Nghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh học
TÍNH CẤP THIẾT CỦAĐỀTÀI
Cây dưa hấu (Citrullus lanatus(Thunb.) Matsum & Nakai) là loài thực vật phổ biến nhất trong họ Bầu bí (Cucurbitaceae), có nguồn gốc từ miền nam châu Phi Dưa hấu chủ yếu được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó phần lớn diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, Caribe và miền Nam nước Mỹ Dưa hấu có giá trị kinh tế quan trọng trong họ Bầu bí và được trồng chủ yếu để ăn tươi hoặc dùng lấy hạt (Robinson và Decker-Walters, 1997) [149].
Năm 2021, Việt Nam thuộc Top 10 nước sản xuất dưa hấu nhiều nhất thế giới với với diện tích diện tích trồng dưa hấu 63.948 ha, sản lượng 1.534.613 tấn, năng suất 23,99 tấn/ha (FAOSAT, 2023) [73] Trong những năm gần đây, sản xuất dưa hấu tại Phú Yên có xu hướng gia tăng và trở thành một trong những cây trồng phổ biến trong sảnxuấtnôngnghiệpđịaphương.Sảnlượngdưahấucủatoàntỉnhđạt35.903,37tấnvà năng suất 23,33 tấn/ha, xấp xỉ năng suất bình quân của cả nước(2021).
Câydưahấuthuộcnhómcâycóthânmềm, yếu,chứanhiềuchấtdinhdưỡngnên dễ bị các đối tượng sinh vật gây hại làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất vàchất lượng quả Trong đó, phải kể đến bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmDidymella bryoniae(Auersw.) Rehm gây ra Đây là bệnh gây hại chính ở nhóm cây họ Bầu bí nói chung và cây dưa hấu nói riêng Bệnh phân bố trên toàn Thế giới, đặc biệt ở các vùng Trung và NamMỹ,Caribbean,ChâuÁ,ChâuPhi,ChâuÂuvàChâuĐạiDương.Bệnhcóthểgâygiảm năng suất 30% dưới điều kiện thời tiết thuận lợi cho phát triển bệnh (Keinath và cs, 2022) [72].
Biểu hiện triệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu là các đốm tròn nhỏ, màu nâu hoặc đen xuất hiện trên lá Từ mép lá, đốm bệnh lớn dần và lan rộng tới cuống lá, làm lá héo Bệnh diễn biến nặng tiếp tục phát triển theo cuống lá tới thâncây,tạo ra vết nứt trên thân và chảy giọt dịch màu nâu Bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD.bryoniaegâyra có thể được nhận diện thông qua quan sát các biểu hiện bệnh trên cây ngoàiđồngruộnghayquansátcấutrúcbàotửcủanấmgâybệnhtrongđiềukiệnphòng thí nghiệm.Ngoài ra, một số phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại giải trình tự gene có thể xác định chính xác tác nhân gây bệnh Hiện nay, các biện pháp để quản lý bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu như sử dụng thuốc hóa học để xử lý hạt giốnghayphun phòng trừ nấm gây bệnh trên đồng ruộng, luân canh cây trồng để giảm tỷ lệ nhiễm bệnh hoặc sử dụng vi sinh vật có ích có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh Sử dụng thuốc hóa học là phương thức quản lý bệnh phổ biến được nông dân áp dụng rộngrãi,tuynhiêngiảiphápnàykhókiểmsoátdưlượngthuốcbảovệthựcvậttrênquả, tác động đến môi trường và sức khỏe con người, giảm giá trị kinh tế cây dưa hấu.Việc sử dụng các vi sinhvậtcó íchnhưnấm hay vikhuẩnđểđểphòngtrừbệnhgâyhạicâytrồng đangđượcnghiêncứuvà ứngdụngphổbiến trênThếgiớicũngnhưtạiViệtNam. Mộtsốchủngvikhuẩn có khảnăngkiểmsoátnấmD.bryoniaevàhạnchế bệnhnứt thân chảy nhựagâyhạicâydưa hấutrênđồng ruộng đã đượcnghiêncứunhư Pseudomonas,Bacillus, StreptomyceshayBreviBacillus(Zhaovàcs, 2016; Nguyễn ThịThu Nga và cs,2010; UtkhedevàKoch, 2002)[93,134, 169].
Phú Yên nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa,thời tiếtkhí hậu nóng ẩm, thuậnlợichothờivụcanhtácdưahấu.Tuynhiênviệcgieotrồngcâydưahấuliêntụcđãtạođiềukiện thuậnlợi chonấm gâybệnh tồntại,tíchlũytrên đồng ruộngvàphát sinhgâyhại. Nhằmquảnlýbệnhnứtthânchảynhựacóhiệuquả,antoàn cho môi trường và đảm bảochấtlượngsảnphẩm,cầnxâydựngvàthựchiệnmộthệthốngquảnlýsinhvậtgâyhạitổnghợpv ớinhiềubiện pháp như quảnlýsức khỏeđất, canh tác,giống vàsửdụngcácyếutốkiểmsoát bệnh hại bằngphương pháp hóahọchaysinhhọc.Tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng sử dụng tác nhân sinh học cụ thể và trên diện rộng trong việc phòng chống bệnhnứtthânchảynhựatrêncâydưahấucònnhiềuhạnchế.Đểcócơsởkhoahọcnhằmxâydựngchiế nlượcquảnlýbềnvữngbệnhnứtthânchảynhựadưahấuvàhạnchếônhiễmmôitrườngcần nghiên cứuđặcđiểm sinh học,sinh tháihọc phù hợp với biệnpháp phòng trừsinhhọcnấmD.bryoniaeg â ybệnhnứtthânchảynhựacâydưahấutạiPhúYên.Xuất phát từ những lý do trên, đề tài luận án “Nghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu
( Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymellabryoniae (Auersw.)Rehmgâyravàbiệnphápphòngtrừsinhhọc”đượcthựchiệ nlàcấpthiết và phù hợp với yêu cầu của thực tiễn sảnxuất.
MỤC TIÊU CỦAĐỀTÀI
2.1 Mục tiêuchung Đánhgiáđượctìnhhìnhsảnxuấtdưahấu,mứcđộgâyhạivàdiễnbiếncủabệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu tại Phú Yên và nghiên cứuứngdụngmộtsốchủngvikhuẩnBacillusspp.đểkiểmsoátnấmD.bryoniaen h ằ m p h ò n g c h ố n g b ệ n h h ạ i đ ạ t h i ệ uquả.
- Đánh giá được thực trạng sản xuất dưa hấu tại Phú Yên và mức độ gây hại, diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu tại PhúYên.
- Thuthập,phânlập,địnhdanhtácnhângâybệnhvàđánhgiácácđặcđiểmhình thái,mốiquanhệditruyền,độctínhgâybệnhcủatácnhângâybệnhnứtthânchảynhựa trên cây dưa hấu tại PhúYên.
- TuyểnchọnđượcmộtsốchủngvikhuẩncóíchBacillusspp.cókhảnăngkiểm soát sự phát triển của nấm bệnh, khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaev àkhảnăngthúcđẩysinhtrưởng,pháttriểncâydưahấutrongđiềukiệnphòng thí nghiệm, nhà lưới và đồngruộng.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀTHỰCTIỄN
Cung cấp dữ liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh học, trình tự gene của nấm
D bryoniaegây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu tại Phú Yên, ghi nhận khả năng xâm nhiễm, phát sinh và phát triển của bệnh tại Phú Yên.
TuyểnchọnđượcmộtsốchủngvikhuẩncóíchBacillusspp.làmcơsởkhoahọc cho việc phòng, chống bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưahấu.
Kếtquảnghiêncứulàcơsởkhoahọcđểứngdụngtrongviệcxâydựngquytrình quản lý bệnh nứt thân chảy nhựa bằng vi khuẩn có íchBacillusnhằm hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học, đồng thời khuyến cáo các giải pháp an toàn trong quản lý bệnh hại đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng cũng như người sảnxuất.
Cung cấp các dẫn chứng của loài nấm gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên câydưa hấu, việc nhận diện triệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựa chính xác sẽ giúp cho việc phòng trừ bệnh chủ động và hiệu quảhơn.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦALUẬNÁN
(1) Xác định được các đặc điểm hình thái và mối quan hệ di truyền của loàiD.bryoniaegây bệnh nứt thân, chảy nhựa tại PhúYên.
(2) Xácđịnh đượcmộtsốchủngvikhuẩncóíchBacillusspp.cókhảnăng kiểm soátsựpháttriển nấmD.bryoniaevàhạnchế bệnhnứt thânchảy nhựa cây dưahấuởđiềukiệninvitro,nhàlướivàđồngruộng;trongđóchủngBacillusspp.SD20D12 đạt hiệu quả tốtnhất.
(3) Bước đầu xác định sự hiện diện của hoạt tính auxin (IAA) trong dịch bào tử của chủng vi khuẩnBacillusspp SD20D12 có vai trò như chất điều hòa tăng trưởng thực vật, kích thích tăng trưởng và phát triển cây dưa hấu trong điều kiệnin vitro, nhà lưới và đồngruộng.
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀNGHIÊNCỨU
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂYDƯAHẤU
Câydưahấu(Citrulluslanatus(Thunberg)Matsum&Nakai)thuộcgiớiPlantae, ngành Angiospermaea, bộ Cucurbitales, họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí), chiCitrullus(Kutty và cs, 2013) [102].Dưa hấu có tên gọi chung làCitrullisdo H A Schrader đề nghị vào năm
1836 và tiếp tục bảo lưu danh pháp bởi các đề xuất độc lập khác của Anguria Miller (1754) và Colocynthis Miller (1754).Momordica lanataThunberg (1794) là tên khoa được hầu hết các nhà Thực vật học chấp nhận,Citrullus vulgarisđượcH.A.Schrader(1836)đềxuấtlàtênkhoahọcđượcsửdụngphổbiếnvàCitrulluslan atusđượcxemlàtêngọilâuđờinhấtcủacâydưahấu.Năm1959,Mansfeldđềnghị tênkhoahọccâydưahấulàCitrulluslanatus(Thunberg)vàtrùnghợpvớitênkhoahọc đã được Matsumura và Nakai đã đề nghị vào năm 1920 Đến nay, tên khoa học của cây dưa hấu được sử dụng phổ biến rộng rãi làCitrullus lanatus(Thunberg) Matsum & Nakai (Kutty và cs, 2013) [102] Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) có hơn 900 loài thực vật, bao gồm dưa chuột, dưa hấu, dưa gang, bí ngô và nhiều loạikhác.
Sựtiếnhóadướisựthuầnhóacâytrồngcủaconngườidiễnratronglịchsửphần lớn không được ghi chép cụ thể và chính xác, mặc dù đã được mô phỏng và xây dựng lại dựa trên các minh chứng lịch sử và phát triển cây trồng bao gồm khảo cổ học, thực vật học, di truyền học, hoa viên cảnh quan, ngôn ngữ học và các ngành khác (Ellul và cs, 2007; Zohary và Hopf, 2000; Paris, 2013) [70, 173, 138] Một trong những minh chứng lịch sử đáng kể nhất là nguồn gốc cây dưa hấu thuộc họ Bầu bí (Janick và cs, 2007) [71].Cáchìnhảnhvềcâydưahấutừthờikỳtrungcổđượclưulạikháítvànhững mô tả ban đầu xuất bắt nguồn từ giai đoạn cuối thời trung cổ (Paris và cs, 2009) [139] Một số loài cây thuộc họ Bầu bí có nguồn gốc từ Ai Cập cổ đại và từ những vùng đất xungquanhkhuvựcbiểnĐịaTrungHảicóniênđạithờiLaMã,mộttrongsốđólàcâydưa hấu (C. lanatus) (Janick và Paris, 2007)[78].
Dưa hấu được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên Thế giới Trung Đông, Châu Mỹ, ChâuPhi,ẤnĐộ,NhậtBảnvàChâuÂulànhữngkhuvựcsảnxuấtdưahấuquantrọng Dưa hấu có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Phi Sự canh tác dưa hấu bắt đầu từ thời Ai Cập cổ đại và Ấn Độ, sau đó lan rộng đến các quốc gia khác nhau như Địa Trung Hải,TrungĐôngvàChâuÁ(Fehér,1993)[75].Đếnthếkỷthứ10,câydưahấuđãđược dunhậpvàoTrungQuốc–mộttrongnhữngquốcgiasảnxuấtdưahấulớnnhấtthếgiới hiện nay. Dưa hấu được trồng ở châu Âu vào thế kỷ thứ 13 và châuMỹvào thế kỷt h ứ
16 Ở Việt Nam, dưa hấu được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm với hạt giống từ trời do chim từ phương Tây mang đến Hiện nay, dưa hấu được trồngphổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó hơn nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, Châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Ellul và cs, 2007) [70] Thông qua việc việc canh tác và chọn lọc kéo dài, các kiểu hình mới của cây dưa hấu đã tiến hóa và thay đổi, các giống được trồng ngày nay có ít điểm tương đồng với các giống châu Phi cổ đại (Fehér, 1993) [75].
Sảnxuấtdưahấuđòihỏimộtchukỳsinhtrưởngdàivàđiềukiệnkhíhậuthíchhợp.Hiện nay,người tiêu dùngđãcónhiềunhận thức cao về giá trịdinhdưỡng vàcôngdụngẩmthực của loạicâytrồngnày.Đi kèm nhucầutiêuthụ sản phẩmcâydưa hấu và sự cảitiếnđadạngvềgiốngcâytrồng,đểthuđượclợinhuận,ngườisảnxuấtphảitạorasảnlượngdưach ấtlượngcao,đadạng về hình thức nhưcácloại quả nhỏ vàkhônghạt, cùng với sựpháttriểncáckỹthuậtchếbiếnsauthuhoạchdướidạngsảnphẩmđónggóicắtsẵn,đãcảithiệnsựt iệnlợicủaviệcphụcvụloạinôngsảnnày.
Dưa hấu là cây nhỏ, thân mềm, có lông, phân nhánh, màu sắc lá thay đổi xanh – xanhđậm–xanhlácây(Schaffervàcs,2013)[138].Dưahấulàloàiduynhấtthuộc họ bầubícóláđượcphânchiathànhcácthùylá(Hình1.1).Trongquátrìnhcanhtác,quan sát bốn dấu hiệu sau đây có thể xác định được thời điểm quả dưa hấu chín: (1) Các tua xoăn màu xanh nhạt trên thân gần vị trí đậu quả chuyển sang màu nâu và khô Một số giống tua xoan chuyển sang màu nâu từ 5 – 10 ngày trước khi quả chín hoàn toàn; (2) Bề mặt lớp vỏ giảm độ bóng và chuyển sang xỉn màu; (3) Lớp vỏ của quả sần sùi và dễ dàng dùng tay ấn nhẹ tạo vết nứt trên vỏ; (4) Quả khi chín có màu xanh đậm, lớp vỏ tại vị trí gần sát mặt đất sẽ chuyển sang màu vàng, vỏ có màu xanh càng đậm thì khi chín xuất hiện màu vàng càng rõ (Wehner, 2008)[170].
Hình 1.1Cây dưa hấuCitrullus lanatus(Thunberg) Matsum & Nakai được trồng tại
Phú Yên vụ Đông xuân 2022 – 2023
Cây dưa hấu có thể được trồng trên đồng ruộng bằng cách gieo hạt hoặc cây con (Wehner, 2008) [170] Để đạt tỷ lệ gieo trồng cao, hạt dưa hấu nên được gieo để nẩy mầm trong bầu có chưa giá thể phù hợp Điều quan trọng kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ và ánhsángthíchhợpđểhạtnảymầmvàcấyrangoàiđấttrồngkhicâykhôngquálớn.Để đạthiệuquảcao,ngườisảnxuấtnênsửdụngmàngphủnhựađểbảovệđất,giữđấtẩm, lữu trữ nguồn dinh dưỡng có trong đất và bảo vệ cây con tránh khỏi côn trùng gây hại Cây được trồng thành từng luống, giữa các cây được trồng với khoảng cách rộng vìcây có thân bò Khoảng cách trồng giữa cáccâydưa hấu có thể tùy thuộc vào quy mô của vườn trồng, lượng nước tưới sẵn có và chất lượng đất Khoảng cách giữa các cây điển hình trong hàng dao động từ
1 – 1,8m trên đất được tưới tiêu, đến một cây cách nhau 1,8– 3,04mtrênđấtkhô.Khoảngcáchhàngthườngthayđổitừ1,82–5,4m.Việckiểm soát chất lượng của đất, côn trùng và dịch bệnh cần được điều chỉnh theo khoảng cách giữa các cây. Người sản xuất có thể điều chỉnh khoảng cách trồng để đạt được chất lượng quả, kích thước và sản lượng dưa tốt nhất cho nhu cầu thị trường Một số người sảnxuấtgieohạtthànhhaihàngkhoảngcáchdưới1m,chophépcáccâynonmọccùng nhau để bảo vệcâycon tránh bị ảnh hưởng bởi gió Dưa hấu có thể được cấy trên đất trống hoặc gieo hạt trên đất có phủbạt.
Câydưahấu(C.lanatus)thíchứngvớikhíhậunóng,khôhạnvàđượcthuầnhóa trong điều kiện canh tác ở vùng nhiệt đới (Schaffer và cs, 2013) [138] Cường độ ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao thúc đẩy sự ra hoa và phát triển quả cây dưa hấu (Wehner, 2008) [170].Nhiệtđộđấttrồngtốiưuđểhạtdưahấunẩymầmlàtừ21,1–35 o C,hạtsẽ không nảy mầm nếu nhiệt độ đất dưới 15,5 o C (Shrefler và cs, 2015)[162].
Dưahấupháttriểntốtnhấttrênđấtthịtphacát,thoátnướctốtvàđộpHthấp,nhưng pháttriển tốt nhấtởvùngtrồngđộ pH của đấtkhoảngtừ 6,0 đến6,8,bón vôinếuđộ pHcủađấtdưới5,5.Khitrồngtrênđấtthịt,câypháttriểnchậm,kíchthướcvàchấtlượngquả dưa hấuthườngkém hơn Đất cát mịn tạo ranhữngquả dưacóchất lượngcao,nhấtlà khi cóchếđộchămsóctốt,cungcấpđủnướcvàbónphân.Sửdụnghệthốngtướinhỏgiọttrởnênphổbiế nhơnvới các vườn trồngcó quy môlớn.Tướinhỏ giọt kết hợp với bón phân cóthểcungcấpchocâydưahấunguồnnitơthíchhợpvàliêntụcmàkhôngcầnbónlượnglớn cùng một lúc(Shrefler và cs, 2015)[162].
Việclựachọnmộthoặcnhiềugiốngdưahấuphùhợplàmộttrongnhữngquyếtđịnhquan trọngnhất củangườisảnxuất.Sử dụng cácgiống khôngphù hợp với thịtrườngtiêudùngvàtìnhhìnhsảnxuấtcụthểsẽdẫnđếnviệclợinhuậnthấp,cóthểvídụviệcgieotr ồngmộtsốgiốngphổbiếnđểphụcvụnhucầutiêudùngtạiđịaphươngnhưngkhôngphùhợpđể vậnchuyểnxacũng không manglạihiệuquảkinh tế cao cho người sản xuất Do đó,ngoàikhả năng được thịtrườngưachuộng,cácgiốngdưa hấu sửdụng phảicónăngsuất caoổnđịnh,thíchứngvớivùngsảnxuấtvàcócácđặctínhkhángbệnhnhấtđịnhởmứcđộ cao Ngoàicác giống dưa hấu có hạthaygiống dưachuyênlấyhạtthông thường, việclaitạocácgiốngdưa không hạt cũng là xuhướngpháttriểnđểphục vụ nhu cầu ngườitiêu dung.Dưa hấutambộithườngđược gọi là dưahấukhông hạt,làsựlai giữa mộtgiống lưỡngbộithôngthường(haibộnhiễmsắcthể)vàmộtdòngtứbội(bốnbộnhiễmsắcthể).Dưatamb ội có hạt chưaphát triển,nhưng đôikhicó một hoặc nhiềuhạt phát triển Việc trồngcâytambộiphảibaogồmgiốngdưahấucóhạtrảiráckhắpruộngđểlàmnguồnphấnhoacầnth iếtcho quátrình hình thànhquảkhônghạt Sử dụng giốngcóquảănđược hoặcgiốngcókhảnăngtạophấnhoa chỉ nhằmmục đích cungcấp phấn hoa Dưa hấu tam bội cóthểđượcsảnxuấtởbấtcứnơinàomàdưahấuthôngthườngđượctrồng.Cácloạikhông hạt thườngđược trồngtrênđồngruộngbằngphươngphápcấyghép,dochi phí hạt giống và khókhăn trongviệctrồngcây (Shrefler và cs, 2015)[162].
Tùy theotừngloại giốngvànhu cầu của thịtrườngtiêuthụ, quả dưahấucókích thước thay đổitừnhỏ, vừa, lớn hoặc khổnglồvớitrọng lượngtừ 2 –20kg; hìnhdángđadạng nhưhìnhtròn,hình obovate(hìnhdạngtrứng ngược,đầu nhỏvềphíacuốnlá),hình khốihoặctráitim;màuvỏđơn sắc (xanhlácâynhạt,đậm;đỏ, trắng hay vàng) hoặcđasắc(màuxanh hayxámcócácsọc trắnghẹp hayrộng); thịt quả thườngmàuđỏ,một sốkhácmàuvàng,camhoặctrắng, ngọtvà cóhạt hay khônghạt(Wehner,2008)[170].Dưa hấu cómàu xanhnhạt và xanh xámít bịtổnthươngdocháynắnghơncácloạidưacómàuxanhđậmvàsọc(Shreflervàcs,2015)[162].
Dưahấubaogồmda,vỏ,thịtvàhạt.Vỏănđượcchiếmkhoảng40%tổngkhối lượngdưahấunhưngthườngbịloạibỏnhưchấtthảigâyracácvấnđềvềmôitrường.Vỏdưa hấu rấtgiàu nguồnaxitbéo, khoáng chất, hợpchấtphenolicvàchấtxơ.Nócũng chứa carbohydratehòa tan,carotenoids, alkaloid, saponinvàphytates.Vỏquảdưa hấu(Watermelon Rind–WMR)làmộtdạngchấtthảinông nghiệpcógiátrị kinhtế vàcầnđượckhai tháctriệtđể Hầuhếtvỏ quả dưa hấu sau khiđượcgọt,sơchếvàlàm sạchcóthể được dùng làm nguyênliệuđể chế biến thànhđường,màuthực phẩm hay chiết xuấthoạtchấtacidcitric Ngàynay, xuhướngphục hồi cácthành phầncógiátrịtừcác bộphận thựcphẩm bịbỏquênvàđưachúngtrởlạichuỗi thứcănmộtcách kinhtếvàbền vững đangngày càngtrởnênquantrọng Điều nàycóthể giúp giảmthiểuthấtthoátvàlãng phílươngthực,giảm tácđộng đếnmôitrường, tốiđahóalợi nhuận nông nghiệpvàcải thiện tínhbềnvững củalươngthựcở quymôthương mại bằngcách chuyểnđổi chấtthải nôngnghiệpcógiátrịcaonày thànhcácchấtcóhoạt tínhsinhhọccảitiến, tănggiátrị thươngmạicủa chấtthảisinhhọc (Devivà Prabhavathy, 2023) [66].Các sản phẩm táichếtừchất thảinôngnghiệpcógiátrịgia tăng đơngiản, tiếtkiệm chi phívàđược ngườidân ưachuộng.Hơnnữa, nguồnnguyênliệudễdàngtìmkiếm,cóthể xây dựng đượcm ô hìnhtổ chức đào tạo tập huấn, cải thiện sinh kế cho người nông dân, đặc biệt là đối tượng phụ nữ ở các nhóm tự lực, hộ sản xuất để cải thiện nền kinh tế người dân địa phương.
Dưa hấu được dùng như một dạng thực phẩm tươi ăn trực tiếp bằng cách cắt lát, miếng (thường có trong salad trái cây), nước ép, sản xuất thành kẹo và hạt có thể ăn được Dưa hấu được dùng như trái cây hàng ngày tương tự như táo, chuối và cam (Wehner, 2008) [170] Dưa hấu là thực phẩm có nhiều khoáng chất, thịt quả chứa hàm lượng carotenoid lớn và cung cấp nước Dưa hấu chứa 5 – 10% đường, 0,22% kali, 0,016% natri, 0,022% canxi trong trọng lượng tươi thịt quả Hàm lượng vitamin A, C trongthịtquảdưahấucaohơn40%sovớicàchua.Hạtdưahấuchứacácacidbéokhông bão hòa đa như linoleic acid (50 – 60% trọng lượng khô), oleic acid (15% trọng lượng khô) và các acid béo bão hòa như palmitic acid, stearic acid và glyceridelưutrữ Các acid béo được sử dụng để điều chế dầu, mỹ phẩm và điều trị bệnh Dầu từ hạt dưa hấu lànguồndượcliệusửdụngtrongđiềutrịungthư,bệnhtimmạchvànhhoạtđộngởmức biểumôvàmàngtếbào,giúpgiảmnồngđộcholesterolvàhuyếtápcao.Cácchấttrung giancủalinoleicacidvàα-linolenicacidđượcsửdụngtrongcôngnghệgen(El-Adawy và Taha, 2001; Logaraj, 2010) [71,119].
TÌNH HÌNH SẢN XUẤT DƯA HẤU TRÊN THẾ GIỚI, TẠI VIỆT NAM VÀ PHÚYÊN .8
Dưahấu(C.lanatus)đượcxếphạngtrongsố10loạirauquảcótầmquantrọngkinhtếhàngđ ầuthếgiới(SchaffervàParis,2016)[156].Hiệnnay,sảnlượngdưahấutạicác quốcgiaChâuÁchiếmhơn80%sảnlượngdưahấutrêntoànThếgiới.TrungQuốclànướcsản xuấtdưa hấulớnnhất,sảnlượngchiếm67,6% trênThếgiới Châu Phi, ChâuÂu vàBắcMỹ cósản lượngtương đương,đạtkhoảng3 – 4triệutấnmỗi năm.Mỗi một khuvựchayquốcgiasẽcóhệthốngsảnxuấtdưahấukhácnhau,tùythuộcvàokhíhậunôngnghiệp,t ừ nhàkínhđến cánh đồng phù hợp với mức độ ứngdụng côngnghệ caokhác nhau.Hầuhết,ởcácvùngnôngthôn,dưahấuđượctrồngxenkẽvớicácloạicâyraumàukhác(Dube và cs,2021) [69].Một sốquốcgia có diệntích trồngdưa hấuvàsảnlượngcao nhấtThếgiớinhư:Trung Quốc,Thổ NhĩKỳ,ẤnĐộ,Algeria, Brazil, Nga, Pakistan,Hoa
60,5triệu tấn/năm,tiếptheolà Thổ NhĩKỳ 3,4triệu tấn/năm, Iran3,2triệutấn/năm… (Bảng 1.1) (FAOSAT, 2023)[73].
Bảng 1.1Top 15 quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất Thế giới năm 2021
STT Quốc gia Diện tích (ha) Sản lượng (tấn)
Năm2021,ViệtNamthuộctrongTop12/15quốcgiasảnxuấtdưahấulớntrênThếgiới,diệntíc hsảnxuấtđạtkhoảng49.543ha,sảnlượng1.212.139tấn,năngsuất24,49 tấn/ha (Bảng 1.1) (FAOSAT, 2023) [73].Việt Namcókhí hậu nhiệt đớigiómùa ẩm, phù hợp vớisựpháttriểncủa câydưa hấu Tại khu vựcmiền Trung,dưahấu được trồng tập trung ở Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên.
Trong những năm gần đây, sản xuất dưa hấu tại Phú Yên có xu hướng gia tăng vàtrởthànhmộttrongnhữngcâytrồngcótiềmnăngcanhtáctrongsảnxuấtnôngnghiệp ởPhúYên.Sảnlượngdưahấucủatoàntỉnhđạt35.903,37tấnvànăngsuất23,33tấn/ha Phú Yên là tỉnh ven biển Nam trung bộ có địa hình địa hình dốc từ Tây sang Đông, đồi núi chiếm 70% diện tích toàn tỉnh Thổ nhưỡng tại Phú Yên có các nhóm đất chính là đất đỏ vàng, đất xám bạc màu, đất đen, đất phù sa dọc theo sông, suối và đất cát ven biển Phú Yên nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô Tài nguyên khí hậu thủy văn tỉnh Phú Yên khá đa dạng các chế độ mưa, chế độ nhiệt, chế độ ẩm, tương đối thuận lợi cho nông nghiệp.Tuynhiên, trong nhữngnăm gần đây, khí tượng thủy văn có nhiều thayđổi.
Trong giai đoạn từ 2014 – 2021, tình hình sản xuất dưa hấu tại Phú Yên ổn định qua các năm và chủ yếu gieo trồng trong vụ Đông xuân để phục vụ Tết Nguyên Đánvà xuấtkhẩu.Năm2014,tổngdiệntíchgieotrồngdưahấulà1.159ha,năngsuấtbìnhquân là 16,92 tấn/ha. Năm 2020, tổng diện tích gieo trồng dưa hấu là 1.977,81 ha, năng suất bình quân là 23,01 tấn/ha. Năm 2021, do tình hình dịch bệnh, diện tích dưa hấu năm 2021 có giảm so với năm 2020, tổng diện tích dưa hấu là 1.538,73 ha, năng suất bình quân là 23,33 tấn/ha (Bảng1.2).
