123 2EEE21E2121271217121121111111111 111 cce 131.1 GIỚI THIỆU CHUNG VE CAY L/ÚA -ccccccccccsssscsssccccsssseeeeeeee 13

1.1.1.Đặc điểm sinh học của cây lúa OL yZd S@fiVđ «+ ees 13

1.1.2.Anh hưởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo 141.1.3.Ảnh hưởng của hạn tới cây lúa - ¿c2 S212 16

1.2 VAI TRO CUA NHÂN TO PHIÊN MÃ LIEN QUAN TỚI ĐÁP UNG

STRESS HAN Ở THUC VẬTT -V2222sss°2222222vvzzszsssseriee 281.2.1.Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực

1.2.2.Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật 341.3 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHE CHUYEN GEN VÀO

THUC VAT 0 ~- 41

1.3.1.Giới thiệu chung về vi khuẩn A /nerf@4cieHS - 5< 555555: 411.3.2 Cơ chế phân tử của việc chuyên gen thông qua A fwef#ciens 421.3.3.Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyên gen thực vật 431.4 TINH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIÓNG LUA CHUYEN GEN CHONG

1.4.1.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên

1.4.2.Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam 47Chương 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 50

2.1 VAT LIBU -°°°°°€°©EEEEEEEEEE2222222222222222424242224444444999990900000000000ncrr 50

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu -¿- ¿2c 221 S1 2212112 EEsEsrkerkee 50

2.1.2.Chủng vi sinh VẬ( .c- Quy nh nh nh kề 50

2.1.3.Vector va oligonucleotide cv cv vế 50

2.1.4.Hóa chất - ác 11 112111 1101111111111 111 01 0110111 HH Hà nàng 512.1.5.ThiẾt Đị Q2 102011211121 1121 1221111110111 101111 nà HH nhà Ha 52

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU - -©©©++©t°*++22222222arrrrrrroooee 52

2.2.1.Xử lý mẫu thực vVật - ¿+ 2212221122111 1121151112 eerke 52

2.2.2.Tách chiết, định lượng DNA/RNA 5 2c S212 ssee 53

2.2.3 Nhân dòng gen OsNACI, OsNAC5 và OsNACT0 vào vector pGEM-T 57

2.2.4.Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNACI trong tế bào thực vật 592.2.5.Tạo cây lúa chuyền gen biểu hiện ØsWAC1 -¿-+-<<©+<5: 612.2.6.Sang lọc các dòng lúa chuyển gen - 2c S222 63

2.2.7.Các phương pháp định lượng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa 64

2.2.8.Phương pháp xử lý số liệu thống kê - ¿+ 5-5222 2 22 2x2 65Chương 3: KET QUA NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN - - 25-552 66

3.1.PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TÓ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊNQUAN DEN TÍNH CHIU HAN © LUA - 222222 66

3.1.1.Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam 663.1.2.Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính

chịu hạn -. -ccc 1112001000211 11211 esses een vn nhu nhu kh nhu cu 67

3.1.3.Phân tích biểu hiện của OsNACI, OsNAC5 va OsNACT0 trong điều

3.2 THIET KE VECTOR BIEU HIỆN OsNACI TRONG TE BAO THUC VAT783.2.1 Thiết kế vector biểu hiện OsNACI điều khiển bởi promoter hoạt

động LEM tỤC -cc HH SH TH TH TK TH nh ch ch, 78

3.2.2.Thiết kế vector biểu hiện OsNACI điều khiển bởi promoter hoạt động

[Ò”110809551E-150+).-Eiaiiaầầdidiaẳũ 81

3.2 NGHIÊN CỨU CHUYEN GEN OsNACT VÀO CÂY LÚA 86

3.3.1.Biến nạp vector biểu hiện vào A tumefaciens LBA4404 863.3.2.Nghiên cứu chuyền gen OSNACI vào lúa - -: -++-++5s+ 552 873.3.3.Sàng lọc các dòng lúa tái sinh được chuyển cấu trúc biểu hiện

LUẬN AN.oecessscsssscsssssesessssssssesscssssssccsssussssusssssssesussssusssssssessssssssssesussesussesseseeess 119

TAI LIEU THAM KHAO 0.00 .ceccsccscsscssssessssessssesssssssscssssssessssessssessssesesestseessiess 120

PHU LUC oceeccecccssccsssesscscscsscscsucscsscssssssvssssvsscsecsssusassucsssucscsussesassessssesissesassessssecsees 1

DANH MỤC CHU VIET TAT

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

ABA : Abscisic acid

ABRE : Yếu tố dap ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT

(ACGT-containing abscisic acid response element)AD : Vung tác động (acting domain)

AMP : Adenosine monophosphateATP : Adenosine triphosphate

BAP : 6-Benzylaminopurine

BD : Vùng liên kết (binding domain)

BDKH : Biến đổi khí hậu

bp : Cặp bazo (base pair)

cDNA : DNA bồ sung (complementary deoxyribonucleic acid)Œ, : Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle)

DEPC : DiethylpyrocarbonateDMSO : Dimethyl sulfoxide

EtBr : Ethidium bromide

IPTG : Isopropyl B-D-1-thiogalactopyranoside

kb : Kilobase

LB : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani

LEA : Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của

phôi (late embryogenesis abundant)

MCS : Vùng nhân dòng đa điểm cat (multiple cloning site)

MOPS : Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic

4

: Messenger ribonucleic acid

: Môi trường nuôi cay thực vat Murashige & Skoog

: 1-naphthaleneacetic acid: NAM/ATAF1/2/CUC2

: Trinh tự nhận biết protein NAC (NAC recognition

: Nhiễm sắc thé

: Mật độ quang học (optical density)

: Khung đọc mở (open reading frame)

: Phan ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction)

: Polyethylene glycol

: Phản ứng nhân bản DNA sao chép ngược (reversetranscription polymerase chain reaction)

: Các chất oxy hoạt hóa (reactive oxygen species)

: Hàm lượng nước tương đối (relative water content)

: Phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng thời gian thực

(Real-time quantiative polymerase chain reaction): Sodium dodecyl sulfate

: Dém Tris-acetate-EDTA: Dém Tris-EDTA

: Nhân tố phiên mã (transcription factor)

: Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid)

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside

DANH MỤC BẢNG

Bang 1.1: Chức năng của nhân tố phiên mã NAC ¿2-5 + 2 ++£+£££zxzzces 40

Bảng 2.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu 50

Bảng 2.2: Thang điểm đánh giá khả năng chịu han của cây lúa theo IRRI 52

Bảng 3.1: Kết qua đánh gid khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam 66

Bang 3.2: Kết quả chuyên gen vào lúa thông qua vi khuẩn A tumefaciens 88

Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh được chuyên gen OsWACT - 91

Bảng 3.4: Kết qua xác định số lượng ban sao gen kháng Hygromycin trong cây lúachuyển gen TTọ -¿- ¿5 + St2St2E2E9EEEEEEEE22121121212121121121111111121121111121 111.1 xe 93Bảng 3.5: Kết quả sinh trưởng của cây lúa chuyền gen Ty trong nhà lưới 94

Bang 3.6: Kết quả sang lọc các dong lúa chuyền gen TTỊ, ¿- - - z s+s+sess 95Bang 3.7: Kết qua sinh trưởng của các cây lúa chuyên gen đời T¡ 96

Bang 3.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu han của các dòng lúa chuyên gen dựatren dO v08 1017 ằằ 104Bang 3.9: Kết quả xác định hàm lượng nước tương đối trong dòng lúa chuyên gen 105

Bang 3.10: Hàm lượng chat diệp lục a trong các dòng lúa chuyền gen 107

Bảng 3.11: Hàm lượng chat diệp lục b trong các dòng lúa chuyền gen 108

Bảng 3.12: Hàm lượng chat diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyền gen 109

Bảng 3.13: Hàm lượng proline trong các dòng lÚa - - «<< <c+sse++ 111Bang 3.14: Kết quả so sánh tương quan kha năng chịu hạn của các dong lúa 115

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress hạn 29Hình 1.2: Sơ đồ câu trúc protein NAC ¿- + ++x+x+2x+E2E2E2Erxerkerxerrrree 36Hình 1.3: Mạng lưới điều hòa phiên mã các gen đáp ứng stress phi sinh học củanhân tố phiên mã NAC ở lúa 2- + ¿55 2++S++S£2EE2E2E£EEEEEEEESEEEEerxerxerrerrrree 39Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM-

Lip9/OsNAC l HH HH HH TH 60

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pBI-35S/OsNAC và pBI-Ubi/OsNACI 61Hình 3.1: Tach chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn -. -:-2 +5+¿ 68Hình 3.2: Nhân bản gen OsNACI, OsNACS và OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR 70Hình 3.3: Sang lọc thể biến nap bang PCR trực tiếp khuẩn lạc - - 71Hình 3.4: Kiểm tra plasmid tái tổ hop bang PCR - - 2 + 2+x+£zEerxzrerxee 72Hình 3.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bang enzyme cắt giới hạn 73

Hình 3.6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNACI, OsNACS và

OsNAC10 của giống lúa Te Đỏ - 5-5-5 S6 SE 1 1E 121215212121112111 11111 te 75Hình 3.7: Biéu hiện của OsNACI, OsNACS và OsNAC10 trong điều kiện hạn 77Hình 3.8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNACI bang enzyme cắt giới

I0 “-‹‹+1 79

Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lac mang pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNACI 80

Hình 3.10: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNACI và pBI-35S/OsNACI 81

Hình 3.11: Xử lý vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bang enzyme cắt giới

Hình 3.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang Rd29A/OsNACI và

Hình 3.13: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd29A/OsNACI và pCAM-Lip9/OsNACI bằng PCR và cắt giới hạn 2- 52s E2 E2 2121212121211 cree 84Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lac mang pCAM-Rd/OsNACI, pBI-35S/OsNACI,

