1. Đặt vấn đề
Mục tiêu nghiên cứu
Đối tƣ ng v nội dung nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Đóng góp mới của luận án
Ứng dụng thực tiễn của luận án
1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo
1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn tới cây lúa
1.1.3.1. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm hình thái
1.1.3.2. Hạn ảnh hưởng tới đặc điểm sinh lý
1.1.3.3. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm sinh hóa
1.1.3.4. Ảnh hưởng của hạn ở mức đ phân tử
1.1.3.4.1 Quá trình nhận và truyền tín hiệu
1.1.3.4.2. ác protein tham gia vào quá trình đáp ứng điều kiện hạn
1.2.1. Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vật
1.2.1.1. Nhân tố phiên mã AP2/ERF (APETALA2/EthyleneResponsive Element Binding Protein)
1.2.1.2. Nhân tố phiên mã WRKY
1.2.1.3. Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper)
1.2.1.4. Nhân tố phiên mã MYB (myeloblastosis)
1.2.2. Nhân tố phiên mã NAC v vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật
Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc protein NAC [108]
Hình 1.3: Mạng lƣới điều hòa phiên mã các gen đáp ứng stress phi sinh học của nhân tố phiên mã NAC ở lúa [103]
Bảng 1.1: Chức năng của nhân tố phiên mã NAC [103]
1.3.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên Thế giới
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam
2.1.1. Đối tƣ ng nghiên cứu
2.1.2. Chủng vi sinh vật
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Bảng 2.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.
2.1.4. Hóa chất
2.1.5. Thiết bị
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật
2.2.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa Việt Nam
2.2.1.2. Xử lý cây lúa với các điều kiện stress giả định
2.2.1.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa chuyển gen
2.2.2. Tách chiết, định lƣ ng DNA/RNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA plasmid
2.2.2.2. Tách chiết RNA từ mô thực vật
2.2.2.3. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
2.2.2.4. Đánh giá mức đ biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR
2.2.2.5. Xác định tương đối số lượng ản cop ằng kỹ thuật qRT-PCR
2.2.4. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 trong tế bào thực vật
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM- Lip9/OsNAC1
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pBI-35S/OsNAC và pBI- Ubi/OsNAC1
2.2.5. Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1
2.2.6. Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen
2.2.7. Các phƣơng pháp định lƣ ng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa
2.2.7.1. Xác định hàm lượng nước tương đối trong lá
2.2.7.2. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll
2.2.7.3. Phương pháp xác định hàm lượng proline
2.2.7.4. Xác định mức đ tích tụ ROS
2.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê
3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam
Bảng 3.1: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam
3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn
Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn
Nhân dòng các gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC vào vector pGEM-T
Hình 3.3: Sàng lọc thể biến nạp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc
Hình 3.4: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng PCR
Hình 3.5: Kiểm tra plasmid tái tổ h p bằng enzyme cắt giới hạn
Giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC
Hình 3.6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNAC1, OsNAC5
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục
Hình 3.8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNAC1 bằng enzyme cắt giới hạn
Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI- 35S/OsNAC1
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động cảm ứng stress
Hình 3.11: Xử lý vectorpCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bằng enzyme cắt giới hạn BamHI
Hình 3.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd29A/OsNAC1và pCAM- Lip9/OsNAC1
Hình 3.13: Kiểm tra plasmid tái tổ h p pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM- Lip9/OsNAC1 bằng PCR và cắt giới hạn
Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1, pBI- 35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pCAM-Lip9/OsNAC1
Hình 3.15: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301
3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa
Bảng 3.2: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Hình 3.16: Chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 vào lúa
3.3.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh đƣ c chuyển cấu trúc biểu hiện OsNAC1
Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc cây lúa tái sinh đƣ c chuyển gen OsNAC1
Bảng 3.4: Kết quả xác định số lƣ ng bản sao gen kháng Hygromycin trong cây lúa chuyển gen T0
Bảng 3.5: Kết quả sinh trƣởng của cây lúa chuyển gen T0 trong nh lƣới
3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T1
Bảng 3.6: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1
Bảng 3.7: Kết quả sinh trƣởng của các cây lúa chuyển gen đời T1
3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2
3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng, phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2
Hình 3.19: Đánh giá khả năng sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen
3.4.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen
Hình 3.20: Các dòng lúa sau 2 tuần xử lý hạn
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen dựa trên độ cuốn lá
Bảng 3.9: Kết quả xác định h m lƣ ng nƣớc tƣơng đối trong dòng lúa chuyển gen
Bảng 3.10: H m lƣ ng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyển gen
Bảng 3.11: H m lƣ ng chất diệp lục b trong các dòng lúa chuyển gen
Bảng 3.12: H m lƣ ng chất diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyển gen
Bảng 3.13: H m lƣ ng proline trong các dòng lúa
Hình 3.21: Ảnh hƣởng của hạn đến sự tích tụ H2O2 trong lá lúa
Hình 3.22: Khả năng phục hồi của các dòng lúa chuyển gen v dòng đối chứng sau xử lý hạn
Bảng 3.14: Kết quả so sánh tƣơng quan khả năng chịu hạn của các dòng lúa