Nghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh học

Nghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh họcNghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh học

NGÔ THẠCH QUỲNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA CÂY

DƯA HẤU (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai)

DO NẤM Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm GÂY RA

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ BẢO VỆ THỰC VẬT

HUẾ - 2024

ĐẠI HỌC HUẾ

NGÔ THẠCH QUỲNH HUYÊN

NGHIÊN CỨU BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA CÂY

DƯA HẤU (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai)

DO NẤM Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm GÂY RA

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ BẢO VỆ THỰC VẬT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của tôi, số liệu được trình bày trong Luận án này là bản gốc của tác giả, trung thực, chính xác, danh dự và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ một học vị nào

Thừa Thiên Huế, ngày tháng năm 2024

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Ngô Thạch Quỳnh Huyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo hướng dẫn, GS.TS Trần Đăng Hòa là người Thầy đầu tiên tại Trường Đại học Nông Lâm Huế, đã hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại Trường và PGS.TS Lê Như Cương là người Thầy đã đặt những viên gạch đầu tiên cho quá trình xây dựng ý tưởng nghiên cứu, nền móng vững chắc để thực hiện luận án

Em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Cô giáo TS Thái Thị Huyền đã luôn luôn động viên, cổ vũ và giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, quý Thầy, Cô giáo Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã truyền dạy kiến thức và định hướng cho em trong quá trình học tập phù hợp với chuyên môn và khả năng của mình, đồng thời đã hỗ trợ, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cơ quan, các đồng nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn đến Mẹ đã truyền đạt kinh nghiệm công tác trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và hỗ trợ con thực hiện luận án Xin được chia sẻ niềm vui này đến chồng và các con đã luôn ủng hộ, cổ vũ để việc học tập được hoàn thành Con xin cảm ơn gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Thừa Thiên Huế, ngày tháng năm 2024

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Ngô Thạch Quỳnh Huyên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa của từ

Bs Bacillus subtilis

BVTV Bảo vệ thực vật

Bp Base Pair-cặp Base

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CABI Centre for Agriculture and Biosciences International/ Trung tâm Nông

nghiệp và Khoa học Sinh học Quốc tế”

CFU Colony Forming Unit/ Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CĐHTTTV Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

CTAB Hexadecyl trimethylammonium bromide

CSB Chỉ số bệnh

DNA Deoxyribonucleic acid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations/ Tổ chức

Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

ISR Induced Systemic Resistance/ Kích thích tính kháng hệ thống

ITS Interal Transcribed Spacer

Isolate Mẫu phân lập

MEGA Molecular evolutionary genetics analysis

NCBI National Center for Biotechnology Information/Trung tâm Thông tin

Công nghệ sinh học Quốc gia NSG Ngày sau gieo

NST Ngày sau trồng

NT Nghiệm thức

PCR Polymerase chain reaction

PTNT Phát triển nông thôn

PGPR Plant growth promoting rhizobacteria/ Vi khuẩn kích thích sinh trưởng

vùng rễ RNA Ribonucleic acid

Rnase Ribonuclease

Taq Thermus aquaticus

Tris Tris-(Hydroxymethyl) Aminomethane

TAE Tris-Acetate-EDTA Buffer

TLC Tỷ lệ chết

TGST Thời gian sinh trưởng

UBND Ủy ban nhân dân

VSV Vi sinh vật

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY DƯA HẤU 4

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây dưa hấu 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý cây dưa hấu 5

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của cây dưa hấu 7

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT DƯA HẤU TRÊN THẾ GIỚI, TẠI VIỆT NAM VÀ PHÚ YÊN 8

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA TRÊN CÂY DƯA HẤU DO NẤM Didymella bryoniae GÂY RA 12

1.3.1 Vị trí phân loại nấm Didymella bryoniae 12

1.3.2 Đặc điểm hình thái và di truyền nấm Didymella bryoniae 13

1.3.3 Bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu do nấm Didymella bryoniae gây ra 17 1.3.4 Các nghiên cứu về nấm Didymella bryoniae trên Thế giới và Việt Nam 19

1.4 BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH 20

1.4.1 Vi khuẩn Bacillus và khả năng kiểm soát tác nhân gây bệnh cây trồng 20

1.4.2 Vi khuẩn Bacillus và khả năng kích thích sinh trưởng thực vật 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 31

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.4.1 Điều tra, đánh giá tình hình sản xuất và sâu bệnh gây hại trên dưa hấu tại Phú Yên 32

2.4.2 Thu thập, phân lập và định danh tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu 33

2.4.3 Đánh giá khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây hại cây dưa hấu của các dòng nấm Didymella bryoniae thu thập tại Phú Yên 36

2.4.4 Đánh giá khả năng kiểm soát sự phát triển nấm Didymella bryoniae của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro 39

2.4.5 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm Didymella bryoniae của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm bệnh nhân tạo 41

2.4.6 Hiệu quả hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm Didymella bryoniae gây ra và kích thích sinh trưởng cây dưa hấu của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp chọn lọc điều kiện ngoài đồng ruộng 42

2.4.7 Đánh giá khả năng kích thích sự sinh trưởng và phát triển cây dưa hấu của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro 44

2.4.8 Đánh giá khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây dưa hấu của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp chọn lọc trong điều kiện nhà lưới 45

2.4.9 Đánh giá khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây dưa hấu của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp chọn lọc trong điều kiện ngoài đồng ruộng 45

2.4.10 Phân lập hoạt chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus spp 47

2.4.11 Xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CÁC ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN CÂY DƯA HẤU TẠI PHÚ YÊN 49

3.1.1 Thời vụ gieo trồng và cơ cấu giống dưa hấu tại Phú Yên 49

3.1.2 Công thức luân canh dưa hấu ở Phú Yên 52

3.1.3 Tình hình sâu, bệnh hại cây dưa hấu ở Phú Yên 56

3.2 KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA CÂY DƯA HẤU 63

3.2.1 Kết quả đánh giá các triệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm Didymella

bryoniae gây ra trên cây dưa hấu ngoài đồng ruộng 63

3.2.2 Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái của tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu bằng hình thái 65 3.2.3 Kết quả định danh tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu bằng

kỹ thuật sinh học phân tử 69 3.3 KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM, GÂY BỆNH VÀ GÂY HẠI CÂY DƯA HẤU CỦA