7

pBI-Ub1/OsNACT1 và pCAM-Lip9/OsNACT -c ch ng re 86

Hình 3.15: PCR trực tiếp khuan lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301 87Hình 3.16: Chuyén cấu trúc biéu hiện gen OSNACI vào lúa - 5+: 90

Hình 3.17: Biểu hiện của OsNACI trong các dòng lúa chuyên gen Ubi:OsNACI 98

Hình 3.18: Biéu hiện của OsNACI trong các dòng lúa chuyén gen Lip9:OsNACI 99Hình 3.19: Đánh giá kha năng sinh trưởng của các dòng lúa chuyền gen 101Hình 3.20: Các dòng lúa sau 2 tuần xử lý hạn - 2 + 2+s+cz+xez+zxezxzxees 103Hình 3.21: Ảnh hưởng của hạn đến sự tích tụ HO) trong lá lúa - 112Hình 3.22: Khả năng phục hồi của các dòng lúa chuyên gen và dòng đối chứng sau

MO DAU

1 Dat van dé

Dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy rathường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làmgiảm sản lượng cây trồng Trong khi đó, dân số toàn cầu tăng nhanh, ước tính năm2050 sẽ tăng lên 9 tỷ người, ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực, tạo ramột áp lực lớn cho việc đảm bảo lương thực Vi vậy, an ninh lương thực là van déthen chốt của nền khoa học nông nghiệp thé giới nói chung và Việt Nam nói riêng.

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực quan trọng nhấtcủa con người Trên thế giới, cây lúa được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì vềdiện tích và sản lượng Ở Việt Nam, cây lúa có vai trò đặc biệt quan trọng, chiếm tỉlệ cao nhất trong tông sản lượng lương thực quốc gia (60%) và được canh tác vớidiện tích lớn nhất (xấp xỉ 3,8 triệu ha) Tuy nhiên, hầu hết diện tích trồng lúa đangđược canh tác trong môi trường bap bênh, rất dé bị tác động bởi các yếu té thờitiết cực đoan, đặc biệt là hạn Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và đặc tínhcác gen đáp ứng hạn, tiến tới tạo dòng/giống lúa có năng suất cao, đồng thờichống chịu được với điều kiện bat lợi ngoại cảnh hạn có ý nghĩa quan trọng đặcbiệt trong việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phan giữ ôn định an ninh

lương thực quốc gia.

Tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tượng bão hòa trong những năm gầnđây chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đadạng di truyền các giống lúa và sự xuất hiện ngày càng nhiều côn trùng, dịch bệnhvà bất lợi ngoại cảnh Trong xu thế đô thị hóa đang diễn ra mọi nơi, nếu chỉ sử dụngcác phương pháp truyền thống trong việc tăng năng suất lúa thì sản lượng lúa gạocủa Việt Nam không thê đáp ứng được tốc độ tăng dân số và nhu cầu xuất khẩu Dođó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp giữa phương pháp truyền thống và công nghệsinh học trong chọn tạo giống lúa mang các tính trạng quý như chống chịu hạn,

9

mặn Trong khi các phương pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yêudé duy trì sự 6n định thì các phương pháp công nghệ sinh học hiện dai sẽ đóng vai

trò quan trọng trong việc hiện thực hóa bước nhảy vọt trong chọn tạo giốn g lúa.

Tinh trạng chiu hạn là tính trạng da gen mà sự biểu hiện của mỗi gen liênquan chặt chẽ với quá trình phiên mã Vì vậy, nhóm gen mã hóa nhân tổ phiên mãđang là trọng tâm trong các nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn theo định hướngchuyển gen Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếpvào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai tròđiều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tăng cường khả năng chịu han củathực vật Nhiều nghiên cứu đã chứng minh cây lúa chuyển gen mã hóa nhân tổphiên mã tăng cường khả năng chịu hạn so với cây không chuyền gen.

Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC là họ nhân tô phiên mã lớn nhất vàđặc trưng của thực vật Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trìnhsinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già hóa,tạo thành tế bào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trường như hạn, mặn vàlạnh của tế bào Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa như

SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã được chứng minh có

liên quan tới quá trình đáp ứng hạn và cây lúa chuyển các gen tăng khả năng chịuhan và năng suất cao hơn so với cây không chuyên gen trong điều kiện hạn.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiêncứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quanđến tính chịu hạn” với mục tiêu tạo ra các dòng lúa chuyên gen chống chịu hạn,đồng thời không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển Các kết quả

thu được sẽ là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây

trồng chuyền gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn.

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, thiết kế vector chuyên gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên

10

quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam.

Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khảnăng chống chịu hạn.

Đối tượng và nội dung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án:

Các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn củagiống lúa Việt Nam.

Các nội dung nghiên cứu chính:

> Nội dung 1: Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm

OsNACI, OsNAC5, OsNACT0 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam;

> Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc biểu hiện gen OsNACI ở thực vật dưới sựđiều khiển của promoter hoạt động liên tục (Ubiquitine, 35S) và hoạt động cam ứng

stress (Lip9, Rd29A).

> Nội dung 3: Nghiên cứu chuyên gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNACI vào lúa.

> Nội dung 4: Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các

dòng lúa chuyên gen.

Địa điểm nghiên cứu

Luận án được thực hiện tại 3 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Phân tử,Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam); Phòng Thínghiệm Việt — Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệpViệt Nam); Phòng Thí nghiệm tương tác cây trồng - vi sinh vật thuộc Trung tâmnghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp.

Đóng góp mới của luận án

Luận án đã phân lập được 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồmOsNACI, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa ban địa Việt Nam (lúa Tẻ Đỏ) Luậnán đã tạo được các hệ vector biểu hiện trong tế bào thực vật mang gen OsNAC]được điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin và 35S) va promoter

11

hoạt động cảm ứng stress (Lip9 và Rd29A) Luận án đã tao được một sé dong luachuyên gen biểu hiện gen đích, sinh trưởng bình thường trong điều kiện không xử lyhạn và có khả năng chịu hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyền gen.

Ứng dụng thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra được các dòng lúa Tạ mang mộtbản sao của gen OsNACI ở dạng đồng hợp biểu hiện dưới sự điều khiển củapromoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 va promoter hoạt động liên tụcUbiquitin Cây chuyên gen có kiểu hình tương đồng với cây đối chứng khôngchuyên gen (về khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất) trong điều kiện bìnhthường không có stress hạn, trong khi khả năng chịu hạn và tỷ lệ sống sót cao hơntrong điều kiện xử lý stress hạn Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứngdụng của gen OsNACI nói riêng và các gen mã hóa nhân tổ phiên mã thuộc nhómNAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung trong công tác tạo giống cây chuyểngen chịu hạn Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNACI doluận án tạo ra đang được nghiên cứu chuyền vào các giống cây trong quan trọng nhưngô, bông, đậu tương dé tạo ra các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng

nhu câu câp thiệt của sản xuât trong điêu kiện thay đôi khí hậu toàn câu ở Việt Nam.

12

Chương 1: TONG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CAY LUA

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa

Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), ho Hòa thảo

(Graminaceae), chi Oryza Chi Oryza phân bố rộng trên thé giới, trong đó có 23loài hoang đã và 2 loài lúa trồng (O sativa và O glaberrima) Loài Oryza sativa L.(2n = 24) được trồng phổ biến trên thế giới, tập trung chủ yếu ởcác quốc gia châu A.Dựa vào đặc điểm hình thái, Kato và cộng sự (1928) đã đề nghị phân chia lúa Oryza

sativa L thành 2 loài phụ là Oryza sativa L indica (lúa Indica) va Oryza sativa L.

japonica (lúa Japonica) Lua Indica thường phân bồ ở vĩ độ thấp như An Độ, Việt Nam,Indonexia cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trau mỏng, com khô, nởnhiéu, Lúa Japonica thường phân bố ở vĩ độ cao như: Nhật Bản, Bắc Trung Quốc,châu Âu cây thấp, lá to xanh đậm, bông chum, hạt ngăn, vỏ trau day, cơm dẻo, ít

Lúa có kiểu hình đa dạng, được trồng ở cả hệ sinh thái vùng cao và vùngthấp Tuy nhiên, khoảng 76% sản lượng gạo toàn cầu được sản xuất từ lúa nước ở

hệ sinh thái vùng đất trũng Theo IRRI (2002), sự phát triển của cây lúa được chia

thành ba giai đoạn, bao gồm: sinh dưỡng (vegetative), sinh san (reproductive) vàchín (ripening) Tiềm năng năng suất lúa được hình thành/xác định trong giai đoạnsinh dưỡng Chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh (liên quan đến số lượng bông), sự

phát triển của rễ, diện tích lá là những đặc điểm chính của giai đoạn sinh trưởng.

Kích thước và hình thái bông được quyết định trong giai đoạn sinh sản, trong khi kíchthước hoặc khối lượng của hạt được quyết định trong giai đoạn chín Giai đoạn sinh sảnđược xác định là giai đoạn cây lúa nhạy cảm nhất với stress sinh học và phi sinh học,ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này [71].

Thời gian sinh trưởng của cây lúa được tính từ lúc nảy mầm cho đến khichin, đao động từ 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh Trong canh

13

tác lúa hiện đại, thời gian sinh trưởng của các giống lúa được các nhà nông họcquan tâm đặc biệt do liên quan trực tiếp đến năng suất và cơ cấu thời vụ, luân canh.Giống lúa có thời gian sinh trưởng quá ngắn hoặc quá dài có năng suất thấp do sinhtrưởng dinh dưỡng bị hạn chế (đối với giống lúa có thời gian sinh trưởng quá ngắn),dễ bị lốp đồ và chịu nhiều tác động bat lợi của điều kiện ngoại cảnh (đối với giỗnglúa có thời gian sinh trưởng quá dài) Ngược lại, các giống có thời gian sinh trưởng trungbình trong khoảng 120 - 135 ngày có khả năng cho năng suất cao hơn nhiều Giống lúasinh trưởng dai ngày tạo ra lượng chất khô lớn nhưng tỷ lệ hạt/rơm ra thấp, riêng cácgiống lúa có thời gian sinh trưởng từ 130 - 150 ngày, ty lệ hạt/rơm ra đạt cao nhất [78].