Tại Phú Yên, cây dưa hấu được tập trung trồng chủ yếu ở các huyện miền núi như huyện Sông Hinh (xã Đức Bình Đông, Đức Bình Tây, Ea Trol, Sơn Giang), huyện SơnHòa(xãSơnHội,EaChàRang,SơnPhước,SơnHà,SơnĐịnh),huyệnĐồngXuân
(xãĐaLộc,XuânLãnh,XuânQuang1,XuânQuang2,XuânQuang3)vàcác xãvùng đất đồi thuộc huyện Tuy An (xã An Nghiệp, An Lĩnh), huyện Tây Hoà (xã Hoà Phú, HoàTânTây),huyệnPhúHoà(xãHoàHội).Cácđịaphươngcònlạidiệntíchtrồngdưa không đáng kể (Bảng1.3).
Sản xuất nông nghiệp gặp nhiều khó khăn do các nguyên nhân như biến đổi khí hậu, diễn biến sâu bệnh gây hại cây trồng phức tạp và việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong nông nghiệp Thành phần sâu bệnh hại phổ biến vàgây hại nặng ở Phú Yên là bọ trĩ, sâu xanh ăn lá, sâu khoang và bệnh nứt thân chảy nhựa Cây dưa hấu mặc dù có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, nhưng diện tích và năng suất còn hạn chế, chưa đáp ứng được nhu cầu và thị hiếu của thị trường Việc quản lý trong sản xuất có nhiều bất cập, kém bền vững như sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu không đúng liều lượng, không đảm bảo thời gian cách ly dẫn đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật còn tồn đọng trên sản phẩm thu hoạch, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường, làm giá trị kinh tế câydưa.
Bảng 1.2Tình hình sản xuất dưa hấu ở Phú Yên trong giai đoạn 2014 - 2021 Năm
Diện tích (ha) Năng suất
Sản lượng (tấn) XuânĐông Cả năm Tỷ lệgieo trồng(%) Đông
Nguồn: Cục thống kê tỉnh Phú Yên, 2022
Bảng 1.3Diện tích sản xuất dưa hấu (ha) tại các địa phương ở Phú Yên trong giai đoạn 2014 - 2021
Nguồn: Cục thống kê tỉnh Phú Yên, 2022
Trước nhu cầu tiêu thụ của thị trường nói chung và xu hướng sản xuất của địa phương nói riêng, Nhà nước đã xây dựng định hướng lâu dài cho việc sản xuất nông sản, tạo động lực thúc đẩy các vùng sản xuất rau, quả phát triển theo hướng bền vững, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng bằng nhiều văn bản, cụ thể như Quyết định số 124/QĐ-TTgngày02/02/2012vềviệcphêduyệtQuyhoạchtổngthểpháttriểnsảnxuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030, Quyết định số 899/QĐ- TTg ngày 10/6/2013 về việc phê duyệt Đề án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theohướng nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững của Thủ tướng Chính phủ; Quyết định số 1976/QĐ-UBND ngày 10/10/2017 về việc phê duyệtQuy hoạch tổng thể phát triển sản xuất nông nghiệp tỉnh Phú Yên đến năm 2025, tầm nhìn đến năm 2030, Chỉ thị số 14/CT-UBNDngày23/8/2013vềviệctăngcườngquảnlýsảnxuất,tiêuthụrauđểđảm để đảm bảo an toàn thực phẩmtrênđịa bàn tỉnh của UBND tỉnh PhúYên;Công văn số 854/SNN ngày26/8/2013 về việc tăng cườngquảnlý sản xuất tiêu thụ rau để đảm bảoATTPtrênđịabàntỉnh,Côngvănsố916/SNNngày14/10/2011vềviệctăngcườngkiểmsoátviệc sử dụng hóa chất trong sản xuất thực phẩm nông sản của Sở Nông nghiệp và PTNT PhúYên Để đảm bảo chất lượng các loại nông sản, đặc biệt sản phẩm rau,quảxanhđòihỏicácnhàkhoahọcvàngườisảnxuấtcầnđưaranhiềugiảiphápthựchiện.
NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA TRÊN CÂY DƯA HẤU
1.3.1 Vị tríphân loại nấm Didymellabryoniae
NấmDidymella bryoniaethuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, bộ Dothideomycetes, họ Didymellaceae, chiDidymella Tên khoa học làMycosphaerellamelonishayDidymella bryoniae(sinh sản hữu tính) vàPhoma cucurbitacearum(Fr.) Sacc (sinh sản vô tính).
Họ Didymellaceae là một trong những họ đa dạng nhất trong bộ nấm Pleosporales (Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes), với hơn 5400 taxo được liệt kê tại MycoBank (Crous và cs, 2004) [64] Hệ thống phân loại của họ Didymellaceae đã trải qua những thay đổi đáng kể thông qua các phân tích về hình thái học và phát sinh loài dựa trên dữ liệu về trình tự DNA của các chủng được được định danh trước đó (Chen và cs, 2015a) [55] Theo Aveskamp và cs (2010) [39], họ Didymellaceae gồm ba chi chính làAscochyta,Didymella,Phomavà các nhóm tương đồng khác được nhóm lại trong họ Didymellaceae, vùng ranh giới của họ Didymellaceae, gồm các chiEpicoccum,Peyronellaea,Stagonosporopsisvà đề nghị thêm các chi khác làBoeremia,LeptosphaerulinavàMacroventuria Trong những nghiên cứu mới nhất, dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự DNA đa locus, họ Didymellaceae được phân loại và phân chia thành 19 chi, bao gồm:Allophoma,Heterophoma, Calophoma(Chen và cs, 2015a, b) [55, 56],Ascochyta,
Phoma, Phomatodes,Epicoccum, Peyronellaea, Stagonosporopsis, Boeremia,Leptosphaerulina, Macroventuria, Nothophoma(Aveskamp và cs, 2010)
2017),Didymellocamarosporium(Wijayawardene và cs, 2016),Heracleicola,
Neodidymella(Ariyawansa và cs, 2015) (Chen và cs, 2017) [57].
Các loài nấm gây bệnh thuộc họ Didymellaceae có tính toàn cầu và môi trường phân bố đa dạng, phạm vi phân bố rộng và xuất hiện phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Caribê, Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Đại Dương (CABI, 2015) [52] Hầu hết các thành viên trong họ này là mầm bệnh của nhiều loài thực vật ký chủ, gây bệnh trên lá và thân (Aveskamp, 2010, 2010; Chen, 2015a, b) [39, 55, 56] Khoảng 70 loài thực vậtđóngvaitròlàcâykýchủcủahọDidymellaceae,baogồmcácloàicâythuộchọCúc (Asteraceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Hòa thảo (Poaceae), họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoa hồng (Rosaceae), họ Bầu bí (Cucurbitaceae) và họ Cà (Solanaceae)(Chen,2017) [57].NấmD.bryoniaep h â nbốkhắpThếgiới,ghinhậnxuất hiện nhiều ở Trung và Nam Mỹ, Caribê, Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Đại Dương (CABI, 2015) [52] Dựa trên sự biến động di truyền của thực vật ký chủ và tác nhân gây bệnh, Santos và cs (2009) [154] đã đánh giá khả năng gây bệnh của nấmD.bryoniaeđối với câytrồng.
Cácđặc điểm về cấutrúcbào tử của nấmD.bryoniaecóthểđượcxác địnhbằngcác phươngpháp gồmphântích môitrường sinh trưởng, pháttriển của bào tửnấm gâybệnh,cácđặcđiểmvềcấutrúc,hình dạng bàotử,kích thước bàotửnấmgâybệnhvà kỹthuậtsinh họcphântử NấmD.bryoniaecóhai hình thứcsinhsảnlàsinhsản hữutínhvàsinhsảnvôtính(Newark,2014)
[132].Trênthânvàlácủacâybịnhiễmbệnhcóthểquansátcảhaihìnhthứcsinhsản.Cácsợinấmphá ttriểnbêntrongmôcủacâyvàtạoracácđốmbệnhtrênláhoặcvếtnứttrênthânhoặcnhánh(Nguyễn ThịThuNga,2009)[19]. Ở giai đoạn sinh sản vô tính, nấm có tên khoa học làPhoma cucurbitacearum(Fr.) Sacc Tên khoa họcDidymella bryoniae(Auersw.) Rehm được công bố năm1881 do Rehm đề nghị, sau đó ông chuyển những loài đuợc mô tả bởi Auerswald (1869) đến chi mới làDidymellaSacc (Nguyễn Thị Thu Nga, 2010) [134] Quả thể vô tính có tên làquảcành(pycnidia)tạoracácbàotửphânsinh(conidia)đểthựchiệncơchếditruyền Quả cành có dạng hỡnh cầu, màu đen, đường kớnh 120 – 180 àm và được hỡnh thành ngaytrênbềmặtmôkýchủ.Quảcànhchứabàotửphânsinh,mỗibàotửcó1-2tếbào dạng hình thoi,kớch thước 6 - 13àm (Keinath, 2002) [158] (Hỡnh1.2).
Hình 1.2Giai đoạn sinh sản vô tínhPhoma cucurbitacearum
(A) Quả cành (pycnidia) màu đen, 120 – 180àm, bỏm trờn bề mặt lỏ, thõn và quả (B) Bào tử phân sinh (conidia), đơn bào, đầu trong, hình trụ, trong suốt, không có vách ngăn hoặc vách ngăn đơn (Newark và cs, 2014) [132] Ởgiaiđoạnsinhsảnhữutính,nấmcótênlàMycosphaerellamelonis(Pass.)Chiu & J C Walker hayD bryoniae(Auersw.) Rehm (Chiu và Walker, 1949) [60], cơ chế ditruyềnđượcthựchiệnbằngquảthểcódạnghìnhbầu(perithecia)tạoracácbàotửtúi (ascospores). Quả thể dạng hình bầu được hình thành do sự dung hợp hữu tính của hai sợi nấm khác nhau, sợi nấm có vách và sợi nấm phân nhánh Nhân của sợi nấm dung hợp thành hợp tử (n × n = 2n), sau các lần phân bào nguyên phân và giảm phân tạo ra bốntếbàođơnnhân.Cáctếbàonàykéodàivàphânbàonguyênphântạoratámbàotử túi (ascospore) được chứa bên trong một túi bào tử (asci) Quả thể dạng hình bầu màu đen, đuờng kớnh từ 140 – 200àm, bờn trong chứa cỏc tỳi bào tử cú kớch thuớc 60 - 90 ì 10 - 15àm Bào tử tỳi cú dạng hỡnh trụ hoặc elip, nhọn hai đầu, cú vỏch ngăn ngang và kớch thuớc 15 - 21 ì 5 - 8àm (Punithalingam và Holiday, 1972) [144] (Hỡnh 1.3) Giai đoạn hữu tính của nấm được quan sát thấy xảy ra ngoài tự nhiên tại các vùng trồng dưa hấu ở Brazil (Santos và Filho, 2009)[154].
Ngoài ra,mộttrườnghợpđặcbiệt hiếmkhixuấthiệnởgiai đoạnsinhsảnhữutínhlà sựxuấthiện của các cấutrúcgiả quả thể bầu(psuedothecia) Quảthể giả dạng hình bầuchỉđượctìmthấytrêncâybịnhiễmbệnh,đặcbiệtlàthâncây.Quảthểgiảcómàuđen,kích thước125–213àm,chứacỏctỳibàotử.Mỗitỳibàotửchứatỏmbàotửtỳi(Hỡnh1.4).
Tùy vào thời điểm và điều kiện thời tiết, nấmD bryoniaecó thể hình thành quả thể dạng hình bầu bầu hoặc quả cành trên cây ký chủ hay đôi khi có thể được tìm thấy trong cùng mô cây ký chủ bị tổn thương Các bào tử túi ở giai đoạn hữu tính đóng vai trò là nguồn bệnh sơ cấp, đó là mầm bệnh chính và dễ dàng phát tán xa nhờ gió Bào tử phân sinh ở giai đoạn vô tính đóng vai trò là nguồn bệnh thứ cấp, được giải phóng ở dạng keo, di chuyển trong khoảng cách ngắn nhờ giọt nước.
Hình 1.3Giai đoạn sinh sản hữu tínhDidymella bryoniae
(A) Quả thể dạng hỡnh bầu (perithecia) màu đen, 200 àm (B) Tỳi bào tử (asci) chứa bào tử túi (ascospore) (C) Bào tử túi (Newark và cs, 2014) [132]
Hình 1.4Giai đoạn sinh sản hữu tínhDidymella bryoniae
(A) Quả thể giả dạng hỡnh bầu (pseudothecia) màu đen, 125 – 213 àm (B) Tỳi bào tử (asci) chứa 8 bào tử tỳi (ascospore) (C) Bào tử tỳi, 14 – 16 x 4 – 6 àm (Newark và cs, 2014) [132] Đểchẩnđoánchínhxáctácnhângâybệnh,cácmẫubệnhthuđượccầnphảiđược phân lập và làm thuần, sau đó so sánh với các mẫu đã biết trước đó hoặc được kiểm tra lại bằng cách lây nhiễm bấm bệnh trên cây khỏe Để chứng minh chủng vi sinh vật thu thập và phân lập được thuộc họ Didymellaceae cần đánh giá dựa trên các quan sát về hìnhtháivàxácđịnhloàithựcvậtkýchủ(Aveskamp,2010;Chen,2015a)[39,55].Tuy nhiên, việc định danh chính xác loàinấmcần dựa trên các phân tích về mặt di truyền bằngcáckỹthuậtsinhhọcphântửgồmkỹthuậtphảnứngchuỗitrùnghợp(polymerase chain reaction – PCR) vàkỹthuật DNA đa hình và nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) (Somai, 2002; Basim, 2016) [158, 43] Qua đó, xác định trình tự vùng phiên mã bên trong5,8SrDNA(ITS),trìnhtựDNAcủatiểuđơnvịlớn28SrDNA(LSU),tiểuđơnvị nhỏ18SrDNA(SSU),trìnhtựcủaRNApolymeraseIIcủatiểuđơnvịlớnthứhai(rpb2) vàvùnggenβ- tubulin(tub2)(Babu,2015;Chen,2015a)[42,55]đểđểnhậndạngthành công, chính xác loàiD.bryoniae.
Từthậpkỷ80củathếkỷXX,cácphươngphápsửdụngchỉthịditruyềnđóngvai tròquantrọngtronglĩnhvựcsinhhọcphântử.Chỉthịditruyềnlàchỉthịthểhiệnsựkhácbiệtgiữacácloàikhá cnhau,khôngthểhiệnchocácgenmụctiêumàchỉlàdấuhiệuhoặc nhưlà“cờđánhdấu”.Cácchỉthịditruyềnchiếmmộtvịtríđặcbiệttrongnhiễmsắcthể
Chỉthịditruyềngồmchỉthịtruyềnthốngvàchỉthịphântử.Chỉthịtruyềnthốnggồmchỉ thị hình thái (tính trạng; đặc điểm hình thái nhưmàusắc, kiểu hình hạt; đặc điểm sinh trưởng…),chỉthịtếbào(cấutrúcnhiễmsắcthể)vàchỉthịsinhhóa.Chỉthịphântử(chỉ thị DNA) nằm gần hoặc liên kết với gen, ít hoặc không ảnh hưởng đến kiểu hình, đánh dấusựthayđổitrongphântửDNAvàđượcchiathànhnhiềuloạidựatrênsựkhácnhau vềphươngphápvàkỹthuậtxácđịnhsựđahình.ChỉthịDNAđượcsửdụngtrongnghiên cứutínhđadạngditruyền,phátsinhloài,phânloại,đánhdấuvàxácđịnhgen;chọnlọc nguồngenvàchọngiống(NguyễnĐứcThành,2014)[25].
Các phân tích dựa trên phương pháp điện di đã chứng minh việc phân loại các loài thành nhiều chi khác nhau tùy theo sự giống nhau về mặt tiến hóa dựa trên trình tự cácvùngITScủachúng.Cáctrìnhtựđượcphântíchchothấymốiliênhệvớicácchủng phân lập có liên quan đếnD bryoniaevà phù hợp với đặc điểm nhận dạng nucleotide đượckhaitháctừcơsởdữliệuGenBank.KỹthuậtphảnứngchuỗitrùnghợpPCRthông thường đã tạo ra các đoạn phân tử khuếch đại có kích thước khoảng 120; 780 và 560bp tươngứngvớicácđoạncặpprimerDB-F3/DB-R3,GSBF1/GSBR1vàITS1/ITS4(Bảng 1.4) (Basim,2016) [43].
Bảng 1.4Primer và điều kiện phản ứng PCR để xác địnhDidymella bryoniae
Primers Chuỗi trình tự nucleotid Điều kiện thực hiện phản ứng PCR điện di Điều kiện thực hiện phản ứng PCR – real time
Các đối tượng sinh vật gây hại trên cây trồng thuộc họ Bầu bí gồm sâu hại,bệnh hại gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng Trong đó, bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmDidymella bryoniae(Auersw.) Rehm gây ra là bệnh gâyhạichính trên nhóm cây họ Bầu bí nói chung và cây dưa hấu nói riêng (Somai và cs, 2002; Newark, 2014) [158, 132] Bệnh nứt thân chảy nhựa được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới nhưng bệnhgâyhạinặngnhấtởnhữngvùngđịalýcókhíhậunóngvàẩm(SitterlyvàKeinath, 1995, Choi và cs, 2010) [97, 59] Bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra có nguồn bệnh tồn tại từ đất, không khí hoặc lây lan từ nguồn hạt giống Tuy nhiên nhữngbộphậncủacâybịnhiễmvàchếttừvụtrướclàmộttrongnhữngnguồnlâybệnh quantrọngnhất.Nguồnbệnhtừkhôngkhícũngđượcghinhậnnhưlànguồnxâmnhiễm chínhtrêndưahấu(NguyễnThịThuNga,2009)[15].Nguồnbệnhsơcấptrênruộng dưamớitrồngcóthểtừhạtgiống,trongđấthaytừkhôngkhídogiómangbàotửtừnơi khác đến. NấmD bryoniaecó thể tồn tại trong hạt Bào tử trên bề mặt hạt có thể sống sót21thángvàsựtồntạicủasợinấmtronghạtđượcghinhận41,7%sau24tháng(Chen và cs, 2021) [58]. Hầu hết cây con được ghi nhận do nấmD bryoniaetrong nhà lưới trướckhiđemrangoàiđồng.Việcsửdụngnhữnghạtgiốngbịnhiễmbệnhđểgieotrồng làm gia tăng sự nghiêm trọng của bệnh trên đồng ruộng Trong đất,D bryoniaecó thể hình thành bào tử áo để lưu tồn ít nhất trong hai năm (Keinath, 2002) [158] NấmD.bryoniaecó thể tồn lưu trong hạt giống hay trên xác bả thực vật nằm trong đất trên hai năm ở dạng vô tính (pycnidia) hay hữu tính (pseudothecia), sợi nấm hoặc các bào tử váchdày.NguồnbệnhnấmD.bryoniaec óthểbắtnguồntừđất,hạtgiống,khôngkhí,… Trong các con đường lan truyền thì lan truyền qua đất là nghiêm trọng nhất Ngoài ra mầm bệnh có thể bắt nguồn do mưa và nước tưới từ lá, thân cây bệnh xâm nhiễm lên các lá cây khỏe Bệnh gây hại nặng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất trái (Guner và Wehner, 2003; Santos, 2009) [83, 154] Bệnh còn một số tên gọi phổ biến khác như bệnh chạy dây, bệnh bã trầu, bệnh xì mủ thân, bệnh bạclá…
Trongcácchỉsốvềkhíhậu,nhiệtđộvàẩmđộlàhaiyếutốchủđạoxácđịnhtính chất biến động di truyền của nấm gây bệnh, ảnh hưởng đến diễn biến phát sinh gây hại của bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa Ngoài đồng ruộng, nhiệt độ tối ưu cho khả năng bệnh phát sinh gây hại nặng trên cây dưa hấu là là 24 o C Trong điều kiện phòng thí nghiệm, sự xâm nhiễm mạnh của nấmD bryoniaevà gây thối quả khi nhiệt độ dao động khoảng 27,2 - 23,8 o C và diễn biến bệnh giảm ở 29,4 o C Ngoài ra, ẩm độ cũng đóng vai trò quan trọng gây ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của nấmD bryoniaevà phát triển của mầm bệnh, ẩm độ tuyệt đối cao và đất ẩm ướt là điều kiện thuận lợi cho sự xâmnhiễm.
CâydưahấucóthểbịnấmD.bryoniaex â mnhiễmởbấtkỳgiaiđoạnsinhtrưởng nào của cây, từ cây con đếncâytrưởng thành, ra hoa, đậu quả (Newark, 2014) [132] Triệu chứng nhiễm bệnh có thể quan sát thấy trên các bộ phận của cây dưa hấu như lá, thân, rễ và trái (Neergaard, 2010) [65, 134] Bào tử nấmD bryoniaecó thể xâm nhập vào cây ký chủ gián tiếp qua vết thương cơ học hay côn trùng chích hút hoặc trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp xâm nhiễm qua lớp cutin trên bề mặt lá hay khí khổng(Neergaard,1989;2010)[65;134].Thôngthườngvịtrínấmxâmnhiễmxảyraởtếbào biểu bì hoặc giữa những tế bào bảo vệ của khí khổng này với khí khổng kia Sau khi xâm nhiễm thành công, sợi nấm tăng trưởng trong những khoảng trống gian bào, kết quả là tế bào bị phá hủy (Nguyễn Thị Thu Nga, 2009) [19] NấmD bryoniaetạo ra nhiều loại enzyme thủy phân nhưpolygalacturonase(PG),pectin methylesterasevàcellulase, trong đópolygalacturonaselà enzyme quan trọng nhất dẫn đến sự phá vỡ tế bào Chiu vàWalker (1949) [60] cũng quan sát thấy trường hợp nấmD bryoniaexâm nhiễmtrựctiếplênlớpbiểubìlácâydưahấu,sựxâmnhiễmquakhíkhổngkhôngquan sátđược.
Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh hại được người nông dân áp dụng chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên, với việc sử dụng thuốc không đúng liều lượng, không đảm bảo thời gian cách ly dẫn đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên quả vượt mứcchophép.Nhằmquảnlýbệnhhạicóhiệuquả,antoànchomôitrườngvàđảmbảo chấtlượngsảnphẩm,cầnxâydựngvàthựchiệnmộthệthốngquảnlýsinhvậthạitổng hợp với nhiều biện pháp như canh tác, giống, sinh học và hóa học Trong đó, việc sử dụng vi sinh vật như một tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại đang là xu hướng tích cực trong quản lý nông nghiệp hiệnđại.
Chiu và Walker (1949) [60] đã thực hiện các nghiên cứu đầu tiên về bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây họ Bầu bí thông qua các quan sát đặc điểm hình thái của của bào tử và độc tính gây bệnh của nấmD bryoniae Các nghiên cứu khác tiếp tục được thực hiện dựa vào sự đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp kỹ thuật hiện đại như RAPD (Random-amplified polymorphic DNA), AFLP của đoạn ITS rDNA hay giải trình tự đoạn ITS rDNA (Somai và cs, 2002;Babu, 2015; Basim, 2016) [158, 42, 43] Nghiên cứu về độc tính của nấm cho thấy cácenzym phân hủy thành tế bào nhưpolygalacturonase(PG),pectate lyase(PL), pectin lyase (PNL),β-galactosidase(β- Gal) vàcellulase(Cx) liên quan đến khả năng gây bệnh của nấmD bryoniae(Zhang và cs, 2010)[48].
Nghiên cứu của Basim và cs (2016) [43] ghi nhận khả năng gây bệnh của nấm
D.bryoniaet r ê ncâydưahấu(Citrulluslanatus(Thumb.)),dưalưới(CucumismeloL.), dưa chuột
(Cucumis sativusL.) và bí ngô (Cucurbitaspp.) Cây dưa hấu mẫn cảm đối với bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaehơn so với các loài cây trồng khác tronghọBầubí(Santos,2009)[154].Cáctriệuchứngbiểuhiệnbệnhxuấthiệnsớmhơn vàtỷlệmôthựcvậtbịtổnthươngtrêncâydưahấucaohơnsovớicácloàicâykhácnhư dưa gang, dưa chuột haybí.
BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ TÁC NHÂNGÂYBỆNH
1.4.1.1 Cơ chế kiểm soát bệnh tác nhân gây bệnh cây trồng của vikhuẩn
Trong tự nhiên các loài vi sinh vật có ích luôn tồn tại, phần lớn đều có lợi cho con người, cây trồng và nguồn tài nguyên thiên nhiên Nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vậtcóíchnóichungvàvikhuẩnnóiriênglàbiệnphápkiểmsoátsinhhọctácnhângây bệnh hại cây trồng, đây chính là chìa khóa khởi tạo nền nông nghiệp bền vững (Azcón- AguilarvàBarea,1997)[41].Hiệnnaynhómvisinhvậtsửdụngnhiềuđểkiểmsoátvà hạnchếdiễnbiếnbệnhgâyhạicâytrồnglàcácchủngvisinhvậtvùngrễkíchthíchsinh trưởng thực vật (PGPR – Plant Growth Promoting Rhizobacteria) PGPR là những vi sinh vật cư trú tại vùng rễ của cây trồng, dễ dàng hình thành khuẩn lạc, có hệ số nhân lớnvàảnhhưởngtrựctiếphoặcgiántiếpđếntácnhângâybệnhhạiởthựcvật.Vikhuẩn có thể có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng hoặc trung tính, vi khuẩn vùng rễ có những khác biệt ưu thế hơn so với vi khuẩn trong đất (Lynch, 1990; Lê Như Cương và cs, 2019; Nguyễn Xuân Vũ, 2021) [124, 8, 32] Trong các nhóm tác nhân sinh học được sử dụng để phòng chống bệnh hại cây trồng, nấm và vi khuẩn là nhóm vi sinh vật đang được nghiên cứu ứng dụng phổ biến trên Thế giới cũng như tại ViệtNam.Tuynhiêncácnghiêncứuứngdụngsửdụngtácnhânsinhhọccụthểvàtrên diện rộng trong việc phòng chống bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu vẫn còn hạnchế.
Trong các vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm ưu thế với khoảng 95% về số lượng. Một gram đất có thể chứa 10 8 – 10 9 tế bào vi khuẩn và số lượng vi khuẩn có thể phân lập và nuôi cấy được chiếm khoảng 1% số vi khuẩn hiện diện trong đất (Glick, 2012) [84].Cácloàivikhuẩncókhảnăngứcchếsinhtrưởngvàpháttriểncủacácloàivisinh vật gây hại khác được gọi là vi khuẩn đối kháng Sự phân bố vi khuẩn trong đất phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng trong đất như nhiệt độ, ẩm độ, và một số các yếu tố khác như muối, acid và thảm thực vật Quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn có ích và tác nhân gây bệnh chocâytrồng phụ thuộc vào môi trường, cây ký chủ và tính đặchiệu.
Vi sinh vật có thể có thể tác động đến cây trồng thông qua cơ chế đối kháng tác nhân gây bệnh như sản sinh các chất kháng sinh (Brucker, 2008; Mazurier, 2009; Sherathia, 2016) [50, 128, 160] hoặc thông qua sự tổng hợp, khoáng hoá hoặc chuyển hoá các chất dinh dưỡng xảy ra trong quá trình chuyển hoá vật chất của vi sinh vật như quá trình cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp auxin, gibberellin, etylen (Costa, 2018;Gomes,2018)[61,82].Bằngcáchtậndụngcácchấtdinhdưỡngđượcgiảiphóng liên tục từ rễ hoặc lá của cây trồng đang sinh trưởng và phát triển, các chủng vi khuẩn có ích sẽ xâm nhập bề mặt lá, hệ thống rễ và lớp đất xung quanh cây trồng một cách hiệuquả.
Vi khuẩn tác động có lợi đến cây trồng bằng cách bảo vệ cây tránh bị mầm mống gây bệnh thực vật tấn công cây trồng thông qua ba cơ chế chính: [1] Cạnh tranh chất dinh dưỡng; [2] Sản sinh các độc chất thực vật (allelochemical); [3] Kích thích tính kháng hệ thống kháng ở cây trồng (ISR – Induced Systemic Resistance) (Cawoy và cs, 2011) [54].
[1] Cơ chế cạnh tranh không gian sống và chất dinhdưỡng
Sựcạnhtranhvềkhônggiansống,cácnguồntàinguyênnhưchấtdinhdưỡngvà oxy, sinh kháng sinh hay tạo protein thường xảy ra giữa các sinh vật sống trong đất. Đâylàquátrìnhdiễnraliêntụcgiữacácnhómvisinhvậttrongđấtđểđạttrạngtháicân bằng.Vớimụcđíchkiểmsoátsinhhọc,vikhuẩncóíchcạnhtranhtrựctiếpvớitácnhân gâybệnhđểchiếmcácnguồndinhdưỡng.Vớilượngchấtnềntươngđốithấptrongvùng rễ, hiệu quả hấp thu và chuyển hóa chất dinh dưỡng của vi khuẩn là yếu tố then chốt trongkhảnăngcạnhtranh.Sựcạnhtranhvềcácnguyêntốvilượngnhưsắt,đồng,kẽm, mangan … cũng xảy ra trong đất Sắt là yếu tố tăng trưởng thiết yếu cho mọi sinh vật sống và sự khan hiếm dạng đặc hiệu sinh học ở môi trường sống trong đất dẫn đến sự cạnh tranh gay gắt (Loper và Henkels, 1997) [120] Siderophore là một loại proteine sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe +3 trong môi trường với áp lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật kháckhôngcóđủionFe +3 choquátrìnhsinhtrưởngcủacây,dođóchúngsẽkhôngsinh trưởngđược(LopervàHenkels,1997;HaasvàDéfago,2005;ĐặngThịNgọcThanhvà cs, 2016; Louden và cs, 2011) [120, 88, 24,122].