NẤM Didymella bryoniae THU THẬP VÀ PHÂN LẬP TẠI PHÚ YÊN TRONG

ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI 76

3.3.1 Khả năng xâm nhiễm tự nhiên hay có tác động cơ học của nấm Didymella

bryoniae thu thập và phân lập tại Phú Yên trong điều kiện nhà lưới 76

3.3.2 Khả năng gây bệnh và gây hại cây dưa hấu của nấm Didymella bryoniae thu thập

và phân lập tại Phú Yên trong điều kiện nhà lưới 79

3.4 KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SỰ PHÁT TRIỂN NẤM Didymella bryoniae CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO 81

3.5 KHẢ NĂNG HẠN CHẾ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA DO NẤM

DIDYMELLA BRYONIAE CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp

TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI CÓ LÂY NHIỄM BỆNH NHÂN TẠO 85

3.6 HIỆU QUẢ HẠN CHẾ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA DO NẤM Didymella

bryoniae CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp ĐIỀU KIỆN NGOÀI

ĐỒNG RUỘNG 90 3.7 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA

HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp TRONG ĐIỀU KIỆN IN

VITRO 94

3.7.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus spp đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt dưa hấu 94 3.7.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus spp đến chiều dài rễ mầm, chiều dài thân mầm

96 3.8 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

DƯA HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp TRONG ĐIỀU KIỆN

NHÀ LƯỚI 98

3.9 HIỆU QUẢ KÍCH THÍCH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA

HẤU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp Ở ĐIỀU KIỆN ĐỒNG

RUỘNG 99

3.9.1 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến chiều dài cây dưa hấu99 3.9.2 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến số lá trên cây dưa hấu

101

3.9.3 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến đến sự ra hoa của cây dưa hấu 103

3.10 HOẠT CHẤT LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY DƯA HẤU CỦA CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp S20D12 105

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 110

1 Kết luận 110

2 Đề nghị 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Top 15 quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất Thế giới năm 2021 9Bảng 1.2 Tình hình sản xuất dưa hấu ở Phú Yên trong giai đoạn 2014 - 2021 11Bảng 1.3 Diện tích sản xuất dưa hấu (ha) tại các địa phương ở Phú Yên trong giai

đoạn 2014 - 2021 11Bảng 1.4 Primer và điều kiện phản ứng PCR để xác định Didymella bryoniae 17

Bảng 2.1 Địa điểm thu thập các chủng vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu 30Bảng 3.1 Thời vụ gieo trồng dưa hấu chính tại Phú Yên năm 2018 - 2019 49Bảng 3.2 Diện tích sản xuất dưa hấu (ha) tại các địa phương ở Phú Yên giai đoạn

năm 2014 - 2021 50Bảng 3.3 Thời vụ gieo trồng chính và cơ cấu giống dưa hấu tại ba vùng sinh thái

thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 - 2019 51Bảng 3.4 Các công thức luân canh cây trồng phổ biến tại ba vùng sinh thái thực hiện

nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 -2019 53Bảng 3.5 Các công thức luân canh cây trồng khác ở ba vùng sinh thái được điều tra

bổ sung trong năm 2019 - 2022 55Bảng 3.6 Mức độ phổ biến của một số đối tượng sâu hại chính trên cây dưa hấu ở

Phú Yên năm 2018 - 2019 56Bảng 3.7 Tình hình xuất hiện các đối tượng sâu hại chính trên cây dưa hấu tại ba

vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 - 2019 58Bảng 3.8 Mức độ phổ biến của một số bệnh hại chính trên cây dưa hấu ở Phú Yên

năm 2018 - 2019 61Bảng 3.9 Tình hình xuất hiện các đối tượng bệnh hại chính trên cây dưa hấu tại ba

vùng sinh thái thực hiện nghiên cứu ở Phú Yên năm 2018 - 2019 62

Bảng 3.10 Địa điểm thu thập các mẫu nấm bệnh D bryoniae ở các vùng sinh thái

nghiên cứu tỉnh Phú Yên 65Bảng 3.11 So sánh độ tương đồng (%) của trình tự nucleotid vùng phiên mã của các

mẫu nấm bệnh D bryoniae phân lập tại Phú Yên với các trình tự khác tại

Genbank 72Bảng 3.12 Hệ số tương đồng di truyền giữa trình tự vùng phiên mã của các mẫu nấm

bệnh D bryoniae phân lập tại Phú Yên 75

Bảng 3.13 Khả năng xâm nhiễm của D bryoniae và gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên

cây dưa hấu 77

Bảng 3.14 Khả năng gây hại của các mẫu nấm D bryoniae được phân lập từ cây dưa

hấu sau 14 ngày lây nhiễm bệnh nhân tạo 79

Bảng 3.15 Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấm D bryoniae spp DB-03 của vi

khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro ở 25 oC và chiếu sáng theo

thời gian 83

Bảng 3.16 Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấm D bryoniae spp DB – 03 của

vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro ở 4 oC và che tối theo thời

gian 84Bảng 3.17 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus spp đến bệnh nứt thân chảy nhựa cây

dưa hấu trong điều kiện nhà lưới có lây nhiễm nhân tạo D bryoniae spp

DB-03 86

Bảng 3.18 Chỉ số bệnh của cây sau xử lý vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện nhà

lưới có lây nhiễm nhân tạo D bryoniae spp DB – 03 87 Bảng 3.19 Tỷ lệ cây dưa hấu bị chết sau xử lý vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện

nhà lưới có lây nhiễm nhân tạo D bryoniae spp DB – 03 88 Bảng 3.20 Tỷ lệ bệnh nứt thân chảy nhựa trong điều kiện xử lý vi khuẩn Bacillus spp

ngoài đồng ruộng 91Bảng 3.21 Chỉ số bệnh nứt thân chảy nhựa trong điều kiện xử lý vi khuẩn Bacillus

spp ngoài đồng ruộng theo thời gian 92

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến tỷ lệ nẩy mầm

của hạt dưa hấu 95

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của xử lý dịch bào tử một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến

chiều dài thân mầm và rễ cây dưa hấu (106 CFU/ml) 97

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến tỷ lệ mọc của cây

dưa hấu (106 CFU/ml) 98

Bảng 3.25 Ảnh hưởng dịch bào tử một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến chiều dài

cây dưa hấu ngoài đồng ruộng 100Bảng 3.26 Số lá trên thân chính cây dưa hấu được xử lý với dịch bào tử một số chủng

vi khuẩn Bacillus spp (106 CFU/mL) theo thời gian 102 Bảng 3.27 Ảnh hưởng của dịch bào tử một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến sự ra

hoa trên cây dưa hấu sau 30 NST 103

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây dưa hấu Citrullus lanatus (Thunberg) Matsum & Nakai được trồng

tại Phú Yên vụ Đông xuân 2022 – 2023 5

Hình 1.2 Giai đoạn sinh sản vô tính Phoma cucurbitacearum 14

Hình 1.3 Giai đoạn sinh sản hữu tính Didymella bryoniae 15

Hình 1.4 Giai đoạn sinh sản hữu tính Didymella bryoniae 15

Hình 1.5 Mô hình vi sinh vật có ích ở vùng rễ kích thích khả năng tăng trưởng và phát triển của cây trồng (Pérez-Montaño và cs, 2014) [140] 27

Hình 2.1 Các địa điểm thu mẫu bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu tại Phú Yên 29

Hình 2.2 Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát nấm D bryoniae của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp (Le và cs, 2012) [112, 113] 40

Hình 2.3 Khoảng cách giữa luống × luống (2,5m) và cây × cây (0,5m) 47

Hình 3.1 Vết bệnh màu nâu, không đều, vòng tròn đồng tâm trên lá cây dưa hấu được trồng ngoài đồng ruộng 64

Hình 3.2 Vết nứt trên thân (A: vị trí giữa thân; B: vị trí trên thân gần rễ) do nấm Didymella bryoniae gây ra bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu 64

Hình 3.3 Đốm úng nước trên trái do nấm Didymella bryoniae gây ra 64

Hình 3.4 Cấu trúc chứa bào tử nấm Didymella bryoniae được hình thành trên bề thân cây dưa hấu thu thập ngoài đồng ruộng 66

Hình 3.5 Hình thái tản nấm Didymella bryoniae trên môi trường PDA sau 03 ngày nuôi cấy trong điều kiện sáng, ở 25oC (A) và trong điều kiện tối, ở 4oC (B) 68

Hình 3.6 Cấu trúc bào tử phân sinh (conidia) của nấm Didymella bryoniae hình thành trên môi trường PDA được quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại X40) Hình 3.7 Giai đoạn sinh sản hữu tính Didymella bryoniae 68

Hình 3.8 Sản phẩm PCR khuếch đại của các mẫu nấm bệnh D bryoniae thu thập và phân lập tại Phú Yên 69

Hình 3.9 Sự tương đồng trình tự nucleotide vùng phiên mã ITS của các mẫu nấm bệnh D bryoniae thu thập tại Phú Yên so với các gen tham chiếu đã công bố tại Genbank 73

Hình 3.10 Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ giữa các mẫu nấm bệnh Didymella

bryoniae spp được thu thập tại Phú Yên với các loài khác đã được công

bố trên Genbank 74Hình 3.11 Một số vị trí nucleotid sai khác giữa trình tự gen của các dòng nấm bệnh

D bryoniae spp thu thập được tại Phú Yên 76

Hình 3.12 Biểu hiện sự xâm nhiễm của mẫu nấm bệnh Didymella bryoniae trên lá

cây dưa hấu sau 48 giờ (A) và 72 giờ (B) 81Hình 3.13 Vết bệnh trên lá và vết nứt trên thân cây dưa hấu sau 7 ngày lây nhiễm

bệnh nhân tạo bằng nấm Didymella bryoniae 81

Hình 3.14 Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấm D bryoniae spp DB – 03 của

vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro ở 25 oC và chiếu sáng sau

10 ngày 83Hình 3.15 Khả năng kiểm soát sự phát triển sợi nấm D bryoniae spp DB – 03 của

vi khuẩn Bacillus spp trong điều kiện in vitro ở 4 oC và che tối sau 10 ngày 84Hình 3.16 Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ của các chủng vi khuẩn Bacillus

spp S1F3, S18F11, S20D12 89Hình 3.17 Vùng giới hạn đường cong diễn biến bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa

hấu (AUDPC) ở các nghiệm thức sử dụng vi khuẩn Bacillus spp 93

Hình 3.18 Ảnh hưởng của dịch bào tử một số chủng vi khuẩn Bacillus spp đến sự

nẩy mầm của hạt dưa hấu 97Hình 3.19 Lá của cây dưa hấu được xử lý bằng dịch huyền phù vi khuẩn vi khuẩn

Bacillus spp S20D12 102

Hình 3.20 Sự hiện diện của cụm hoa đực (đỏ) và hoa cái (xanh) trên cây dưa hấu

104Hình 3.21 Hoa cái (trái) và hoa đực (phải) của cây dưa hấu ngoài đồng ruộng 104Hình 3.22 Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin (IAA) sản sinh

bởi vi khuẩn Bacillus spp S20D12 được đọc bằng NMR C13 106

Hình 3.23 Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin (IAA) sản sinh

bởi vi khuẩn Bacillus spp S20D12 được đọc bằng NMR 1 – H 107

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) là loài thực vật phổ

biến nhất trong họ Bầu bí (Cucurbitaceae), có nguồn gốc từ miền nam châu Phi Dưa hấu chủ yếu được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó phần lớn diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, Caribe và miền Nam nước Mỹ Dưa hấu có giá trị kinh tế quan trọng trong họ Bầu bí và được trồng chủ yếu để ăn tươi hoặc dùng lấy hạt (Robinson và Decker-Walters, 1997) [149]

Năm 2021, Việt Nam thuộc Top 10 nước sản xuất dưa hấu nhiều nhất thế giới với với diện tích diện tích trồng dưa hấu 63.948 ha, sản lượng 1.534.613 tấn, năng suất 23,99 tấn/ha (FAOSAT, 2023) [73] Trong những năm gần đây, sản xuất dưa hấu tại Phú Yên có xu hướng gia tăng và trở thành một trong những cây trồng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp địa phương Sản lượng dưa hấu của toàn tỉnh đạt 35.903,37 tấn và năng suất 23,33 tấn/ha, xấp xỉ năng suất bình quân của cả nước (2021)

Cây dưa hấu thuộc nhóm cây có thân mềm, yếu, chứa nhiều chất dinh dưỡng nên

dễ bị các đối tượng sinh vật gây hại làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất

lượng quả Trong đó, phải kể đến bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm Didymella bryoniae

(Auersw.) Rehm gây ra Đây là bệnh gây hại chính ở nhóm cây họ Bầu bí nói chung và cây dưa hấu nói riêng Bệnh phân bố trên toàn Thế giới, đặc biệt ở các vùng Trung và Nam Mỹ, Caribbean, Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Đại Dương Bệnh có thể gây giảm năng suất 30% dưới điều kiện thời tiết thuận lợi cho phát triển bệnh (Keinath và

cs, 2022) [72]

Biểu hiện triệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu là các đốm tròn nhỏ, màu nâu hoặc đen xuất hiện trên lá Từ mép lá, đốm bệnh lớn dần và lan rộng tới cuống lá, làm lá héo Bệnh diễn biến nặng tiếp tục phát triển theo cuống lá tới thân cây,

tạo ra vết nứt trên thân và chảy giọt dịch màu nâu Bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm D

bryoniae gây ra có thể được nhận diện thông qua quan sát các biểu hiện bệnh trên cây

ngoài đồng ruộng hay quan sát cấu trúc bào tử của nấm gây bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm Ngoài ra, một số phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại giải trình

tự gene có thể xác định chính xác tác nhân gây bệnh Hiện nay, các biện pháp để quản

lý bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu như sử dụng thuốc hóa học để xử lý hạt giống hay phun phòng trừ nấm gây bệnh trên đồng ruộng, luân canh cây trồng để giảm

tỷ lệ nhiễm bệnh hoặc sử dụng vi sinh vật có ích có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh

Sử dụng thuốc hóa học là phương thức quản lý bệnh phổ biến được nông dân áp dụng rộng rãi, tuy nhiên giải pháp này khó kiểm soát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên quả, tác động đến môi trường và sức khỏe con người, giảm giá trị kinh tế cây dưa hấu Việc

sử dụng các vi sinh vật có ích như nấm hay vi khuẩn để để phòng trừ bệnh gây hại cây trồng đang được nghiên cứu và ứng dụng phổ biến trên Thế giới cũng như tại Việt Nam

Một số chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát nấm D bryoniae và hạn chế bệnh nứt thân

chảy nhựa gây hại cây dưa hấu trên đồng ruộng đã được nghiên cứu như Pseudomonas,

Bacillus, Streptomyces hay Brevi Bacillus (Zhao và cs, 2016; Nguyễn Thị Thu Nga và cs,

2010; Utkhede và Koch, 2002) [93, 134, 169]

Phú Yên nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho thời vụ canh tác dưa hấu Tuy nhiên việc gieo trồng cây dưa hấu liên tục đã tạo điều kiện thuận lợi cho nấm gây bệnh tồn tại, tích lũy trên đồng ruộng và phát sinh gây hại Nhằm quản lý bệnh nứt thân chảy nhựa có hiệu quả, an toàn cho môi trường và đảm bảo chất lượng sản phẩm, cần xây dựng và thực hiện một hệ thống quản lý sinh vật gây hại tổng hợp với nhiều biện pháp như quản lý sức khỏe đất, canh tác, giống và sử dụng các yếu tố kiểm soát bệnh hại bằng phương pháp hóa học hay sinh học Tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng sử dụng tác nhân sinh học cụ thể và trên diện rộng trong việc phòng chống bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu còn nhiều hạn chế Để có cơ sở khoa học nhằm xây dựng chiến lược quản lý bền vững bệnh nứt thân chảy nhựa dưa hấu và hạn chế ô nhiễm môi trường cần nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái học phù hợp với biện pháp phòng

trừ sinh học nấm D bryoniae gây bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu tại Phú Yên Xuất

phát từ những lý do trên, đề tài luận án “Nghiên cứu bệnh nứt thân chảy nhựa cây

dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai) do nấm Didymella bryoniae

(Auersw.) Rehm gây ra và biện pháp phòng trừ sinh học” được thực hiện là cấp thiết

và phù hợp với yêu cầu của thực tiễn sản xuất

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

2.1 Mục tiêu chung

Đánh giá được tình hình sản xuất dưa hấu, mức độ gây hại và diễn biến của bệnh

nứt thân chảy nhựa do nấm D bryoniae gây ra trên cây dưa hấu tại Phú Yên và nghiên cứu ứng dụng một số chủng vi khuẩn Bacillus spp để kiểm soát nấm D bryoniae nhằm

phòng chống bệnh hại đạt hiệu quả

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Đánh giá được thực trạng sản xuất dưa hấu tại Phú Yên và mức độ gây hại, diễn

biến bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm D bryoniae gây ra trên cây dưa hấu tại Phú Yên

- Thu thập, phân lập, định danh tác nhân gây bệnh và đánh giá các đặc điểm hình thái, mối quan hệ di truyền, độc tính gây bệnh của tác nhân gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu tại Phú Yên

- Tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn có ích Bacillus spp có khả năng kiểm soát sự phát triển của nấm bệnh, khả năng hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm D

bryoniae và khả năng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển cây dưa hấu trong điều kiện phòng

thí nghiệm, nhà lưới và đồng ruộng

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp dữ liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh học, trình tự gene của nấm

D bryoniae gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu tại Phú Yên, ghi nhận khả

năng xâm nhiễm, phát sinh và phát triển của bệnh tại Phú Yên

Tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn có ích Bacillus spp làm cơ sở khoa học

cho việc phòng, chống bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để ứng dụng trong việc xây dựng quy trình

quản lý bệnh nứt thân chảy nhựa bằng vi khuẩn có ích Bacillus nhằm hạn chế sử dụng

thuốc bảo vệ thực vật hóa học, đồng thời khuyến cáo các giải pháp an toàn trong quản

lý bệnh hại đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng cũng như người sản xuất