Đẻ nhánh là tính trạng số lượng, có hệ số di truyền thấp cho đến trung bìnhvà chịu ảnh hưởng rõ rệt của điều kiện ngoại cảnh Trong quá trình sinh trưởng,nhánh lúa được hình thành từ các mầm trên thân Các giống lúa khác nhau có thờigian đẻ nhánh khác nhau Khả năng đẻ nhánh có ý nghĩa đáng kể đối với năng suất

sau này của cây lúa [69].

Chiều cao cây lúa cũng là một chỉ tiêu hình thái có liên quan đến một số chỉtiêu sinh trưởng khác, đặc biệt là khả năng chống đồ của cây lúa Các nhà khoa họcở Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã chứng minh các giống lúa lùn có nguồn gốctừ Trung Quốc mang gen lùn là gen lặn không ảnh hưởng đến chiều dài bông lúa, cóý nghĩa rat quan trọng trong công tác chọn tạo giống [69].

1.1.2 Anh hướng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo

Lúa gạo là cây lương thực chính của người dân châu Á Mặc dù năng suất lúagạo đã tăng lên theo thời gian sau cuộc cách mạng xanh Những năm gần đây, dotác động của biến đổi khí hậu đặc biệt là hạn hán thường xuyên xảy ra làm ảnhhưởng không nhỏ đến sự tăng năng suất lúa gạo Ít nhất 23 triệu ha trồng lúa (20%tổng diện tích trồng lúa) ở châu Á chịu ảnh hưởng của hạn hán [105] Hạn hán đãgây ra sự thiếu hụt lương thực ở nhiều mức độ khác nhau, dẫn đến nạn đói xảy ra 0các khu vực khác nhau của châu A và châu Phi Ở An Độ, hạn hán những năm

14

1918, 1957 - 1958 và 1965 đã dẫn đến nạn đói trong thế kỷ XX [46] Hạn hán năm1987 đã ảnh hưởng đến gần 60% tổng diện tích trồng trọt và 285 triệu người trênkhắp Án Độ [132] Tương tự, khu vực bị ảnh hưởng hạn hán hàng năm trung bình ởTrung Quốc trong giai đoạn 1978 - 2003 được ước tinh là 14 triệu ha và chi phí kinhtế trực tiếp xử lý hạn hán chiếm khoảng 0,5% - 3,3% GDP của ngành nông nghiệpTrung Quốc Ở Thái Lan, hạn hán năm 2004 ước tính đã ảnh hưởng đến 2 triệu hadiện tích trồng và hơn 8 triệu người [22] Mới đây, Bộ Nông nghiệp My đã công bố

số liệu cho thay, lượng gạo tồn kho tại ba quốc gia xuất khâu gạo hàng đầu thé giớilà Thái Lan, An Độ và Việt Nam sẽ giảm xuống còn khoảng 19 triệu tấn vào cuốinăm 2016 Đây là mức giảm lớn nhất ké từ năm 2003 trở lại đây Việc nguồn cungkhông được đảm bảo sẽ tác động đến an ninh lương thực của 7,2 tỷ người trên thếgiới Gánh nặng này càng tăng nếu dân số thế giới tăng lên 9,6 tỷ người vào năm2050 Điều này đồng nghĩa với việc sản xuất nông nghiệp cần phải tăng 70% dé đápứng nhu cầu thực phẩm của người dân Liên hợp quốc cảnh báo, nếu nguồn cunglương thực không được đảm bảo, thế giới sẽ có thêm 60 triệu người nữa bị thiếu ăncùng với gần 1 tỷ người suy dinh dưỡng vào năm 2020 [162].

Việt Nam là một trong số các quốc gia bi tac động nặng nề nhất bởi biến đổikhí hậu Sự xuất hiện thường xuyên của hạn hán tiếp tục đe dọa nghiêm trọng đếnnền sản xuất lúa gạo trong nước [134] Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn

hán, sản lượng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nước, đặc biệt là

vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có xu hướng giảm dan, có thé giảm tới 12,5% vào

năm 2050 và 16,5% vào năm 2070 Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày

càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trường thế giới do Việt Nam là một trongnhững nước xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới Chính vì vậy, các chínhsách tăng trưởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp dé đối phó với hạnhán phải được chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sựtham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [163].

15

1.1.3 Ảnh hướng của hạn tới cây lúa

Cây lúa đòi hỏi lượng nước lớn hơn rất nhiều so với các cây trồng khác trongsuốt chu kỳ sống Trung bình dé sản xuất 1 kg hạt lúa cần 3.000 — 5.000 lít nước, trongkhi dé sản xuất 1 kg hạt lúa mỳ hoặc ngô thì lượng nước chỉ cần khoảng 1⁄2 Chính vi vậy,hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa gạo Hạn ảnh hưởngtiêu cực đến cây lúa ở tất cả các đặc điểm, bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phântử Qua đó, hạn ảnh hưởng tới năng suất cây lúa [144].

1.1.3.1 Ảnh hướng của hạn tới đặc điểm hình thái

Cây lúa khi tiếp xúc với hạn bị giảm khả năng hấp thu nước ở rễ, đồng thờităng tỷ lệ thoát hơi nước, dẫn tới suy giảm quá trình sinh trưởng, phát triển và cuốicùng là giảm năng suất Khi hạn xảy ra, cây lúa phản ứng bằng cách làm chậm hoặcngừng sinh trưởng Đây là phản ứng bình thường giúp cây lúa giảm sự mat nước,đóng vai trò như một cơ chế sông sót Khi đó, cây lúa có những thay đổi hình tháilinh hoạt nhằm giảm thiểu sự mat nước, đồng thời duy trì lượng nước hap thụ vàocơ thé Ở mức độ hình thái, lá và rễ là hai cơ quan bị ảnh hưởng nặng nề nhất và cảhai cơ quan này đều có vai trò quan trọng đối với khả năng thích nghi điều kiện hạncủa cây lúa Chính vì vậy, sự biến đồi kiểu hình trong điều kiện hạn của cây lúa thểhiện rõ nhất ở hai bộ phận này.

Lá dong đóng vai trò quan trọng duy trì sự tong hợp và vận chuyền sản phẩmquang hợp trong điều kiện hạn ở cây lúa Dưới điều kiện hạn, năng suất và đặc điểm

lá đòng có mỗi tương quan dương Chính vì vậy, các đặc điểm như diện tích, hàm

lượng nước tương đối, hàm lượng chlorophyll, của lá dong được đề xuất trongchọn tạo giống lúa chống chịu hạn [39] Cuốn lá là một trong những đáp ứng ở câylúa trong điều kiện hạn Nếu sức trương tế bào duy trì đưới điều kiện thiếu nước thìđộ cuốn lá diễn ra chậm Tuy nhiên, dưới điều kiện thiếu nước nghiêm trọng, độcuốn lá tăng, dẫn đến ngăn ngừa sự thoát hơi nước và mất nước, giúp duy trì thếnước trong tế bào Do đó, cuốn lá là một phản ứng thích nghi của cây lúa dưới điều

16

kiện thiếu nước và độ cuốn lá cũng được sử dụng như một tiêu chí đánh giá khả

năng chịu hạn ở cây lúa [58, 118].

Bộ rễ giữ vai trò quan trọng trong việc đáp ứng với điều kiện hạn ở cây lúa.Bộ rễ hút nước, hấp thụ dinh dưỡng từ đất [115] Dưới điều kiện hạn, đặc điểm cấutrúc và mức độ phát triển của bộ rễ là yếu tố quyết định giúp duy trì năng suất lúa.Trong điều kiện thiếu nước nhẹ, sự phát triển hệ rễ được ưu tiên, trong khi sự pháttriển chồi bị ức chế Điều này là do sự thiết lập, điều chỉnh lại gradient thế nướcthông qua việc điều chỉnh thâm thấu và nới lỏng thành tế bào, giúp rễ vẫn phát triểntăng trưởng trong điều kiện thế nước thấp, trong khi cơ chế này không được điều hòaở lá [65] Đồng thời, rễ ăn sâu tăng cả về chiều dài và khối lượng hoặc cuộn lại vớinhau đâm sâu dưới tầng đất giúp tăng cường khả năng hút nước Ở các giống lúa chịuhạn thì chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ/cây ở các giống chịu hạn cao hơn rất nhiềugiỗng đối chứng Như vậy, khối lượng khô và chiều dài của rễ là một tiêu chí tốt đánhgiá tiềm năng năng suất dưới điều kiện hạn [48].

1.1.3.2 Han ảnh hưởng tới đặc điểm sinh lý

Hạn hán ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý khác nhau ở cây lúa Cây lúaphản ứng lại với stress hạn bằng các đáp ứng sinh lý giúp chúng thích ứng với điềukiện thiếu nước Tối ưu hóa các quá trình sinh lý là điều kiện tiên quyết giúp cây lúatăng hiệu suất sử dụng nước Một đáp ứng quan trọng ở cây lúa là khả năng duy trìthế nước trong các mô, co quan bang cách giảm áp suất thấm thấu trong tế bào,được coi như một cơ chế đáp ứng hạn [91, 123] Thiếu hụt nước ảnh hưởng tới quátrình sinh lý ở lúa theo nhiều cách khác nhau, bao gồm quá trình quang hợp, tốc độ

thoát hơi nước, hoạt động đóng mở khí khong, hiệu quả sử dung nước, Ở lúa, các

thông số này đều giảm dưới tác động của hạn [30, 39].