[2] Cơ chế ức chế trực tiếp tác nhân gây bệnh hại câytrồng
Cơ chế kháng sinh: Vi sinh vật có thể tiết ra một số hoạt chất kháng sinh (antibiosis)cótácdụngkìmhãmsựpháttriểncủasinhvậtkhác,ứcchếmầmbệnhđược sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển Trong số rất nhiều phân tử có hoạt tính sinh học đượcBacillustổng hợp, cáchoạt chất kháng sinh như kanosamine, zwittermicine hay aminoglycoside hoặc các phân tử hợp chất peptide có khả năng kháng nấm hay diệt khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh hại thực vật Đối kháng (hay kháng sinh) là cơ chế được biết đến nhiều nhất và quan trọng nhất được sử dụng để hạn chế sự xâm nhập của mầm bệnh vào mô câychủ.
Các loàiBacillusnhưB.amyloliquefaciens,B.subtilis,B.cereus,B.licheniformis,
B.megaterium,B.mycoidesvàB.pumilusđượcbiếtđếnlànhữngvikhuẩnsản xuất cácphântửkháng sinh.Bacillus subtiliscó4 – 5%bộ gen dùngđểtổnghợpkháng sinhvàcókhảnăngtạorahơn20hợpchấtkhángkhuẩnvớicấutrúcđadạng(Stein,2005)[164].Các hợpchất peptideđại diện cho nhómkhángsinhBacilluschiếmưuthế, thể được cấu tạohoàntoàntừcác acid aminvà cónhiềukích thước khácnhau Các loài vi khuẩnBacillusspp.Cóthểsảnxuấtranhiềuchuỗipolipepideđểhìnhthànhnênnhiềuhoạtchấtkhá ngsinhnhư oligopeptide, rhizocticin phosphono-oligopeptide, lipopeptidetuầnhoàn(cLP).CácloạikhángsinhpeptidechínhcủaBacilluscóthểkhácnhauvềloạivàtrìnhtựcủacácgốc acidamin,bảnchấtcủachutrìnhpeptide,độdàivàsựphânnhánhcủachuỗiaxitbéo
(OngenavàJacques,2008)[136].Cácoligopeptidetuầnhoànhoặctuyếntính,đượccấu tạotừcácchuỗipeptidecơbảnvàxuấthiệnhoạtchấtkhángsinhaminoglycoside(Stein, 2005) [164].CáclipopeptidecLPBacillusthểhiệncáchoạtđộngkhángsinhcụthểnên có thể tham gia một cách khác nhau vào sự đối kháng của các mầm bệnh thực vật khác nhau Ngoài ra, các loài vi khuẩnBacilluscòn có thể tạo ra các chuỗi heptapeptide có khảnăngliênkếtvớiacidbéotựdođểhìnhthànhcáchoạtchấtkhángsinhnhưsurfactin, iturin vàfengycin.
Cơ chế ức chế khác: Khác với cơ chế kháng sinh với khả năng sản sinh các hoạt chất có trọng lượng phân tử thấp và không cần tiếp xúc vật lý, cơ chế ký sinh cũng là một cơ chế quan trọng được sử dụng bởi một số vi sinh vật có khả năng phá hủy thành tếbàomầmbệnhbằngcácenzymephânhủy.Vikhuẩncókhảnăngkýsinhvàsảnxuất các enzyme phânhủythành tế bào và gắn lên bào tử hoặc sợi nấm của mầm bệnh (Whipps, 2001). Một số tương tác khác xảy ra giữa tác nhân gây bệnh và vi khuẩn có ích đã dẫn đến khả năng kiểm soát sinh học như sự hình thành màng sinh học, bất hoạt yếu tố nảy mầm của mầm bệnh và suy thoái các độc tố gâybệnh.
Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB) là vi khuẩn sống xung quanh vùng rễ của cây trồng, khi tương tác với rễ cây có thể kích thích cơ chế kháng bệnh tự nhiên của cây trồng, chống lại vi khuẩn hay nấm gây bệnh Hiện tượng này được gọi là tính kháng hệ thống (ISR) (Ryu và cs, 2004) [152] Các vi khuẩn có khả năng sản sinh chấtgâycảmứngISRbaogồmcácvikhuẩngramâmnhưPseudomonasspp.vàSerratiaspp.hayvikhuẩn gramdươnglàBacillusspp.(Bent,2006;Kloeppervàcs,2004,2006) [45, 99,68].
Tínhkhánghệthốngcâytrồng(ISR)làmộtquátrìnhgồmi)tếbàothựcvậtnhận biết các chất kích thích được tạo ra bởi các tác nhân cảm ứng, ii) sự truyền tín hiệu cần thiếtđểtruyềntrạngtháicảmứngtrongcâyvàiii)cơchếbảovệđượckíchhoạthạnchế hoặc ức chế sự xâm nhập của mầm bệnh vào mô thực vật (Van Loon, 2007) [44] Việc phân lập một số chủng PGPR có hiệu quả trong kiểm soát sinh học hoạt động của tác nhân gây bệnh đã làm sáng tỏ sự đa dạng trong phương thức hoạt động của vi khuẩn có ích thông qua cơ chế kích hoạt hệ thống bảo vệ ở cây trồng Do tính hệ thống củacâytrồng, khả năng phòng thủ được nâng cao được thể hiện ở rễ cũng như ở lá Sự kích thíchhệthốngmiễndịchthựcvậtnàyđạidiệnchomộttrongnhữngkhíacạnhmớiđược pháthiệnvềtươngtácgiữathựcvậtvàvikhuẩn(BakkervàVanLoon,2007)[44].Một số chủng vi khuẩn có thể làm giảm sự xâm nhiễm bệnh thông qua kích hoạt nhanh các phản ứng phòng vệ của cây khi mầm bệnh tấn công, tăng cường sức đề kháng của cây trồng (Conrath và cs,2006) [63] Các phân tử bảo vệ như phytoalexin hay protein (chitinase,β- 1, 3- glucanase, chấtức chế proteinase…) và li gn in c ó tác dụ ngc ủn gc ố thànhtếbào(VanLoon,2007)[44].Thànhtếbàodàylên,phântửbảovệdínhvàothành tế bào hoặc các mô lân cận tế bào thực vật bị tổn thương là những rào cản ngăn chặn mầm bệnh lấy chất dinh dưỡng và làm chậm sự xâm nhập của nấm (Lugtenberg và cs, 2002)[107].
VikhuẩnBacilluslàloàivisinhvậtcóíchtiềmnăngchohoạtđộngsảnxuấtchế phẩm sinh học vì khả năng vi khuẩn tồn tại lâu dài trong chếphẩm.
TrênThếgiới,cácnghiêncứukinhđiểnđãmởđầuchoxuhướngsửdụngcácvi khuẩnBacillustrong việc kiểm soát bệnh gây hại cây trồng phải kể đến các nghiên cứu củaBakervàcộngsự(1983)sửdụngchủngvikhuẩnB.subtilischủngAPPL-1đểchứng minh khả năng kiểm soát bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương do nấmUromycesappendiculatusgây ra hay Centurion (1991) dùngB subtilisW401 làm giảm 80-100% sựxuấthiệnbệnh(Ongena,2014)[137].Bettiol(2011([54]đãdùngdịchchiếtvikhuẩn
B subtilisthu được từ kết tủa sau phản ứng với amoni sunphat ở pH 2.0 đã ức chế hoạt độngcủanấmUromycesappendiculatus.VikhuẩnB.ehimensis(Hostervàcs,2005) [92]tạoracácenzymephânhủychitin,B.subtilisAF1thểhiệnmộtsốđộctínhđốivới nấmbệnhthôngquaviệctiếthoạtchấtN-acetylglucosaminidasevàglucanase(Manjula & Podile, 2005) [127] Ngoài ra, vi khuẩnB subtiliscũng có thể hạn chế bệnh thánthư trên cây đậu tương và cây bông (Bakker, 2007; Bettiol, 2011) [44,54].
Hoạt động đối kháng củaBacillusspp liên quan đến nhiều cơ chế như kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống và kích kháng, trong đó kháng sinh là cơ chế phổ biến Các vi khuẩn vùng rễ thuộc chi vi khuẩnBacillusgồm nhiều loàin h ư
B subtilis,B cereus,B amyloliquefaciens,B pumlus,B maycoides,B. pastueri,B.sphaericus… có thể sản sinh nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau và có ức chế nhiều mầm bệnh gây hại thực vật (Gnanamanickam, 2009; Narayanasamy, 2013) [81,131].NghiêncứucủaManjulavàcs(2004) [126]chothấysửdụngtếbàovikhuẩn
B.subtilischủngAF1cóhiệuquảhạnchếbệnhthốitráiởcâycamvàbệnhgỉsắtởcâylạc Chế phẩm từ vi khuẩnBacillusđể trừ nấm bệnh hại cây trồng như nấmR. solani,Fusariumspp.,Pyricularia oryzae(Kumar và cs, 2011; Jangir và cs, 2018)
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂMNGHIÊNCỨU
Nghiên cứu được tiến hành tại Phú Yên trong thời gian từ năm 2019 – 2023 Cụ thể, các nghiên cứu thu thập số liệu thứ cấp và thu thập mẫu bệnh nứt thân chảy nhựa được thực hiện tại các xã có diện tích trồng dưa hấu lớn tại Phú Yên và đại diện cho ba vùng sinh thái khác nhau (Hình 2.1).
- Vùng đồng bằng (đất phù sa bồi ven sông): Xã Hoà Thành, Thị xã Đông Hoà và Xã Hoà An, huyện Phú Hoà nằm dọc hai bên bờ sôngBa.
- Vùng bán sơn địa thuộc huyện đồng bằng (đất cát pha, thịt nhẹ): Xã Hoà Hội, huyện PhúHoà.
Hình 2.1Các địa điểm thu mẫu bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu tại Phú Yên
(1) Xã Hoà Thành, Thị xã Đông Hoà; (2) Xã Hoà An, huyện Phú Hoà; (3) Xã
Hòa Hội, huyện Phú Hòa; (4) Xã EaTrol, huyện Sông Hinh
Mẫu nấm bệnh được phân lập, quan sát đặc điểm hình thái, điện di và PCR tại Phòng phân tích và giám định bệnh cây trồng - Chi cục Trồng trọt và BVTV Phú Yên.
Trình tự gen của các mẫu nấm bệnh được giải trình tự tại Công ty Apical
Các nghiên cứu về khả năng gây bệnh và gây hại của các mẫu nấm bệnh phân lập; khả năng kiểm soát và hạn chế bệnh của vi khuẩnBacillusđối với nấm bệnhD.bryoniaegây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu được tiến hành tạiPhòng phân tích và giám định bệnh cây trồng - Chi cục Trồng trọt và BVTV Phú Yên.
ĐỐI TƯỢNGNGHIÊNCỨU
Các mẫu mô thực vật có dấu hiệu bị nhiễm bệnh nứt thân chảy nhựa biểu hiện trênthâncủacâydưahấungoàiđồngruộngđượcthuthậpvàtiếnhànhphânlậptạiChi cục Trồng trọt và BVTV PhúYên.
CácchủngvikhuẩnBacillusspp.đãđượcthuthậpvàphânlậptừmộtsốkhuvực miền Trung Việt Nam, bao gồmBacillusspp S1A1, S1F3, S13E2, S13E3, S18F11 và S20D12, đặc điểm chủng vi khuẩn là kích thích sinh trưởng cây trồng (Bảng 2.1) Các chủng vi khuẩn đã được định danh bằng trình tự đoạn 16S-rDNA và đăng ký gene trên NCBI (Le, 2011)[89].
Bảng 2.1Địa điểm thu thập các chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu
Vi khuẩn Bacillus spp Vùng sinh thái Địa điểm thu
Bacillusspp S1A1 Đất ven sông Duy Xuyên, Quảng Nam
Bacillusspp S1F3 Đất ven sông Duy Xuyên, Quảng Nam
Bacillusspp S13E2 Đất ven biển Quảng Điền, Thừa Thiên Huế
Bacillusspp S13E3 Đất ven biển Quảng Điền, Thừa Thiên Huế
Bacillusspp S18F11 Đất ven biển Phong Điền, Thừa Thiên Huế
Bacillusspp S20D12 Đất ven biển Thăng Bình, Thừa Thiên Huế
Môi trường PGA có thành phần gồm 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar và nướcđủthểtích1.000ml.MôitrườngPGAđượcchuẩnbịnhưsau:Cân200gkhoaitây đã được rửa sạch, gọt vỏ và cắt nhỏ thành từng lát mỏng cho vào cốc thủy tinh có sẵn500mlnướccấtvôtrùng.Đunhỗnhợptrênđểthulấydịchkhoaitây,thêmnướccấtvừa đủ 1.000ml.Cho vào nồi hấp áp suất và hấp khử trùng ở điều kiện 1ATM, nhiệt độ 121 o C trong vòng 15 phút Để nguội sau đó đổ vào đĩa petri đã hấp khửtrùng.
Môi trường King’s B có thành phần gồm 15g agar, 20g proteose peptone số
3,10ml glycerol, 1,5g MgSO 4 và nước cất vừa đủ 1.000ml Môi trường King’s B được chuẩn bị như sau: Khuấyđều tất cả các thành phần như trên và nước, ngoại trừ MgSO4, điều chỉnh pH = 7,2.
Từ từ thêm MgSO4vào hỗn hợp trên và lắc đều cho đến khi đủ1.000ml và sau đó hấp khử trùng Đổ 20 ml môi trường King’s B vào đĩa petri đường kính 90mm để thực hiện các thao tác nuôi cấy vi khuẩn tiếptheo.
CácchủngvikhuẩnBacillussửdụngtrongnghiêncứunàyđượcphânlậptừcác chủngBacillusđã có sẵn tại phòng nghiên cứu, lưu giữ ở nhiệt độ - 20 o C và nhân nuôi trên môi trường King’s B.
NhânnuôivikhuẩntrongmôitrườngKing’sB:Lầnlượtphânlậpmộtkhuẩnlạc đơn đối với mỗi chủng từ đĩa petri có chứa vi khuẩnBacillusspp và hòa vào nước cất vôtrùngđượcchứatrongeppendorfđểthuđượcdungdịchbàotửrồilắcđềubằngmáy lắcVortex(MX-S,Biologix)vớitốcđộ1000vũng/phỳt,01phỳt.Hỳt50àmdungdịch bào tử vào đĩa petri chứa môi trường King’s B đã chuẩn bị, trang đều, ủ ấm 28 o C trong vòng 48giờ.
Thuvikhuẩn:Thêm10mlnướccấtvôtrùngvàođĩapetricódịchbàotửvikhuẩn sau 48 giờ ủ ấm, dùng trang thủy tinh vô trùng hòa đều vi khuẩn trong dung dịch, lắc đềuvàthuđượcdungdịchbàotửvikhuẩnởnồngđộ10 10 CFU/mL.Thêmnướcđểđưa dung dịch về nồng độ 10 6 CFU/mL.
NỘI DUNGNGHIÊNCỨU
Nội dung 1: Đánh giá tình hình sản xuất dưa hấu tại Phú Yên, mức độ gây bệnh và diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu tại Phú Yên;
Nội dung 2: Thu thập, phân lập, định danh tác nhân gây bệnh bằng phươngpháp sinh học phân tử và đánh giá các đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền và độc tính của nấmD.bryoniae;
Nội dung 3: Tuyển chọn một số chủng vi khuẩnBacillusspp có khả năng kiểm soát sự phát triển của nấm bệnh và khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và đồng ruộng;
Nội dung 4: Xác định chủng vi khuẩn có íchBacillusspp có khả năng kích thích sinh trưởng, phát triển cây dưa hấu trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và đồng ruộng.
PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU
2.4.1 Điều tra, đánh giá tình hình sảnxuấtvàsâu bệnhgâyhạitrêndưa hấu tạiPhú Yên
2.4.1.1 Điều tra tình hình sản xuất cây dưa hấu tại PhúYên.
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thực hiện điều tra tại các huyện trồng dưa hấu trọng điểm tại Phú Yên đại diện cho ba vùng sinh thái, gồm: Vùng đồng bằng (Xã Hoà Thành, thị xã Đông Hoà và xã HoàAn,huyệnPhúHoà);Vùngbánsơnđịathuộchuyệnđồngbằng(XãHòaHội,huyện Phú Hòa); Vùng bán sơn địa thuộc huyện miền núi (Xã EaTrol, huyện SôngHinh).
Số liệu sơ cấp và điều tra được thu thập từ tháng 12/2018 đến tháng3/2019.
- Thu thập số liệu sơ cấp về thực trạng sản xuất dưa hấu thông qua phỏng vấn nông hộ sản xuất, cán bộ kỹ thuật hợp tác xã tại vùng điều tra, chuyên viên công tác tại các cơ quan chuyên môn như phòng Nông nghiệp và PTNT, phòng Tài nguyên – Môi trườngvàcụcThốngkêtỉnhPhúYêntheoPhiếuđiềutrakếthợpđiềutrađánhgiáruộng trồngdưa.
- LậpmẫuPhiếuđiềutratheophươngphápphỏngvấnnhanhcósựthamgiacủa người dân (Participatory Rural Appraisal - PRA) bằng bảng câu hỏi với các nhóm chỉ tiêuđượctrìnhbàytạimẫuPhiếuđiềutra(Phụlục).Sốphiếuđiềutra:30phiếu/xã.Tổng số phiếu điều tra là 90phiếu.
- Điều tra vềquymô sản xuất, giống dưa hấu phổ biến, năng suất, thời vụ, địa hình, tập quán sản xuất, giai đoạn sinh trường hoặc tuổi/cấp tuổi của cây dưahấu.
- Cácđiềukiệnnàybaogồmvùngsinhthái,thờivụ,giống,giaiđoạnsinhtrưởng phát triển của cây, các bộ phận bị hại củacây
2.4.1.2 Điều tra tình hình sâu, bệnh gây hại trên cây dưahấu
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thực hiện điều tra tại các xã Hoà Thành, thị xã Đông Hoà; xã Hoà An, huyện PhúHoà;xãHòaHội,huyệnPhúHòa;xãEaTrol,huyệnSôngHinhvàovụĐôngXuân 2018 –
2019 (tháng 12/2018 – 3/2019), Xuân Hè 2019 (tháng 3 – 6/2019) và Hè Thu 2019 (tháng
Phương pháp tiến hành Điều tra thành phần và mức độ phổ biến của dịch hại nông nghiệp (sâu hại và bệnhhại)trêncâydưahấutạibavùngsinhtháilựachọnkhảosáttạitỉnhPhúYêntheo phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng (Viện Bảo vệ thực vật, 1997) [8,31]
- Khu vực điều tra: Tại mỗi vùng sinh thái chọn khu vực gieo trồng có diệnt í c h
≥2ha.Chọnngẫunhiên03ruộngdưacódiệntích≥1000m 2 Tạimỗiruộngđiềutra10 điểm ngẫu nhiên nằm trên đường chéo góc, các điểm không cố định và cách bờ ít nhất 2 mét Số mẫu điều tra tại mỗi điểm là 10 cây dưahấu/điểm.
- Thời gian điều tra: Điều tra địnhkỳ7 ngày/lần tại ruộng điềutra.
- Điều tra thành phần và mức độ phổ biến của các đối tượng sâu bệnh hại trên cây dưa hấu dựa vào tần suất bắt gặp của sâu bệnh hại theo công thứcsau:
Tổng số lần bắt gặp
Tổng số lần điều tra
2.4.2.1 Thu thập và phân lập tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấutại PhúYên
Các mẫu thân cây dưa hấu trên đồng ruộng bị nứt thân chảy nhựa do nấm bệnh gây ra được thu thập, bảo quản đưa về Phòng phân tích và giám định bệnh cây tại Chi cục Trồng trọt và BVTV Phú Yên để tiến hành phân lập, phân tích.
Thời gian và địa điểm thu mẫu
Tiến hành thu mẫu thân bị bệnh ở 20 điểm thuộc các xã Hoà Thành, thị xãĐông Hoà; xã Hoà An, huyện Phú Hoà; xã Hòa Hội, huyện Phú Hòa; xã EaTrol, huyện Sông Hinh đại diện cho ba vùng sinh thái Mỗi xã tiến hành thu tại 5điểm.
- Thu mẫu: Tại các ruộng dưa đã chọn, quan sát những cây dưa hấu có lá xuất hiệnnhiềuvếtđốmđentừmépngoàilanvềphíagânlá,nhiềuvếtnứtnhỏxuấthiệntrên thân,tạivịtrívếtnứtcóchảydịchnhựavàng,nhấtlàphầngốcsátvớimặtđấtxuấthiện triệuchứngchảygiọtdịchngaytạivịtrívếtnứt,tạiđâyxuấthiệnnhiềuđốmđenrấtdễ thu thập được bào tử nấm gây bệnh Mẫu thân cây bị bệnh cần lấy ở vị trí bao gồm cả mô khỏe và mô bệnh Các mẫu bệnh thu thập được lưu trữ trong túi giấy và dán nhãn vớiđầyđủcácthôngtinvềthờigian,địađiểmthuthập,loạigiốngvàthờiđiểmsaugieo của cây dưa hấu bị nhiễm bệnh Đặt túi giấy chứa mẫu bệnh vào thùng nhựa cẩn thận, tránh va đập và hơi nước ngưng tụ và đưa về Phòng thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và BVTV Phú Yên để phân lập nấm gây bệnh theo phương pháp củaRogervàDean (2005)[150].
- Xử lý mẫu: Các mẫu bệnh được rửa nhẹ dưới vòi nước để bớt bụi bẩn, để khô và cắt gọn gàng thành các đoạn thân khoảng 5cm hoặc mảnh lá khoảng 5 x 5cm Đặt mẫu bệnh đã xử lý lên đĩa petri có lót giấy thấm đã được hấp khử trùng và bảo quản trongtủđịnhônởnhiệtđộ28 o C,chiếusáng12/12giờ.Mẫubệnhsẽđượcdùngđểphân lập tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưahấu.
- Phân lập nấm gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu: Mẫu mô thực vật có vết bệnh sau khi thu được ngoài đồng sau khi được xử lý và ủ ẩm trong tủ định ôn. Sau3–4ngàylưutrữ,quansátsựthayđổitrêncácmẫubệnhnhưcácvếtđốmđenxuất hiện nhiều hơn, kích thước lớn hơn Tại vị trí tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe, cắt mẫu bệnh đã rửa sạch thành mảnh có kích thước 2 × 2 cm Khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng cách ngâm trong dung dịch cồn 70% khoảng 1 – 3 phút, rồi rửa bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần Đặt mẫu bệnh lên giấy lọc vô trùng để làm khô mẫu, hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật lẫn tạp Cắt mẫu bệnh thành các mảnh nhỏ khoảng 0,5 ×0,5cm và đặt vào đĩa petri có đường kính 9cm chứa 20 ml môi trường WA đã được hấp khử trùng Sau khi cấy xong, đặt ngược đĩa petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy Đĩa petri có chứa mẫu bệnh được đặt trong điều kiện 25°C, chiếu sáng 12h để kích thích sự hình thành bào tửnấm.
- Sử dụng phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm sang đĩa petri có đường kính 90mm chứa 20 ml môi trường PGA có bổ sung kháng sinh rifampicin 100 mg/ml để thu được dòng thuần Những mẫu nấm hoại sinh được loại bỏ, những mẫu nấm nghi ngờlàtácnhângâybệnhtiếnhànhlàmthuầnđểgiámđịnhbằngbàotửnấmbệnh.Mẫu nấm thuần được cấy chuyền sang mụi trường ẳ PDA, nhiệt độ 24°C, chiếu sỏng 12h sáng/ngày.Sau14ngàycấychuyền,cácđĩapetrichứadòngnấmD.bryoniaeđượcquan sát để đánh giá các đặc điểm hình thái và định danh bằng sinh học phântử.
2.4.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái và định danh tác nhân gây bệnh nứt thân chảynhựa trên cây dưahấu
TảnnấmthuầnsinhtrưởngtrênđĩapetrichứanấmbệnhD.bryoniaesau14ngày cấy chuyền được được sử dụng làm vật liệu để quan sát và địnhdanh.
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thí nghiệm định danh nấm bệnh bằng hình thái được được tiến hành tại Phòng phân tích và giám định bệnh cây trồng - Chi cục Trồng trọt và BVTV Phú Yên vào tháng 04/2019.
Thí nghiệm định danh nấm bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện tại Công ty Apical Scientific Sdn Bhd (Malaysia) vào tháng 9/2019.
- Khảo sát đặc điểm hình thái nấm bệnh: Dựa vào phương pháp quan sát một số đặc điểm hình thái như hình dạng và màu sắc tản nấm phát triển trên môi trường PGA, đặc điểm cành sinh bào tử, hình dạng bào tử và so sánh với một số nghiên cứu để bước đầu ghi nhận mẫu nấm bệnh thu thập được thuộc loài nấm nào Chọn lọc các mẫu nấm bệnhbướcđầuxácđịnhthuộcloàiDidymellabryoniaebằngđịnhdanhhìnhtháiđểtiến hành định danh bằng sinh học phân tử Đánh số thứ tự các mẫu nấm bệnh được chọn lọc.
- Định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Các mẫu nấmD.bryoniaebước đầu xác định thuộc loàiD bryoniae, được thực hiện tinh sạch thành các sản phẩm PCR Các mẫu bấm bệnh có kết quả PCR tốt, rõ nét trên bảng điện di vàkích thước trong khoảng 500 – 600bp được chọn lọc và thực hiện định danh bằngkỹthuật sinh học phân tử Phương pháp thực hiện cụ thể nhưsau:
KẾT QUẢ VÀTHẢOLUẬN
TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CÁC ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN CÂY DƯA HẤU TẠIPHÚYÊN
Thời gian sinh trưởng của các giống dưa hấu kéo dài khoảng 60 - 65 ngày và có thể gieo trồng nhiều vụ trong năm Thực hiện điều tra và phỏng vấn các hộ sản xuất, thời vụ trồng dưa hấu tại Phú Yên được phân thành ba vụ chính gồm Xuân Hè, Hè Thu vàĐôngXuân.VụXuânHèbắtđầugieotrồngtừtháng3–4và thu hoạchtháng5–6 Vụ Hè Thu bắt đầu gieo trồng từ tháng 6 – 7 và thu hoạch tháng 8 – 9 Vụ Đông Xuân bắt đầu gieo trồng vào tháng 12 – tháng 01 năm sau và thu hoạch tháng 2 – 3, đặc biệt ởkhuvựcmiềnnúi,ngườinôngdânsaukhithuhoạchsắnvàotháng1–2sẽtrồngdưa hấu vào tháng 2 – 4 (Bảng3.1).
Bảng 3.1Thời vụ gieo trồng dưa hấu chính tại Phú Yên năm 2018 - 2019
Thị trường tiêu thụ Thời gian trồng Thời gian thu hoạch Đông Xuân Tháng 12/2018 –
Xuân Hè Tháng 3 – 4/2019 Tháng 5 – 6/2019 Xuất khẩu
Tại Phú Yên, dưa hấu được gieo trồng ở hầu hết các địa phương trên địa bàn toàntỉnh,phầnlớntậptrunggieotrồngtạicáchuyệnmiềnnúinhưSôngHinh,SơnHòa, Tây Hòa và PhúHòa Đây cũng chính là khu vực sản xuất dưa hấu chuyên dành chothị trường xuất khẩu của tỉnh Vụ ĐôngXuân là thời vụ trồng dưa hấu chính, chiếm phần lớn diện tích sản xuất của cả năm (Bảng3.2).
Bảng 3.2Diện tích sản xuất dưa hấu (ha) tại các địa phương ở Phú Yên giai đoạn năm 2014 - 2021
Diện tích sản xuất dưa hấu (ha)
Vụ Đông Xuân Cả năm
Bảng 3.3Thời vụ gieo trồng chính và cơ cấu giống dưa hấu tại ba vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 - 2019
Tỷ lệ số hộ tái sản xuất (%)
Vùng bán sơn địa huyện đồng bằng
Vùng bán sơn địa huyện miền núi
Giống khác 10,00 - - Ở vùng đồng bằng, 100% số hộ nông dân đều trồng dưa hấu vào vụ Đông Xuân, tỷ lệ số hộ nông dân tái sản xuất vào vụ Xuân Hè và Hè Thu lần lượt là 40 và 6,67%.Ở vùng bán sơn địa huyện đồng bằng và vùng bán sơn địa huyện miền núi, 100% số hộ nôngdângieotrồngdưahấuvàovụĐôngXuân,tỷlệsốhộnôngdântáisảnxuấtvàvụ Xuân Hè chiếm tỷlệ thấp lần lượt là 13,33 và 10,00 % và không có hộ nông dân tái sản xuất vào vụ Hè Thu (Bảng 3.3) Những năm thời tiết nắng nóng hoặc dưa hấu mất giá, nôngdânchỉtrồngdưahấuvụĐôngXuân,vàchuyểnsangcanhtáccâytrồngkháchoặc bỏ đất trống vào vụ Xuân Hè Tỷ lệ số hộ nông dân tái sản xuất dưa hấu mỗi vụ có thể thay đổi, tùy phụ thuộc vào thị trường tiêu thụ, điều kiện thời tiết hoặc giá trị sản phẩm câytrồngtạithờiđiểmđóhoặccóthểchuyểnsangcâytrồngkháccólợinhuậncaohơn.