Cung cấp các dẫn chứng của loài nấm gây bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu, việc nhận diện triệu chứng bệnh nứt thân chảy nhựa chính xác sẽ giúp cho việc phòng trừ bệnh chủ động và hiệu quả hơn

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

(1) Xác định được các đặc điểm hình thái và mối quan hệ di truyền của loài D

bryoniae gây bệnh nứt thân, chảy nhựa tại Phú Yên

(2) Xác định được một số chủng vi khuẩn có ích Bacillus spp có khả năng kiểm soát sự phát triển nấm D bryoniae và hạn chế bệnh nứt thân chảy nhựa cây dưa hấu ở điều kiện in vitro, nhà lưới và đồng ruộng; trong đó chủng Bacillus spp SD20D12

đạt hiệu quả tốt nhất

(3) Bước đầu xác định sự hiện diện của hoạt tính auxin (IAA) trong dịch bào tử

của chủng vi khuẩn Bacillus spp SD20D12 có vai trò như chất điều hòa tăng trưởng thực vật, kích thích tăng trưởng và phát triển cây dưa hấu trong điều kiện in vitro, nhà

lưới và đồng ruộng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY DƯA HẤU

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây dưa hấu

Cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunberg) Matsum & Nakai) thuộc giới Plantae, ngành Angiospermaea, bộ Cucurbitales, họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí), chi Citrullus (Kutty và cs, 2013) [102] Dưa hấu có tên gọi chung là Citrullis do H A Schrader đề

nghị vào năm 1836 và tiếp tục bảo lưu danh pháp bởi các đề xuất độc lập khác của

Anguria Miller (1754) và Colocynthis Miller (1754) Momordica lanata Thunberg (1794) là tên khoa được hầu hết các nhà Thực vật học chấp nhận, Citrullus vulgaris được H A Schrader (1836) đề xuất là tên khoa học được sử dụng phổ biến và Citrullus

lanatus được xem là tên gọi lâu đời nhất của cây dưa hấu Năm 1959, Mansfeld đề nghị

tên khoa học cây dưa hấu là Citrullus lanatus (Thunberg) và trùng hợp với tên khoa học

đã được Matsumura và Nakai đã đề nghị vào năm 1920 Đến nay, tên khoa học của cây

dưa hấu được sử dụng phổ biến rộng rãi là Citrullus lanatus (Thunberg) Matsum &

Nakai (Kutty và cs, 2013) [102] Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) có hơn 900 loài thực vật, bao gồm dưa chuột, dưa hấu, dưa gang, bí ngô và nhiều loại khác

Sự tiến hóa dưới sự thuần hóa cây trồng của con người diễn ra trong lịch sử phần lớn không được ghi chép cụ thể và chính xác, mặc dù đã được mô phỏng và xây dựng lại dựa trên các minh chứng lịch sử và phát triển cây trồng bao gồm khảo cổ học, thực vật học, di truyền học, hoa viên cảnh quan, ngôn ngữ học và các ngành khác (Ellul và

cs, 2007; Zohary và Hopf, 2000; Paris, 2013) [70, 173, 138] Một trong những minh chứng lịch sử đáng kể nhất là nguồn gốc cây dưa hấu thuộc họ Bầu bí (Janick và cs, 2007) [71] Các hình ảnh về cây dưa hấu từ thời kỳ trung cổ được lưu lại khá ít và những

mô tả ban đầu xuất bắt nguồn từ giai đoạn cuối thời trung cổ (Paris và cs, 2009) [139] Một số loài cây thuộc họ Bầu bí có nguồn gốc từ Ai Cập cổ đại và từ những vùng đất xung quanh khu vực biển Địa Trung Hải có niên đại thời La Mã, một trong số đó là cây

dưa hấu (C lanatus) (Janick và Paris, 2007) [78]

Dưa hấu được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên Thế giới Trung Đông, Châu Mỹ, Châu Phi, Ấn Độ, Nhật Bản và Châu Âu là những khu vực sản xuất dưa hấu quan trọng Dưa hấu có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Phi Sự canh tác dưa hấu bắt đầu từ thời

Ai Cập cổ đại và Ấn Độ, sau đó lan rộng đến các quốc gia khác nhau như Địa Trung Hải, Trung Đông và Châu Á (Fehér, 1993) [75] Đến thế kỷ thứ 10, cây dưa hấu đã được

du nhập vào Trung Quốc – một trong những quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất thế giới hiện nay Dưa hấu được trồng ở châu Âu vào thế kỷ thứ 13 và châu Mỹ vào thế kỷ thứ

16 Ở Việt Nam, dưa hấu được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm với hạt giống từ trời do chim từ phương Tây mang đến Hiện nay, dưa hấu được trồng phổ

biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó hơn nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, Châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Ellul và cs, 2007) [70] Thông qua việc việc canh tác và chọn lọc kéo dài, các kiểu hình mới của cây dưa hấu đã tiến hóa và thay đổi, các giống được trồng ngày nay có ít điểm tương đồng với các giống châu Phi cổ đại (Fehér, 1993) [75]

1.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý cây dưa hấu

Sản xuất dưa hấu đòi hỏi một chu kỳ sinh trưởng dài và điều kiện khí hậu thích hợp Hiện nay, người tiêu dùng đã có nhiều nhận thức cao về giá trị dinh dưỡng và công dụng

ẩm thực của loại cây trồng này Đi kèm nhu cầu tiêu thụ sản phẩm cây dưa hấu và sự cải tiến đa dạng về giống cây trồng, để thu được lợi nhuận, người sản xuất phải tạo ra sản lượng dưa chất lượng cao, đa dạng về hình thức như các loại quả nhỏ và không hạt, cùng với sự phát triển các kỹ thuật chế biến sau thu hoạch dưới dạng sản phẩm đóng gói cắt sẵn, đã cải thiện sự tiện lợi của việc phục vụ loại nông sản này

Dưa hấu là cây nhỏ, thân mềm, có lông, phân nhánh, màu sắc lá thay đổi xanh – xanh đậm – xanh lá cây (Schaffer và cs, 2013) [138] Dưa hấu là loài duy nhất thuộc họ bầu bí có lá được phân chia thành các thùy lá (Hình 1.1) Trong quá trình canh tác, quan sát bốn dấu hiệu sau đây có thể xác định được thời điểm quả dưa hấu chín: (1) Các tua xoăn màu xanh nhạt trên thân gần vị trí đậu quả chuyển sang màu nâu và khô Một số giống tua xoan chuyển sang màu nâu từ 5 – 10 ngày trước khi quả chín hoàn toàn; (2)