Hạn ảnh hưởng tới quang hợp: Đáp ứng đầu tiên của cây lúa khi môi trườngtrở nên khô hạn là đóng khí không để giảm sự thoát hơi nước Hoạt động này dẫntới hệ quả ngăn can dòng CO; đi vào lá và làm giảm quá trình cố định carbon, dan

17

tới sự dư thừa điện tử, từ đó tạo ra các chất oxy hoạt hóa (reactive oxygen species ROS) gây độc tế bào Khả năng đồng hóa CO; giảm cũng đồng thời làm tăng tínhnhạy cảm của thực vật với những ton thương do ánh sáng mặt trời gây nên [47, 82].Dé giảm sự mat nước, ngoài cơ chế đóng mở khí khổng, cây lúa còn giảm tiết diệnlá, thu hẹp độ che phủ tán lá và tăng tính nhạy cảm của lá non Đây là những yếu tốảnh hưởng trực tiếp tới bộ máy quang hợp, dẫn tới sự giảm kha năng tông hợp vàtích lũy sinh khối của cây lúa Do bị thiếu nước, thê tích tế bào giảm, tế bào chất trở

-nên đặc hơn, dẫn tới làm tăng tính tương tác giữa các phân tử và các protein dễ bị

phân hủy hơn Độ nhớt của tế bào chat tăng có thé gây độc cho tế bao và ảnh hưởng

tới hoạt động chức năng của các enzyme, trong đó có cả các enzyme của bộ máy

quang hợp Thực nghiệm đã chứng minh trong giai đoạn bi stress hạn, hoạt tính của

các enzyme quang hợp như phosphoenolpyruvate carboxylase, nicotinamide

adenine dinucleotide phosphate-malic enzyme, Rubisco, fÍructose-l,

6-bisphosphatase va pyruvate orthophosphate dikinase giảm từ 2 — 9 lần, tương ứngvới sự giảm thé nước của lá Bên cạnh các enzyme quang hợp, thành phan sắc tốnhư điệp lục và các carotenoid cũng đóng vai trò rất quan trọng đối với quá trìnhquang hợp Các sắc tố này có nhiệm vụ thu năng lượng từ ánh sáng dé tạo ra lựckhử cho quá trình quang hợp Tuy nhiên, trong điều kiện cây lúa bị stress hạn, domảng lục lạp bị tốn thương, cấu trúc không bảo bị biến đồi, cùng với sự xuất hiệncủa các giọt lipid và các chất oxy hoạt hóa khiến cho hàm lượng và tỉ lệ giữa cácthành phan sắc tố (diệp luc a, điệp luc b và carotenoid) bị thay đối, dẫn tới làm giảmquá trình quang hợp của cây Quang hợp là quá trình trao đổi chất chính quy địnhnăng suất cây trồng, vì vậy hạn làm giảm quá trình quang hợp qua đó làm giảm năngsuất cây trồng [76, 82].

Han ảnh hưởng tới sắc tổ quang hợp: Hạn là nguyên nhân gây ra những thayđổi liên quan đến chức năng trao đôi chất Một trong những thay đổi đó là làm mathoặc giảm kha năng tông hợp sắc tố quang hợp Quá trình thu nhận ánh sáng giảm,

18

dẫn đến năng lượng cung cấp cho pha tối của quang hợp giảm Những thay đổi vềhàm lượng sắc tố quang hợp có liên quan chặt chẽ về sinh khối và sản lượng.Chlorophyll là một trong các sắc tố quan trọng của bộ máy quang hợp, có chứcnăng hấp thu ánh sáng và chuyển năng lượng ánh sáng tới trung tâm phan ứngquang hợp Chlorophyll a và b đều dé bị phá hủy dưới điều kiện hạn Tuy nhiên, cácsắc tố quang hop carotenoid khác được bổ sung trong cấu trúc sắc tố quang hop,giúp cây chống chịu han Hàm lượng chlorophyll giảm và tới đa hóa hiệu suất lượngtử của hệ PSII (Fv/Fm) đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu ở lúa chịu hạn

[130] Theo Yang và nhóm nghiên cứu, hàm lượng chlorophyll và Fv/Fm giảm rõ

rệt ở dong lúa dưới điều kiện hạn Hàm lượng chlorophyll giảm có thé do cảm ứngvới stress hạn gây nên sự suy giảm quá trình sinh tổng hợp sắc tố, phá hủy sắc tố,mat mát lục lap hoặc tăng quá trình oxy hóa lipit [154].

Hạn ảnh hưởng tới hiệu quả sử dụng nước: hiệu suất sử dụng nước (wateruse efficiency - WUE) là một trong những yếu t6 quan trọng quy định năng suất câytrồng dưới điều kiện hạn và được coi như một chiến lược trong cải tiến giống câytrồng chống chịu hạn Ở giống lúa Basmati, các thông số như cường độ quang hợp,hàm lượng nước tương đối và độ dẫn khí không có mối tương quan thuận với WUEthì tốc độ thoát hơi nước lại tỷ lệ nghịch với WUE dưới điều kiện hạn.

Han anh hưởng tới hormone Abscisic acid (ABA): ABA là hormone điều hòasinh trưởng va tham gia vào các đáp ứng với bat lợi phi sinh học ở cây lúa Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh vai trò trung gian trong đáp ứng hạn của ABA thông qua

một loạt con đường truyền tín hiệu Hai chức năng được nghiên cứu nhiều nhất củaABA trong đáp ứng stress hạn là đóng khí khong và điều hòa biểu hiện của mộtnhóm lớn các gen đáp ứng stress Teng và cộng sự đã chứng minh, trong điều kiện

hạn, cây lúa xử lý ABA ngoại sinh sẽ phục hồi tốc độ quang hợp, độ dẫn khí không,

tốc độ thoát hơi nước va tăng biểu hiện của nhiều gen tham gia đáp ứng han [138].Tương tự, Ahmad và nhóm nghiên cứu đã chỉ ra răng, ABA điều hòa quá trình đóng

19

mở khí khong va qua đó điều hòa quá trình thoát hơi nước Trong điều kiện stressdo thiếu nước, hàm lượng ABA tăng mạnh gây ức chế hoạt động của bơm phụthuộc ATP cản trở hấp thụ K+, làm nước rò rỉ ra ngoài gây nên sự giảm sức trươngnướckhiến cho khí không đóng lại [12] ABA cũng là yếu tô hoạt hóa biểu hiệnnhiều gen mà sản pham của các gen này tham gia vào các đáp ứng hạn khác nhau.Các gen này chủ yếu được kích hoạt biểu hiện bởi một nhóm nhân tố phiên mã liênkết đặc hiệu với promoter chứa yếu tố đáp ứng ABA [116] Các phát hiện nàychứng tỏ vai trò trung tâm của ABA trong đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật nói

chung và cây lúa nói riêng.

1.1.3.3 Ảnh hướng của hạn tới đặc điểm sinh hóa

Khi điều kiện thiếu nước xảy ra, cây lúa tích tụ các chất vô cơ, hữu cơ hòatan trong tế bào chất nhằm duy trì thế nước thấp, qua đó duy trì sức trương nước củatế bào Quá trình sinh hóa này được biết đến như là cách điều chỉnh áp suất thẩmthấu tế bào và phụ thuộc vào áp lực gây ra bởi sự thiếu nước của cây lúa Điềuchỉnh áp suất thâm thấu đạt được bằng cách tích tụ proline, sucrose, glycinebetainevà các chất tan khác trong tế bào chất, qua đó cải thiện khả năng hấp thu nước từ đấtkhô hạn Trong số các chất tan này, proline đóng vai trò quan trọng và được nghiêncứu khá rõ trong đáp ứng stress Hạn cũng gây tích tụ các chất đường hòa tan Mộtphản ứng sinh hóa quan trọng khác là sự tăng hoạt động chống oxy hóa, cải thiệnkhả năng chịu hạn bằng cách loại bỏ các chất ROS.

Vai trò proline trong đáp ứng hạn: Proline là một loại acid amin, có khốilượng phân tử nhỏ, hòa tan tốt trong nước và tham gia vào nhiều chức năng sinh họckhác nhau ở thực vật Dưới điều kiện hạn, proline đóng vai trò then chốt trong sựđiều chỉnh áp suất thầm thấu ở tế bào thực vat Hơn nữa, các chất nay không độc khitập trung với nồng độ cao và làm ôn định cấu trúc của các phân tử protein, giúpthành tế bào chống lại ảnh hưởng của sự tập trung muối cao và các chất tan có hạicho tế bào Sự tích lũy proline có ý nghĩa quan trọng, bởi chúng đóng vai trò nòng

20

cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược gradien nồng độdưới điều kiện stress hạn Báo cáo đầu tiên về sự tích lũy proline tự do được đưa ra

bởi Kemble và Mac-Pherson ở cỏ lúa mạch đen (1954) [77] Sau đó, những nghiên

cứu tương tự cũng được thấy trên đối tượng cây lúa Dưới điều kiện thiếu nước,hàm lượng proline trong cây lúa có sự thay đổi đáng kể Hàm lượng proline tăngnhiều lần ở cây xử lý hạn so với cây đối chứng không xử lý hạn [62, 94] Sự tích lũy

proline là phản ứng thông thường ở thực vật nói chung và ở cây lúa nói riêng trong

điều kiện thiếu hụt nước [96].