Dưa hấu được gieo trồng trong vụ Đông Xuân với mục đích phục vụ thị trường xuất khẩu và tiêu thụ nội địa trong dịp Tết nguyên đán, vụ Xuân Hè và Hè Thu được gieo trồng rải rác, diện tích nhỏ, mục đích phục vụ thị trường nội địa Cơ cấu các giống dưahấutạiPhúYênchủyếugồmcácgiốngnhư:TrangNông386,ThiênVương,Hoàng
Châu,PhùĐổng,TrangNông522,ChiaTai.Cácgiốngdưahấuđượctrồnghiệnnayhầu hết có năng suất cao, đạt yêu cầu về phẩm chất, hình dạng quả, màu sắc thịt quả, độ ngọt Ngoài ra, nông dân còn trồng một số giống khác nhưng diện tích không đáng kể. Tuỳtheonhucầucủathịtrườngtiêuthụ,ngườinôngdânsẽlựachọncácgiốngdưahấu phù hợp với yêu cầu bảo quản, vận chuyển khác nhau Quả dưa hấu chuyên dành cho thị trường xuất khẩu yêu cầu có lớp vỏ cứng để có thể vận chuyển xa, thịt quả màu đỏ vàtươilâu.GiốngTrangNông386đượcưachuộnghơnsovớicácloạigiốngkhácnhờ đáp ứng được các tiêu chuẩn kểtrên.
Vào vụ Đông xuân, tại xã EaTrol, huyện Sông Hinh (vùng bán sơn địa huyện miền núi) và xã hòa Hội, huyện Phú Hòa (vùng bán sơn địa huyện đồng bằng) giống dưa hấu Trang Nông 386 được trồng phổ biến, 90% số hộ nông dân trồng giống Trang Nông 386 và sản phẩm cung cấp cho thị trường xuất khẩu, 10% số hộ nông dân trồng giống Thiên Vương Đặc điểm của các giống này là vỏ mỏng cứng và dai thích hợp để vận chuyển xa, thịt trái đỏ đậm, tươi lâu và dùng để cung cấp cho thị trường xuất khẩu. Tại xã Hòa Thành, thị xã Đông Hòa và xã Hòa An, huyện Phú Hòa (vùng đồng bằng), Phù Đổng và Hoàng Châu là giống dưa hấu được trồng phổ biến, tỷ lệ số hộ nông dân trồng giống dưa lần lượt là 30 và 26,67% Ngoài ra, người nông dân còn sử dụng giống Trang Nông 522 (20%), ChiaTai (13,33%) và một số giống khác (10%) Đặc điểm của các giống này là vỏ mỏng, thịt trái đỏ đậm và dùng để cung cấp cho thị trường nội địa.
Tại ba vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu, có 04 công thức luân canh cây trồng phổ biến và có thể thay đổi để phù hợp với điều kiện thực tế của vùng trồng Tùy theo tính chất của mỗi loại đất ở vùng trồng, thời vụ trồng tại địa phương và điều kiện thời tiếtmỗinămmàngườinôngdâncóthểxâydựngvàhìnhthànhcáccôngthứcluâncanh cây trồng khác nhau và phù hợp cho từng vùng sinhthái. ỞvùngđồngbằngvớitínhchấtđấtphùsabồivensôngBa,điềukiệnthổnhưỡng màu mỡ, thuận lợi nên người nông dân thường trồng luân canh dưa hấu với một số cây hoa màu, rau đậu vào cả ba vụ Xuân Hè, Hè Thu và Đông Xuân hay hai vụ Đông Xuân vàXuânHètrongnăm.Theođó,tạivùngđồngbằngngườinôngdântrồngdưahấutheo ba công thức luân canh là [1] Dưa hấu (ĐX) - Ngô/Dưa hấu (XH) - Rau đậu/Ngô( H T )
- Hoa Tết; [2] Dưa hấu (ĐX) - Ngô/Dưa hấu (XH) - Dưa hấu/Rau đậu/ Ngô (HT); [3] Dưahấu(ĐX)-Ngô/Dưahấu/Rauđậu(XH)vớitỷlệlầnlượtlà6,67,60và33,33%số hộ trồng dưa hấu ghinhận. Ở vùng bán sơn địa huyện đồng bằng (xã Hòa Hội, huyện Phú Hòa) và bán sơn địahuyệnmiềnnúi(xãEatrol,huyệnSôngHinh)vớitínhchấtđấtthịtnhẹ,100%sốhộ dân trồng dưa hấu vào vụ Đông Xuân và trồng sắn vào vụ Hè Thu theo công thức [4] Dưa hấu(ĐX) - Sắn (XH) (Bảng3.4).
Bảng 3.4Các công thức luân canh cây trồng phổ biến tại ba vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 -2019
CT Công thức luân canh
Tỷ lệ gieo trồng (% số hộ)
Vùngb ánsơnđ ịahuyệ n đồng bằng
1 Dưa hấu (ĐX) - Ngô/Dưa hấu (XH)
- Rau đậu/Ngô (HT) - Hoa Tết 6,67 - -
2 Dưa hấu (ĐX) - Ngô/Dưa hấu (XH) 0
- Dưa hấu/Rau đậu/Ngô (HT) 60,00 - -
3 Dưa hấu (ĐX) - Ngô/Dưa hấu/Rau đậu (XH) 33,33 - -
4 Dưa hấu (ĐX) - Sắn (XH) - 100,00 100,00
Ghi chú: ĐX: Đông Xuân; XH: Xuân Hè; HT: Hè Thu
Ngoài các địa điểm thực hiện khảo sát, nghiên cứu còn tiến hành điều tra mởrộng tại một số các xã khác có diện tích trồng dưa hấu rải rác, manh mún trên địa bàn tỉnh Các công thức luân canh giữa cây dưa hấu và một số loại cây trồng khác được điều tra bổ sung và ghi nhận có 14 công thức luân canh cây trồng tại các điểm trồng dưa hấu ở Phú Yên (Bảng 3.5) Cụ thể được ghi nhận nhưsau:
- Tại vùng đồng bằng, các hộ sản xuất dưa hấu luân canh cây trồng theo công thức số 1 – 9.
+Côngthứcluâncanh [1,2,3,4]:TạicácđiểmtrồngdưahấuthuộcthịxãĐông Hòa có thổ nhưỡng đất phù sa bồi dọc sông Ba và đất cát pha, các hộ nông dân luân canhdưahấuvàmộtsốloạihoamàu,rauđậukhác.ThờiđiểmgieotrồngvụĐôngXuân từ tháng 12 năm trước – tháng 3 năm sau, vụ Xuân Hè từ tháng 3 – 6 và vụ Hè Thu từ tháng 6 – 7 Vụ Hè Thu thu hoạch từ tháng 9 –10, một số diện tích đất rồng được bỏ trống để tránh thời tiết mưa bão và lũ lụt, còn một số diện tích khác được dùng trồng hoa Lay-ơn để phục vụ nhu cầu thị trường dịp Tết Nguyênđán.
+ Công thức [5, 6, 7]: Tại các điểm trồng dưa hấu thuộc huyện Phú Hòa có thổ nhưỡng đất phù sa bồi dọc sông Ba và đất cát pha, các hộ nông dân trồng dưa hấu liên tiếp hai vụ Đông Xuân và Xuân Hè, vào vụ Hè Thu người nông dân bỏ đất trống hoặc luâncanhcâytrồngkhác.Ngoàira,mộtsốdiệntíchsảnxuấtcáchộnôngdântrồngxen kẽ dưa hấu và các loại cây rau lấy quả khác như bầu bí, mướp, khổ qua vào vụ Đông Xuân.
+ Công thức [8]: Tại các điểm trồng dưa hấu thuộc xã Hòa Xuân, huyện Đông Hòacóthổnhưỡngđấtcátpha,cáchộnôngdânluâncanhcâyhọđậugiữahaivụtrồng dưa hấu theo công thức Dưa hấu (ĐX) - Đậu phộng (XH) - Dưa hấu(HT).
+ Công thức [9]: Tại các điểm trồng dưa hấu thuộc xã An Chấn, huyện Tuy An có thổ nhưỡng đất cát pha, các hộ nông dân luân canh trồng cây dưa hấu và lúa theo côngthứcLúa(ĐX)-Dưahấu(XH) -Lúa(HT).Câydưahấuđượctrồngtiếptheotrên đất trồng lúa vụ Đông Xuân thường được người dân địa phương gọi là dưa hấu Mùng5 tháng 5 (Âmlịch).
- Tại vùng bán sơn địa thuộc huyện đồng bằng và huyện miền núi, các hộ sản xuất dưa hấu luân canh cây trồng theo công thức số 10 – 14.
+Côngthức[10,11]:DưahấuđượctrồngtrênđấtthịtnhẹtạixãAnNghiệp,An Lĩnh, huyện Tuy An sau khi thu hoạch lúa Đông xuân sớm hoặc bắp Dưa hấu được trồng vào tháng 4 và thu hoạch vào tháng 6 Các vụ tiếp theo người nông dân sẽ trồng hoamàu.
+Côngthức[12]:TạicácđiểmtrồngdưahấuthuộcxãHoàHội,huyệnPhúHoà có thổ nhưỡng đất cát pha, các hộ nông dân luân canh dưa hấu và cây màu khác theo công thức Dưa hấu (ĐX) - Rau lấy quả khác (bí đỏ/bí chanh) (XH) Sau khi thu hoạch, đa số các diện tích đất này bỏ trống trong vụ HèThu.
KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA CÂYDƯAHẤU
3.2.1 Kết quảđánhgiácáctriệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựado nấm Didymellabryoniae gâyratrên cây dưahấungoài đồngruộng
Quan sát cây dưa hấu được gieo trồng ngoài đồng ruộng tại các vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên, bệnh nứt thân chảy nhựa có thể biểu hiện ở các mức độkhácnhau,vịtrívếtbệnhcóthểxuấthiệnởtrênlá,thânvàtrái.Cácnghiêncứukhác cũng đánh giá chung rằng các triệu chứng nổi bật nhất được quan sát và ghi nhận trên lá, sau đó dần dần tiến đến thân và quả (Basim và cs, 2016; Gusmini và cs, 2005) [43; 80].
Trước tiên ghi nhận triệu chứng cây bị nhiễm bệnh xuất đầu tiên trên lá hoặc lá mầm Mép lá màu vàng, các đốm bệnh không đồng đều, kích thước 1 – 2 cm hoặc lớn hơn và lan rộng Ban đầu, vết bệnh bị ướt, sau đó khô lại và có màu nâu nhạt Bệnh thường xuất hiện từ bìa lá, lan rộng về phía gân chính và tạo thành các mảng màu nâu sậm, hình vòng cung và đồng tâm Sau đó, các đốm dần tối màu thành nâu đen Láhoại tửvàbịcháykhô.Tạitâmvếtbệnhcóđínhcácđốmđen,kíchthướcbằngđầukim(Hình
3.2A).Vếtnứttiếtranhữnggiọtnhựamàunâuđỏ,sauđóchuyểnsangnâuđenvàkhô cứng (Hình 3.2 B) Tuy nhiên, việc cây trồng không được bón phân đầy đủ hay các vết thương trên thân cây do tổn thương cơ giới hoặc gặp điều kiện thời tiết nắng nóngxảyra đột ngột cũng có thể dẫn đến triệu chứng nứt thân và chảy nhựa Do đó, không thể chẩn đoán bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu dựa trên sự xuất hiện của các giọt nhựa tiết ra từ vết nứt Trên vỏ trái dưa hấu nhiễm bệnh xuất hiện các đốm nhỏ có hình tròn hay bầu dục, úng nước Các đốm bệnh thường xuất hiện ở trung tâm trái Sau đó, các đốm co cụm, hợp nhất và khô dần, màu nâu hay đen và làm nứt vỏ trái (Hình3.3).
Các triệu chứng héo cây thường được quan sát thấy cuối chukỳ lâynhiễm, giai đoạn từ ba đến bốn tuần sau khi cây bị nhiễm bệnh Bệnh làm héo dây hay héo nhánh,khôlá,trườnghợpbịnặngnhánhkhôngthểrahoa,đậutrái.Bệnhgâythiệthạivềnăng suất và phẩm chất trái Các mô tả của Basim và cs (2016) [43] cho biết mức độ nghiêm trọng của bệnh nứt thân chảy nhựa làmtỷlệ phần trăm số mô thực vật bị tổn thương ở cây dưa hấu là rất cao, cao hơn so với các loài thực vật khác thuộc họ Bầubí.
Hình 3.1Vết bệnh màu nâu, không đều, vòng tròn đồng tâm trên lá cây dưa hấu được trồng ngoài đồng ruộng
Hình 3.2Vết nứt trên thân (A: vị trí giữa thân; B: vị trí trên thân gần rễ) do nấm
Didymella bryoniaegây ra bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưahấu
Hình 3.3Đốm úng nước trên trái do nấmDidymella bryoniaegâyra
3.2.2 Kết quả khảo sátđặcđiểm hình tháicủatácnhângâybệnhnứtthân chảy nhựa câydưahấu
Qua quan sát các triệu chứng trên cây dưa hấu ngoài đồng ruộng và thu thập để sử dụng làm vật liệu phân lập tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa và đánh giá đặc điểm hình thái của các mẫu nấm thu thập từ ba vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu và phân lập được trên môi trường PDA, bước đầu nhận diện nấmD bryoniaechính là tác nhân gây bệnh nghi ngờ Trong khoảng thời gian vụ Đông Xuân năm 2018 – 2019 (từ tháng12/2018đếntháng3/2019)đãthuthậpvàphânlậpđược05dòngnấmD.bryoniaespp tại ba vùng sinh thái ở tỉnh Phú Yên (vùng đồng bằng, vùng bán sơn địa thuộc huyệnđồngbằngvàvùngbánsơnđịathuộchuyệnmiềnnúi).Mẫubệnhđượcthutừcácruộngtrồngd ưahấucódiệntíchtrên1.000m 2và nôngdânchuyêncanhdưahấu.Sựphân bố các dòng nấm theo địa điểm thu mẫu được trình bày ở Bảng3.10.
Bảng 3.10Địa điểm thu thập các mẫu nấm bệnhDidymella bryoniaeở các vùng sinh thái nghiên cứu tỉnh Phú Yên
D bryoniae Vùng sinh thái Địa điểm thu mẫu Tính chất đất gieo trồng
DB – 01 Vùng đồng bằng Thôn Ân Niên, xã Hòa An, huyện Phú Hòa Đất cát pha
DB – 02 Vùng bán sơn địa huyện miền núi Thôn Kỳ Lộ, xã Xuân
Quang 1, huyện Đồng Xuân Đất thịt nhẹ
DB – 03 Vùng bán sơn địa huyện đồng bằng Thôn Phong Hậu, xã Hòa
Hội, huyện Phú Hòa Đất thịt nhẹ
Vùng đồng bằng Thôn Phước Lộc, xã Hòa
Thành, huyện Đông Hòa Đất phù sa bồi ven sông
Ghi chú: DB:Didymella bryoniae
ViệcxácđịnhD.bryoniaec óthểdựatrênkhóaphânloạicủanấm,nhưhìnhthái tảnnấm,cấutrúcbàotử,tốcđộtăngtrưởngvàkíchthướcbàotửkíchhoạtviệcsảnxuất cấu trúc giả quả thể bầu pseudothecia và đánh giá khả năng gây bệnh (Keinath, 1995; 2002) [97, 158] Đặc điểm hình thái của nấmD bryoniaeđược mô tả thông qua quan sát quá trình sinh trưởng của sợi nấm và hình thái tản nấm trên môi trường nuôi cấy và các đặc điểm riêng biệt của bào tử khi quan sát cấu trúc bằng kính hiển vi quang học. Quansátdướikínhhiểnvisoinổi,tạicácvếtbệnhtrênlá,thânhayquảchínhxuấthiện cácđốmtrònmàuđenlàcấutrúcsinhsảnvàditruyềncủanấmD.bryoniae.Đólàcấu trúc quả cành (pycnidia), quả thể dạng bầu (perithecia) hay quả thể giả dạng hình bầu (pseudothecia) có chứa các bào tử đóng vai trò là nguồn bệnh sơ cấp hoặc thứ cấp (Punithalingam và Holiday, 1972; Choi và cs, 2010) [144, 59] Các đốm đen nhỏ được quan sát trên thân, lá và quả của cây bị nhiễm bệnh và được sử dụng để phục vụ chẩn đoán chính xác bệnh do nấmD bryoniaegây ra trên cây dưa hấu (Hình 3.4).
Hình 3.4Cấu trúc chứa bào tử nấmDidymella bryoniaeđược hình thành trên bề thân cây dưa hấu thu thập ngoài đồng ruộng
Các mẫu nấm bệnhD bryoniaesau khi thu thập ngoài động ruộng, được phân lập trên môi trường WA (Water Agar) có bổ sung kháng sinh, sau đó được làm thuần trờn mụi truờng ẳ PDA (Potato dextrose agar) Cỏc đĩa petri cú chứa chủng nấm phõn lập được đặt trong điều kiện ánh sáng 12/12h để kích thích sự hình thành bào tử Các quan sát cho thấy hình thái của 05 dòng nấm phân lập khá giống nhau về hình thái tản nấm, hệ sợi nấm và hình dạng màu sắc bào tử Các đĩa petri ở nhiệt độ 25 o C và chiếu sáng, tản nấmD bryoniaetăng trưởng trên môi trường PDA có màu trắng, gồm nhiều sợimảnh,bềmặttảnnấmthôráp,gợnsóng;sợinấmcóxuhướngmọctrênkhông(Hình
3.5 A) Trong điều kiện tối, nhiệt độ 4°C, tản nấm chuyển sang màu xanh ôliu, dần dần chuyển sang màu đen, có các vòng tròn đồng tâm (Hình 3.5 B) Đặt đĩa petri có chứa nấmD bryoniaenuụi cấy và làm thuần trờn mụi trường ẳ PDA, chiếu tia UV 12 giờ/ngàyđểkíchthíchtạobàotửthìnhậnthấybàotửxuấthiệnsau2–3ngàythựchiện thửnghiệm.Sosánhvớitrườnghợpđốichứng,đặtđĩapetritươngtựnhưngkhôngđược chiếu sáng nhận thấy bào tử truởng thành sau 4 – 5ngày.
Dưới kính hiển vi, thực hiện khảo sát hình dạng và kích thước bào tử nấm từcác đĩapetrichứamẫunấmbệnhđượcthuthậptừcácvùngsinhtháinghiêncứu,nhìnchung bào tử phân sinh (conidia) có dạng hình trụ, đầu tròn, có vách ngăn với một thắt nhẹ ở giữa và trong suốt Conidia cú chiều dài trung bỡnh khoảng từ 6,4 – 13,6àm và đường kớnhtrungbỡnhkhoảngtừ3,69–4,68àm(Hỡnh3.6).CỏcnghiờncứuvềhỡnhthỏiD. bryoniaeđược nghiên cứu đầy tiên bới Chiu và Walker (1949) [60], Keinath (1995)
[97], sau đó Choi (2010) [59] hay Li (2015) [42] và Basim (2016) [43] cũng có các mô tả tương tự về hình thái của nấm bệnh này Bên cạnh đó, trong quá trình thu thập mẫu bệnh nghiên cứu đã quan sát được cấu trúc sinh sản của nấmD bryoniaeở giai đoạn sinh sản hữu tính diễn ra ngoài tự nhiên, cơ chế di truyền có thể được thực hiện bằng cáchquảthểbầu(perithecia)màuđen,phóngthíchcáctúibàotử(asci),mỗitúicóchứa cácbàotửtúi(ascospores).Bàotửtúicódạnghìnhtrụhoặcelip,nhọnhaiđầu,cóvách ngăn ngang (Hình 3.7) Các nghiên cứu khác cũng nhận định rằng không quan sát thấy cấu trúc quả thể giả dạng hình bầu (pseudothecia) ở giai đoạn hữu tính hoặc quả cành (pycnidia)ởgiaiđoạnvôtínhkhiphânlậpvànuôicấynấmD.bryoniaet r ê nmôitrường ẳ PDA (Basim, 2016) [43] Mặc dự tồn tại cỏc cấu trỳc cú chức năng di truyền tương tự như conidia nhưng ascosporeshaypseudothecia có thể được xem như một dấu hiệu đặc trưng để xác định nấmD bryoniae, tuy nhiên trong nhiều trường hợp các cấu trúc bào tử này không thể tìm thấy được trên mô thực vật bị nhiễm bệnh Hơn nữa, cấu trúc pseudothecia xuất hiện và phát triển trên mô bệnh muộn hơn so vớipycnidia.
Vào đầu mùa sinh trưởng, nấmD bryoniaecó thể tạo ra pycnidia (quả thể vô tính chứa hàng trăm conidia mỗi quả) hoặc pseudothecia (quả thể hữu tính chứa hàng chụcascosporestrongmỗiquả)trênmảnhvụnvậtchủcònsótlạitừvụtrướcđểbắtđầu quátrìnhsinhtrưởngvàthựchiệnchukỳgâybệnhmới.Độẩmtựnhiêntrênmảnhvụn thực vật bị nhiễm bệnh và nhiệt độ không khí ngoài tự nhiên là điều kiện cần thiết cho sựhìnhthànhcácquảthể.Phầnlớnconidiacóthểbámtrênmảnhvụnthựcvậthoặctán cây,ascosporesđượcpháttánvàokhôngkhíhoặcdínhlênbềmặtcủacâydưahấutrồng trên đồng ruộng, một số ascospore được cho là phát sinh từ những mảnh vụn dưa hấu còn sót lại trên những đồng ruộng bị bỏ trống sau khi thu hoạch (Keinath, 2014) [98]. NấmD.bryoniaecótínhđồngnhất,cảpycnidiavàpseudotheciađềuđượcsảnsinhtrên thân cây dưa hấu, pycnidia được quan sát thấy trên lá, cuống lá, gân vàdâyleo, pseudothecia cũng được tìm thấy trên gân và cuống lá, trên lá, pycnidia phổ biến hơn pseudothecia Mặc dù sự xuất hiện và loại quả thể (sinh sản vô tính hay sinh sản hữu tính)đãđượcbáocáođốivớimộtsốcâytrồngthuộchọBầubíđượctrồngphổbiến,tần suất và mật độ của quả thể không được định lượng chính xác nhưng sự khác biệt về tần suấtcủaquảthể(pycnidiahaypseudothecia)cóthểảnhhưởngđếntiếntriểndịchbệnh, sự phân bố của cây bị bệnh và sự lây lan của mầm bệnh (Keinath, 2014)[98].
Hình 3.5Hình thái tản nấmDidymella bryoniaetrên môi trường PDA sau 03ngày nuôi cấy trong điều kiện sáng, ở 25 o C (A) và trong điều kiện tối, ở 4 o C(B)
Hình 3.6Cấu trúc bào tử phân sinh (conidia) của nấmDidymella bryoniaehìnhthành trên môi trường PDA được quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đạiX40).
Hình 3.7Giai đoạn sinh sản hữu tínhDidymella bryoniae.
Quả thể dạng hình bầu (perithecia) [A] giải phóng túi bào tử (asci) [B] có chứa 8 bào tử túi (ascospores) [C] ở mỗi túi.
Sau khi ly trích DNA từ sinh khối tản nấm thuần tăng trưởng trên môi trường PDA, sự hiện diện genomic DNA của các mẫu nấm sử dụng để khảo sát đều thể hiện bằngcácvệtsángrõvàđủchấtlượngđểthựchiệnphảnứngPCRtrênbảnggelagarose 1% (Hình 3.8).
Hình 3.8Sản phẩm PCR khuếch đại của các mẫu nấm bệnhD bryoniaethu thập và phân lập tại Phú Yên
Kết quả phổ điện di trên bản gel agagose 1% cho thấy các sản phẩm khuếch đại chuỗinucleotidvùngtrìnhtựITS-rRNAcủatấtcả05mẫunấmbệnhphânlậpđềuhiện diện trên gel điện di với chất lượng tốt, rõ nét, không nhiễu với mỗi băng điện di (vệt sáng trên hình) là duy nhất cho mỗi chủng nấm bệnh được phân lập Các băng điện di củamẫubệnhnằmởvịtríkhoảng500–600bp.Cácbăngđiệndicókíchthướcnhỏhơn 100bp là sự hiện diện của các đoạn mồi dư thừa khi tham gia vào phản ứng PCR (Hình 3.8) Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu khác khi sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 để khuếch đại trình tự vùng phiên mã 5,8S rDNA (ITS), 28S rDNA (LSU), 18S rDNA (SSU) để nhận dạng thành công và chính xác loàiDidymellaspp (Somai, 2002; Babu, 2015; Chen, 2015a; Basim,2016) [158, 42, 55,43].
3.2.3.2 GiảitrìnhtựvùnggeneITS1,5,8SrRNA,ITS2vàđịnhdanhcácmẫunấmbệnhDidymella bryoniae phân lập tại PhúYên
Sau khi lắp ráp và loại bỏ các đoạn nucleotid bị nhiễu ở 2 đầu, cả 05 mẫu nấm bệnhD bryoniaeđều có kết quả PCR dương tính với mồi ITS1 và ITS4, với kết quả giải trình tự vùng gene ITS1, 5,8S rRNA và ITS2 của 5 mẫu nấm phân lập tại Phú Yên đều cho tín hiệu tốt với chiều dài lớn hơn 500bp (Hình 3.8; Bảng 3.11) Trình tự các mẫu nấm bệnhD bryoniaephân lập có kích thước đoạn đọc được lần lượt là DB-01: 534bp;DB-02:559bp;DB-03:595bp;DB-04:604bpvàDB-05:591bp.Năm(05)mẫu nấm bệnhD bryoniaephân lập được trên cây dưa hấu tại Phú Yên được giải trình tự các vùng gene ITS1, 5,8S rRNA và ITS2, kết quả giải trình tự vùng gene ITS1, 5,8s rRNA, ITS2 các mẫu nấm bệnhD bryoniaephân lập tại Phú Yên như sau:
> Assembled sequence_ DB – 01|Length: 591bp
TTCCTCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAA CTTTCAGAAGTGGGGTGTTTTACGGCATGGCCACCGCCGAGCTCCAATGCGAGTTGTGCT ACTACGCAGAGGGGGACTACAGCGAGACCGCCACTGAATTTCGGGGCCGGCAGGCGCGGG GACCGTCCCGGAGGACAGCCCCGGCCCACGCCGATCCCCAACGCCAGGCACTGGGGGCCT GAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGC GTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTG CGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTATTTATTTGTTT ATGTGTCACTCAGAGGAGAAAACCACTAAAGACATAAGAGTTTGGGTTCTCCGGCGGGCG CCTGGTTCCGTTGCCCGAAGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAAGCAACGATAGGTAAGGTT CACAAAGGGTTTGGGAGTTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAAGGTC
> Assembled sequence_ DB – 02|Length: 559bp
TTCCTCCGGCTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCA ACCTTGGTGCCGCCGGAGCGGGCTTGTGGGGGGTTTAGAGGCAGGACGCCGAGGGATC CCAATGCGAGGCTGATGCTACTGCGCAAAGGAGAGGGCCTTCGGGTCCGCCACTGATT TTGGGAGACTGCCGTGGCAGATCTCCAACGCCGGGCCACGGGGGCTCGAGGGTTGAAA CGACGCTCGGACAGGCATGCCTCCCAGGATACTGGAAGGCGCCATGTGCGTTCAAAGA TTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTT CATCGATGCTGGAGCCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTGACAGTTCGCTAAGAACA CTCAGAAGTATCGTCGGGTTCGAAAACAGAGATTCTGATGAGACCGGCGGGCACCCTC GCGGGCGCCGCCGAAGCAACAGGTATAATAGTTCACAAAGGGTAGAGAGTGTAGTACTCA GTAATGATCCCTCCGCAAGGTCACCCTACGGAAGG
> Assembled sequence_DB – 03 |Length: 534bp
GACAAACACCCAACACCAAGCAAAGCTTGAAGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCC CCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC AATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCC GTTGTTGAAAGTTGTAACTATTAAAGTTTTTCAGACGCTGATTGCAACTACAAAGGGTTT AAATGTGTCCAATCGGCGGGCGGACCCGCCGAGGAAACGAAGGTACTCAAAAGACATGGG TAAGAGATAGCAGGCAAAGCCTACAACTCTAGGTAATGATCCTTCCGCAAGGTT
> Assembled sequence_ DB – 04 |Length: 604bp
TTCCTCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTC AACTTTCAGAAGTGGGGTGTTTAACGGCATGGCCACCGCCGCGTTCCAACTGCGAGGT TGTGCTACTACGCAGAGGAGGACTACAGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGAGCCGGCC CGCCGCGCAAACCCCCGGGGGGGGCTGCGCGCCGTACGGCCGATCTCCAACGCCAGGC ACTGGGGGCCTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGC GGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACT TATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAG TTTTGATTTATTTGTTTATAATCCACTCAGAGGAGAAAACCATAAAAAACAAAGAGTT TGGGTTCTCCGGCGGGCGCCTGGCTCCGGAGGGCCCCCGCGAAGGGGCCGGCCCGGGG CGATCCCGCCGAAGCAACGATAGGTAAGGTTCACAAAGGGTTTGGGAGTTTGTAAACTCG GTAATGATCCCTCCGCAAGGTC
> Assembled sequence_ DB – 05 |Length: 595bp
TTCCTCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTC AACTTTCAGAAGTGGGGTGTTTAACGGCATGGCCACCGCCGCGTTCCAACTGCGAGGT TGTGCTACTACGCAGAGGAGGACTACAGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGAGCCGGCC CGGCGCGCATCCCCGGAGGGCTGCAGCCGTACGGCCGATCTCCAACGCCAGGCACTGG GGGCCTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCG CAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCG CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTG ATTTATTTGTTTATAATCCACTCAGAGGAGAAAACCATAAAAACAAAGAGTTTGGGTT CTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGAGGCCCCGTGAAGGGCCGGCCCGGGGCGATCCCGC CGAAGCAACGATAGGTAAGGTTCACAAAGGGTTTGGGAGTTTGTAAACTCGGTAATGATC CCTCCGCAAGGTC
Dựa trên kết quả giải trình tự vùng gene ITS1, 5,8s rRNA, ITS2 các mẫu nấm bệnhD bryoniaephân lập tại Phú Yên, so sánh mức độ tương đồng của các trình tự đượcgiảivớitrìnhtựcủacácmẫunấmđãđượccôngbốtạingânhànggenbằngchương trình Nucleotide Blast tại NCBI Trình tự các đoạn đọc được bao phủ vùng ITS1, 5,8S rRNA và ITS2 của chuỗi ITS cho phép xác định chính xác tác nhân gây bệnh nứt thân chảynhựatrêncâydưahấuthuthậpvàphânlậptạiPhúYênởmứcloài.Cácđoạntrình tựITScủa05mẫunấmbệnhD.bryoniaetrongnghiêncứuđượctìmkiếmvàsosánh mức độ tương đồng với các trình tự tham chiếu đã công bố trên Ngân hàng Gen (Genbank) tại NCBI thông qua phần mềm trực tuyến BLAST.
KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM, GÂY BỆNH VÀ GÂY HẠI CÂY DƯA HẤU CỦA NẤMDidymella bryoniaeTHU THẬP VÀ PHÂN LẬP TẠI PHÚ YÊN TRONG ĐIỀU KIỆNNHÀLƯỚI
NẤM DIDYMELLA BRYONIAE THU THẬP VÀ PHÂNLẬPTẠI PHÚ YÊN TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀLƯỚI
3.3.1 Khảnăngxâmnhiễmtựnhiênhaycótácđộngcơhọccủanấm Didymellabryoniae thu thập và phân lập tại Phú Yên trong điều kiện nhà lưới
Khả năng xâm nhiễm của mẫu nấm phân lập đều được ghi nhận ở tất cả các nghiệm thức Hầu hết các cây ký chủ đều có biểu hiện bị nhiễm nấm thể hiện bằng sự xuấthiệnđốmnhỏởvịtríméplá,úngnướcsau48-57giờlâynhiễmởcảnghiệmthức tạo vết thương và không tạo vết thương trên cây dưa hấu (Bảng3.13). ỞnghiệmthứcsửdụngmẫunấmbệnhD.bryoniaeD B–02,vếtbệnhhìnhthành trên lá chậm hơn, các đốm nhỏ có triệu chứng úng nước xuất hiện sau 52 giờ lây nhiễm đốivớicâycótạovếtthươngvà57giờsaulâynhiễmđốivớicâykhôngtạovếtthương; các mẫu nấm bệnhD bryoniaecòn lại ghi nhận sự xuất hiện vết bệnh sau 48 giờlâynhiễm Tuynhiên thời gian xuất hiện vết bệnh không có sự khác biệt đáng kể, thời gian ghinhậnvếtbệnhxuấthiệnđầutiênvàcuốicùngởtấtcảcáccâythínghiệmđềuxảyra trongvòng24giờsaukhilâynhiễmbệnhnhântạo.Kếtquảnàychứngminhbàotửnấm
D.bryoniaecóthểxâmnhiễmvàocâykýchủbằngnhiềucáchkhácnhau,trựctiếphoặc giántiếpthôngquavếtthươngtrêncây.Môphỏngnàyphùhợpvớisựxuấthiệncáctổnthươngcơhọc do vết côntrùng chíchhúttrêncây ởngoàiđồng ruộng Kết quảnàyphù hợpvớicáccơchếxâmnhiễmcủaD.bryoniaevàocâykýchủdoNeergaard(2012)[134].Bào tửnấmD.bryoniaecóxâmnhiễmtrựctiếpbằngcáchhìnhthành đĩaápbámtrênbềmặtmô lá, sợi nấm xâm nhiễm trựctiếpqua lớp biểu bì,khíkhổnghoặccác lỗtraođổinước, khôngkhíhay trựctiếp quavết thương.Vịtrísợi nấmxâmnhiễmxảyraởtế bàobiểubì hoặc giữa nhữngtếbào bảo vệ của haikhí khổnglân cậnNeergaard(2012)[134].Sau khi xâm nhiễmthành công,sợi nấm tăngtrưởng trongnhữngkhoảng trốnggianbào, kếtquảtếbàobịpháhủy(NguyễnThịThuNga,2009)[19].D.bryoniaeđượctạoranhiều loại enzymethủyphânnhưpolygalacturonase(PG),pectin methylesterasevàcellulase, trongđópolygalacturonaseđượcenzymequantrọngnhấtchosựphávỡtếbào.
Tỷlệbệnhđượcghinhậnvàđánhgiákhitriệuchứngbệnhxuấthiệnởtấtcảcác nghiệm thức Theo ghi nhận về thời gian biểu hiện bệnh, triệu chứng là các đốm nâu nhỏ, úng nước ở nghiệm thức phun dung dịch bào tử chứa bào tử mẫu nấmD.bryoniaeDB-02 trên cây con không tạo vết thương xuất hiện chậm nhất, xảy ra sau 57 giờlâynhiễm.Dođó,tỷlệbệnhđượcghinhậnởtấtcảcácnghiệmthứcvàongàythứ3saukhi lâynhiễm.Tấtcảcácchủngnấmphânlậpđềugâytổnthươngtrênlácủacâykýchủvới tỷ lệ bệnh từ
80 đến 100%, cao hơn so với đối chứng (0%) (Bảng3.13).
Bảng 3.13Khả năng xâm nhiễm củaDidymella bryoniaevà gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu
Hình thức lây nhiễm Thời gian ủ bệnh Tỷ lệ bệnh (%) sau 72 giờ
Nước cất (ĐC) Tạo vết thương cơ học - 0 ± 0,00 d -
Nước cất (ĐC) Không tạo vết thương - 0 ± 0,00 d -
DB – 01 Tạo vết thương, phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 01 Phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 b ++
DB – 02 Tạo vết thương, phun dịch bào tử 52 giờ 86,67 ± 11,54 b +
DB – 02 Phun dịch bào tử 57 giờ 80 ± 0,00 c +
Hình thức lây nhiễm Thời gian ủ bệnh Tỷ lệ bệnh (%) sau 72 giờ
DB – 03 Tạo vết thương, phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 03 Phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 04 Tạo vết thương, phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 04 Phun bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 05 Tạo vết thương, phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
DB – 05 Phun dịch bào tử 48 giờ 100 ± 0,00 a ++
(-) không có tổn thương = chủng D bryoniaespp không gây bệnh;
(+) xuất hiện tổn thương trên thân, cây thẳng = chủng D bryoniaespp xâm nhiễm trung bình;(+
+)xuấthiệntổnthươngtrênthân,vếtbệnhlanrộnghoặcnhiềuvếtbệnh,câyhéo=chủngD.bryoniae spp xâm nhiễm mạnh;
Trung bình trong cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Bào tử nấmD bryoniaecó thể xâm nhập và lây nhiễm trên hầu hết các bộ phận của cây (Keinath, 2014) [98] Triệu chứng nhiễm bệnh có thể quan sát thấy trên các bộ phận của cây dưa hấu, trước hết ở lá là các đốm nhỏ, úng nước, khô héo dần, sau đó là các vết nứt ở thân, vết nứt kéo dài và chảy nhựa Mức độ xâm nhiễm của các mẫu nấm
D.bryoniaespp.trênlácóảnhhưởngnhấtđịnhđếntỷlệdiệntíchlábịtổnthươnghoặc có biểu hiện triệu chứng cây nhiễm bệnh Thông qua đó, sự khác biệt về độc tính của các chủngD. bryoniaespp thu thập cũng được chứng minh rõ ràng qua mức độ xâm nhiễm của các chủng phân lập sau 10 ngày lây nhiễm Các mẫu nấmD bryoniaespp DB – 01, DB –
03, DB – 04 và DB – 05 là những chủng xâm nhiễm tích cực, thời gian xâm nhiễm và biểu hiện bệnh sớm (48 giờ), tỷ lệ bệnh 100% và gây ra hiện tượngsuygiảm khả năng sinh trưởng ở tất cả các cây ký chủ được đánh giá mức độ xâm nhiễm ở mức mạnh (+ +) Mẫu nấmD bryoniaespp DB – 02 xâm nhiễm yếu hơn do thời gian xâm nhiễm và biểu hiện bệnh chậm tương ứng với tỷ lệ bệnh thấp hơn, 86,67% trong vòng52giờđốivớicâytạovếtthươngvà80%trongvòng57giờđốivớicâykhôngtạo vếtthương.MẫunấmD.bryoniaespp.DB–02cũnggâyhiệntượngsuygiảmkhảnăng sinh trưởng ởcâyký chủ bằng đánh giá mức độ xâm nhiễm ở mức trung bình (+) Các cây đối chứng tạo vết thương không biểu hiện các triệu chứng nhiễm nấm bệnh (Bảng 3.13).
Khả năng gây bệnh và gây hại từ các mẫu nấmD bryoniaeđược thu thập và phânlậptạiPhúYêntừcáctriệuchứngbệnhnứtthânchảynhựatrêncâyhoặcvếtbệnh xuấthiệntrêncâydưahấu.Sựkhácbiệtđángkểvềđộctínhcủacác mẫunấmgâybệnh
D.bryoniaeđ ư ợ cxácđịnhbằngtỷlệdiệntíchlácóbiểuhiệnnhiễmbệnh(%)vàchiều dài vết nứt thân chảy nhựa (không phải do tác động cơ học) xuất hiện trêncây.
Bảng 3.14Khả năng gây hại của các mẫu nấmDidymella bryoniaeđược phân lập từ cây dưa hấu sau 14 ngày lây nhiễm bệnh nhân tạo
Diện tích lá biểu hiện nhiễm bệnh
Chiều dài vết nứt trên thân (cm) Độc lựccủa
Mức độ nghiêm trọng bệnh
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 Độc lực của mẫu nấm bệnh D bryoniae : * = thấp (1 đến 25%), ** = trung bình (25 đến 50%), *** = cao (50đến 75%) và **** = nguy hiểm (75 đến 100%) (Babu, 2015) [42]
Mức độ nghiêm trọng của bệnh phân cấp như sau: Cấp 1 = 0; Cấp 2 = 0 đến 3; Cấp 3 = 3 đến 6; Cấp 4 = 6đến 12; Cấp 5 = 12 đến 25; Cấp 6 = 25 đến 50; Cấp 7 = 50 đến 75; Cấp 8 = 75 đến 87; Cấp 9 = 87 đến 94; Cấp1 0
= 94 đến 97; Cấp 11 = 97 đến 100; Cấp 12 = 100 (Horsfall và Barratt, 1945) (Bock và cs, 2009) [47, 95] Độc lực của các chủng phân lập được phân thành hai nhóm, thấp * (1 đến 25% diện tích lá) và trung bình ** (26 đến 50% diện tích lá) nhưngtỷlệ diện tích lá bị tổn thương và chiều dài vết nứt trên thân cây có sự khác biệt Mẫu nấm bệnhD. bryoniaeDB – 02 có độc lực thấp (*), tỷ lệ diện tích lá có biểu hiện triệu chứng bệnh là
15,74% và chiều dài vết nứt trên thân 1,46 cm Mẫu nấm bệnhD bryoniaeDB – 01,
DB – 03, DB – 04 và DB – 05 có độc lực trung bình (**),tỷlệ diện tích lá có biểu hiện bệnh chênhlệchnhautừ27,73đến41,13%.Cáccâykýchủđượcsửdụngtrongnghiệmthức đối chứng (nước cất) không xuất hiện các triệu chứng nhiễm bệnh (Bảng3.14).
NấmD bryoniaeđược thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu khác cho thấy các chủngD bryoniaeđược thu thập từ các địa điểm khác nhau, trên cùng hoặc khác cây ký chủ có sự khác biệt về độc lực Các chủngD bryoniaecó thể được phân lập từ các loạicâykýchủkhácngoàicâydưahấunhưdưalưới,dưaganghaybíđao.Độclựccủa các chủng này có thể hiện khác nhau đối với từng loại cây ký chủ Phần lớn các chủng phân lập từ cây dưa hấu có độc lực cao hoặc cực kỳ độc đối với chồi non của hạt dưa hấu (Babu, 2015) [42] Tuy nhiên, các thử nghiệm khả năng gây bệnh của mẫu nấm bệnhD. bryoniaethu thập tại Phú Yên chỉ được thực hiện trên cây dưa hấu và các nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành bổ sung trên các loại cây trồng khác thuộc họ bầu bí như dưa lưới, dưa leo hay bí để nghiên cứu kỹ hơn về phổ thực vật ký chủ của cácchủngnàytạicácvùngsinhtháithựchiệnnghiêncứu.Nghiêncứuvềkhảnăngmẫn cảm của dưa hấu và các loại bầu bí khác đối với các chủng phân lập từ các cây ký chủ có nguồn gốc khác nhau có thể hữu ích cho các quá trình lựa chọn và nhân giống cây trồng có tính kháng (Babu, 2015)[42].
Quansátquátrìnhsinhtrưởngpháttriểncủacâydưahấusaukhiđượclâynhiễm bệnh nhân tạo ở kết quả nghiên cứu trước đã cho thấy triệu chứng biểu hiện bệnh trên lácâykýchủcóthờigianxuấthiệnbệnhkhácnhau,hầuhếttriệuchứngbệnhxuấthiện sau 48 giờ lây nhiễm bệnh nhân tạo (Bảng 3.13) Ở cây dưa hấu được lây nhiễm mẫu nấm bệnhD. bryoniae, trên lá xuất hiện những chấm nhỏ, khô sau 48 giờ lây nhiễm bệnhnhântạo(Hình3.12A).Sauđó,cácvếtbệnhcótriệuchứngúngnước,bấtđịnhvà bắtđầulâylantrongkhoảng24giờtiếptheo(Hình3.12B).Cácđốmúngnướclanrộng tạothànhnhữngvếthoạitửlớntrênbềmặtlá(Hình3.13A)vàvếtnứttrênthâncómàu xám trắng ở cây dưa hấu ở những ngày sau đó (Hình 3.13B).
Thời gian theo dõi các triệu chứng biểu hiện bệnh trên lá hoặc thân cây ký chủ kéo dài khoảng 20 ngày sau khi chủng, kết quả cũng phù hợp với các nghiên cứu cùng đốitượngđãđượcthựchiệntrênthếgiớitừ4đến30ngày(Santosvàcs,2009;Babuvà cs, 2015; Somai và cs, 2002a; Keinath và cs, 2022) [154, 42, 158, 72] Dựa vào đánh giá khả năng xâm nhiễm của các mẫu nấm bệnh phân lập, ghi nhận các trường hợp vết bệnh xuất hiện sau 48 giờ gây bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh do các mẫu nấm phân lập gây ra ở cấp 5 (12 đến 25% diện tích lá) hoặc cấp 6 (25 đến 50% diện tích lá) thì các mẫu nấm bệnhD bryoniaeDB – 01, DB – 03, DB – 04 và DB – 05 được đánh giá là gây tổn hại cao đến cây dưahấu.
Ngoài ra, kết quả giải trình tự gene, mức độ tương đồng giữa các mẫu nấm bệnh phân lập được với các loài đã được công bố tại Genbank cho thấyD bryoniaeDB-03 chínhlàloàiS.cucurbitacearumisolateUF-DB-35(mãKF990411).Dođó,nghiêncứu sử dụng mẫu phân lậpD bryoniaeDB – 03 để khảo sát khả năng kiểm soát bệnh nứt thânchảynhựatrêncâydưahấubằngvikhuẩnBacillusspp.ởcácthínghiệmtiếptheo.
Hình 3.12Biểu hiện sự xâm nhiễm của mẫu nấm bệnhDidymella bryoniaetrên lá cây dưa hấu sau 48 giờ (A) và 72 giờ (B)
Hình 3.13Vết bệnh trên lá và vết nứt trên thân cây dưa hấu sau 7 ngày lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng nấmDidymella bryoniae
KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SỰ PHÁT TRIỂN NẤMDidymella bryoniaeCỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp TRONG ĐIỀU KIỆNINVITRO
Trong nghiên cứu này, khả năng kiểm soát sự phát triển nấmD bryoniaecủa mộtsốchủngvikhuẩnBacillusspp.đượcthểhiệnquakhảnăngkiểmsoátsựpháttriển của sợi nấmD bryoniaespp DB – 03 trờn mụi trường ẳ PDA tối ưu cho sự phỏt triển củaD.bryoniae.MộtsốloàivikhuẩnBacillusđãđượcnghiêncứuvàứngdụngrộngrãi đểthúcđẩykhảnăngkiểmsoátbệnhhạithựcvậtvàthúcđẩysựsinhtrưởngvàphát triển của cây trồng (Domenech và cs, 2006; Cawoy và cs, 2011; Kumar và cs, 2011 và Jangir, 2018) [68, 54, 101, 79] ChiBacillusđược biết đến trong việc tạo ra nhiều hoạt chấtsinhhọcnộisinhnhưbacteriocinvàlipopeptidecótácdụnghạnchếmầmbệnhvà ngănchặnmộtsốbệnhgâyhạitrêncâytrồng(Pradhanvàcs,2018;Simkovàcs,2012) [142, 163]. Dựa vào cơ chế này, khả năng kiểm soát nấm của vi khuẩn (hay hiệu suất đối kháng) được tính dựa vào khả năng hạn chế sự phát triển của sợi nấm (Le Như Cương và cs, 2019a) [115] Khi tiến hành thử nghiệm hiệu suất đối kháng của vi khuẩn trong điều kiệnin vitro, kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm đều có khả năng ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm trờn mụi trường ẳ PDA Ở nhiệt độ 25 o C và chiếu sỏng, tản nấmD bryoniaespp DB – 03 tăng trưởng trờn mụi trường ẳ PDA cú màutrắng,tốcđộtạobàotừtừ2–3ngày,cònởnhiệtđộ4°Cvàchetối,tảnnấmchuyển sang màu xanh ôliu, dần dần chuyển sang màu đen, tốc độ tạo bào từ 4 – 5 ngày Vi khuẩnBacillusspp cho thấy hiệu quả ức chế tốt đối với sự phát triển sợi nấmD.bryoniaespp DB – 03 ở cả hai điều kiện nuôi cấy có chiếu sáng và chetối.
Trong điều kiệnin vitroở 25 o C và chiếu sáng, tại thời điểm 6 ngày sau khi cấy nấm, hiệu suất đối kháng nấmD bryoniaespp DB – 03 của các chủng vi khuẩnBacillusthử nghiệm đạt từ 18,46 đến 28,25% Các chủng vi khuẩnBacillusspp.
S1F3, S18F11vàS13E3lànhữngvikhuẩnmạnhứcchếhiệuquảsựtăngtrưởngsợinấmtrên mụitrườngẳPDA.Thờiđiểm10ngàysaukhicấynấm,khảnănghạnchếsựphỏttriển sợinấmD.bryoniaecủacácchủngvikhuẩnthửnghiệmcũngđượcthểhiệnrõrànghơn thông qua hiệu suất đối kháng nấmD bryoniaespp DB – 03 của các chủng vi khuẩnBacillusđạt từ 45,45 đến 60,7% Các chủngBacillusspp S1F3, S18F11 và S20D12 có hiệu suất đôi kháng đạt giá trị hơn 50% Kết quả cho thấy, chủngBacillusspp.S20D12 ức chế sự sinh trưởng của sợi nấmD bryoniaespp DB – 03 tốt nhất với hiệu suất đối kháng là 60,71% và chủngBacillusspp S1A1 ức chế sự sinh trưởng của sợi nấmD.bryoniaespp.DB– 03kémnhấtvớihiệusuấtđốikhánglầnlượtlà45,15%(Bảng3.15, Hình3.14).
Trongđiềukiệninvitroở4 o Cvàchetối,cácchủngvikhuẩnBacillusspp.cũng cho thấy sự hiệu quả trong khả năng ức chế sự phát triển sợi nấmD bryoniaespp.D B
– 03 Tại thời điểm 6 ngày sau khicấynấm, hiệu suất đối kháng nấmD bryoniaespp.
DB – 03 của các chủng vi khuẩn Bacillusthử nghiệm đạt từ 19,53 đến 30,08% Thời điểm10ngàysaukhicấynấm,kếtquảchothấykhảnănghạnchếsựpháttriểnsợinấm
D.bryoniaespp.DB–03củacácchủngvikhuẩnthửnghiệmđượcthểhiệnrõrànghơn và tương tự như trường hợp có chiếu sáng, hiệu suất đối kháng của các chủngBacillusspp.S1F3,S13E2,S18F11vàS20D12đạtgiátrịhơn50%.Sau10ngàycấynấm,chủn gBacillusspp S20D12 ức chế sự sinh trưởng của sợi nấmD bryoniaespp DB – 03 tốt nhất với hiệu suất đối kháng là 67,13% và chủngBacillusspp S1A1 ức chếs ự s i n h trưởng của sợi nấmD bryoniaespp DB – 03 kém nhất với hiệu suất đối kháng là 47,03
Bảng 3.15Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấmDidymella bryoniaespp DB-03 của vi khuẩnBacillusspp trong điều kiệnin vitroở 25 o C và chiếu sáng theo thời gian
Chủng vi khuẩn Hiệu suất đối kháng nấm (%) sau thời gian cấy nấm
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Hình 3.14Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấmD bryoniaespp DB – 03 của vi khuẩnBacillusspp trong điều kiện in vitro ở 25 o C và chiếu sáng sau 10 ngày
Bảng 3.16Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấmDidymella bryoniaespp DB – 03 của vi khuẩnBacillusspp trong điều kiệnin vitroở 4 o C và che tối theo thời gian
Chủng vi khuẩn Hiệu suất đối kháng nấm (%) sau thời gian cấy nấm
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Hình 3.15Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấmDidymella bryoniaespp DB – 03 của vi khuẩnBacillusspp trong điều kiệnin vitroở 4 o C và che tối sau 10n g à y
Nhìn chung ở cả hai điều kiện nuôi cấy (không hoặc kích thích tạo bào tử nấm gây bệnh), các chủng vi khuẩnBacillusspp S1F3, S18F11 và S20D12 đều là những loài vi khuẩn cú khả năng ức chế hiệu quả sự tăng trưởng sợi nấm trờn mụi trường ẳ PDAsau6ngàycấynấm.Sau10ngàycấynấmthìkhảnănghạnchếsựtăngtrưởngsợi nấm củaBacillusspp S13E2,Bacillusspp S13E3 vàBacillusspp S18F11 không có sự khác biệt rõràng.
Sự ức chế khả năng phát triển nấm của các loàiBacillusbị ảnh hưởng bởi việc sảnxuấtcácchấtkhángsinhứcchếnấmnhưbacilysisn,inturin,fengycin,bacillomycin, Surfactin, ericin, merscidin, subtilosin, subtilin và mycosublilin (Mora và cs, 2011; Simko và cs, 2012) [130, 163] Hiệu suất đối kháng củaBacillusspp S20D12 ở mức thấp(25,6%)tạithờiđiểm6ngàysaukhicấynấmvàđạtcaonhất(60,7%)tạithờiđiểm
10ngàysaukhicấynấm.Nhưvậy,tỷlệhiệusuấtđốikhángcủachủngvikhuẩnBacillusspp S20D12 tăng 2,37 lần sau 4 ngày tiếp tục theo dõi thí nghiệm Điều này cho thấy tốc độ tăng sinh củaBacillusspp S20D12 xảy ra nhanh chóng, dẫn đến hiệu suất đối kháng tăng mạnh Theo Lê Như Cương và cs (2019a) [115] cũng ghi nhận chủngBacillusspp.S20D12 không ngăn chặn đáng kể sự lây nhiễm của nấmS rolfsiigây bệnh héo rũ mốc trắng vàA nigergây bệnh héo rũ mốc đen trên cây lạc giai đoạn 7 và 14 ngày sau khi cấy nấm, nhưng đạt hiệu quả kháng nấm tốt ở giai đoạn 21 và 28 ngày sau khi cấy nấm trong điều kiện nhà lưới (Le và cs, 2019b)[116].
KHẢ NĂNG HẠN CHẾ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA DO NẤM DIDYMELLA
Thực hiện lây nhiễm nhân tạo nấm bệnhD bryoniaespp DB – 03 trên cây con, quansátdiễnbiếnbệnhnứtthânchảynhựavàocáckỳđiềutra7,14và21ngàysaulâynhiễm và đánh giá khả năng kiểm soát sự phát sinh và phát triển nấmD bryoniaecủa các chủng vi khuẩnBacillusspp trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm bệnh nhân tạo Nghiên cứu về khả năng khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấmD bryoniaespp.DB
–03trongphòngthínghiệmchothấycácchủngvikhuẩnBacillusspp.S18F11,S20D12 và S1F3 là những vi khuẩn có khả năng kiểm soát nấmD bryoniaespp DB – 03 trong điều kiệnin vitro Một số chủng vi khuẩn có khả năng hạn chế tác nhân gây bệnh trong điều kiệnin vitrolà tiền đề hạn chế bệnh hại trong điều kiện nhà lưới Tuy nhiên khả năng kiểm soát sự phát triển và tăng trưởng sợi nấm trong điều kiệnin vitrovẫn chưa đủ dữ liệu để đảm bảo cho khả năng hạn chế bệnh hại trong nhà lưới bởi do còn phụ thuộcvàokhảnăngsốngvàsảnsinhcácchấtkhángnấmtrongđiềukiệnnhàlướicólây nhiễm bệnh nhântạo.
Kếtquảnghiêncứuchothấy,mứcđộkhácbiệtvềtỷlệbệnh(%)củacâysaukhi bịlâynhiễmmẫunấmD.bryoniaespp.DB–03ởcácnghiệmthứcđượcxửlývớivi khuẩnBacillusspp so với nghiệm thức đối chứng có sự khác biệt theo thời gian.Tỷlệ bệnh (%) của cây ở nghiệm thức đối chứng (nước cất) cao hơn sovớicác nghiệm thức được xử lý với vi khuẩnBacillusspp vào cáckỳđiều tra 7, 14 và 21 ngày Sau 7 ngày lây nhiễm, cây con được xử lý với vi khuẩnBacillusspp S1F3 và S18F11 thuộc nhóm cây cótỷlệ bị nhiễm bệnh thấp nhất (43,34% và 46,67 % ) Vào các thời điểm quan sát tiếp theo, nhómcâycó tỷ lệ bệnh thấp thay đổi bao gồm cây được xử lý với các chủng vi khuẩnBacillusspp S1F3, S13E3, S18F11 và S20D12, nhóm này cótỷlệ bệnh thấp hơnsovớiđốichứng.Tạithờiđiểm14ngàysaulâynhiễm,câyđượcxửlývớivikhuẩnBacillusspp. S20D12 cótỷlệ bệnh thấp nhất (46,67%) Tại thời điểm 21 ngày saulâynhiễm, cây được xử lý với vi khuẩnBacillusspp S18F11 cótỷlệ bệnh thấp nhất (60,00%) (Bảng3.17).NgoạitrừnghiệmthứcxửlývớivikhuẩnBacillusspp.S1A1có tỷ lệ bệnh cao cho thấysự kémhiệu quảtrongviệckiểmsoátbệnhnứt thânchảynhựadonấm bệnhD.bryoniaeDB –03gây ra,cácnghiệmthức còn lạicótỷlệbệnhtrêncâyconkhácbiệt khôngquánhiềumặc dùsựkhácbiệtcóýnghĩavềmặtthốngkê.
Bảng 3.17Ảnh hưởng của vi khuẩnBacillusspp đến bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm nhân tạoDidymella bryoniaespp.
Tỷ lệ bệnh (%) của cây bị nhiễm nấm D bryoniae spp. DB–03 sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus spp.
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
S20D12vàS18F11lànhómcâycókhảnăngkiểmsoátsựxâmnhiễmvàgâyhạicủanấmbệnhD.br yoniaeDB – 03cóhiệuquảsovới đối chứng và các nghiệm thức còn lại Chỉ sốbệnhcủanghiệmthứcBacillusspp.S1F3vàBacillusspp.S13E2làthấpnhất(8,67%và10,67%)sau7ngày;Bacillusspp.S1F3,Bacillusspp.S20D12vàBacillusspp S18F11là thấp nhất (20,67%, 21,34%và24,00%)sau 14ngày;Bacillusspp
S18F11vàBacillusspp.S20D12là thấp nhất(28,00%và32,67%)sau 21ngày lâynhiễm (Bảng3.18).
Bảng 3.18Chỉ số bệnh của cây sau xử lý vi khuẩnBacillusspp trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm nhân tạoDidymella bryoniaespp DB – 03
Chỉ số bệnh (%) của cây bị nhiễm nấm D bryoniae spp. DB–03 sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus spp.
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Về tỷ lệ cây chết ở kỳ điều tra 7 ngày sau lây nhiễm đạt giá trị là 0% Tại thời điểmnày,câyconchỉxuấthiệncáctriệuchứngbệnhlànhữngđốmnâunhỏtrênláhoặc nặnghơnlàcáctổnthươngtrênláởdiệnrộnghayvếtnứttrênthânkéodài.Sauđó,một số cây biểu hiện bệnh nặng hơn làm cho cây héo hoặc một phần lá cây khô héo hoàn toàn, tuy nhiên vẫn chưa ghi nhận cây chết Sau 14 ngày lây nhiễm nấm bệnh, một số nghiệmthứcđãghinhậncâyconbịnhiễmbệnhnặng,cácbộphậnhéodầnvàhéohoàn toàndẫnđếngâychếtcâycontừ3,34đến13,34%,sovớiđốichứng50,00%.Ngoạitrừ nghiệm thức cây con được xử lý với vi khuẩnBacillusspp S1F3 và S20D12 khôngghi nhận sự chết ở cây con nhưngtỷlệ số cây có biểu hiện bệnh ở thang điểm số 3 (cây bị héo một phần) nhiều hơn so vớikỳđiều tra trước đó Đến thời điểm 21 ngày sau lây nhiễm, các cây con bị nhiễm bệnh nặng gia tăng,tỷlệ chết của cây con gia tăng trong khoảngtừ13,34đến40,00%.NghiệmthứcxửlývớivikhuẩnBacillusspp.S20D12và
S18F11cótỷlệcâychếtthấpnhất13,34%,trongkhiởnghiệmthứcđốichứngtỷlệchết cây là 100%(Bảng3.19).
