Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen chitinase kháng bệnh đạo ôn nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Lúa gạo lương thực người dân Châu Á, ngô dân Châu Mỹ, hạt kê dân Châu Phi lúa mì dân Châu Âu Bắc Mỹ Tuy nhiên nói, khắp giới, đâu có dùng đến lúa gạo sản phẩm từ lúa gạo Khoảng 40% dân số giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực 110 quốc gia sản xuất tiêu thụ gạo với mức độ khác Lượng lúa gạo sản xuất mức tiêu thụ cao tập trung khu vực Châu Á Năm 1980, riêng Châu Á có 1,5 tỉ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm 2/3 dân số Châu Á Con số ước tính tăng lên gấp đôi, người người dân nghèo thường dùng lúa gạo nguồn lương thực chính, nguồn thức ăn chủ yếu cho sống ngày họ Khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay loại thức ăn cung cấp nhiều protein vitamin lượng Lúa gạo lương thực quan trọng nước ta trồng lúa nghề truyền thống nhân dân Việt Nam từ xa xưa, từ người Việt cổ Kinh nghiệm sản xuất lúa hình thành, tích lũy phát triển với hình thành phát triển dân tộc ta Những tiến khoa học kỹ thuật, sản xuất lúa nước quốc tế thúc đẩy mạnh mẽ ngành trồng lúa nước ta vươn lên bắt kịp trình độ tiên tiến giới Những năm gần đây, Việt Nam tham gia vào thị trường lúa gạo quốc tế với sản lượng gạo xuất hàng năm đứng thứ số nước xuất gạo nhiều giới ĐBSCL ĐBSH hai vựa lúa lớn nước, góp phần quan trọng thành chung Trong năm qua Việt Nam chọn, tạo nhiều giống lúa có suất cao, phẩm chất tốt Tuy nhiên điều kiện khí hậu Việt Nam nóng ẩm quanh năm, yếu tố đất đai, cỏ dại, dịch bệnh hạn hán diễn biến phức tạp Cây lúa dễ mắc dịch bệnh nấm vi khuẩn gây bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc làm giảm chất lượng suất lúa từ 20 – 80%, có nhiều nơi dịch bệnh làm cho mùa màng bị trắng Việc sử dụng chất độc hóa học bảo vệ thực vật ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe người sinh vật khác Nghiêm trọng dư lượng chất độc hóa học tồn đất, nước, qua chuỗi thức ăn làm cân sinh thái, phá hủy mơi trường sống đến mức báo động Vì vậy, việc chọn tạo giống lúa có suất cao, chất lượng tốt, có khả chống chịu sâu bệnh, côn trùng điều kiện khắc nghiệt thời tiết, khí hậu để đáp ứng nhu cầu lương thực bảo vệ môi trường nhiệm vụ cấp thiết nhà khoa học Ngày việc tạo giống trồng mang gen kháng sâu, bệnh, nhà khoa học nước quốc tế quan tâm nghiên cứu Một giải pháp nhà khoa học hướng tới tạo giống kĩ thuật chuyển gen, mẻ kĩ thuật chuyển gen ứng dụng để tạo vật liệu khởi đầu có giá trị cho nghiên cứu chọn tạo giống nhiều đối tượng trồng khác Tạo trồng mang gen kháng sâu, bệnh phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phương pháp nhanh it tốn đạt kết nhiều đối tượng trồng thuốc lá, cà chua, hoa cúc, đậu xanh, lúa nhiều giống trồng khác “Nghiên cứu tạo lúa chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo ôn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” cần thiết mang tính ứng dụng cao nhằm tạo giống lúa chuyển gen có suất cao, chất lượng tốt kháng bệnh đạo ôn MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu qui trình ni cấy mơ thích hợp (mơi trường tạo callus, môi trường tạo chồi từ callus, môi trường rễ ) từ hạt hai giống lúa DT22 lúa KDĐB (khang dân đột biến) Ứng dụng qui trình tái sinh để chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo ôn vào hai giống lúa DT22 lúa KDĐB nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tạo giống lúa mang gen kháng bệnh đạo