Ngoài vai trò là chất điều hòa áp suất thâm thấu tế bào, proline còn giữ vaitrò là chất chống oxy hóa, phân tử bảo vệ tế bào, bảo vệ protein và là phân tử tínhiệu Proline là chất loại bỏ gốc hydroxyl hiệu quả Chat này kết hợp với gốc OH déhình thành nên gốc tự do ôn định hơn Proline kết hợp với gốc OH và oxy nguyên tử

tạo thành proline nitroxit, proline peroxit hoặc giải phóng oxy phân tử dang

dioxygen (oxy triplet), qua đó làm mất các gốc tự do — những gốc này có thé làmmất ôn định cấu trúc protein, cau trúc màng tế bào Như vậy, proline với vai trò loạibỏ gốc oxy hóa, qua đó giúp ôn định cấu trúc protein, cấu trúc màng tế bào [44, 60].Ngoài ra, proline và các sản phẩm trung gian của nó trong quá trình trao đổi có khảnăng điều khiển hoạt động biéu hiện của nhiều gen tham gia đáp ứng hạn Theo Iyervà cộng sự, chất trung gian sinh tổng hợp và phân giải proline P5C (pirolin-5-cacboxylat) trong cây lúa có khả năng tăng cường biểu hiện một số gen điều chỉnhthẩm thấu, trong đó có gen dhn4 [73] Trong điều kiện thiếu nước, hàm lượng proline

được sử dụng như là một chỉ thị hóa sinh dé chọn lọc các giống cây có kha năng chịu han

cao [44].

Vai trò của polyamine dưới diéu kiện han: Polyamine là các phân tử mangđiện tích nhỏ và là thành phần không thể thiếu trong hệ thống sinh học Các

polyamin thường gặp ở thực vat là putrescine, cadaverine, spermidine, spermine va

các hợp chat hữu cơ chứa hai hoặc nhiều nhóm amino hoạt động như những nhân tố

21

sinh trưởng của thực vật Polyamine liên quan tới nhiều quá trình sinh lý khác nhau,ví dụ như quá trình sinh trưởng - phát triển của thực vật và cả quá trình đáp ứng stresshạn Quá trình sinh tong hợp polyamine được kiểm soát chặt chẽ với sự tham gia của các

enzyme như ornithine decarboxylase, arginine decarboxylase,

S-adenosyl-L-methionine decarboxylase Vai trò của polyamine trong đáp ứng chống chịu stresshạn liên quan tới khả năng khử ROS, én định mảng, điều hòa thầm thấu, cân bằngion và điều hòa quá trình phiên mã gen chức năng Dưới điều kiện hạn, hàm lượngpolyamine ở thực vật tăng cao, liên quan tới tăng khả năng quang hợp, giảm mất nước,cải thiện điều hòa thấm thấu và giải độc tế bao Tuy nhiên, cơ chế hoạt động chưa được

hiểu biết đầy đủ [136] Polyamine được đề xuất với nhiều vai trò khác nhau bao gom,

điều hòa biểu hiện gen bang cách tăng cường biểu hiện bam DNA của các nhân tốphiên mã, cân bang ion, ổn định mang, tham gia vào quá trình phosphoryl hóaprotein và chuyền đôi cầu hình DNA Sự tích lũy polyamine là phản ứng tức thời vàđược quan sát thấy ở lúa khi tiếp xúc với hạn Nhiều nghiên cứu chỉ ra răng, cây lúatăng cường sinh tổng hợp polyamine, đặc biệt là spermidine và spermine dạng tự dođể đối phó với hạn Đây được coi là đặc điểm quan trọng ở cây lúa có khả năngchịu hạn Ứng dụng kỹ thuật di truyền đã tạo ra cây lúa biến đổi gen mang gen adc

(từ cây cà độc dược) mã hóa arginine decarboxylase - một loại enzyme tham gia

vào quá trình tổng hợp spermidine và spermine có khả năng chịu hạn cao hơn sovới cây lúa đối chứng [31].

Vai trò của chất chong oxy hóa đưới điêu kiện hạn: Dưới tác động stress sinhhọc va phi sinh học, thực vật đáp ứng bằng cách sản sinh ra các chất ROS ROS làcác hợp chất chứa oxy, có khả năng phản ứng cao với thời gian tồn tại ngắn, có théchuyên hóa lẫn nhau ROS bao gồm ion oxy, các gốc tự do và peroxide, được tạo ratrong quá trình trao đôi chất bình thường liên quan đến oxy và đóng vai trò quantrọng đối với các con đường truyền tín hiệu của tế bào Theo Sharma và nhómnghiên cứu, quá trình hoạt hóa oxy xảy ra theo hai cơ chế Cơ chế thứ nhất là khử

22

đơn trị oxy theo từng bước dẫn tới hình thành gốc superoxide, hydrogen peroxide,gốc hydroxyl và nước Theo cơ chế thứ hai, nguyên tử oxy ở trạng thai “triplet” hapthụ năng lượng dư thừa tạo ra trạng thái oxy “singlet” Trong điều kiện hạn hán,ROS hoạt động như những phân tử tín hiệu thứ cấp để khởi động các phản ứngphòng vệ của tế bào Tuy nhiên, khi hàm lượng ROS tăng cao trong giai đoạn tế bào

bị stress han sẽ gây ra các ton thương oxy hóa cho tế bao Do có tính phan ứng rấtmạnh, ROS có thê gây peroxide hóa lipid dẫn tới sự lây lan phản ứng gốc tự do kiểudây truyền ROS tấn công vào các vị trí đặc biệt của acid amin, làm thay đổi acidamin, do đó làm thay đôi hoạt tính protein và phần lớn các dang biến đổi này làkhông phục hồi được, dẫn đến gây mất chức năng tế bào và trong trường hợpnghiêm trọng có thé gây chết tế bao ROS oxy hóa DNA bởi các gốc hydroxyl tự dooxy hóa gốc đường hoặc các bazơ gây đứt gẫy sợi DNA, dẫn tới đột biến DNA Đềgiảm thiểu ảnh hưởng của stress oxy hóa sinh ra trong điều kiện môi trường khôhạn, thực vật đã hình thành một hệ thống bảo vệ chống oxy hóa rất phức tạp và hiệuquả, bao gồm các chất chống oxy hóa có bản chất không phải enzyme (ví dụ như

proline, polyamine, glyxin betain, cystein, glutathione, axit ascorbic, carotenoid )

và các enzyme (vi dụ như superoxide dismutase, monodehydroascorbat reductase,

catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase ) Cac chatchống oxy hóa phân bố chủ yếu trong không bảo, luc lap, tế bao chat, ty thé và haunhư không có trong nhân Chúng có vai trò bảo vệ tế bào bằng cách loại bỏ các gốcROS, kìm him các gốc ROS, làm gián đoạn chuỗi oxy hóa bằng cách tương tác vớicác gốc hữu cơ, chuyên các peroxyl thành các sản phẩm oxy hóa bền như ancol,aldehyt, xeton ; thay đôi cầu trúc cơ chất làm chậm quá trình oxy hóa; hoặc có thêgây chết một lớp tế bào để bảo vệ mô sống [59, 101] Thành phần các enzyme thamgia chống oxy hóa bao gồm superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT),

peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX) va glutathione reductase Các

enzyme thuộc hệ thống này có thé trực tiếp loại bo ROS hoặc tham gia vào quá

23

trình tong hợp các hợp chất chống oxy hóa không phải là enzyme SOD có thé khửO; thành HO; trong luc lap, ty thé, té bao chat va peroxisome, sau đó HO, tiép tucbị loại bỏ bởi POD CAT cũng là một enzyme rat quan trong và không thé thiếu đối

với quá trình phân giải HO, trong ty thé và peroxisome khi thực vật gặp stress hạn.

Việc duy trì hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa ở mức cao giúp tế bào tăngkhả năng chống lại các ton thương oxy hóa, nhờ đó tăng kha năng chống chịu hancủa thực vật Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa không sử dụng enzyme bao gồmcác hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ như glutathione, axit ascorbic,carotenoid, tocopherol Các hợp chat này thường hoạt động kết hợp với nhau débảo vệ hệ thống màng quang hợp trong điều kiện stress oxy hóa -carotenetrong lục lạp ngoài chức năng của một sắc tố còn có tác dụng chống oxy hóa rấthiệu quả Phân tử này có thể giảm nhanh trạng thái triplet của diệp lục để ngăncan quá trình sản sinh oxy nguyên tử, do đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương dooxy hóa a-tocopherol cũng là một sắc tố có khả năng bảo vệ lipid và các thànhphần khác trên màng lục lạp theo cả hai cơ chế vật lý và hóa học (phản ứng với

!O; trong lục lạp), do đó bảo vệ cấu trúc và chức năng của quang hệ II Do vaitrò khử độc của các hợp chất dạng này, các enzyme tham gia xúc tác cho quátrình tổng hợp, phân giải và tái sử dụng các hợp chất chống oxy hóa này cũng rấtquan trọng đối với sự sống còn của tế bào trong điều kiện khô hạn [113].

Các chất chống oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong loại bỏ các chất ROSvà sự biểu hiện của chúng làm tăng khả năng chịu hạn ở cây lúa Mức độ hạn càngtăng thì mức độ hoạt động của các chất chống oxy hóa như AsA, GSH, APX, SOD,

MDHAR, DHAR, GR phenylalanine ammonia-lyase vàCAT càng tăng lên để

chống lại tác động tiêu cực của các gốc ROS, làm giảm thiểu ton thương gây ra bởi

ROS, qua đó cây giúp lúa tăng khả năng chịu hạn [90, 125] Theo Li và nhóm nghiên

cứu, trong điều kiện hạn nhẹ, đáp ứng hóa sinh đầu tiên ở cây lúa non là sự tăng hoạt

động của các enzyme chông oxy hóa, làm tăng khả năng thích nghi của cây lúa với môi

24

trường hạn Vì vậy, quá trình tích lũy và tăng cường mức độ hoạt động của các chấtchống oxy là một trong những cơ chế ở cây lúa làm giảm hoặc ngăn ngừa thiệt hại

do ROS gay ra và cải thiện khả năng chịu hạn [59].