Bảng 3.19Tỷ lệ cây dưa hấu bị chết sau xử lý vi khuẩnBacillusspp trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm nhân tạoDidymella bryoniaespp DB – 03
Tỷ lệ chết (%) của cây dưa hấu bị nhiễm nấm D bryoniae spp DB – 03 sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus spp.
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
MộtđiểmthúvịởnghiêncứunàylàsựgópmặtcủacácchủngvikhuẩnBacillusspp S1F3, S18F11 và S20D12 trong các chỉ tiêu đánh giá về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở hầu hết các thời điểm quan sát Điềunàychứng tỏ rằng việc xử lý cây với dung dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S1F3, S18F11 và S20D12 đã phòng ngừa được số cây bị nhiễmbệnhtheothờigian.Đồngthời,việcxửlýcâyconvớivikhuẩntrongthínghiệm đã kiểm soát được sự phát sinh và diễn biến gây bệnh nặng của nấm bệnhD bryoniaespp DB –
03 bởi vì chỉ số bệnh càng lớn chứng tỏ cây càng bị tổn thương do sự xâm nhiễm và phát sinh gây hại của tác nhân gây bệnh đối với cây ký chủ Khả năng kiểm soát sự gây hại củaBacillusspp S20D12 có diễn biến chậm hơn trongkỳđiều tra 7 ngày sau lây nhiễm nhưng tỷ lệ chết cây con là thấp nhất trong các kỳ điều tra 14 ngày và 21 ngày sau lâynhiễm.
Kết quả nghiên cứu này cũng được đánh giá là tương ứng với thí nghiệm trong điềukiệninvitro,khảnănghạnchếsựpháttriểnsợinấmD.bryoniaeh a yhiệusuấtđối kháng của các vi khuẩnBacillusspp S20D12 không đạt hiệu quả cao trongkỳđiều tra sớm, nhưng khả năng đối kháng tăng mạnh ở các kỳ điều tra tiếp theo Như vậy, có thể thấy khi xử lý vi khuẩn đã làm hạn chế bệnh hại trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm bệnh thông qua việc làm hạn chế tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh và tỷ lệ chết cây Các chủngvi khuẩnBacillusspp S13F1, S18F11 và S20D12 là những chủng vi khuẩn có nguồn gốc từgốcthâncâylạc.Ởcấpđộloài,cácchủngBacillusspp.S1F3vàS20D12thuộccùng một nhánh với các chủng tham chiếuB amyloliquefaciensFZB42, trong khi chủngBacillusspp.S18F11 cù ng hệthamchiếuvớitậphợpcác v i khuẩnBacillus subtilis
(Hình 3.16) (Le và cs, 2018) [114].DựatrêncâyphátsinhloàicủacácchủngvikhuẩnBacillusnhận thấy,Bacillusspp.S20D12vàBacillusspp S1F3cómối quanhệgần, cùng hệ thamchiếu,cóthểlýgiảiđược phầnnàomứcđộtươngđồngvềkhả năng kiểm soátsựphát triển nấmD.bryoniaetrongđiềukiệninvitrovànhà lướiđãthựchiệnởnghiêncứunày.
Hình 3.16Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ của các chủng vi khuẩnBacillus spp S1F3, S18F11, S20D12. Độ dài nhánh biểu thị tỷ lệ phần trăm của sự khác biệt về trình tự và các số tại các nút biểu thị giá trị bootstrap (Le và cs, 2018) [102].
Nhiều loài vi khuẩnBacillusphổ biến với các hoạt động kiểm soát các tác nhân gây bệnh hại thực vật là nấm (Ongena và Jacques, 2008; Raaijmakers và cs, 2009; Raaijmakersvàcs,2010)[136,145,146].Bằngcáchtậndụngcácchấtdinhdưỡngđược giải phóng liên tục từ rễ hoặc lá của cây đang phát triển, các chủng vi khuẩn có lợi sẽ xâm chiếm bề mặt lá, hệ thống rễ và lớp đất xung quanh chúng một cách hiệu quả Đổi lại, chúng tác động có lợi đến cây trồng bằng cách bảo vệ cây khỏi bị nhiễm mầm bệnh thựcvậtthôngquabacơchếchính: [1]Cạnhtranhkhônggiansốngvàchấtdinhdưỡng;
[2] Ức chế tác nhân gây bệnh hại cây trồng bằng cách sản xuất các chất độc thực vật(allelochemical); [3] Kích thích tính kháng hệ thống ở cây trồng (Cawoy và cs, 2011)[54].
HIỆU QUẢ HẠN CHẾ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA DO NẤMDidymellabryoniaeCỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp ĐIỀU KIỆN NGOÀI ĐỒNGRUỘNG
Trong thí nghiệm này, một số chủng vi khuẩnBacillusspp được nhân nuôi tạo chếphẩmtạmthờivàsửdụngchocâydưahấu.Việctạochếphẩmtạmthờinhằmthuận lợi cho việc triển khai thí nghiệm ngoài đồng ruộng Trong điều kiện tự nhiên, dưới tác độngcủađiềukiệnngoạicảnhbiếnđộng,hiệuquảtácđộngcủavikhuẩncóíchlêncây trồngcũngcósựthayđổi.Trongphạmvinghiêncứu,cácthínghiệmđánhgiáhiệuquả khảnănghạnchếbệnhtrêncâydưahấuđượcbốtríthựchiệntạivùngbánsơnđịahuyện đồng bằng (xã Hòa Hội, huyện Phú Hòa) vào vụ Đông Xuân 2021 - 2022 Đây cũng là vùng sinh thái thu thập được mẫu nấm bệnhD bryoniaespp DB – 03 Đồng thời, xã HòaHộithuộchuyệnPhúHòalàđịaphươngtrồngdưatrọngđiểmtạiPhúYêncóvùng trồng dưa hấu chuyên dành cho thị trường xuất khẩu với diện tích hơn 50ha Do đó, tại địa điểm biis trí thí nghiệm có điều kiện ngoại cảnh, tập quán canh tác và hệ vi sinh vật tồnlưutrongđấttươngđốiđadạng.NguồnbệnhnấmD.bryoniaelàtácnhângâybệnh nứt thân chảy nhựa ở cây dưa hấu là có thể tồn tại ở trong đất ở vùng trồng hay tàn dư thực vật Đông Xuân là thời vụ trồng dưa chính ở địa phương và toàn tỉnh, tỷ lệ trồngở vụ Đông Xuân đạttỷlệ cao so với cả năm từ 60,34% trở lên qua theo dõi từ năm 2014 đến2021(Bảng3.1).VụĐôngXuân2021-2022,tìnhhìnhthờitiếttrênđịabàntỉnhkhá thuận lợi trong quá trình sản xuất, đầu vụ không có mưa lớn, giữa vụ thời tiết thuận lợi chocâytrồngsinhtrưởng,pháttriểnbìnhthường,đếncuốivụthờitiếtcómưanhẹ.Các điều kiện này trở thành những yếu tố ngẫu nhiên ảnh hưởng đến hiệu quả tác động của các chủng vi khuẩnBacillusspp đến khả năng kiểm soát bệnh gây hại cây dưa hấu nói chungvàbệnhnứtthânchảynhựadonấmD.bryoniaenóiriêngởđiềukiệnngoàiđồng ruộng.
Trong nghiên cứu này, có ba thời điểm theo dõi tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh ở 10,
20 và 30 ngày sau khi trồng, tương ứng với việc quan sát diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựatrêncâydưahấungoàiđồngruộngvàocácgiaiđoạnsinhtrưởngvàpháttriểncủa cây khi xử lý bằng chế phẩm sinh học tạm thời Sau khi trồng 10 ngày, đây là giaiđoạn cây con, thực hiện bón thúc lần 1 Sau khi trồng 20 ngày là giai đoạn cây tăng trưởng mạnh về thể chất, chuẩn bị chuyển tiếp ra hoa Sau khi trồng 30 ngày, đây là giai đoạn rahoa,đánhgiátỷlệhoađực/cáilàyếutốquantrọngđểcấuthànhnăngsuất.Trongthí nghiệm này, không thực hiện đánh giá hiệu quả của vi khuẩnBacillusspp trong giai đoạnđậuquả,bởidothínghiệmngoàisựthụphấnđượcthựchiệnbởicácloàicôntrùng ngoài tự nhiên còn được sử dụng biện phápkỹthuật thụ phấn bổ sung bằngtay
Bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD bryoniaegây ra thường gây tác hại chính ở lá, thân và vị trí thân gần gốc của cây dưa hấu Bệnh làm cho lá sớm lụi tàn, dễ rụng, nhất là trong điều kiện ngoại cảnh thích hợp Nguồn bệnh gây nứt thân chảy nhựa nằm trongđất,tàndưcủacâybịbệnh.Khibịmuộnlàmhéodây,chếtcây.Nhìnchung,bệnh nứtthânchảynhựagâyhạiphổbiếntrênđồngruộng,xuấthiệnởtấtcảcácnghiệmthức, cây dưa hấu càng già càng dễ bị nhiễm bệnhn ặ n g
Khisosánhgiữacácnghiệmthứccósửdụngchếphẩmsinhhọctạmthờivớiđối chứngchothấyviệcxửlývớivikhuẩnBacillusđãlàmhạnchếbệnhnứtthânchảynhựa trên đồng ruộng hơn so với đối chứng Ở các kỳ điều tra,tỷlệ bệnh xảy ra ngoài đồng ruộng ở nghiệm thức đối chứng từ 83,32 đến 90,00%, trong khi các nghiệm thức được xử lý bằng chế phẩm sinh học tạm thời thìtỷlệ bệnh từ 56,67 đến 78,34% (Bảng3.20).
Bảng 3.20Tỷ lệ bệnh nứt thân chảy nhựa trong điều kiện xử lý vi khuẩnBacillusspp. ngoài đồng ruộng
Tỷ lệ bệnh (%) của cây dưa hấu sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus spp.
(giai đoạn ra hoa) Đối chứng 85,00 ± 0,00 a 83,34 ± 1,67 a 90,00 ± 0,00 a 1.708,33 ± 16,67 a S1A1 73,34 ± 1,67 b 78,34 ± 1,67 b 75,00 ± 0,00 bc 1.525,00 ± 25,00 b S1F3 61,67 ± 1,67 c 63,34 ± 1,67 de 68,34 ± 1,67 de 1.283,33 ± 16,67 e S13E2 63,34 ± 1,67 c 66,67 ± 1,67 cd 71,67 ± 1,67 cd 1.341,67 ± 16,67 d S13E3 70,00 ± 0,00 b 70,00 ± 0,00 c 78,34 ± 3,34 b 1.441,67 ± 16,67 c S18F11 71,67 ± 1,67 b 61,67 ± 1,67 e 56,67 ± 1,67 f 1.258,34 ± 22,04 e S20D12 61,67 ± 1,67 c 56,67 ± 1,67 f 63,34 ± 3,34 e 1.191,67 ± 8,33 f
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy mức độ khác biệt giữa các nghiệm thức sử dụng các chủng vi khuẩnBacilluskhác nhau có sự khác biệt rõ ràng Tạikỳđiều tra 10 ngàysaukhitrồng,tỷlệbệnhởcácnghiệmthứcmặcdùcósựkhácbiệtrõràng,nhưng sựchênhlệchtỷlệkhôngcao,tỷlệbệnhtừ61,67đến73,34%.Sau2lầnbónthúccóbổ sung chế phẩm sinh học tạm thời vào thời điểm 10 và 25 ngày sau trồng, tác dụng của vi khuẩnBacillustrong hiệu quả hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa đã thể hiện rõ rệt ở haikỳđiều tra tiếp theo (Bảng 3.20).Tỷlệ bệnh tăng nhẹ ở kỳ điều tra 20 và 30ngàysau trồng, mặc dù trong các giai đoạn này cây càng lớn bệnh càng gây hại nặng vàđiều kiện thời tiết giữa và cuối vụ Đông Xuân có mưa nhẹ, thuận lợi cho nấm gây bệnh phát triển Cũng trong giai đoạn này, sự chênh lệchtỷlệ bệnh giữa các nghiệm thức có sự phânnhómrõràng,hiệuquảhạnchếbệnhtốtnhấtởcácnghiệmthứcsửdụngvikhuẩnBacillusspp. S18F11, S20D12 và S1F3 Nhìn chung, chế phẩm sử dụng vi khuẩnBacillusspp. S20D12 hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa tốt hơn so với đối chứng vàcác chủng vi khuẩnkhác.
Trongnghiêncứunày,tỷlệcâybịbệnhhaychỉsốbệnhnứtthânchảynhựađược ghinhậnvàocácthờiđiểm10,20và30ngàysaukhitrồngđượcdùngđểxácđịnhvùng giới hạn đường cong diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựa (AUDPC) để so sánh hiệu quả việc bổ sung dịch bào tử vikhuẩn.
Bảng 3.21Chỉ số bệnh nứt thân chảy nhựa trong điều kiện xử lý vi khuẩnBacillus spp ngoài đồng ruộng theo thời gian
AUDPC Đối chứng 27,34 ± 0,34 ab 57,67 ± 1,34 a 77,34 ± 0,67 a 1.100,00 ± 17,56 a S1A1 25,34 ± 0,88 b 56,00 ± 1,85 a 52,34 ± 0,34 b 955,00 ± 15,28 b S1F3 17,00 ± 0,00 d 38,34 ± 1,85 c 46,00 ± 1,00 cd 698,33 ± 22,05 e S13E2 28,34 ± 0,88 a 42,67 ± 0,88 bc 46,67 ± 1,20 c 801,67 ± 8,34 d S13E3 29,34 ± 0,88 a 46,00 ± 2,51 b 53,67 ± 3,28 b 875,00 ± 36,17 c S18F11 25,34 ± 0,33 b 44,67 ± 1,67 b 44,00 ± 1,73 cd 793,34 ± 26,19 d S20D12 21,00 ± 1,00 c 42,67 ± 2,34 bc 41,00 ± 1,73 d 733,34 ± 26,03 de
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Chỉ số bệnh của cây dưa hấu ngoài đồng ruộng khá cao, và cao hơn so với các nghiêncứuđượcthựchiệntrongnhàlưới.Ởkỳđiềutra10và20ngàysautrồng,nghiệm thứcsửdụngchếphẩmsinhhọctạmthờicónguồngốctừchủngvikhuẩnBacillusspp S1F3 đã phát huy vai trò hạn chế bệnh nứt thân trên đồng ruộng ngay từ giai đoạn này, chỉ số bệnh thấp nhất (17,00% điều tra lần 1 và 38,34% điều tra lần 2) so với tất cảcácnghiệmthứccònlại.CácnghiệmthứcsửdụngcácchủngvikhuẩnBacillusspp.S13E2,
S13E3,S18F11vàS20D12chỉsốbệnhmặcdùsựkhácbiệtcóýnghĩavềmặtthốngkê nhưngkhôngchênhlệchnhiều.Ởkỳđiềutra30ngàysautrồng,chỉsốbệnhcủacây được xử lý với vi khuẩnBacillusspp S20D12, S18F11 và S1F3 lần lượt là 41,00%, 44,00% và 46,00% thấp hơn so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại (Bảng 3.21).
DựatrênchỉsốAUDPCdựatrêntỷlệbệnhđượcthểhiệntạiBảng3.20chothấy, nghiệm thức bổ sung vi khuẩnBacillusspp S20D12 có giá trị AUDPC thấp nhất (1.191,67) so với đối chứng (1.708,3) và các nghiệm thức còn lại (1.258,34 đến 1.525) Đồng thời, chỉ số AUDPC dựa trên chỉ số bệnh được thể hiện tại Bảng 3.21 cho thấy, nghiệm thức bổ sung vi khuẩnBacillusspp S1F3 hay S20D12 có giá trị AUDPC thấp nhất(698,33hay733,34),saisốgiữahainghiệmthứcnàykhôngkhácbiệtvềmặtthống kê, thấp hơn so với đối chứng (1.100) và các nghiệm thức còn lại (793,34 đến955).
Ghi chú: TLB: Tỷ lệ bệnh; CSB: Chỉ số bệnh
Hình 3.17Vùng giới hạn đường cong diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu (AUDPC) ở các nghiệm thức sử dụng vi khuẩnBacillusspp.
BiểuđồthểhiệngiátrịAUDPCgiữacácnghiệmthứcsửdụngbổsungcácchủng vi khuẩnBacillusspp So với đối chứng (nước cất) cho thấy rõ hiệu quả của việc sử dụngvikhuẩncóíchchủngBacillusspp.S20D12hayBacillusspp.S1F3manglạihiệu quảtrongviệchạnchếbệnhnứtthânchảynhựavớicâydưahấuởđiềukiệnđồngruộng (Hình 3.17). Kết quả này cũng tương ứng với nghiên cứu đánh giá khả năng hạn chế bệnhnứtthânchảynhựatrongnhàlướivàcácnghiêncứuđãđượcthựchiệntrongđiều kiệnin vitrotrướcđó.
Các vi khuẩn đất ức chế sự phát triển của mầm bệnh thực vật và hoặc giảmtỷlệ mắcbệnhbằngcáccơchếkhácnhau,giúpsựpháttriểncủacâytrồng.CơchếISR(kích thích tính khánghệthống khángởcây trồng)là một cơ chế quan trọng để vi khuẩn có ích thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) tăng cường khả năng phòng vệ chống lạicác mầmbệnh.Trạngtháikhángcựnàyđượcđặctrưngbởisựkíchhoạtcủaphảnứngphòng vệtiềmẩncủacâytrồngkhicótháchthứcmầmbệnhkhôngchỉởvịtrícảmứngmàcòn một cách có hệ thống trong các bộ phận của cây trồng và được tách biệt về mặt không gianvớichấtcảmứng(Pietersevàcs,2014)[142].Tínhkhánghệthốngbắtđầukhicác phân tử kích thích (elicitor) được nhận diện bởi các phân tử thụ thể của tế bào thực vật Các phân tử thụ thể có thể ở trên màng hoặc nằm trong tế bào chất của tế bào thực vật Trong hầu hết trường hợp, thụ thể trên màng là tín hiệu nhận biết đầu tiên đối với các elicitorbắtnguồntừnguồnbệnh.Saukhicácphântửthụthểnhậnbiếtđượccáctínhiệu đến từ mầm bệnh, chúng sẽ kích hoạt các phân tử truyền tín hiệu để tạo ra phản ứng kháng hệ thống của thựcvật.
TrongtrườnghợpcâydưahấuđượcxửlývớidịchbàotửvikhuẩnBacillusngoài động ruộng, có thể giả thuyết rằng phản ứng ban đầu củacâydưa hấu đối với sự xâm nhập của Bacillusgiống như phản ứng với mầm bệnh, nhưng hệ thống miễn dịch thực vậtbịứcchếkhitínhiệucộngsinhbịkhởixướng(Santosvàcs,2009)[154].Trongcây dưa hấu, ở giai đoạn đầu của sự tương tác với vi khuẩnBacillusspp phụ thuộc vào các phân tử tín hiệu từ chồi như các hoạt chất thứ cấp tham gia vào phản ứng của thực vật chống lại mầm bệnh Vì vậy, sự tương tác giữa các con đường truyền tín hiệu liên quan đếnphảnứngbảovệthựcvậtvànhữngconđườngdoBacillusgâyracóthểđượccholà sẽ tác động đến sự tương tác giữa mầm bệnhD bryoniaevà cây dưa hấu Điều này đã giảithíchđượccácchủngvikhuẩnBacillusspp.thamgiatrongnghiêncứucókhảnăng kiểmsoátsựxâmnhiễmcủanấmD.bryoniaegâybệnhnứtthânchảynhựatrêncâydưa hấu có hiệu quả ở đồng ruộng.
KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp TRONG ĐIỀU KIỆNINVITRO
Sự nẩy mầm là toàn bộ các quá trình bắt đầu từ sự tái thu nước của hạt đến sự lú rễmầmrakhỏihạt.Cácđặctínhquantrọngnhấtcủasựnảymầmlà:hấpthunướcmạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh và phát sinh nhiệt mạnh (Bùi trang Việt, 2020) [34] Sựnảy mầm theo đúng nghĩa hẹp thường được xem như hoàn thành khi rễ mầm lú ra khỏi các vỏhột(1– 2mm).Giaiđoạntăngtrưởngcủacâymầm,hạtthuthêmnướcvàtăngcường độ hô hấp, tương ứng với sự tăng trưởng đáng kể của rễ mầm và thân mầm (Bùi Trang Việt, 2020) [34] Sự nẩy mầm của hạt giống được cải thiện có thể liên quan đến khả năng hạn chế một số bệnh hại có nguồn gốc từ hạt giống trong quá trình theo dõi tỷ lệ nảymầm.Bêncạnhđó,mộtsốvikhuẩncóthểliênquantrựctiếpđếnthúcđẩyquátrình mọcmầmthôngquaquátrìnhkíchthíchsinhtrưởngcủacâygiúpcâynhanhchóngvượt quagiaiđoạnmẫncảmvớicácnhómnguyênnhângâybệnhhoặckíchthíchtínhkháng hệ thống của cây trồng chống lại các nguyên nhân gâybệnh.
Tỷlệnẩymầmliênquanđếnchấtlượnghạtgiống,thờitiếtkhíhậukhigieotrồng và sự phá hoại của các đối tượng sinh vật gây hại trong quá trìnhnẩymầm và mọc lên từ đất Trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, các yếu tố nước, nhiệt độ 25 ± 2 o C, ẩm độ 80 ± 0,2% và cường độ chiếu sáng 2000 ± 200 lux (12/24 giờ) được bố trí đồng đều giữa các nghiệmthức.
Bảng 3.22Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩnBacillusspp đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt dưa hấu
Chủng vi khuẩn Tỷ lệ nẩy mầm (%) của hạt dưa hấu theo thời gian
2 ngày 3 ngày 4 ngày Đối chứng (nước cất) 23,33 ± 3,34 c 76,67 ± 3,34 b 80,00 ± 0,00 b
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Quan sát thực tế quá trình nẩy mầm của hạt dưa hấu, sự nẩy mầm được ghinhận khi rễ mầm lú ra khỏi các vỏ hạt (1 – 2mm) vào ngày thứ 2 sau khi gieo diễn ra ở tất cả các nghiệm thức Các hạt giống dưa hấu được xử lý với dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S20D12 nẩy mầm sớm nhất vàtỷlệ nảy mầm cao nhất 43,33%, thấp nhất là đối chứng (nước cất) 23,33%, hạt giống được xử lý với dịch bào tử các chủng vi khuẩnBacillusspp.kháckhôngcósựkhácbiệtđángkể(Bảng3.22).Nhữngngàytiếptheosự nảymầmtiếptụcdiễnra,tỷlệnảymầmởcácnghiệmthứcđềucaohơnsovớiđốichứng (nước cất) Các vi sinh vật có ích có thể kích thích khả năngnảymầm của hạt giống thông qua quá trình trao đổi chất hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây chết mầm, chết cây từ đó làm chotỷlệ mọc tăng lên (Raaijmakers, 2009) [145] Điều này có nghĩa các chủng vi khuẩn có ích giải phóng các hoạt chất điều hòa tăng trưởng thực vật (CĐHTTTV) có tác dụng kích thích sự nảy mầm của hạt dưahấu.
Vàongàythứ3saukhigieo,tỷlệnảymầmtăngnhanhởcácnghiệmthức.Trong đó hạt giống được xử lý với dịch bào tử các chủng vi khuẩnBacillusspp S1F1 vàS20D12cótỷlệnảymầmcaonhất,giữacácnghiệmthứcxửlýbằngdịchbàotửBacillusspp.S12E2,S13E3vàS18F11thìtỷlệnảymầmcủahạtkhôngcósựkhácbiệt.Nguyên nhân chủng vi khuẩnBacillusspp S1F1 và S20D12 làm tăngtỷlệ nảy mầm của hạt giốngcóthểliênquanđếnkhảnănghạnchếbệnhhạicónguồngốctừhạtgiống.Những kết nghiên cứu về khả năng kích thích khả năng nảy mầm của hạt giống bởi một số vi khuẩn có ích cũng đã được một số tác giả công bố như: Khả năng kích thích nảy mầm hạt cà chua tăng 8,3% do vi khuẩnBacillusHBR7 (Arawal và cs, 2013); khả năng kích thích nảy mầm của hạt lạc (Ricksen,2011).
Ngàythứ4saukhigieohạt,tỷlệnảymầmtăngnhẹởcácnghiệmthức,100%số hạtđượcxửlýbằngdịchbàotửBacillusspp.S20D12vàBacillusspp.S1F3lúrễmầm (Bảng 3.22) Sự nảy mầm vàtỷlệ mọc của một số loại cây rau khi xử lý với chủng vi khuẩnBacillusspp S20D12 cũng cho kết quả tương tự (Lê Như Cương, 2015)[5].
Một số nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn có ích có thể làm tăngtỷlệ nảy mầm và mọc mầm của một số loại cây trồng Nghiên cứu của Arawal và cs (2013) cho thấy chủngvikhuẩnchủngBacillusHBR7làmtăngtỷlệnảymầmcàchua8,3%;nghiêncứu Girish và Umesha (2005), Mishra và cs (2010), Ibiene và cs (2012) chothấyvi khuẩnBacilluscó khả năng kích thích sinh trưởng ở vùng rễ, làm tăngtỷlệ nảy mầm và sức nảy mầm của cây cà chua; nghiên cứu của Lim JH và Kim SD (2009), Cezón và cs (2003) cho thâấy một số chủng vi khuẩn làm tăngtỷlệ nảy mầm và mọc mầm của ớt; nghiên cứu của Lê Như Cương và cs (2015) chủng vi khuẩnBacillusspp S18F11 và S13E2kíchthíchtỷlệnảymầmvàmọcmầmcủacảixanh;chủngBacillusspp.S20D12 làmtăngtỷlệnảymầmớtvàtỷlệmọcởcâycàchua(LêNhưCươngvàcs,2014;2015; 2018; 2021) [4; 5; 31;32].
Giaiđoạntăngtrưởngcủacâymầmtươngứngvớisựtăngtrưởngcủarễmầmvà thânmầm.Hoạttínhbiếndưỡngcủacâymầm(từphôi)tăngmạnh,nhưnghoạttínhbiến dưỡng của mô dự trữ (tử diệp) giảm mạnh, các chất dự trữ cạn dần Ngay lúc đó,câymầmhấpthunướcvàcácchấtkhoángnhanhchóng,cácdiệplạpphânhóatrongtửdiệp hay lá non, cây mầm trở nên tự dưỡng (Bùi Trang Việt, 2020) [34] Chiều dài rễ mẫm và chiều dài thân mầm được ghi nhận vào ngày thứ 7 sau khi gieohạt. Ở hạt giống dưa hấu, việc xử lý hạt với dung dịch bào tử một số chủng vi khuẩn thuộccácchủngvikhuẩnBacillusspp.đãthúcđẩygiaiđoạnnảymầmcủahạtsớmhơn và kích thích sự tăng trưởng của cây mầm bằng cách tăng cường sự kéo dài rễ mầm và thân mầm Hạt được xử lý với dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S20D12hayBacillusspp S1F3 sự kéo dài rễ mầm (54,50 – 56,40mm) và thân mầm (69,00 – 70,17mm) đạt hiệu quả cao nhất.Hạt được xử lý với nước cất hay dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S1A1 sự kéo dài rễ mầm (46,00 – 47,00mm) và thân mầm (55,20mm) kém nhất Hạt dưahấuđượcxửlývớidịchbàotửvikhuẩnBacillusspp.S13E2,S13E3hayS18F11 đã kéo dài rễ mầm (48,80 – 50,80mm) và thân mầm (60,40 – 62,40mm) không có sự khác biệt (Bảng 3.23, Hình 3.18).
Bảng3.23ẢnhhưởngcủaxửlýdịchbàotửmộtsốchủngvikhuẩnBacillusspp đến chiều dài thân mầm và rễ cây dưa hấu (106CFU/ml)
Chủng vi khuẩn Chiều dài rễ mầm (mm) Chiều dài thân mầm (mm) Đối chứng (nước cất) 47,00 ± 0,54 cd 55,20 ± 0,37 c
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Bacillusspp S13E3 (trên) S1A1 (dưới) Bacillusspp S13E2 (trên) S1F3 (dưới)
Hình 3.18Ảnh hưởng của dịch bào tử một số chủng vi khuẩnBacillusspp.đếnsự nẩy mầm của hạt dưa hấu
KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY DƯA HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀLƯỚI 98
Mỗi một cá thể sinh vật đều trải qua một chu trình phát triển hay chu trình sống. Mỗi chu trình phát triển gồm nhiều giai đoạn nối tiếp nhau, theo một trình tự nhất định không thể đảo ngược Phát triển chỉ những thay đổi của mô, tế bào thực vật hay các bộ phận của cây từ lúc khởi đầu cho tới lúc trưởng thành Nếu chọn điểm khởi đầu trong sự phát triển thực vật là “sự nảy mầm của hạt”, trong điều kiện môi trường thích hợp (nhiệt độ, nước, oxy) sự nẩy mầm sẽ cho cây mầm từ phôi trong hạt “Sự mọc” là giai đoạntiếptheotrongquátrìnhpháttriểncủathựcvật,câymầmtăngtrưởngđểthànhcâytrưởng thành mang hoa và trái.