Bề mặt lớp vỏ giảm độ bóng và chuyển sang xỉn màu; (3) Lớp vỏ của quả sần sùi và dễ dàng dùng tay ấn nhẹ tạo vết nứt trên vỏ; (4) Quả khi chín có màu xanh đậm, lớp vỏ tại

vị trí gần sát mặt đất sẽ chuyển sang màu vàng, vỏ có màu xanh càng đậm thì khi chín xuất hiện màu vàng càng rõ (Wehner, 2008) [170]

Hình 1.1 Cây dưa hấu Citrullus lanatus (Thunberg) Matsum & Nakai được trồng tại

Phú Yên vụ Đông xuân 2022 – 2023

Cây dưa hấu có thể được trồng trên đồng ruộng bằng cách gieo hạt hoặc cây con (Wehner, 2008) [170] Để đạt tỷ lệ gieo trồng cao, hạt dưa hấu nên được gieo để nẩy mầm trong bầu có chưa giá thể phù hợp Điều quan trọng kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để hạt nảy mầm và cấy ra ngoài đất trồng khi cây không quá lớn Để đạt hiệu quả cao, người sản xuất nên sử dụng màng phủ nhựa để bảo vệ đất, giữ đất ẩm, lữu trữ nguồn dinh dưỡng có trong đất và bảo vệ cây con tránh khỏi côn trùng gây hại Cây được trồng thành từng luống, giữa các cây được trồng với khoảng cách rộng vì cây

có thân bò Khoảng cách trồng giữa các cây dưa hấu có thể tùy thuộc vào quy mô của vườn trồng, lượng nước tưới sẵn có và chất lượng đất Khoảng cách giữa các cây điển hình trong hàng dao động từ 1 – 1,8m trên đất được tưới tiêu, đến một cây cách nhau 1,8 – 3,04m trên đất khô Khoảng cách hàng thường thay đổi từ 1,82 – 5,4m Việc kiểm soát chất lượng của đất, côn trùng và dịch bệnh cần được điều chỉnh theo khoảng cách giữa các cây Người sản xuất có thể điều chỉnh khoảng cách trồng để đạt được chất lượng quả, kích thước và sản lượng dưa tốt nhất cho nhu cầu thị trường Một số người sản xuất gieo hạt thành hai hàng khoảng cách dưới 1m, cho phép các cây non mọc cùng nhau để bảo vệ cây con tránh bị ảnh hưởng bởi gió Dưa hấu có thể được cấy trên đất trống hoặc gieo hạt trên đất có phủ bạt

Cây dưa hấu (C lanatus) thích ứng với khí hậu nóng, khô hạn và được thuần hóa

trong điều kiện canh tác ở vùng nhiệt đới (Schaffer và cs, 2013) [138] Cường độ ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao thúc đẩy sự ra hoa và phát triển quả cây dưa hấu (Wehner, 2008) [170] Nhiệt độ đất trồng tối ưu để hạt dưa hấu nẩy mầm là từ 21,1 – 35oC, hạt sẽ không nảy mầm nếu nhiệt độ đất dưới 15,5 oC (Shrefler và cs, 2015) [162]

Dưa hấu phát triển tốt nhất trên đất thịt pha cát, thoát nước tốt và độ pH thấp, nhưng phát triển tốt nhất ở vùng trồng độ pH của đất khoảng từ 6,0 đến 6,8, bón vôi nếu độ pH của đất dưới 5,5 Khi trồng trên đất thịt, cây phát triển chậm, kích thước và chất lượng quả dưa hấu thường kém hơn Đất cát mịn tạo ra những quả dưa có chất lượng cao, nhất là khi

có chế độ chăm sóc tốt, cung cấp đủ nước và bón phân Sử dụng hệ thống tưới nhỏ giọt trở nên phổ biến hơn với các vườn trồng có quy mô lớn Tưới nhỏ giọt kết hợp với bón phân

có thể cung cấp cho cây dưa hấu nguồn nitơ thích hợp và liên tục mà không cần bón lượng lớn cùng một lúc (Shrefler và cs, 2015) [162]

Việc lựa chọn một hoặc nhiều giống dưa hấu phù hợp là một trong những quyết định quan trọng nhất của người sản xuất Sử dụng các giống không phù hợp với thị trường tiêu dùng và tình hình sản xuất cụ thể sẽ dẫn đến việc lợi nhuận thấp, có thể ví dụ việc gieo trồng một số giống phổ biến để phục vụ nhu cầu tiêu dùng tại địa phương nhưng không phù hợp

để vận chuyển xa cũng không mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất Do đó, ngoài khả năng được thị trường ưa chuộng, các giống dưa hấu sử dụng phải có năng suất cao ổn định, thích ứng với vùng sản xuất và có các đặc tính kháng bệnh nhất định ở mức độ

cao Ngoài các giống dưa hấu có hạt hay giống dưa chuyên lấy hạt thông thường, việc lai tạo các giống dưa không hạt cũng là xu hướng phát triển để phục vụ nhu cầu người tiêu dung Dưa hấu tam bội thường được gọi là dưa hấu không hạt, là sự lai giữa một giống lưỡng bội thông thường (hai bộ nhiễm sắc thể) và một dòng tứ bội (bốn bộ nhiễm sắc thể) Dưa tam bội có hạt chưa phát triển, nhưng đôi khi có một hoặc nhiều hạt phát triển Việc trồng cây tam bội phải bao gồm giống dưa hấu có hạt rải rác khắp ruộng để làm nguồn phấn hoa cần thiết cho quá trình hình thành quả không hạt Sử dụng giống có quả ăn được hoặc giống có khả năng tạo phấn hoa chỉ nhằm mục đích cung cấp phấn hoa Dưa hấu tam bội

có thể được sản xuất ở bất cứ nơi nào mà dưa hấu thông thường được trồng Các loại không hạt thường được trồng trên đồng ruộng bằng phương pháp cấy ghép, do chi phí hạt giống

và khó khăn trong việc trồng cây (Shrefler và cs, 2015) [162]