ôn Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định lúa chuyển gen NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Xuất phát từ mục tiêu nói trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nội dung sau: Hiệu quả, thời gian nồng độ thích hợp hóa chất khử trùng với hai giống lúa Bước đầu Xác định mơi trường ni cấy thích hợp để tạo callus, nhân nhanh callus, tái sinh chồi từ callus rễ Bước đầu xác định qui trình chuyển gen Chitinase vào hai giống lúa DT22 lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định lúa chuyển gen Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học Đề tài xác định loại hóa chất, thời gian nồng độ khử trùng thích hợp hai giống lúa nghiên cứu Bước đầu xác định điều kiện thành phần mơi trường thích hợp cho việc tái sinh chuyển gen từ hai giống lúa Tạo nguồn nguyên liêu phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen Áp dụng qui trình tái sinh nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh đạo ôn vào hai giống lúa DT 22 lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens Ý nghĩa thực tiễn Xác định môi trường nuôi cấy mô, tái sinh từ callus hạt gạo hai giống lúa DT22 KDĐB sau biến nạp phục vụ cho công tác tái sinh lúa chuyển gen Tạo lúa chuyển gen kháng nấm đạo ôn làm vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa có suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh đáp ưng nhu cầu an ninh lương thực nước quốc tế ngày cao Kết nghiên cứu cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghiên cứu chuyển gen kháng sâu bệnh vào số giống lúa nhờ Agrobacterium tumefaciens CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại lúa Theo kết nghiên cứu nhà khảo cổ học, nguồn gốc lúa vùng Đông Nam Á Đơng Dương, nơi mà có nhiều di tích lúa phát triển khoảng 10.000 năm trước Cơng ngun Sau nghề trồng lúa phát triển vào nước Châu Á [6],[7],[43] Cây lúa thuộc họ Graminae (hịa thảo), chi Oryza, lồi Oryza sativa L Chi Oryza có 23 lồi có loài lúa trồng O sativa phổ biến Châu Á O glaberrima phổ biến Tây Phi O sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể chia thành loài phụ Indica, Japonica Javanica (hay Japonica nhiệt đới) [6], [35], [43], [44] Lúa Indica thường trồng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, xanh nhạt cong kháng nhiều sâu bệnh Hạt gạo dài trung bình, có nhiều tinh bột Năng suất lúa Japonica Lúa Japonica thường trồng vùng ơn đới nơi có độ cao 1000m (so với mặt nước biển), có thân ngắn, chống đổ, xanh đậm, thẳng đứng, chồi, hạt gạo thường trịn, ngắn trung bình, dẻo nấu hàm lượng tinh bột Lúa Japonica thường có suất cao Indica Lúa Japonica nhiệt đới trồng phổ biến Indonesia, mang đặc điểm loại lúa Japonica Indica Hình thức gần giống lúa Japonica, có rộng với nhiều lơng chồi, thân cứng, cảm quang, hạt lúa thường có Lúa Oryra glaberrima trồng tây Châu Phi cách 3500 năm Nguồn gốc chúng lưu vực sơng Niger Mali, có thân cao Indica, gié lúa thẳng, có khơng có nhánh phụ Hạt lúa khơng có lơng vỏ trấu, gạo đỏ, kháng nhiều sâu bệnh chịu hạn, suất loại lúa nói [43] Nghiên cứu isozyme, người ta phân biệt O sativa làm nhóm rõ ràng hơn: Nhóm I (Indica), II, III, IV, V, VI (Japonica) Trong đề tài chúng tơi sử dụng callus lồi O sativa L với hai thứ là: O sativa var utitissima A Camus (lúa tẻ) O sativa var glutinosa Tanka (lúa nếp) để tiến hành nghiên cứu [20] 1.2 Đặc điểm sinh học lúa Các giống lúa có nhiều đặc điểm khác chiều cao, thời gian sinh trưởng, khả chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh… nhiên, chúng có đặc điểm chung hình thái, giải phẫu sinh lý hóa sinh [10],[11],[19] Trước hết mặt hình thái, quan sinh dưỡng lúa bao gồm phận thân, lá, rễ, hoa hạt, phận có đặc điểm riêng phù hợp với chức định: Rễ: rễ lúa loại rễ chùm Nó chia làm hai loại: loại thứ rễ mầm mọc từ phơi hạt, có tác dụng hút nước chất dinh dưỡng đến lúc có lá, loại thứ rễ đốt mọc từ đốt thân nằm mặt đất, có tác dụng hút chất dinh dưỡng ni cây, trao đổi khơng khí, giữ cho lúa đứng vững Thân: thân lúa loại thân thảo Ở thời kì mạ lúc lúa cịn non thân lúa bẹ tạo thành Sau làm đốt, thân lúa lóng đốt tạo thành Lá lúa: bao gồm mầm thật Lá mầm mọc trình ngâm ủ thời gian đầu sau gieo mạ Lá thật mọc trình sinh trưởng sinh dưỡng lúa tồn suốt trình sinh trưởng lúa Hoa lúa: có nhiều hoa bơng lúa q trình trổ lại khơng đồng thời nên hoa lúa nở theo quy luật từ xuống dưới, từ vào Thời gian nở hoa phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thời tiết: thuận lợi, nhiệt độ thích hợp, đủ nắng, trời quang mây, gió nhẹ hoa nở rộ vào – sáng; trời nắng nóng hoa lúa nở sớm vào lúc – sáng; trời âm u thiếu ánh sáng gặp rét hoa lúa nở muộn từ 12 – 14 trưa Thời gian phơi màu, thụ tinh hoa lúa từ mở vỏ trấu đến lúc khép lại khoảng 50 – 60 phút Hạt lúa: hạt lúa hình thành từ hoa lúa Các hạt lúa xếp sít gối lên tạo thành lúa [6],[7] 1.3 Yêu cầu sinh thái Yêu cầu lượng mưa: lúa yêu cầu nhiều nước trồng khác Lượng mưa cần thiết cho lúa trung bình từ – mm/ngày mùa mưa, – mm/ngày mùa khô Một tháng lúa cần khoảng 200mm nước Sự thiếu hụt hay thừa nước ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển lúa Yêu cầu ánh sáng: ánh sáng ảnh hưởng đến lúa mặt Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quang hợp, số chiếu sáng ngày ảnh hưởng đến phát triển, hoa, kết lúa sớm hay muộn Cường độ ánh sáng thích hợp cho lúa từ 250 - 400 calo/cm2/ngày Yêu cầu nhiệt độ: nhiệt độ làm lúa sinh trưởng nhanh hay chậm, phát dục tốt hay xấu Lúa sinh trưởng bình thường nhiệt độ 25 - 28 0C Nếu nhiệt độ thấp 170C sinh trưởng lúa chậm lại, thấp 13 0C lúa ngừng sinh trưởng, nhiệt độ thấp kéo dài nhiều ngày lúa chết Nhiệt độ cao, phạm vi từ 28 - 35 0C lúa sinh trưởng nhanh chất lượng Nhiệt độ lớn 400C lúa sinh trưởng nhanh tình trạng sinh trưởng xấu, kéo theo gió lào, ẩm độ thấp chết Mức độ ảnh hưởng nhiệt độ cao hay thấp, mạnh hay yếu tùy thuộc vào giống lúa giai đoạn sinh trưởng, phát triển lúa Nhiệt độ thích hợp cho lúa nảy mầm 28 - 320C, trổ bông, phơi màu yêu cầu nhiệt độ 20 - 38 0C Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoa kết sớm hay muộn lúa Một số giống lúa mẫn cảm với nhiệt độ, tích lũy đủ số nhiệt định (tổng tích ơn) đời sống hoa kết Tổng tích ơn giống ngắn ngày 2000 - 25000C, giống dài ngày 3000 - 35000C Yêu cầu thổ nhưỡng: lúa nước gieo cấy hầu hết nhóm loại đất, muốn lúa có suất cao đất trồng phải đáp ứng số yêu cầu sau: thứ địa hình phẳng, thành phần giới từ thịt trung bình đến thịt nặng; thứ hai hàm lượng N,P,K tổng số đạt mức khá; thứ ba độ pH từ 4,5 - 7,0; thứ tư độ mặn phải thấp 0,5% tổng số muối tan [7] 1.4 Giá trị dinh dưỡng ý nghĩa kinh tế lúa 1.4.1 Giá trị dinh dưỡng lúa Lúa loại lương thực có giá trị dinh dưỡng cao Bộ phận sử dụng chủ yếu lúa hạt lúa Ở hạt lúa hàm lượng tinh bột 62,4%, nguồn cung cấp lượng chủ yếu cho người Về hàm lượng protein, giống lúa Việt Nam có hàm lượng protein chủ yếu khoảng – %, giống lúa nếp có hàm lượng protein cao giống lúa tẻ Hàm lượng lipit chủ yếu lớp vỏ cám, gạo xay 2,02% gạo xát cịn 0,52% Hàm lượng vitamin nhóm B B1, B2, B6, PP… lượng vitamin B1 0,45 mg/100 hạt (trong phơi 47%, vỏ cám 34,5%, hạt gạo 3,8%) 1.4.2 Ý nghĩa kinh tế lúa Theo số liệu FAO, 2005: Trên giới, lúa 250 triệu nông dân trồng Cây lúa vừa lương thực 1,3 tỉ người nghèo giới, vừa sinh kế chủ yếu nông dân nguồn cung cấp lượng lớn cho người, bình quân 180-200 kg gạo/người/năm nước Châu Á, khoảng 10 kg gạo/người/năm nước Châu Mỹ [41], [43], [44] Việt Nam có tổng dân số 80 triệu người 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực Hạt lúa phận dùng làm lương thực, tất phận khác lúa người sử dụng phục vụ cho nhu cầu cần thiết, chí phận rễ lúa nằm đất sau thu hoạch cày bừa vùi lấp để tăng chất mùn cho đất [7] Do lúa có vai trị quan trọng đời sống người Những nghiên cứu lúa khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn có ý nghĩa thực tế lớn [45],[48] II TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1 Tình hình sản xuất lúa giới Theo thống kê FAO, năm 2005 lúa trồng 114 nước có mặt khấp châu lục Trong đó, Châu Phi có 41 nước, Châu Á có 30 nước, Bắc Trung Mỹ có 14 nước, Nam Mỹ có 13 nước, Châu Âu có 11 nước Châu Đại Dương có nước Diện tích lúa biến động đạt khoảng 152000 triệu ha, suất lúa bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha Ấn Độ nước có diện tích trồng lúa lớn 44790 triệu ha, ngược lại Jamaica nước có diện tích trồng lúa thấp 24 Năng suất lúa cao đạt 9,45 tấn/ha Australia thấp 0,9 tấn/ha Iraq [43], [44] Giai đoạn 2001- 2005, sản lượng lúa giới tăng, năm 2005 đạt 618441 triệu Trong đó, sản lượng lúa Châu Á đạt 559349 triệu chiếm 90,45%; tương tự Nam Mỹ 24020 triệu (3,88%); Châu Phi 18851 triệu chiếm (3,04%); Bắc Trung Mỹ 12537 triệu (2,03%); Châu Âu Châu Đại Dương 3684 triệu (0,6%) Như giai đoạn này, Châu Á có sản lượng lúa lớn giới 2.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam Nghề trồng lúa Việt Nam có lịch sử lâu đời so với nghề trồng lúa nước Châu Á Theo tài liệu khảo cổ Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam…cây lúa có mặt từ 3000-2000 năm trước cơng ngun Tổ tiên hóa lúa dại thành lúa trồng phát triển nghề trồng lúa đạt tiến ngày [4] Từ thực đổi (năm 1986) đến nay, Việt Nam có tiến vượt bậc sản xuất lúa; đưa nước ta từ nước thiếu ăn triền miên đảm bảo đủ lương thực cho nhu cầu nước mà xuất từ - triệu gạo/năm, đứng hàng thứ giới nước xuất gạo Tính đến ngày 06/10/2008 (theo số liệu VFA), tình hình xuất gạo tháng 09/2008 đạt 342170 tấn, trị giá 211,222 triệu USD Từ ngày 01/01/2008 đến ngày 30/9/2008 xuất gạo đạt 3554303 tấn, trị giá FOB 2153 tỷ USD [45] III BỆNH HẠI LÚA (DISEASES) Chúng ta chia bệnh lúa làm nhóm tùy theo tác nhân gây bệnh: bệnh vi khuẩn, bệnh siêu vi khuẩn, bệnh tuyến trùng, bệnh sinh lý bệnh nấm như: bệnh đốm nâu, bệnh khô vằn, bệnh thối bẹ, bệnh đạo ôn… 3.1 Bệnh đạo ôn (Rice blast): Bệnh đạo ôn bệnh làm thiệt hại nghiêm trọng suất lúa Bệnh có khắp vùng trồng lúa giới Những thiệt hại bệnh đạo ôn gây lúa thông báo thường xuyên giới Việt Nam Theo báo cáo suất giảm tới 80% vùng dịch thiệt hại bệnh gây hàng năm vào khoảng 10 - 25%, (1992) [22] Bệnh đạo ơn xt lúc lúa non, đặc biệt gây tác hại mạnh lúc lúa trổ Do vậy, gây nên bơng bạc hạt thóc bị đen, lep lửng, làm giảm sản lượng chất lượng lúa nhiều Bệnh gây hại sớm từ nương mạ thường bị nặng giai đoạn làm đòng đến sau trổ thời gian Nấm cơng phận lúa nhiều phiến Bệnh xuất đốt thân làm gãy ngang thân lúa cổ (bệnh khô