Tỷ lệ mọc của cây phụ thuộc vào giống và các yếu tố ngoại cảnh Vi khuẩn có íchcóthểkíchthíchkhảnăngmọcmầmnhưlàmtăngtốcđộmọchaytỷlệmọccủacây (Hayat và cs, 2010) [91] Để đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩnBacillusspp đến tỷ lệ mọc, các nghiệm thức được bố trí trong cùng một điều kiện nhà lưới nhiệt độ 25 ± 2 o C, độ ẩm
80 ± 0,2% Kết quả nghiên cứu cho thấy,tỷlệ mọc của hạt giống khi được xử lý với dịch bào tử vi khuẩn luôn có tỷ lệ mọc cao hơn so với đối chứng (nước cất) sau các ngày theo dõi Như vậy, vi khuẩn đã làm tăngtỷlệ mọc và tốc độ mọc của cây, trong đó hạt giống được xử lý với dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S20D12 cho kết quả tốt hơn so với các nghiệm thức khác (Bảng3.24).
Bảng 3.24Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩnBacillusspp đến tỷ lệ mọc của cây dưa hấu (106 CFU/ml)
Chủng vi khuẩn Tỷ lệ mọc (%) của cây dưa hấu theo thời gian
7 ngày 10 ngày 14 ngày Đối chứng (nước cất) 52,00 ± 2,00 c 54,00 ± 2,45 c 66,00 ± 2,45 c
Trung bình trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Tại thời điểm 7 ngày sau gieo hạt, hơn 50% số hạt giống đều mọc ở tất cả các nghiệmthức,hạtgiốngđượcxửlývớidịchbàotửvikhuẩncótỷlệmọc55–64%cao hơn so với đối chứng (nước cất) Hạt giống sau khi ngâm ủ để gieo vào bầu ươm đã có rễ mầm từ 1 – 2mm, cây mọc sau 7 ngày có 2 lá mầm và 1 lá thật Nguyên nhân làm tăngtỷlệmọcmầmcủacâydưahấubởiviệcxửlýhạtbằngdịchvikhuẩncóíchcóthể liên quan đến khả năng các CĐTTTV trong dịch bào tử vi khuẩn đã kích thích sự sinh trưởng của cây, tương tự như giai đoạn nẩy mầm, nhưng không có sự khác biệt nhiều giữa các nghiệm thức xử lý ở giai đoạnnày.
Tạithờiđiểm10–14ngàysaugieo,tỷlệmọcởcácnghiệmthứcxửlýbằngdịch bào tử vi khuẩn bắt đầu thay đổi đáng kể so với quan sát trước đó,tỷlệ mọc ở nghiệm thứcđốichứngchỉtăngnhẹvàthấpnhất.TỷlệmọcởnghiệmthứcxửlýbằngvikhuẩnBacillusspp.S20D12 cao nhất Chủng vi khuẩnBacillusspp S1F3 cũng cho kết quả tốt Các nghiên cứu khác cũng cho thấy vi khuẩnBacilluscó khả năng làm tăngtỷlệ mọc và hạn chế bệnh chết rạp cây con Ở giai đoạn này, cây có 4 – 5 lá thật, rễ đã bao phủ kín bầu,thân chắc khỏe (Lê Như Cương, 2019b) [116] Các loài vi khuẩn có íchcó thể liên quan đến hạn chế các tác nhân gây thối mầm với các nguồn bệnh nằm ở hạt giống bị nhiễm bệnh hoặc nằm trong đất Các tác nhân sinh học này có thể tiêu diệt các nguồn bệnh hoặc kích thích làm chotỷlệ mọc tăng lên Kết quả nghiên cứu một số chủng vi khuẩn cũng cho thấy chế phẩm vi khuẩnBacilluscó khả năng làm tăngtỷlệ mọc và hạn chế bệnh chết rạp cây con (Lê Như Cương và cs, 2014; Lê Như Cương, 2015) [4,5].
HIỆU QUẢ KÍCH THÍCH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp Ở ĐIỀU KIỆN ĐỒNG RUỘNG .99 1 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩnBacillusspp đến chiều dài cây dưahấu99
(giaiđoạngiatăngkíchthướccủathựcvậtsausựnảymầmcủahột)và“pháttriển”(giai đoạn cho hoa, trái và hột) Sự tăng trưởng là phân chia tế bào và gia tăng không hoàn nghịch về kích thước (chiều dài, chiều rộng, diện tích) hay trọng lượng (tươi hay khô) Sự tăng trưởng thường chỉ các biến đổi xảy ra ở cơ quan dinh dưỡng (rễ, thân lá) Sự phát triển dùng để chỉ ra các biến đổi về chất quan trọng như sự chuyển tiếp ra hoa, tạo trái và hột Chiều cao cây ngoài phụ thuộc vào chất lượng giống trồng còn phụ thuộc vào các yếu tố ngoại cảnh như chế độ chăm sóc, điều kiện môi trường, hàm lượng dinh dưỡng bổ sung và ảnh hưởng của vi sinhvật.
Hạt giốngkhi gieo vào bầu ươmcó rễmầm dàikhoảng 2mm.Sau7 ngàygieohạt,câymọc,có2lámầmvà1láthật.Phundịchbàotửvikhuẩnlầnthứ1lênbềmặtđấtquan h gốccâymầm sau 10ngàygieohạt, lần thứ2sau25 ngàygieo hạt.Câycon14 ngàysaugieocó4–5láthật,rễbénkínbầuươm.Nhữngcâyconkhỏevàcósứcsốngđồngđều được chọn lựatrồngvào chậu nhựa đểcáccâycon đạt độđồngnhấtởtấtcả cácnghiệmthức.Hailầnphundịchbàotửchocâyđượcxemnhưbổsungchấtdinhdưỡngngoạisin hchocâykíchthíchsựnẩymầmvàtăngtrưởng.Rễmầmtiếpthuchấtdinhdưỡng,tíchtụvàchuyểnh óathànhcáchoạtchấtnộisinhcầnthiếtchoquátrìnhtăngtrưởngrễ,thân,lácủacâyvàchuẩnbịchog iaiđoạnchuyểntiếprahoavàhìnhthànhtrái.
Bảng 3.25Ảnh hưởng dịch bào tử một số chủng vi khuẩnBacillusspp đến chiều dài cây dưa hấu ngoài đồng ruộng
Chiều dài thân chính (cm)
(giai tăng trưởng và chuyển tiếp ra hoa)
(giai đoạn ra hoa) Đối chứng (nước cất) 15,50 ± 0,31 d 46,40 ± 0,24 d 113,20 ± 0,58 e
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Kết quả nghiên cứu cho thấy các nghiệm thức sử dụng chế phẩm sinh học tạm thời có nguồn gốc từ vi khuẩnBacillusspp đều làm gia tăng chiều dài cây ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng gồm: giai đoạn cây con (16,24 đến 18,84cm) so với đối chứng (15,20cm), giai đoạn tăng trưởng, chuyển tiếp ra hoa (45,40 đến 58,00cm) so với đối chứng (46,40cm) và giai đoạn ra hoa (117,40 đến 121,20cm) so với đối chứng (113,20cm) (Bảng 3.25) Các chế phẩm sử dụng vi khuẩnBacillusspp S1F3, S13E2, S13E3vàS20D12làmtăngchiềudàicâyvượttrộiởcácgiaiđoạncâyconvàgiaiđoạn tăngtrưởng,chuyểntiếprahoa;Bacillusspp.S13E2,S13E3vàS20D12làmtăngchiều cao giai đoạn ra hoa;Bacillusspp S1A1 làm chiều dài cây tăng đều qua các giai đoạn và cao hơn so với đối chứng;Bacillusspp S18F11 không hiệu quả tăng chiều cao cây so với đối chứng ở giai đoạn chuyển tiếp ra hoa và ra hoa (Bảng3.25).
Chiều cao cây là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng tăng trưởng của cây khi tác động của biện pháp kỹ thuật hay thay đổi nguồn dinh dưỡng bổ sungchocây.NghiêncứucủaLêNhưCươngvàNguyễnXuânVũ(2014)[4]khixửlý vi khuẩn có ích vùng rễ ở giống lạc Dù Tây Nguyên cho thấy bón chế phẩm vi khuẩnBacillussp. S20D12 làm tăng chiều dài cành cấp 1 đầu tiên hơn so với đối chứng.Haynghiên cứu khác của Lê Như Cương và Nguyễn Quảng Quân (2016) [6] cho thấy các công thức có xử lý chế phẩmBacillusspp BaD-S20D12 ở giống lạc L14 cho tổngsốcành/cây nhiều hơn và chiều dài cành cấp 1 dài hơn so với các công thức còn lại và đối chứng trên vùng đất cát Điều này cho thấy khả năng kích thích sinh trưởng của chủng vi khuẩnBacillusspp S20D12 đạt hiệu quả đối với một vài cây trồng mà các nghiên cứuđãthựchiện.Kếtquảnghiêncứuvềchiềucaocâydướisựảnhhưởngcủacácchủng vi khuẩn có khả năng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng liên quan đến khả năng sinhtổnghợpcácchấtđiềuhòatăngtrưởngthựcvậtdẫnđếnkhảnăngpháttriểnvềmặt hìnhtháicủacâytrồng.Nghiêncứukhácvềhoạtchấtsinhhọcchothấyvikhuẩncóthể sảnsinhcáchoạtchấtkhángnấm,hạnchếtáchạicủatácnhângâybệnhlàmảnhhưởng đếnsứckhỏecâytrồng.Việchạnchếnấmbệnhcũnggópphầngiúpchocâysinhtrưởng tốt hơn Cần xác định một số hoạt chất điều hòa tăng trưởng thực vật hiện diện trong dịch bào tử của chủng vi khuẩn có vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ ở giai đoạn cây con, giúp cho cây sinh trưởng tốt ở các giai đoạn phát triển tiếptheo.
Sốlátrêncâyliênquanđếntìnhhìnhsinhtrưởngvàpháttriểncủacây.Sốlátrên thânchínhphụthuộcvàochiềucaocây,khảnăngralálàtuổithọcủalá.Dướitácđộng của vi khuẩn có ích đã làm chiều cao cây dưa hấu cao hơn so với đối chứng, tăng số lá trên cây so với đốichứng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, một số nghiệm thức sử dụng chế phẩm sinh học tạm thời có nguồn gốc từ vi khuẩnBacilluscây dưa hấu có số lá trên thân chính nhiều hơn so với cây đối chứng và các nghiệm thức còn lại Ở giai đoạn cây con, các nghiệm thức sử dụngBacillusspp S1F3, S13E2, S13E3 và S20D12 cósốlá trên thân chính nhiềuhơn(3,73đến4,33lá)sovớiđốichứngvànghiệmthứcbổsungBacillusspp.S1A1vàS18F11 (3,33đến3,40lá).Ởgiaiđoạn tăngtrưởngvàchuyểntiếprahoa,tất cả cácnghiệmthức sử dụng vi khuẩnBacillusspp đều cósốlátrên thân chínhnhiều hơn(6,87đến8,33lá)sovớiđốichứng(6,27lá).Ởgiaiđoạnrahoa,nghiệmthứcBacillusspp.S1F3 vàS20D12cósốlá nhiềunhất (15,87đến 17,60lá),nghiệm thứcBacillusspp. S1A1vàS18F11có số lá nhiều hơn(14,80lá)so vớicác nghiệm thức cònhayđốichứng ((14,20đến14,73lá)
(Bảng3.26).Nhìnchung,chủngvikhuẩnBacillusspp.S1F3vàS20D12làmtăngsốlượnglátrênth ânchínhquacáckỳđiềutravàcaonhất,cácchủngvikhuẩnBacillusspp S13E2,
S13E3vàS18F11chỉtậptrunggiatăngsốlá trên thânchínhởgiaiđoạncâyconvàgiaiđoạntăngtrưởng,chuyểntiếprahoahơnsovớiđốichứng,chủ ngBacillusspp.S1A1khônglàmtăngsốlánhiềuhơnsovớiđốichứng(Bảng3.26).
Bảng 3.26Số lá trên thân chính cây dưa hấu được xử lý với dịch bào tử một số chủng vi khuẩnBacillusspp (106 CFU/mL) theo thời gian
Số lá trên thân chính
10 NST (giai đoạn cây con)
20 NST (giai đoạn tăng trưởng và chuyển tiếp ra hoa)
30 NST (giai đoạn ra hoa) Đối chứng (nước cất) 3,33 ± 0,06 c 6,27 ± 0,11 e 14,20 ± 0,12 d
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Quansátvềmặthìnhthái,lácủacâydưahấuđượcxửlýbằngdịchhuyềnphùvi khuẩn vi khuẩnBacillusspp S20D12 và S1F3 cũng có chất lượng tốt hơn về màu sắc, độ dày của lá và diện tíchlá.
Hình 3.19Lá của cây dưa hấu được xử lý bằng dịch huyền phù vi khuẩn vi khuẩn
3.9.3 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến đến sự ra hoa của cây dưa hấu
Sự ra hoa (hay sự phát triển hoa) là một bước chuyển quan trọng trong đời sống thựcvật.Sựrahoangoàichịusựảnhhưởngcủacácyếutốtựnhiên(nhiệtđộ,ánhsáng hay siết nước) còn chịu ảnh hưởng của quá trình “tăng trưởng” trước đó của cây trồng, khảnăngchuyểnhóavàdựtrữcácchấtdinhdưỡngcầnthiếtchogiaiđoạn“pháttriển” Ở cây dưa hấu, có sự hiện diện của hoa đực và hoa cái (Hình 3.20, 3.21) Số lượng hoa trêncâyvàtỷlệhoacái/đựctrêncâylàmộttrongnhữngyếutốquantrọngđểcấuthành năng suất của câytrồng.
Bảng 3.27Ảnh hưởng của dịch bào tử một số chủng vi khuẩnBacillusspp đến sự ra hoa trên cây dưa hấu
Chủng vi khuẩn Số hoa đực Số hoa cái Tổng số hoa
Tỷ lệ hoa cái/đực (%) Đối chứng (nước cất) 20,47 ± 0,06 c 5,13 ± 0,06 d 25,60 ± 0,00 e 25,08 ± 0,40 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi cây con được xử lý với dịch bào tử các chủng vikhuẩnchothấyhiệuquảkíchthíchgiữacácchủngvikhuẩnkhácnhau.Hiệuquảkích thích sự “phát triển” thể hiện thông qua kết quả về số hoa vàtỷlệ hoa cái/đực trêncâylà tiền đề để nâng cao năng suất khi thu hoạch Nghiệm thức sử dụng chủng vi khuẩnBacillusspp.S20D12 có tổng số hoa là 36,07 hoa và số lượng hoa cái cao nhất là 8,00 hoa,đồngthờitỷlệsốhoacáivàhoađựccủanghiệmthứcnàycũngđạtgiátrịcaonhất (28,50%)(Bảng 3.27) Điều này chứng tỏ, vi khuẩnBacillusspp S20D12 kích thích khả năng ra hoa, tăng tỷ lệ hoa cái/đực tương đương với tăng khả năng đậu trái, do đó cóthểlựachọnvàgiữđượctráicónăngsuấtvàphẩmchấttráitốt.Cácthínghiệmthực hiện để đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩnBacillusspp đối với việc hạnchế bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu ngoài đồng ruộng đều đạt kết quả cao hơn sovớiđốichứng,hiệuquảtốtnhấtlànhómcácchủngvikhuẩnBacillusspp.S20D12,S18F11 vàS1F3.Đốivớihiệuquảkíchthíchsựsinhtrưởngvàpháttriểncâydưahấu,chếphẩm sử dụng vi khuẩnBacillusspp S20D12 đạt hiệu quả tốt hơncả.
MộtsốkếtquảnghiêncứukháccũngchothấyvikhuẩnBacillusngoàihoạtđộng đối kháng các loại nấm, vi khuẩn gây bệnh với phổ tác động rộng góp phần tăng khả năngkhángbệnhcủacâycòncócókhảnăngkíchthíchsinhtrưởngcâytrồng(Figueredo và cs, 2017; Kumar và cs, 2011) [76, 101] Sở dĩ có kết quả này là do vi khuẩn Bacilluscòn tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phânhủythành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng tốt và tăng sức đề kháng cho cây (Kumar và cs, 2011)[101].
Hình 3.20Sự hiện diện của cụm hoa đực (đỏ) và hoa cái (xanh) trên cây dưa hấu
Hình 3.21Hoa cái (trái) và hoa đực (phải) của cây dưa hấu ngoài đồng ruộng
HOẠT CHẤT LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA HẤU CỦA CHỦNG VI KHUẨNBacillusspp S20D12 105 KẾT LUẬN VÀĐỀNGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu về khả năng kiểm soát sự phát triển của sợi nấmD.Bryoniaespp trong điều kiệnin vitro, khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảynhựa trong điều kiện nhà lưới, đồng ruộng hay khả năng kích thích sự nẩy mầm, gia tăng chiều dài rễ mầm, kéo dài thân mầm của cây dưa hấu trongin vitrovà kích thích sự mọc của cây con,nhậnthấychủngvikhuẩnBacillusspp.S20D12cónhữngsựbiểuhiệnnổibậthơn sovớicácchủngvikhuẩnBacilluscònlạithamgiatrongnghiêncứunàyởkhảnăngđối kháng nấmgâybệnh và kích thích sự tăng trưởng, phát triển cây trồng, đặc biệt đối với nấmD. bryoniaegây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu Do đó, để làm rõ khả năngkíchthíchsựtăngtrưởngvàpháttriểncủacâytrồng,nghiêncứuđãthựchiệnviệc xácđịnhhoạttínhcácchấtđiềuhòatăngtrưởngthựcvật(CĐHTTTV)nộisinhởchủng vi khuẩnBacillusspp S20D12 bằngkỹthuật sắc ký lỏng Ứng dụngkỹthuật sắc ký lỏnghiệunăngcao(HPLC)đãghinhậnđượccáccáctínhiệuvềsựhiệndiệncủaauxin nội sinh (IAA) trong dịch bào tử của vi khuẩnBacillusspp S20D12 Kết quả phân tích cấutrúcbằngphươngphápphổcộnghưởngtừhạtnhân13C-NMR(125MHz,DMSO) và 1H- NMR (500 MHz, DMSO) được trình bày ở Hình 3.22,3.23.
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho tất cả các nguyêntửcarboncómặttrongphântử(Hình3.18).Tínhiệucộnghưởngởvùngtrường yếunhất,vớigiátrịδ9,69−138,03ppm(doảnhhưởngcủahiệuứnganisotropic),có cường độ pic yếu, được gán cho nguyên tử carbon C=O (không mang proton) Kết quả này tương ứng với tín hiệu cộng hưởng từ đối chiếu ở mẫu IAA chuẩn với giá trị δ8,91−138,02ppm.
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho từng kiểu proton có mặt trong phân tử (Hình 3.22) Độ cao đường cong tích phân 1H được gán choprotonH-2doproton,cáctínhiệucộnghưởngởtrườngyếunhấtthuộcvềcácproton ở vòng thơm gắn trực tiếp với nhóm C=O xuất hiện trong vùng trường yếu nhất ở δ=2,94−4,43 ppm, tương ứng với tính hiệu cộng hưởng từ đối chiếu ở mẫu IAA chuẩn vớiđộcaođườngcongtíchphânbằng2Hcógiátrịlàδ=2,08.Nhưvậy,cácsốliệuphổ 1H-NMR và13C-NMR đã được xác nhận cấu trúc của hoạt chất acid indole3-acetic (IAA) được sản xuất bởi vi khuẩnBacillusspp.S20D12.
Mẫu Bacillus spp S20D12 Hình 3.22Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin (IAA) sản sinh bởi vi khuẩnBacillusspp S20D12 được đọc bằng NMR C13
Mẫu Bacillus spp S20D12 Hình 3.23Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin (IAA) sản sinh bởi vi khuẩnBacillusspp S20D12 được đọc bằng NMR 1 – H
Nghiên cứu này đã ghi nhận sự hiện diện của hoạt tính auxin nội sinh trong dịch bàotửvikhuẩnBacillusspp.S20D12,kếtquảthuđượctươngtựvớimộtsốnghiêncứu khác về khả năng sinh IAA của nhóm vi khuẩn vùng rễ của các loại cây trồng như lúa, ớt,càchua,khoaitây,thuốclá,sâm,quếvàcâydượcl i ệ u (Kloeppervàcs,2004;López-
Buciovàcs,2007)[99,121].VikhuẩnBacillusspp.S20D12làchủngvikhuẩncónhiều ưuđiểmvàđượcnhómtácgiảLêNhưCươngvàcộngsự(2019a,b)[115,116]lựachọn sản xuất chế phẩm phòng trừ bệnh héo rũ và kích thích sự sinh trưởng cây lạc tại miền Trung Việt Nam. Trong các nghiên cứu của Lê Như Cương (2018, 2019a, 2019b)[109, 115, 116] về vi khuẩnBacillusspp S20D12, sự hiện diện của các CĐTTTV khác cũng cần thiết cũng được nhắc đến Giả thuyết đặt ra rằng, trong dịch bào tử của vi khuẩnBacillusspp. S20D12 còn có sự hiện diện của nhóm CĐTTTV khác là cytokinin và gibberellin.Sựhiệndiệncủaauxin(IAA)trongdịchbàotửcủachủngvikhuẩnBacillusspp.S20D12 đượcxemnhưbổsungCĐTTTVngoạisinhvàoquátrìnhngâmủhạtdưa hấu Sự di chuyển của auxin theo cơ chế tế bào – tế bào là nhân tố quan trọng trong sự hình thành trục phôi cũng như sự hình thành mô phân sinh ngọn chồi, mô phân sinh ngọn rễ và các tử diệp sau đó. Hoạt tính auxin trong dịch bào tử vi khuẩnBacillusspp S20D12 đã “góp phần” thúc đẩy được quá trình nẩy mầm của hạt dưa hấu Ngoài ra, auxincóvaitròđiềuhòasựưutínhngọn,phânhóamômạch,hìnhthànhnụhoavàtăng trưởng trái. Trong sự tăng trưởng của thân non, auxin điều khiển sự kéo dài thân bằng cách gia tăng tính giãn vách tế bào (Bùi Trang Việt, 2020) [34] Chính vai trò này đã làmrõđượcsựhiệndiệncủaauxintrongdịchbàotửvikhuẩnBacillusspp.S20D12đã “góp phần” thúc đẩy được quá trình kéo dài rễ và thân của câymầm.
Vi sinh vật có thể gây ra những thay đổi sinh lý ở thực vật mà chủ yếu là qua trung gian sản xuất các hoạt chất chuyển hóa thứ cấp của vi sinh vật đặc biệt là CĐHTTTVnộisinh.Vikhuẩncóthểảnhhưởngđếnthựcvậttăngtrưởngtrựctiếpthông quaviệcsảnxuấtCĐHTTTVnộisinhvàgiántiếpthôngquaviệcsảnxuấtcáctácnhân kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh từ đất (Glick và cs, 2007; 2012) [84, 85] Axit Indole3- acetic(IAA)làhoạtchấtauxintựnhiêndồidàonhấtđượcsảnxuấtbởivikhuẩn (Lambrecht và cs, 2000; Bloemberg và Lugtenberg, 2001) [104, 146] Sinh tổng hợp IAA cũng được phổ biến rộng rãi ở các trực khuẩn liên quan đến thực vật và được coi làcóliênquantrựctiếpđếnviệcthúcđẩytăngtrưởngthựcvật(Tsavkelovavàcs,2007; Idris và cs, 2007) [168,98].
Ngoài ra, gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng do của gibberellin tác động mạnh lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc.VìvậykhixửlýhạtgiốngdưahấuvớidịchbàotửvikhuẩnBacillusspp.S20D12, có lẽ sự hiện diện của gibberellin có trong dịch đã giúp cây mầm tăng nhanh quá trình sinhtrưởng,rễmầmvàthânmầmđượckéodài.Tuynhiên,tronggiớihạncủanghiên cứu này, chúng tôi chưa đánh giá được sự hiện diện của các CĐHTTTV nội sinh khác ngoài auxin có trong dịch bào tử của vi khuẩnBacillusspp S20D12, do đó cần được tiến hành đánh giá thêm để làm rõ điều này Trong trường hợp các hạt giống dưa hấu đượcxửlývớidịchbàotửtậpđoànvikhuẩnBacillusspp.đượctuyểnchọn,phảichăng sựgiatăngtổnghợpauxin,dẫnđếnsựthayđổitỷlệcácCĐHTTTVkhácnhưcytokinin hay gibberellin đã dẫn đến sự hình tỉ lệ các CĐHTTTV thích hợp, không những đủ để khởi phát sự hình thành cây mầm mà còn giúp cho sự phát sinh hình thái cây mầm,dẫn đến sự kéo dài rễ mầm và thân mầm cây dưahấu.
Nhìn chung, vi khuẩnBacillusđược xem là nhóm vi sinh vật quan trọng để ứng dụng kiểm soát sinh học trong nông nghiệp vì khả năng sản xuất nhiều chất chuyểnhóa thứ cấp Khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng của nhóm vi khuẩnBacillusđãđượcghinhậnvàmộtsốcơchếhoạtđộngcủanhómvikhuẩnkíchthíchtăng trưởng thực vật (PGPB - Plant Growth Promoting Bacteria) đã được đề xuất Vi khuẩnBacilluscó một số ưu thế hơn so với các chi vi khuẩn thuộc nhóm PGPB về hoạt động thúc đẩy tăng trưởng như khả năng sản xuất các CĐHTTTV nội sinh, sản sinh kháng sinh, gây ra tình trạng kháng thuốc toàn thân và được sử dụng như thuốc trừ sâu sinh học (Reva và cs, 2004) [148] Các chủng vi khuẩn thuộc nhómBacillusđã được ứng dụng như sinh nhiều loại enzyme giúp phân hủy các nguồn cơ chất khác nhau khóphân hủy, cung cấp dinh dưỡng, tăng cường hệ thống kháng bệnh trên cây trồng Để có thể ứngdụngcácchủngvikhuẩntrongtạosảnphẩmbổsungtrongchămsócvàbảovệcây trồng, cần có các đánh giá tác động trực tiếp của vi khuẩn đối với câytrồng.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kếtluận
- Đã giải trình tự gen và định danh xác định mẫu nấm bệnh DB – 03 là nấmDidymella bryoniae(Fuckel) Rehm (tên đồng nghĩa làStagonosporopsiscucurbitacearum(mãcôngbốNCBIKF990411).Sựsaikháctạimộtvàivịtrí nucleotid của05trìnhtựgenemẫunấmbệnhthuthậptạiPhúYênvàkhoảngcáchhệsốditruyền nhỏ (0,01 – 0,07) đã nhấn mạnh khả năng phân bố của mầm bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau tại PhúYên.
S13E3,S18F11vàS20D12cókhảnăngkiểmsoátsựpháttriểnnấmDidymellabryoniaevớihiệusuấtđối khángtừ44,46%đến60,71%,trongđóvikhuẩnBacillusspp.S20D12 có hiệu suất đối kháng cao nhất là60,71%.
- Trongđiềukiệnnhàlưới,cácchủngvikhuẩnBacillusspp.S1A1,S1F3,S13E2, S13E3, S18F11 và S20D12 có khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấmD.bryoniaegây ra vớitỷlệ chết ở cây con từ 13,34 – 40,00% trong đó nghiệm thức được xử lý với vi khuẩnBacillusspp S18F11 và S20D12 đạt hiệu quả tốtnhất.
- Ở điều kiện ngoài đồng ruộng, các chủng vi khuẩnBacillusspp S1A1, S1F3, S13E2, S13E3, S18F11 và S20D12 đều kéo dài thân chính, gia tăng số lá, tổng số hoa so với đối chứng Chủng vi khuẩnBacillusspp S20D12 thể hiện ưu thế kích thích cây con tăng trưởng và phát triển vượt trội hơn so với các chủng cònlại.
- Bước đầu ghi nhận được sự hiện diện của cấu trúc acit indole3-acetic (IAA)có trong dịch tế bào vi khuẩnBacillusspp S20D12, góp phần giải thích vi khuẩnBacillusspp có khả năng kích thích sự sự nẩy mầm của hạt và phát triển của cây dưahấu.
Đềnghị
- NghiêncứumởrộngvềmậtđộvikhuẩnthíchhợpđểhạnchếtốiưusựpháttriểnsợinấmD. bryoniaetrongđiềukiệninvitro,mậtđộvikhuẩntốiưuđểthựchiệnphốitrộnchếphẩmvàođấttrồn gtrênđồngruộng,thờiđiểmvàsốlầnxửlýngoàiđồngruộng.
- Tiếptụcthựchiệnkhảosátsựhiệndiệncủacácchấtđiềuhòatăngtrưởngthực vật khác của vi khuẩn như cytokinin, gibberellin để lý giải được khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây dưahấu.
- XâydựngvàthửngiệmmôhìnhứngdụngchủngvikhuẩnBacillusspp.S20D12 khảnănghạnchếbệnhnứtthânchảynhựacâydưahấudonấmDidymellabryoniaegây ra trong điều kiện ngoài đồngruộng.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
STT Tên bài báo Tạp chí, số Tên tác giả Xếp hạng
1 Thực trạng sản xuất dưahấu(Citrullus lanatusThumb.) tạiPhú Yên
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tập 132 (3A): 31 –
Trần Đăng Hòa, Thái Thị Huyền, Cao GiangNam,Trần Thị Xuân Phương
Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước
2 Evaluation of Biacillusspp strains for biological control of gummy stem blight,Didymella bryoniae(Auersw.) in watermelon
Crop Research, Vol 58 (No 5 and 6), 2023 DOI: 10.31830/2454-1761.2023.CR-935
Danh mục WoS (Web of Science)
3 Đa dạng di truyền của một số mẫu nấmDidymella bryoniaegâybệnhnứtthânchảynhựa câydưahấutại PhúYên
Tạp chí Bảo vệ thực vật, Số 6, 2023 Ngô Thạch
Trần ĐăngHòa,Thái Thị Huyền
Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
[1] Hoàng Kim Chi, Nguyễn Đình Tuấn, Lê Hữu Cường, Trần Thị Hồng Hà,Lê MaiHương,TrầnThịNhưHằng(2020).Sànglọcvànghiêncứumộtsốchủngvikhuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng phân lập từ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) tại Việt Nam Bản B củaTạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 62(5).