1.1.3.4 Ảnh hướng của hạn ở mức độ phân tử

Ở mức độ phân tử, phản ứng chống chịu stress hạn của thực vật đượcthực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp Các nghiên cứu ởmức phân tử đã chỉ ra rằng, nhiều gen đáp ứng hạn ở mức phiên mã [127] Ởlúa, những gen tham gia bảo vệ tế bào khỏi tác động tiêu cực trong điều kiệnthiểu nước thông qua các giai đoạn: nhận tín hiệu, truyền dẫn tín hiệu và bộmáy điều hòa phiên mã biểu hiện các gen đáp ứng hạn [146] Các sản phẩm củanhóm gen đáp ứng hạn chia làm hai nhóm Nhóm thứ nhất gồm các proteinchức năng tham gia trực tiếp vào đáp ứng hạn bằng cách bảo vệ tế bào khỏi tácđộng tiêu cực do stress hạn (ví dụ, các enzyme tham gia quá trình tổng hợp cácchất điều hòa thẩm thấu tế bào, các protein LEA biểu hiện trong giai đoạn phôimuộn, protein chống oxy hóa, protein sốc nhiệt, aquaporin ) Nhóm thứ hai làcác protein tham gia điều hòa biểu hiện gen và truyền dẫn tín hiệu trong đápứng stress hạn, bao gồm các nhân tố phiên mã và protein kinase [121] Các genchức năng và điều hòa đáp ứng hạn đã được sử dụng làm tăng khả năng chịuhạn bằng phương pháp chuyển gen Nghiên cứu, phân tích chức năng của cácgen đáp ứng hạn không chỉ để hiểu cơ chế hoạt động của bộ máy đáp ứng hạn,mà còn ứng dụng trong cải thiện khả năng chịu hạn cây trồng thông qua kỹ

thuật thao tác gen.

1.1.3.4.1 Quá trình nhận và truyền tín hiệu

Nhận tín hiệu là bước đầu tiên để thực vật đáp ứng với stress môi trường.Đề tiếp nhận các tín hiệu, tế bào có rất nhiều thụ thể gắn trên màng nguyên sinh vàtrong chất nguyên sinh Các thụ thể tế bào nhận biết tín hiệu stress và các protein

màng xử lý tín hiệu, tê bào sẽ sản sinh ra các phân tử tín hiệu thứ câp thông qua các

25

phản ứng enzyme đặc trưng Phân tử tín hiệu thứ cấp được chia thành ba loại cơ

ban: (1) các phân tử ki nước, ví dụ như diacylglycerol, IP3 và phosphatidylinositol,

liên kết với mang và có thé khuếch tán từ màng sinh chất vào vùng cận màng déphản ứng và điều hòa các protein đáp ứng trên màng; (2) các phân tử ưa nước, ví dụnhư cAMP, cGMP và Ca””, nằm trong tế bao chất; (3) các phân tử khí, NO va COcó thê khuếch tán xuyên qua tế bào chất và màng tế bào Ngoài ra, các chất oxy hoạthóa sinh ra trong điều kiện stress hạn cũng đóng vai trò là phân tử tín hiệu thứ cấptrong con đường truyền tín hiệu của tế bào tới bộ máy đáp ứng stress [42] Phân tửtín hiệu thứ cấp thường khởi đầu bằng một chuỗi các phản ứng phosphoryl hóaprotein và cuối cùng tác động tới các protein đích trực tiếp tham gia vào đáp ứngthích nghi stress hoặc các nhân tố phiên mã điều khiển một nhóm gen chức năngđặc trưng Phosphoryl hóa protein là một trong những cơ chế chính để thực vậtkiểm soát các quá trình tế bào nhăm đáp ứng với các tín hiệu stress của môi

trường Protein kinase hoạt hóa bởi stress của thực vật được chia thành hai nhóm

chính: protein kinase hoạt hóa mitogen (mitogen-activated protein kinase —MAPK) và protein kinase phụ thuộc canxi (calcium-dependent protein kinase —

CDPK) Cả hai nhóm protein này đều liên quan tới qua trình đáp ứng với nhiều loạistress môi trường khác nhau (trong đó có hạn) và đều được hoạt hóa rất nhanh ngaysau khi tế bào tiếp xúc với các yêu tô stress sinh học và phi sinh học [42].

1.1.3.4.2 Các protein tham gia vào quá trình đáp ứng điều kiện hạn

Để đáp ứng lại tín hiệu stress hạn, tế bào thực vật tăng cường sự biểu hiệncủa hàng loạt các gen liên quan tới đáp ứng chống chịu Dựa trên chức năng trongđáp ứng chống chịu stress hạn, có thể chia sản phẩm protein của các gen chức năngnày thành một số nhóm như protein sốc nhiệt (HSP), protein LEA (lateembryogenesis abundant protein), aquaporin, protein tham gia 6n định cấu trúcmàng, protein tham gia vào các quá trình tổng hợp, phân giải và sửa chữa [47].

Protein sốc nhiệt (HSP): HSP là một loại chaperone phân tử tham gia vào

26

quá trình tong hợp, vận chuyên, biến đổi và phân giải protein trong nhiều chu trìnhtế bào Trong điều kiện stress, HSP còn tham gia vào phản ứng duỗi xoắn proteinphụ thuộc ATP và duy trì 6n định cấu trúc protein và màng tế bào Nhiều nghiêncứu đã chứng minh HSP không chỉ được tổng hợp khi tế bào sốc nhiệt mà còn đượctích lũy trong điều kiện stress muối, oxy hóa và hạn Quá trình phân giải protein xảyra trong điều kiện hạn do thể tích tế bào bị giảm và khả năng tương tác của proteinvới các yếu tô phân giải tăng HSP duy trì và sửa chữa cau trúc của các protein chứcnăng, đồng thời tham gia vận chuyên các protein sai hỏng tới bộ máy phân giải đểloại bỏ khỏi tế bào Một số nghiên cứu về chuyên gen HSP đã chứng minh vai tròtăng cường tính chống chịu stress hạn của HSP trong cây chuyền gen [18].

Protein LEA: Protein LEA là một họ lớn các protein được biểu hiện nhiều ởgiai đoạn phát triển phôi muộn và trong nhiều điều kiện stress khác nhau như hạn,

mặn, lạnh, nóng và ABA Họ protein LEA được chia thành sáu nhóm dựa trên tính

bảo thủ trình tự axit amm, trong đó protein LEA nhóm 2 (còn được gọi là protein

chống mắt nước - dehydrin hay RAB) được nghiên cứu khá kĩ Đặc điểm chung củaprotein LEA là ưa nước, bền nhiệt và biểu hiện gen đáp ứng ABA Chức năng của

protein LEA cho tới nay vẫn chưa được làm 16, tuy nhiên hầu hết các nhà nghiêncứu đều cho rang protein này hoạt động như những phân tử liên kết nước trong cácquá trình tạo phức hóa ion và duy trì 6n định cau trúc màng tế bào và các đại phântử Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc chuyên gen mã hóa protein LEA đãgiúp tăng cường khả năng chống chịu hạn, mặn của cây chuyển gen Điều nàychứng tỏ vai trò quan trọng của protein LEA trong đáp ứng chống chịu stress hạn ở

thực vật [14].

Aquaporin: Aquaporin là nhóm protein thuộc ho protein xuyên mang có tính

bảo thủ cao Aquaporin tham gia vào quá trình vận chuyên nước qua mang bangcách tạo ra các lỗ dẫn nước trong lớp lipid kép của màng, giúp tăng tốc độ hấp

thu nước Protein này được biêu hiện nhiêu trong các tê bao thuộc mô đang sinh

27

trưởng và mô rễ Xu và cộng sự đã chứng minh rằng, sự biểu hiện của genTaTIP2 điều hòa dương trong điều kiện stress hạn, điều hòa âm trong điều kiện

stress mặn và sự đáp ứng của protein này không phụ thuộc ABA [152] Lian và

nhóm nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng, so với cây hoang da thì cây lúa nươngchuyền gen (biểu hiện quá mức gen RWC3) được cải thiện đáng ké khả năng chịuhạn và qua đó xác nhận aquaporins tăng khả năng chịu hạn Tương tự, cây thuốclá chuyên gen TaAQP7 tăng khả năng chịu han bang cách cải thiện khả năng giữnước, giảm tích tụ ROS và giảm tổn thương màng tế bao [85] Nhu vậy, mức độ

tích lũy aquaporin liên quan tới đáp ứng stress han.

12 VAI TRO CUA NHÂN TO PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI DAP UNGSTRESS HAN O THUC VAT

1.2.1 Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vậtNhân tổ phiên mã (Transcription factor - TF) là những protein hoạt động kếthợp với một số yếu tố điều hòa khác, bao gồm các protein cải biến/thay đôi cấu trúc sợinhiễm sắc, để điều hòa tương tác của RNA polymerase với DNA [33] Trong hệ genthực vật có khoảng 7% gen mã hóa TF, trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đápứng chống chịu stress Trong cây mô hình Arabidopsis, các nhà khoa hoc đã xácđịnh được gần 2000 loại nhân tố phiên mã khác nhau, trong đó có nhiều TF điều hòabiểu hiện đáp ứng các điều kiện bat lợi của môi trường, bao gồm cả đáp ứng hạn CácTF này tương tác với yếu tô cis nằm trong vùng promoter của các gen chức năng đápứng stress, từ đó hoạt hóa sự biểu hiện của các gen chức năng này dé tham gia vào quátrình chống chịu stress của tế bào Một số TF đóng vai trò là yếu tố điều hòa chính củacác con đường truyền tín hiệu và điều hòa hoạt động gen trong phản ứng thích nghỉ vớiđiều kiện stress Trong tế bào, các TF không hoạt động độc lập mà kết hợp với nhau vàvới nhiều protein khác Mỗi nhân tố phiên mã là một nút liên kết giữa nhiều con đườngđiều hòa khác nhau, tạo thành một mạng lưới điều hòa hoạt động gen rất phức tạp trongtế bào (Hình 1.1) [86].