Tùy theo từng loại giống và nhu cầu của thị trường tiêu thụ, quả dưa hấu có kích thước thay đổi từ nhỏ, vừa, lớn hoặc khổng lồ với trọng lượng từ 2 – 20kg; hình dáng đa dạng như hình tròn, hình obovate (hình dạng trứng ngược, đầu nhỏ về phía cuốn lá), hình khối hoặc trái tim; màu vỏ đơn sắc (xanh lá cây nhạt, đậm; đỏ, trắng hay vàng) hoặc đa sắc (màu xanh hay xám có các sọc trắng hẹp hay rộng); thịt quả thường màu đỏ, một số khác màu vàng, cam hoặc trắng, ngọt và có hạt hay không hạt (Wehner, 2008) [170] Dưa hấu có màu xanh nhạt và xanh xám ít bị tổn thương do cháy nắng hơn các loại dưa có màu xanh đậm và sọc (Shrefler và cs, 2015) [162]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của cây dưa hấu

Dưa hấu bao gồm da, vỏ, thịt và hạt Vỏ ăn được chiếm khoảng 40% tổng khối lượng dưa hấu nhưng thường bị loại bỏ như chất thải gây ra các vấn đề về môi trường

Vỏ dưa hấu rất giàu nguồn axit béo, khoáng chất, hợp chất phenolic và chất xơ Nó cũng chứa carbohydrate hòa tan, carotenoids, alkaloid, saponin và phytates Vỏ quả dưa hấu (Watermelon Rind – WMR) là một dạng chất thải nông nghiệp có giá trị kinh tế và cần được khai thác triệt để Hầu hết vỏ quả dưa hấu sau khi được gọt, sơ chế và làm sạch có thể được dùng làm nguyên liệu để chế biến thành đường, màu thực phẩm hay chiết xuất hoạt chất acid citric Ngày nay, xu hướng phục hồi các thành phần có giá trị từ các bộ phận thực phẩm bị bỏ quên và đưa chúng trở lại chuỗi thức ăn một cách kinh tế và bền vững đang ngày càng trở nên quan trọng Điều này

có thể giúp giảm thiểu thất thoát và lãng phí lương thực, giảm tác động đến môi trường, tối đa hóa lợi nhuận nông nghiệp và cải thiện tính bền vững của lương thực

ở quy mô thương mại bằng cách chuyển đổi chất thải nông nghiệp có giá trị cao này thành các chất có hoạt tính sinh học cải tiến, tăng giá trị thương mại của chất thải sinh học (Devi và Prabhavathy, 2023) [66] Các sản phẩm tái chế từ chất thải nông nghiệp có giá trị gia tăng đơn giản, tiết kiệm chi phí và được người dân ưa chuộng Hơn nữa, nguồn nguyên liệu dễ dàng tìm kiếm, có thể xây dựng được mô hình tổ

chức đào tạo tập huấn, cải thiện sinh kế cho người nông dân, đặc biệt là đối tượng phụ nữ ở các nhóm tự lực, hộ sản xuất để cải thiện nền kinh tế người dân địa phương

Dưa hấu được dùng như một dạng thực phẩm tươi ăn trực tiếp bằng cách cắt lát, miếng (thường có trong salad trái cây), nước ép, sản xuất thành kẹo và hạt có thể ăn được Dưa hấu được dùng như trái cây hàng ngày tương tự như táo, chuối và cam (Wehner, 2008) [170] Dưa hấu là thực phẩm có nhiều khoáng chất, thịt quả chứa hàm lượng carotenoid lớn và cung cấp nước Dưa hấu chứa 5 – 10% đường, 0,22% kali, 0,016% natri, 0,022% canxi trong trọng lượng tươi thịt quả Hàm lượng vitamin A, C trong thịt quả dưa hấu cao hơn 40% so với cà chua Hạt dưa hấu chứa các acid béo không bão hòa đa như linoleic acid (50 – 60% trọng lượng khô), oleic acid (15% trọng lượng khô) và các acid béo bão hòa như palmitic acid, stearic acid và glyceride lưu trữ Các acid béo được sử dụng để điều chế dầu, mỹ phẩm và điều trị bệnh Dầu từ hạt dưa hấu

là nguồn dược liệu sử dụng trong điều trị ung thư, bệnh tim mạch vành hoạt động ở mức biểu mô và màng tế bào, giúp giảm nồng độ cholesterol và huyết áp cao Các chất trung gian của linoleic acid và α-linolenic acid được sử dụng trong công nghệ gen (El-Adawy

và Taha, 2001; Logaraj, 2010) [71, 119]

Sắc tố đỏ lycopene có trong thịt quả dưa hấu là một dạng carotenoid có khả năng chống oxy hóa hiệu quả Một chế độ ăn giàu hàm lượng lycopene có khả năng giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, chủ yếu là ung thư tuyến tiền liệt (Giovannucci, 2002) [86] Dưa hấu là nguồn cung cấp lycopene quen thuộc trong thực phẩm, chứa trung bình 48,6 lycopene/g trọng lượng tươi (Holden và cs, 1999) [94]

Dưa hấu có chứa hai loại axit amin là citrulline và arginine (Perkins-Veazie và

cs, 2007) [141] Citrulline là tiền chất của arginine, một axit amin bán thiết yếu cần thiết cho trẻ sơ sinh và người lớn bị bệnh nặng hoặc bị thương (Flynn và cs, 2002) [77] Arginine có thể được tạo ra thông qua nitric oxit synthase hoặc thông qua arginase trong chu trình urê (Tong và Barbul, 2004) [167] Các axit amin citrulline và arginine đã được các nhà y học nghiên cứu vì tính hữu ích trong điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, chức năng miễn dịch, chữa lành vết thương và sức khỏe tim mạch (Tong và Barbul, 2004) [167] Ngoài ra, citrulline còn có khả năng giảm lượng mỡ trong cơ thể sau khi chuyển hóa thành arginine, ngăn chặn hoạt động của phosphatase kiềm không đặc hiệu (TNAP) của mô và ngăn ngừa sự tích tụ chất béo Hàm lượng citrulline trong vỏ quả dưa hấu nhiều hơn trong thịt quả (Devi và Prabhavathy, 2023) [66]