[2] Nguyễn Thị Thu Cúc và Lê Văn Vàng (2016), Quản lý dịch hại cây trồng thân thiện với môi trường, NXB Đại học CầnThơ.
[3] Lê Như Cương, Hoàng Kim Toản, Nguyễn Xuân Vũ và Thái Thị Huyền (2019) Hiệu quả kích thích sinh trưởng và nâng cao năng suất của vi khuẩn Bacillus cho cây lạc ở Thừa Thiên Huế.Hue University Journal of Science: Agriculture andRural Development, 128(3C),13-22.
[4] Lê Như Cương và Nguyễn Xuân Vũ (2014), Sinh trưởng, phát triển và năng suất của lạc khi xử lý vi khuẩn có ích vùng rễ,Tạp chí Nông nghiệp và Phát triểnNôngthôn(4), tr 74 -81.
[5] Lê Như Cương (2015), Hiệu quả kích thích nảy mầm, mọc mầm của ớt, cà chua và cải xanh bởi vi khuẩn Bacillus có nguồn gốc bản địa,Tạp chí Nông nghiệp vàPhát triển nông thôn, Kỳ 1, tháng 4/ 2015, tr 31 -37.
[6] Lê Như Cương và Nguyễn Quảng Quân (2016), Hiệu quả kích thích sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus đến cây lạc ở Bình Định,Tuyển tập kết quả nghiên cứukhoa học cây trồng 2014 - 2015, NXB Đại học Huế, tr 7 -15.
[7] LêNhưCương(Chủbiên),NguyễnVĩnhTrường,TrầnThịThuHà,Nguyễn Thị Thu Thủy, Trương Thị Diệu Hạnh và Trần Thị Nga (2018),Giáo trình Bệnh cây,NXB Đại họcHuế.
[8] Lê Như Cương (chủ nhiệm) (2019) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ vi khuẩn có íchBacillusspp phòng trừ bệnh héo rũ và kích thích sinh trưởng lạc tại miềnTrungViệtNam.BáocáotổngkếtđềtàikhoahọcvàcôngnghệcấpBộGD&ĐT.
[9] Khí tượng thủy văn khu vực Nam Trung Bộ(2022).
[10] Hà Quang Hùng (2006), Thành phần sâu, nhện hại nhãn, đặc điêm hình thái, sinh học và diễn biến mật độ của rầy vân nâu Cornegenapsilla sinica (Homoptera: Psyllidae)trênnhãnnăm2006,tạithịxãHưngYên,TạpchíBảovệthựcvật,Số4,trang 2 -8.
TrichodermavớinấmbệnhhạicâytrồngSclerotiumrolfsiiSacc.trongđiềukiệninvitro,Tạp chí khoa học Đại học Huế75A, tr 49 -55.
[12] Lưu Thế Hùng và Trần Vũ Phến (2014), Khảo sát khả năng đối kháng của cácchủngBacillusspp.đượcphânlậptừtỉnhHậuGiangđốivớinấmgâybệnhđốm vằn hại lúa (Rhizoctonia solaniKuhn) trong điều kiệnin vitro,Hội thảo quốc gia bệnhhại thực vật Việt Nam lần thứ 13, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 249 - 257.
[13] Ngô Thạch Quỳnh Huyên, Trần Đăng Hòa, Thái Thị Huyền, Cao Giang Nam, Trần Thị Xuân Phương (2023) Thực trạng sản xuất dưa hấu (Citrullus lanatusThumb.) tại Phú Yên.Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 132 (3A): tr 31 –43.
[14] TháiThịHuyền, Trần Thị ThanhHà, Lê NhưCương (2014),Hiệu quả kíchthíchsinhtrưởngvà phòng trừbệnhlởcổ rễ,thối trắngthân càchuabằng vi khuẩn đốikhánggiaiđoạnvườnươm,TạpchíKhoahọc-ĐạihọcHuế,Tập91B,số3,tr.115-126.
[15] Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998).Giáo trình Bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, HàNội.
[16] DươngMinh,LêPhướcThạnhvàĐàoThịHồngXuyến(2010).Mộtsốsản phẩmnghiêncứutừnấmTrichodermacótriểnvọngcủaĐạihọcCầnThơ.Tạpchíkhoahọc(Đại học Cần Thơ), 16b, tr.173-179.
[17] Niên giám thống kê tỉnh Phú Yên(2021).
[18] VũKhắcNhượng(2006).Hiệntượngđốmlá-nứtthâncâydưahấuvàbiện pháp ngăn ngừa.Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1, tr.37-38.
[19] Nguyễn Thị Thu Nga, Eigil de Neergard và Hans Jorgen Lyngs Jorgensen (2009).NghiêncứusinhhọcsựxâmnhiễmcủanấmDidymellabryoniaegâybệnhđốm lá chảy gôm trên dưa hấu và phản ứng tự vệ của dưa hấu chống lại sự xâm nhiễm của mầmbệnh.In"HộithảoQuốcgiabệnhhạithựcvậtViệtNam"(VũTriệuMân,HàViết Cường and và Cs, eds.), tr.136-153.
[20] TrầnVũPhến,LýThuThảovàTrầnVănNhã(2011),Tuyểnchọnvikhuẩn vùngrễthuộcchiBacillusđốikhángvớivikhuẩnRalstoniasolanacearumgâybệnhthối củ gừng,Kỷ yếu Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam, tr 190 -195.
[21] Trần Vũ Phến, Trần Thị Bích Trân và Lê Văn Đức (2013), Hiệu quả của vi khuẩn Bacillusamyloliquefaciens, BreviBacillusbrevis và chito-oligosaccharide trong phòngtrịbệnhcháybìalálúatrongđiềukiệnnhàlưới,Hộithảoquốcgiabệnhhạithực vật Việt Nam lần thứ 12, tr 209 -217.
[22] Trần Vũ Phến, Nguyễn Thị Vàng và Đinh Ngọc Trúc (2014), Khả năng phòngtrừsinhhọcbệnhbạclálúacủamộtsốchủngBacillusphânlậptừtỉnhHậuGiang trong điều kiện nhà lưới.Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 12/2014, tr.6 2
Kỹthuậttrồngvàchămsóccâydưahấu.ViệnKhoahọcNôngnghiệpViệtNamvàTrungtâm Khuyến nông Quốc gia, HàNội.
[24] Đặng Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Cao Ngọc Điệp (2016) Sự sản xuất IAA và siderophore của các chủng vi khuẩn liên hiệp thực vật và ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây bắp (Zea maysL.) trồng trong chậu Tap̣chı́Khoa hoc̣Trườ ng Đaị hoc ̣Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên,Công nghệ và Môi trường,46(2016), tr.59-67.
[25] Nguyễn Đức Thành (2014), Cáckỹthuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật,Tạp chí Sinh học, Vol 36, No 3, tr.265-294.
[26] NguyễnTấtThắng,ĐỗTấnDũngvàNguyễnVănTuất(2011),Nghiêncứu bệnhhéoxanhvikhuẩn(RalstoniasolanacearumSmith)hạicâykhoaitâyvùngHàNội
- phụ cận và biện pháp phòng trừ,Tạp chí Khoa học và Phát triển, 9, tr.725 - 734.
[27] Vũ Huy Trung, Nguyễn Vĩnh Trường và Nguyễn Thị Nguyệt (2005). Nghiêncứubệnhnứtthânchảygômdưahấuvàkhảonghiệmmộtsốloạithuốctrừbệnh.Tạp chí Bảo vệ thực vật, 3: tr.14-16.
[28] Lê Hồng Việt, Vũ Văn Long, Thị Tú Linh, Đỗ Bá Tân, Châu Minh Khô (2018), Ảnh hưởng của luân canh lúa-dưa hấu đến độ hữu dụng của đạm, lân trong đất vànăngsuấtlúatrênnềnđấtphèntạitỉnhHậuGiang,TạpchíkhoahọcTrườngĐạihọcCần Thơ, 54, tr.235-240.
[29] Tổng cục Thống kê Việt Nam(2021).
[30] TrịnhThànhTrung,PhanLạcDũng,TrầnThịLệQuyên,DươngVănHợp, Đào Thị Lương (2013) Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumsp1901phânlậptạiRừngQuốcgiaHoàng Liên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013)59-70.
[31] Nguyễn Xuân Vũ, Lê Như Cương, Phan Thị Phương Nhi, Lê Đức Lâm (2018), Hiệu quả kích thích sinh trưởng và nâng cao năng suất của chế phẩm Bacillus cho cây lạc trồng tại Quảng Nam,Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên, Tập 127, số 1C, tr 149 –157.
[32] Nguyễn Xuân Vũ, Phan Thị Phương Nhi, Trần Thị Hoàng Đông, Thái Thị Huyền,LêNhưCương(2021),Khảnănghạnchếbệnhhạilátrêncâylạccủachếphẩm sinh học Bacillustại Quảng Nam,Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 2 (295), tr 10 -15.
1:Phươngphápđiềutracơbảndịchhạinôngnghiệpvàthiênđịchcủachúng.Nhàxuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 99trang.
[34] Bùi Trang Việt (2020) Sinh lý thực vật NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ ChíMinh.
[35] Abd-Allah, E F (2005), Effect of aBacillus subtilisisolate on southern blight (Sclerotium rolfsii) and lipid composition of peanut seeds,Phytoparasitica, 33, pp 460 -466.
[36] Abd-Allah, E F., and G El-Didamony (2007), Effect of seed treatment ofArachis hypogaeawithBacillus subtilison nodulation in biocontrol of southern blight (Sclerotium rolfsii) disease,Phytoparasitica35, pp 8 -12.
[37] Ali, B., Sabri, A N., Ljung, K., & Hasnain, S (2009) Quantification of indole-3-acetic acid from plant associatedBacillusspp and their phytostimulatory effect onVigna radiata(L.).World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25, 519-526.
[38] Antoun, H., & Prévost, D (2006) Ecology of plant growth promoting rhizobacteria PGPR:Biocontrol and biofertilization,1-38.
[39] Aveskamp, M.M., de Gruyter J., Woudenberg, J H C., et al (2010). Highlights of the Didymellaceae: A polyphasic approach to characterise Phoma and relatedpleosporalean genera.Studies in Mycology, Vol 65,pp.1–60.
[40] Ashwini, N., & Srividya, S (2014) Potentiality of Bacillus subtilis as biocontrol agent for management of anthracnose disease of chilli causedbyColletotrichum gloeosporioides OGC1.3.Biotech, 4(2),127-136.
[41] Azcón-Aguilar, C., Barea, J.M (1997) Arbuscular mycorrhizas and biological control of soil-borne plant pathogens – an overview of the mechanisms involved.Mycorrhiza, 6(6),457-464.
[42] Babu, B., Kefialew, Y W., Li, P F., Yang, X P., George, S., Newberry, E., & Paret, M L (2015) Genetic characterization ofDidymella bryoniaeisolates infectingwatermelonandothercucurbitsinFloridaandGeorgia.Plantdisease,99(11), 1488- 1499.
[43] Basım, E., Basım, H., Abdulai, M., Baki, D., & ệztỹrk, N (2016), Identification and characterization of Didymella bryoniae causing gummy stem blight diseaseofwatermelon(Citrulluslanatus)inTurkey,CropProtection,Vol.90,pp.150- 156.
[44] Bakker, P., Pieterse, C.M.J ,Van Loon, L.C (2007) Induced systemic resistance by fluorescentPseudomonasspp.Phytopathology, Vol 97, No 2, pp 239- 243.
[45] Bent, E (2006) Induced systemic resistance mediated by Plant Growth- Promoting Rhizobacteria (PGPR) and Fungi (PGPF),In: Multigenic and inducedsystemic resistance in plants Tuzun, S ,Bent, E (eds), pp.225-258.
[46] Bloemberg, G V., & Lugtenberg, B J (2001) Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria.Current opinion inplantbiology, 4(4),343-350.
[47] Bock, C H., Gottwald, T R., Parker, P E., Cook, A Z., Ferrandino, F.,Parnell, S., & Van den Bosch, F (2009) The Horsfall-Barratt scale and severity estimates of citrus canker.European Journal of Plant Pathology, 125,23-38.
[48] Borisova,S.,Circello,B.,Zhang,J.,vanderDonk,W.,Metcalf,W.(2010) Biosynthesis of rhizocticines, antifungal phosphonate oligopeptide producedbyBacillus subtilis ATCC6633.Chemistry and Biology, Vol 17, No pp.28-37.
[49] Burgess, L.W., Knight, T.E., Tesoriero, L., Phan, H.T. (2008),Diagnosticmanual for plant diseases in Vietnam ACIAR Monograph No 129, 210p.
[50] Brucker, R M., Baylor, C M., Walters, R L., Lauer, A., Harris, R N.,and Minbiole, K P C (2008) The Identification of 2,4-diacetylphloroglucinol as an antifungal metabolite produced by cutaneous bacteria of the salamander plethodon cinereus.Journal of chemical ecology, 34, pp 39 -43.
[51] Bric,J.M.,Bostock,R.M.,&Silverstone,S.E.(1991).Rapidinsituassay for indoleacetic acid production by bacteria immobilized on a nitrocellulose membrane.Applied and environmental Microbiology, 57(2),535-538.
[52] CABI (2015).Didymella bryoniae(Gummy Stem Blight of Cucurbits) Datasheet (Full) Report Crop Protection Compendium (accessed 14.04.16.).www.cabi.org/cpc/.
[53] Campbell, C L., & Madden, L V (1990).Introduction to plant diseaseepidemiology John Wiley &Sons
[54] Cawoy, H., Bettiol, W., Fickers, P., & Ongena, M (2011) Bacillus-based biological control of plant diseases.Pesticides in the modern world-pesticides use andmanagement, pp.273-302.
[55] Chen, Q., Jiang, J R., Zhang, G Z., et al (2015a) Resolving the Phoma enigma.Studies in Mycology Vol 82, pp 137–217.
[56] Chen, Q., Zhang, K., Zhang, G Z., et al (2015b) A polyphasic approach to characterise two novel species of Phoma (Didymellaceae) from China.Phytotaxa. Vol 197, pp.267–281.
[57] Chen Q., Hou L W., Duan W J., Crous P W., Cai L (2017). Didymellaceae revisited.Studies in Mycology Vol 87, pp 105 –159.
[58] Chen, L., Hao, Z., Li, K., Sha, Y., Wang, E., Sui, X., Mi, G., Tian, C., & Chen, W (2021) Effectsof growth-promoting rhizobacteria on maize growth and rhizosphere microbial community under conservation tillage in Northeast China.Microbial Biotechnology, 14(2),535-550.
[59] Choi, I Y., Choi, J N., Choi, D C., Sharma, P K., & Lee, W H (2010). Identification and characterization of the causal organism of gummy stem blight in the muskmelon (Cucumis meloL.).Mycobiology, 38(3),166-170.
[60] Chiu, W F., Walker, J C (1949), Morphology and variability of the cucurbitblackrotfungus.JournalofAgriculturalResearch,Vol.78,No.5,pp.81-102.
[61] Costa, O Y., Raaijmakers, J M., & Kuramae, E E (2018) Microbial extracellular polymeric substances: ecological function and impact on soil aggregation.Frontiers in microbiology, 9,337094.
[62] Compton M E., (1999), Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon,Plant Cell,Tiss Org Cult., 58,185-188.
[63] Conrath, U., Beckers, G.J.M., Flors, V., Garcia-Agustin, P., Jakab, G., Mauch, F., Newman, M.A., Pieterse, C.M.J., Poinssot, B., Pozo, M.J., Pugin, A., Schaffrath, U., Ton, J., Wendehenne, D., Zimmerli, L., Mauch-Mani, B., Prime, A. (2006) Priming: Getting ready for battle.Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol.
[64] Crous, P.W., Gams, W., Stalpers, J.A., Robert, V., Stegehuis, G., (2004).MycoBank:anonlineinitiativetolaunchmycologyintothe21 st century.StudiesinMycolo gy Vol 50, pp 19 –22.
[65] De Neergaard, E (1989), Histological investigation of flower parts of cucumber infected by Didymella bryoniae,Canadian Journal of Plant Pathology, Vol.
[66] Devi, S G., & Prabhavathy, C (2023) Increasing the Economic Value of Nutritionally Rich Watermelon Rind by Preparing Edible Value-added Products.FoodSci: Indian Journal of Research in Food Science and Nutrition,25-28.
[67] Doyle, J J., Doyle, J L., (1987) Isolation of DNA from fresh plant tissue. Focus: 12:13-15.
[68] Domenech, J., Reddy, M S., Kloepper, J W., Ramos, B., & Gutierrez- Manero,J.
(2006).CombinedapplicationofthebiologicalproductLS213withBacillus,PseudomonasorChrys eobacteriumforgrowthpromotionandbiologicalcontrolofsoil- borne diseases in pepper and tomato.BioControl, 51,245-258.
[69] Dube, J., Ddamulira, G., & Maphosa, M (2021) Watermelon production in Africa: challenges and opportunities.International Journal of Vegetable Science, 27(3),211-219.
[70] Ellul, P L C., Naval, M M., Nogueral, F J., Sanchez, S., Atarés, A., Moreno, V., Corella, P., Dirks, R (2007), Watermelon biotechnology, Agriculture and forestry, transgenic crops, Springer Verlag, Berlin, Vol 60, pp.129–165.
[71] El-Adawy, T A., & Taha, K M (2001) Characteristics and composition of watermelon, pumpkin, and paprika seed oils and flours.Journal of agricultural andfood chemistry, 49(3),1253-1259.
[72] Egel, D S., Adkins, S T., Wintermantel, W M., Keinath, A P.,D’ArcangeloZhaoK.N.,Parada-Rojas,C.H., &Quesada-Ocampo,L.M (2022).
Diseases of Cucumbers, Melons, Pumpkins, Squash, and Watermelons.In Handbook ofVegetable and Herb Diseases(pp 1-105) Cham: Springer International Publishing.
[73] FAOSTAT, (2023) FAOSTAT Crops,National Production(accessed 10.11.23).http://faostat.fao.org/
[74] Francis, I., Holsters, M., Vereecke, D (2010) The Gram-positive side of plant-microbe interactions.Environmental Microbiology, Vol 12, No 1, pp.1-12.
[75] Fehér.T.(1993),WatermelonCitrulluslanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai,
Genetic Improvement of Vegetable Crops, Vol 21, pp 295 – 311.
[76] FigueredoM.S.,TenelliM.L.,IbánezF.,MorlaF.,CerioniG.,DelCarmen
Tordable M., and Fabra A (2017), Induced systemic resistance and symbiotic performance of peanut plants challenged with fungal pathogens and coinoculatedwiththe biocontrol agentBacillussp CHEP5 and Bradyrhizobium sp SEMIA6144.Microbiological
[77] Flynn, N E., Meininger, C J., Haynes, T E., & Wu, G (2002) The metabolic basis of arginine nutrition and pharmacotherapy.Biomedicine&Pharmacotherapy, 56(9),427-438.
[78] Janick, J., Paris, H S., & Parrish, D C (2007) The cucurbits of Mediterranean antiquity: Identification of taxa from ancient images and descriptions.Annals of Botany,100 (7):1441-1457.
[79] Jangir, M., Pathak, R., Sharma, S., & Sharma, S (2018) Biocontrol mechanisms of Bacillus spp., isolated from tomato rhizosphere, against Fusarium oxysporum f.spp lycopersici.Biological Control, 123,60-70.
[80] Gusmini, G., Song, R., & Wehner, T C (2005) New sources of resistance to gummy stem blight in watermelon.Crop Science, 45(2),582-588.
[81] Gnanamanickam, S.S (2009) Biological control of rice diseases (Progress in Biological Control vol 8).Springer Science Business MediaB.V., pp 67 -78.
[82] Gomes, E A., Lana, U G P., Quensen, J F., de Sousa, S M., Oliveira, C. A., Guo, J., Guimarães, L J M., and Tiedje, J M (2018), Root-associatedmicrobiome of maize genotypes with contrasting phosphorus use efficiency,Phytobiomes Journal, 2, pp 129 -137.
[84] Glick, B R., Todorovic, B., Czarny, J., Cheng, Z., Duan, J., &McConkey,
B (2007) Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase.Critical Reviews inPlant Sciences, 26(5-6), 227-242.
[85] Glick, B R (2012), Plant growth-promoting bacteria: Mechanisms and applications.Scientifica, pp 1 –15.
[86] Giovannucci, E (2002) A review of epidemiologic studies of tomatoes, lycopene, and prostate cancer.Experimental biology and medicine, 227(10),852-859.
[87] Gisi, U., Chet, I., & Gullino, M L (2009) Recent developments in management of plant diseases Dordrecht, Holland:Springer
[88] Haas, D., & Défago, G (2005) Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads.Nature reviews microbiology, 3(4),307-319.
[89] Haggag, W.M (2008) Isolation of bioactive antibiotic peptides fromBacillus brevisandBacillus polymyxaagainstBotrytis greymould in strawberry.Biocontrol Science and Technology, Vol 41, No pp 477-491.
[90] Hara, H (1969),The Correct Author's Name of Citrullus lanatus (Cucurbitaceae),Taxon, Vol 18, No 3, pp 346 –347.
[91] Hayat, R., Ali, S., Amara, U., Khalid, R., & Ahmed, I (2010) Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review.Annalsofmicrobiology, 60,579-598.
[92] Hoster, F., Schmitz, J.E., Daniel, R (2005) Enrichment of chitinolytic microorganisms: isolation and characterization of a chitinase exhibiting antifungal activity against phytopathogenic fungi from a novel Streptomyces strain.AppliedMicrobiology and Biotechnology, Vol 66, No 4, pp.434-442.
[93] Huang, W., Zhao, X., Zhao, X., Li, Y., & Lian, J (2016) Effects of environmental factors on genetic diversity of Caragana microphylla in Horqin Sandy Land, northeast China.Ecology and Evolution, Vol 6, No 22, pp.8256–8266.
[94] Holden,J.M.,Eldridge,A.L.,Beecher,G.R.,Buzzard,I.M.,Bhagwat,S., Davis, C. S., & Schakel, S (1999) Carotenoid content of US foods: an update of the database.Journal of Food Composition and Analysis, 12(3),169-196.
[95] Horsfall, J G & Barratt, R W (1945) An improved grading system for measuring plant disease.Phytopathology, 35,655.
[96] Idris, E E., Iglesias, D J., Talon, M., & Borriss, R (2007) Tryptophan- dependent production of indole-3-acetic acid (IAA) affects level of plant growth promotion byBacillus amyloliquefaciensFZB42.Molecular plant-microbeinteractions, 20(6),619-626.
[97] Keinath,A.P.,Farnham,M.,Zitter,T.(1995),Morphological,pathological, and genetic differentiation ofDidymella bryoniaeandPhomaspp isolated from Cucurbits,Phytopathology, Vol 85, pp.364–369.
[98] Keinath,A.P.(2014).ReproductionofDidymellabryoniaeonninespecies of cucurbits under field conditions.Plant Disease, 98(10),1379-1386.
[99] Kloepper, J.W., Ryu, C.M., Zhang, S.A (2004) Induced systemic resistanceandpromotionofplantgrowthbyBacillusspp.Phytopathology,Vol.94,No 11,pp.1259-1266.
[100] Korabecna,M.,2007.ThevariabilityinthefungalribosomalDNA(ITS1, ITS2, and 5.8 S rRNA Gene): Its biological meaning and application in medical mycology.Communicating Current Research and Educational Topics and
[101] Kumar, A., Prakash, A., & Johri, B N (2011) Bacillus as PGPR in crop ecosystem.Bacteria in agrobiology: crop ecosystems, 37-59.
[102] Kutty, S B., Abdullah, N E., Hashim, H., Kusim, A S., Yaakub, T N. T., Yunus, P N A M., & Abd Rahman, M F (2013, April) Classification of watermelon leaf diseases using neural network analysis.In 2013 IEEE
BusinessEngineering and Industrial Applications Colloquium (BEIAC), pp 459-
[104] Lambrecht, M., Okon, Y., Broek, A V., & Vanderleyden, J (2000). Indole-3-acetic acid: a reciprocal signalling molecule in bacteria–plant interactions.Trends in microbiology, 8(7),298-300.
[105] Lake, J R., Shorr, J S., Steffen, B J., Chu, A H., Gordon, R D., & Wiesner, R H (2005) Differential effects of donor age in liver transplant recipients infected with hepatitis B, hepatitis C and without viral hepatitis.American
[106] Lugtenberg, B., Kamilova, F (2009) Plant-growth-promoting- rhizobacteria.Annual Review of Microbiology, Vol 63, No pp.541-556.
[107] Lugtenberg, B.J.J., Chin-A-Woeng, T.F.C., Bloemberg, G.V (2002). Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.Antonie Van
LeeuwenhoekInternational Journal of General and Molecular Microbiology, Vol 81,
[108] Levi, A., Jarret, R., Kousik, S., Patrick Wechter, W., Nimmakayala, P., Reddy, U.K (2017) Genetic Resources of Watermelon Genetics and Genomics of Cucurbitaceae.PlantGeneticsandGenomics:CropsandModels,Vol.20,pp.87–110.
[109] Le, C N., Hoang, T K., Thai, T H., Tran, T L., Phan, T P N., & Raaijmakers,J.M.(2018).Isolation,characterizationandcomparativeanalysisofplant- associated bacteria for suppression of soil-borne diseases of field-grown groundnut in Vietnam.Biological
[110] Le, C N., Thai, T H., Nguyen, X V., Nguyen, T L., Tran, T X P., & Tran, T P N (2019) Biological control of groundnut stem rot byBacillusspp strain S20D12.Archives of Phytopathology and Plant Protection, 52(7-8),625-638.
[111] Le, C.N (2011), Diversity and biological control ofSclerotium rolfsii,causal agent of stem and pod rot of groundnut PhD, WageningenUniversity.
[112] Le, C N., Kruijt, M., and Raaijmakers, J M (2012a), Involvement of phenazines and lipopeptides in interactions betweenPseudomonasspecies andSclerotium rolfsii, causal agent of stem rot disease on groundnut,Journal of
[113] Le,C.N.,Mendes,R.,Kruijt,M.,andRaaijmakers,J.M.(2012b),Genetic and Phenotypic Diversity ofSclerotium rolfsiiin Groundnut Fields in CentralVietnam,Plant
[114] Le, C N., Hoang, T K., Thai, T H., Tran, T L., Phan, T P N., and Raaijmakers, J M (2018), Isolation, characterization and comparative analysis of plantassociatedbacteriaforsuppressionofsoil-bornediseasesoffield-growngroundnut in Vietnam,Biological Control, 121, pp 256 -262.
[115] Le, C N., Thai, T H., Nguyen, X V , Nguyen, T L., Tran, T X P., and Tran,T.P.N.(2019a),BiologicalcontrolofgroundnutstemrotbyBacillusspp.Strain
S20D12,Archives Of Phytopathology And Plant Protection, 52, pp 625 -638.
[116] Le, C N., Thai, T H., Tran, D H., Nguyen, T L., La, T T H., and Nguyen, X V (2019 b), Genetic diversity of groundnut rhizosphere antagonistic bacteriaandbiologicalcontrolofgroundnutwilteddiseasesincentralVietnam,LegumeResearch,
[117] Li,P.F.,Ren,R.S.,Yao,X.F.,Xu,J.H.,Babu,B.,Paret,M.L.,&Yang,
X P (2015) Identification and Characterization of the Causal Agent of Gummy Stem Blight from Muskmelon and Watermelon in East China,Journal ofPhytopathology, Vol 163, No 4, pp.314-319.
[118] Li J., Tang Y., Qin Y., Li X., Li H (2012), Agrobacterium-mediated transformation of watermelon (Citrullus lanatus), Afr J Biotechnol., 11(24): 6450- 6456.
[119] Logaraj,T.V.(2010),Watermelon(Citrulluslanatus(Thunb.)Matsumura and Nakia) seed oils and their use in health,Nuts and seeds in health and diseaseprevention, Chap 136, pp.1149-1163.
[120] Loper, J E., & Henkels, M D (1997) Availability of iron toPseudomonas fluorescensin rhizosphere and bulk soil evaluated with an ice nucleation reporter gene.Applied and Environmental Microbiology, 63(1),99-105.
[121] López-Bucio, J., Campos-Cuevas, J C., Hernández-Calderón, E., Velásquez-Becerra, C., Farías-Rodríguez, R., Macías-Rodríguez, L I., & Valencia- Cantero, E (2007).Bacillusmegateriumrhizobacteriapromote growth and alter root- systemarchitecturethroughanauxin-andethylene- independentsignalingmechanisminArabidopsis thaliana Molecular Plant-Microbe
[122] Louden, B C., Haarmann, D., & Lynne, A M (2011) Use of blue agar CAS assay for siderophore detection.Journal of microbiology & biology education, 12(1),51-53.
[123] Lugtenberg, B and F., Kamilova (2009), Plant growth promoting rhizobacteria.Annu Rev Microbiol., 63, pp 541 -556.
[124] Lynch,J.M.(1990),TheRhizosphere,Wiley-Interscience,ChichesterUK.
[125] Mahapatra, S., Rao, E S., Sandeepkumar, G M., & Sriram, S. (2020).Stagonosporopsis cucurbitacearumthe causal agent of gummy stem blightofwatermelon in India.Australasian Plant Disease Notes, 15,1-3.