28

Phụ thuộc ABA ea [m8 a

az 2 pS `) Ỳ

Cac = Seca 2) aC) CC

Hình 1.1: Mạng lưới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress han [86]

Ghỉ chú: Nhân tổ phiên mã đáp ứng điều kiện hạn được chia thành hai nhóm phụ thuộcABA (màu đỏ) và không phụ thuộc ABA (màu den) Các nhân tổ phiên mã hoạt hoá (mũi tên

màu xanh) hoặc tức chế (đường màu đỏ) sự biểu hiện của một số gen đích (6 màu vàng).

Cho đến nay, các TF tham gia trong mạng lưới điều hòa hoạt động gen đápứng stress hạn được xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đóđược nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF (APETALA 2/ethylene-

responsive element binding factor), NAC (NAM/ATAF1/CUC2) và WRKY Ngoài

ra, một số nhân tố phiên mã thuộc các nhóm khác như MYB (myeloblastosis

oncogene), bZIP (basic leucine zipper) cũng được chứng minh có tham gia vào quá

trình điều hòa hoạt động gen đáp ứng điều kiện stress hạn ở thực vật [86].

29

1.2.1.1 Nhân tổ phiên mã AP2/ERF (APETALA2/EthyleneResponsive Element

Binding Protein)

AP2/ERF là họ nhân tố phiên mã đặc trưng của thực vật, với khoảng 145thành viên ở Arabidopsis và 170 thành viên ở lúa Tat cả các TF thuộc họ này đềuchứa một domain liên kết DNA bảo thủ, với tên gọi là vùng AP2 Vùng AP2 cóchiều dài khoảng 60 axit amin, có vai trò tương tác với phân tử DNA Mỗi AP2gồm hai tiểu phan, bao gồm tiểu phần YRG (yếu tố YRG) năm phía đầu N và tiểuphần RAYD (yếu tố RAYD) nằm phía đầu C Tiểu phần YRG dài khoảng 20 axitamin, giàu các gốc ưu nước, có chức năng tương tác trực tiếp với phân tử DNA.Tiểu phần RAYD dài khoảng 40 axit amin, trong đó có một đoạn trình tự dài 18 axitamin có khả năng tạo thành một chuỗi xoắn a đóng vai trò quyết định cấu trúc và

chức năng cua vùng RAYD được dự đoán tham gia vào tương tác protein-protein

nhờ cấu trúc xoắn a hoặc có vai trò làm thay đồi hoạt tính liên kết DNA của nhân tốphiên mã AP2/ERF thông qua sự tương tác giữa bề mặt ưa nước của chuỗi xoắn ơvới rãnh chính trên phân tử DNA Các protein liên kết với yếu tố cis DRE/CRT cóchứa các gốc axit amin bảo thủ đặc trưng trong vùng AP2 quyết định vai trò liên kết

DNA của toàn bộ phân tử protein [97, 104, 117].

Dựa trên sự tương đồng về trình tự axit amin và số lượng vùng AP2, họprotein AP2/ERF được chia thành 4 phân họ riêng biệt, bao gồm ERF, AP2, RAV

và DREB (ehydration-responsive element-binding protein) Trong đó, phan họ

DREB được nghiên cứu nhiều nhất, trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau, baogồm Arabidopsis, lúa, khoai tây, ngô Ở Arabidopsis, nhóm TF DREB gồm 8 gen,

trong đó gen DREB2A và DREB2B là 2 gen cảm ứng mạnh với hạn, mặn và nhiệt

độ cao theo con đường không phụ thuộc ABA [140] Biểu hiện của DREBIA dướisự điều khiển của một promoter cảm ứng stress đã cải thiện đặc tính trổ bông, giúptăng sản lượng thu hoạch trong điều kiện hạn của dòng lúa chuyển gen so với dòngđối chứng [97] Cây lúa chuyên gen biểu hiện tăng cường OsDREB2A cũng có tỉ lệ

30

sông sót cao hơn so với cây đối chứng trong điều kiện hạn và mặn [104].1.2.1.2 Nhân tố phiên mã WRKY

WRKY là một trong những họ nhân tố phiên lớn nhất của thực vật Nhân tốphiên mã WRKY được đặt tên theo đặc điểm của vùng liên kết DNA và được gọi làvùng WRKY Vùng này chứa một trình tự axit amin có tính bảo thủ rất cao làWRKYGQK ở dau N và một cấu trúc zinc finger ở đầu C Vùng WRKY bao gồmkhoảng 60 gốc axit amin, tạo thành bốn chuỗi xoắn B đối song song có chứa các gốcCys/His liên kết với ion kẽm (Zn) nằm ở vị trí Cx;sCxa;›sHxH (C2H2) hoặcCx7Cx»3HxC (C2HC) Cả hai trình tự WRKY va ZF quyết định hoạt tính liên kếtDNA của protein WRKY.Ngoài hai cấu trúc bảo thủ là vùng WRKY và trình tự ZF,các protein WRKY còn chứa một số cấu trúc đặc trưng của các nhân tố phiên mã,bao gồm tín hiệu định vị nhân NLS, leucine zipper, vùng giàu Ser-Thr, vùng giàuGln, vùng giàu Pro, vùng kinase và TIR-NBS-LRR [11, 34] Vùng WRKY liên kết

với một trình tự DNA đặc trưng trên promoter của gen đích là hộp W (TTGACC/7T).

Chuỗi BIchứa trình tự WRKYGQK của vùng WRKY có chức năng tương tác với

rãnh chính của phân tử DNA Các gốc axit amin trong trình tự WRKYGQK nhậnbiết DNA chủ yếu dựa trên các tương tác không phân cực với nhóm methyl của cácbazơ T năm trong hộp W.

Dựa trên số lượng vùng WRKY và cấu trúc ZF, họ protein WRKY được chiathành ba phân họ Phân họ WRKYI đặc trưng với hai vùng WRKY và một cấu trúcC2H2 ZF Phân họ WRKY II va III chỉ có một vùng WRKY và một cau trúc C2H2

ZF (nhóm II) hay C2HC (nhóm IID) [11] Cho đến nay, nhiều gen WRKY đã được

chứng minh cảm ứng biểu hiện mạnh và sớm khi tế bào đáp ứng với các yếu tốstress vô sinh như hạn, mặn Kết quả phân tích bằng phương pháp lai RNA(Northern blot) cho thấy có 10 trong số 13 gen OsWWRKY (ở lúa) đáp ứng khácnhau với các điều kiện mặn, hạn, lạnh và nóng [111] Ở lúa mỳ cũng có 8 trong số

15 gen WRKY đáp ứng với stress hạn, mặn, lạnh và nóng [149].

31

1.2.1.3 Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper)

bZIP là họ nhân tố phiên mã quan trọng của thực vật Ho TF nay đượcnghiên cứu nhiều nhất trên đối tượng Arabidopsis, với khoảng 75 thành viên, đượcchia thành 10 nhóm dựa trên sự tương đồng của các vùng chức năng trên chuỗipolypeptide Cấu trúc của TF bZIP bao gồm 2 chuỗi xoắn ơ chứa một vùng liên kếtDNA và một motif leucine-zipper đặc trưng Protein bZIP liên kết đặc hiệu với

đoạn DNA chứa trình tự lõi ACGT trong vùng promoter của gen đích nhờ sự có mặt

một số yếu tố cis đặc trưng như A-box (TACGTA), C-box (GACGTC), G-box

(CACGTG) hay ABRE (ACGTGT/GC) [74].

Một số yếu tố điều hòa bZIP hiện nay đã được xác định có tiềm năng ápdụng dé tăng cường khả năng chống chịu hạn của cây trồng OsABF1, OsbZIP23 và

OsbZIP46 (lúa) được chứng minh giúp tăng cường khả năng chống chịu hạn và mặncủa cây lúa chuyên gen SIAREB (cà chua) tương tác với cả promoter RD29B

(Arabidopsis) và LAP (cà chua) theo con đường phụ thuộc ABA, qua đó tăng cường

kha năng chống chịu stress của cây chuyên gen mô hình Sự biểu hiện củaZmbZIP37 giúp tăng cường kha năng chống chịu han của của cây ngô chuyên gen

[74] Các nghiên cứu này chứng tỏ vai trò quan trọng của nhân tố phiên mã bZIPtrong điều hòa biéu hiện gen đáp ứng điều kiện bat lợi của thực vật.

1.2.1.4 Nhân tổ phiên mã MYB (myeloblastosis)

MYB/MYC là họ nhân tố phiên mã có ở cả động vật và thực vật ỞArabidopsis, TF họ MYB/MYC chiếm trên 10% tổng số gần 2000 gen mã hóa nhântố phiên mã.Về cấu trúc, protein MYB có 2 vùng chức năng phân biệt, bao gồm:vùng đầu N là vùng MYB có vai trò liên kết DNA và vùng đầu C có vai trò điềuhòa hoạt động của protein Vùng MYB là một trình tự dài 52 axit amin, có thé lặplại nhiều lần (tối đa có thể lặp lại 4 lần), mỗi đoạn lặp tạo thành 3 chuỗi xoắn ơ.Chuỗi xoắn thứ hai và thứ ba của mỗi trình tự lặp tạo thành cầu trúc HTH (helix-turn-helix) mang 3 gốc tryptophan (hay gốc kị nước) có vai trò điều hòa không gian,

32

hình thành nhân kị nước trong cấu trúc 3D HTH Ở thực vật, gốc tryptophan đầutiên của trình tự lặp R3 được thay thế bằng phenylalanine hoặc isoleucine Dựa trên sốlượng vùng MYB, họ proten MYB được chia thành 4 phân họ, bao gồm 1R-MYB,

2R-MYB, 3R-MYB và 4R-MYB Protein R2R3-MYB đặc trưng cho giới thực vật, với

khoảng trên 100 thành viên ở các loài một lá mam và hai lá mầm khác nhau [15, 20].

Ở thực vật, nhiều nhân tố phiên mã MYB đã được chứng minh tham giavào các con đường đáp ứng yếu tổ stress phi sinh học Ví du, AMYB2, AtMYB74và AtMYB102 được tăng cường biểu hiện bởi yếu tố stress hạn AzMYB60 vàAtMYB96 hoạt động thông qua chuỗi truyền tín hiệu ABA để kiểm soát sự di

chuyển của khí khong, qua đó tăng tinh chiu han và bệnh tat cho cây Hoạt động

phiên mã của quá trình sinh tổng hợp sáp được điều hòa bởi MYB96, nhờ đó gópphan tăng tính chịu han của cây A thaliana [15] Chen và nhóm nghiên cứu

(2005) đã phân lập được một gen MYB cảm ứng với stress hạn từ Boea crassifolia, đặttên là BcMYBT BCMYBI mã hóa một protein thuộc nhóm R2R3-MYB BcMYB1 được

biểu hiện rất mạnh trong điều kiện stress hạn, đồng thời cũng cảm ứng với các điềukiện mặn và nhiệt độ thấp Tương tu, A/MYB102 của Arabidopsis cũng đáp ứng vớistress nước [15] Seo và Park (2009) gần đây đã công bố nghiên cứu về một nhân tôphiên mã R2R3-MYB, đặt tên là MYB96, điều hòa quá trình hoạt hóa mô phân sinhrễbên trong điều kiện hạn theo con đường truyền tín hiệu ABA-auxin Sự biểu hiệntăng cường MYB96 dan tới kiểu hình sinh trưởng còi cọc, giảm hình thành rễ bên vàtăng khả năng chịu hạn Các nghiên cứu ở lúa cũng đã phát hiện ra nhiều nhân tố phiênmã MYB liên quan tới đáp ứng chống chịu stress phi sinh học Trong cây chuyên gen,sự biểu hiện tăng cường của 2sÄ⁄YB3R-2 làm tăng khả năng chịu lạnh, hạn và mặn cho

cây, đồng thời làm giảm tính nhạy cảm với ABA Tương tự, sự biểu hiện của

OsMYB55 cũng làm tăng sức chống chịu han và nhiệt độ cao của cây chuyền gen thôngqua cơ chế tăng cường hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen tham gia vào trao déichất axit amin [15].

33

1.2.2 Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật

NAC là nhân tố phiên mã lớn nhất đặc chưng của thực vật, với khoảng 117

gen WAC ở Arbidopsis, 151 gen ở lúa, 79 gen ở nho, 26 gen ở cam quýt, 163 gen ở

cây gỗ dương, 152 gen ở đậu tương và thuốc lá Tên gọi NAC bắt nguồn từ tên củaba proteinđầu tiên được phát hiện có chứa vùng liên kết DNA tương tự nhau(domain NAC), bao gom NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsistranscription activation factor) va CUC (cup-shaped cotyledon) [13] Nhan tố phiênmã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, hóa sinh khác nhau trong tế bào,bao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng các yếutố stress phi sinh học và hữu sinh Nhân tố phiên mã NAC được chia thành 8 phân họ (từNAC-a đến NAC¬h) dựa trên mức độ tương đồng của vùng NAC Mỗi phân họ lại đượcphân chia tiếp thành một vài phân họ phụ dựa trên các trình tự bảo thủ ở đầu C Kết quảphân tích cây phát sinh quan hệ di truyền của các protein NAC đã cho thấy các thành

viên của họ protein này tập hợp theo từng phân nhóm dựa trên chức năng của chúng và

những protein NAC đáp ứng stress được xếp vào chung một nhóm [43].1.2.2.1 Đặc điểm cấu trúc của nhân to phiên mã NAC

Các nhân tố phiên mã NAC đặc trưng bởi một domain liên kết DNA phía đầuN có tính bảo thủ cao (domain NAC) và một domain điều hòa phía đầu C có sự thay đổi

da dạng giữa các nhóm protein NAC [45].

Domain NAC là một chuỗi peptide năm ở phíađầu N gồm khoảng 150 - 160goc axit amin va được chia thành 5 domain đặt tên từ A đến E (Hình 1.2) [103].Vùng bảo thủ C và D tích điện đương có vai trò liên kết DNA; chức năng của vùngA liên quan đến quá trình hình thành cau trúc dimer; vùng biến đổi B và E quyếtđịnh vai trò chức năng khác nhau giữa các protein NAC [103] Cấu trúc tổng thểcủa một protein NAC dạng monomer là một chuỗi B xoắn đối song song (B1-6/7) vàđược bao quanh bởi hai chuỗi xoắn a, chuỗi al phía đầu N và chuỗi a2 nằm bêntrong Đặc biệt, các gốc Val119-Ser183 (B4-6; vùng D-E), Lys123 và Lys126 (B4-5;

34

vùng D) cùng với Lys79, Arg85 và Arg88 (B1-2; vùng C) được xác định có vai trò

quyết định khả năng liên kết DNA của domain NAC Vị trí Arg88 có tính bảo thủrất cao, trong khi hai vị trí Lys79 và Arg85 có thể thay thế cho nhau ở các proteinNAC khác nhau, tạo nên sự đa dang về ái lực với DNA Ngoài ra, domain NAC cònchứa một hoặc hai trình tự tín hiệu định vị nhân giúp tế bào nhận biết và vận chuyểnprotein vào nhân và chức năng này được quyết định các gốc Lys trong vùng D.Ngoài vai trò liên kết DNA, domain NAC cũng tham gia điều hòa quá trình tươngtác của protein NAC với một số protein khác, có liên quan tới thời gian t6n tại vàkhả năng hoạt động của protein NAC [95, 108] Tuy nhiên, đa số các protein NACđều có cau trúc dimer va đây là một đặc điểm đặc trưng của họ protein NAC.Domain NAC tham gia điều hòa quá trình dimer hóa nhờ các gốc Leul4—Thr23 vàGlu26-Tyr31 Các gốc axit amin này tạo thành một chuỗi B đối song song ngắn tạibề mặt giữa hai monomer và được ôn định nhờ hai gốc Argl9 và Glu26 Quá trìnhdimer hóa có thé điều hòa tính đặc hiệu trong tương tác protein-DNA của proteinNAC Các nhân tổ phiên mã NAC khác nhau có khả năng nhận biết và liên kết đặc

hiệu với các trình tự DNA khác nhau trên vùng promoter của gen đích [95].

Vùng điều hòa phiên mã nằm ở phía đầu C của protein NAC có tinh đa dạngrất cao, có vai trò quyết định đến khả năng điều hòa phiên mã của từng protein (hoạthóa hoặc ức chế phiên mã)và được gọi là vùng điều hòa phiên mã (Transcriptionregulatory region - TRR) Vùng TRR có một số trình tự đặc trưng giàu Ser-Thr,Pro-Glu hay các gốc có tính axit Các nghiên cứu về đa dạng phân tử đã cho thay

các motif này bảo thủ giữa các phân nhóm trong cùng một nhóm protein NAC,

nhưng khác nhau giữa các nhóm khác nhau Điều này chứng tỏ các motif này có vaitrò khác nhau đối với mỗi loại protein NAC [45, 108].

Ở thực vật, dé thích nghi với điều kiện môi trường biến đối liên tục, tế bào có mộtcơ chế đáp ứng phiên mã nhanh với các kích thích băng phản ứng cắt phân giải có kiểm

soát các nhân tô phiên mã liên kêt mang (membrane associated transcription factor

-35

MTF) Trong vùng polypeptide đầu C của một số protein NAC có chứa vùng NLTđược phát hiện có mang một cấu trúc xoăn a (transmembrane motifs - TM) có chức năngliên kết protein với màng tế bào hay mạng lưới nội chat Cho đến nay, các nhà khoa học

đã xác định được 18 NTL ở Arabidopsis, 11 NTL ở đậu tương, 7 NTL ở ngô, 6 NTL ở

nho, 5 NTL ở lúa và 4 NLT 6 Medicago truncatula Một số nghiên cứu đã chứng minhcác NTL này được tăng cường biểu hiện trong điều kiện stress và có thé liên quan tới cácđáp ứng chống chịu của tế bào với các yếu tô stress của môi trường [108, 122].

DNA/ liên kết protein/ tạo cầu

—\—_ TRdomain ————>^®- pap > ——— NACdomain —————*>

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc protein NAC [108]

Ghi chú: (i) Protein NAC có cấu trúc đặc trưng bao gom domain NAC bảo thủ ở dau N với 5 vùngchức năng từ A — E (màu đỏ) có vai trò liên kết DNA, tương tác protein và tạo cầu trúc dimer,chuỗi peptide dau C với trình tự biến đổi có chức năng điều hòa (ii) Protein NAC có domain NACchứa vùng điều hòa âm (màu vàng) và chuỗi polypeptide dau C có trình tự đóng vai trò làm tín

hiệu vận chuyển màng (màu xanh lá) (iii) Protein chỉ có domain NAC (iv) Protein mang hai

domain NAC lặp lại (v) Protein có một đoạn trình tự kéo dai phía đâu Nnằm trước domain NAC.(vi) Protein có domain NAC nằm ở dau C, domain điều hòa nằm ở dau N mang motif ZF (zincfinger) dong vai tro la domain lién két DNA.

36