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT DƯA HẤU TRÊN THẾ GIỚI, TẠI VIỆT NAM VÀ PHÚ YÊN

Dưa hấu (C lanatus) được xếp hạng trong số 10 loại rau quả có tầm quan trọng kinh

tế hàng đầu thế giới (Schaffer và Paris, 2016) [156] Hiện nay, sản lượng dưa hấu tại các

quốc gia Châu Á chiếm hơn 80% sản lượng dưa hấu trên toàn Thế giới Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn nhất, sản lượng chiếm 67,6% trên Thế giới Châu Phi, Châu Âu và Bắc Mỹ có sản lượng tương đương, đạt khoảng 3 – 4 triệu tấn mỗi năm Mỗi một khu vực hay quốc gia sẽ có hệ thống sản xuất dưa hấu khác nhau, tùy thuộc vào khí hậu nông nghiệp,

từ nhà kính đến cánh đồng phù hợp với mức độ ứng dụng công nghệ cao khác nhau Hầu hết, ở các vùng nông thôn, dưa hấu được trồng xen kẽ với các loại cây rau màu khác (Dube

và cs, 2021) [69] Một số quốc gia có diện tích trồng dưa hấu và sản lượng cao nhất Thế giới như: Trung Quốc, Thổ Nhĩ Kỳ, Ấn Độ, Algeria, Brazil, Nga, Pakistan, Hoa Kỳ, Việt Nam… Năm 2021, Trung Quốc là quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất thế giới với sản lượng đạt hơn 60,5 triệu tấn/năm, tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ 3,4 triệu tấn/năm, Iran 3,2 triệu tấn/năm… (Bảng 1.1) (FAOSAT, 2023) [73]

Bảng 1.1 Top 15 quốc gia sản xuất dưa hấu lớn nhất Thế giới năm 2021

STT Quốc gia Diện tích (ha) Sản lượng (tấn)

tấn/ha (Bảng 1.1) (FAOSAT, 2023) [73] Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, phù hợp với sự phát triển của cây dưa hấu Tại khu vực miền Trung, dưa hấu được trồng tập trung ở Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên

Trong những năm gần đây, sản xuất dưa hấu tại Phú Yên có xu hướng gia tăng

và trở thành một trong những cây trồng có tiềm năng canh tác trong sản xuất nông nghiệp

ở Phú Yên Sản lượng dưa hấu của toàn tỉnh đạt 35.903,37 tấn và năng suất 23,33 tấn/ha Phú Yên là tỉnh ven biển Nam trung bộ có địa hình địa hình dốc từ Tây sang Đông, đồi núi chiếm 70% diện tích toàn tỉnh Thổ nhưỡng tại Phú Yên có các nhóm đất chính là đất đỏ vàng, đất xám bạc màu, đất đen, đất phù sa dọc theo sông, suối và đất cát ven biển Phú Yên nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô Tài nguyên khí hậu thủy văn tỉnh Phú Yên khá đa dạng các chế độ mưa, chế

độ nhiệt, chế độ ẩm, tương đối thuận lợi cho nông nghiệp Tuy nhiên, trong những năm gần đây, khí tượng thủy văn có nhiều thay đổi

Trong giai đoạn từ 2014 – 2021, tình hình sản xuất dưa hấu tại Phú Yên ổn định qua các năm và chủ yếu gieo trồng trong vụ Đông xuân để phục vụ Tết Nguyên Đán và xuất khẩu Năm 2014, tổng diện tích gieo trồng dưa hấu là 1.159 ha, năng suất bình quân

là 16,92 tấn/ha Năm 2020, tổng diện tích gieo trồng dưa hấu là 1.977,81 ha, năng suất bình quân là 23,01 tấn/ha Năm 2021, do tình hình dịch bệnh, diện tích dưa hấu năm

2021 có giảm so với năm 2020, tổng diện tích dưa hấu là 1.538,73 ha, năng suất bình quân là 23,33 tấn/ha (Bảng 1.2)

Tại Phú Yên, cây dưa hấu được tập trung trồng chủ yếu ở các huyện miền núi như huyện Sông Hinh (xã Đức Bình Đông, Đức Bình Tây, Ea Trol, Sơn Giang), huyện Sơn Hòa (xã Sơn Hội, Ea Chà Rang, Sơn Phước, Sơn Hà, Sơn Định), huyện Đồng Xuân (xã Đa Lộc, Xuân Lãnh, Xuân Quang 1, Xuân Quang 2, Xuân Quang 3) và các xã vùng đất đồi thuộc huyện Tuy An (xã An Nghiệp, An Lĩnh), huyện Tây Hoà (xã Hoà Phú, Hoà Tân Tây), huyện Phú Hoà (xã Hoà Hội) Các địa phương còn lại diện tích trồng dưa không đáng kể (Bảng 1.3)

Sản xuất nông nghiệp gặp nhiều khó khăn do các nguyên nhân như biến đổi khí hậu, diễn biến sâu bệnh gây hại cây trồng phức tạp và việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong nông nghiệp Thành phần sâu bệnh hại phổ biến và gây hại nặng ở Phú Yên là bọ trĩ, sâu xanh ăn lá, sâu khoang và bệnh nứt thân chảy nhựa Cây dưa hấu mặc dù có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, nhưng diện tích và năng suất còn hạn chế, chưa đáp ứng được nhu cầu và thị hiếu của thị trường Việc quản lý trong sản xuất có nhiều bất cập, kém bền vững như sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu không đúng liều lượng, không đảm bảo thời gian cách ly dẫn đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật còn tồn đọng trên sản phẩm thu hoạch, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường, làm giá trị kinh tế cây dưa

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất dưa hấu ở Phú Yên trong giai đoạn 2014 - 2021 Năm

Diện tích (ha) Năng suất

(tấn/ha)

Sản lượng (tấn) Đông

Xuân

Cả năm Tỷ lệ gieo

trồng (%)

Đông Xuân

Cả năm Đông Xuân

Nguồn: Cục thống kê tỉnh Phú Yên, 2022

Bảng 1.3 Diện tích sản xuất dưa hấu (ha) tại các địa phương ở Phú Yên trong giai

đoạn 2014 - 2021

Năm Sông

Hinh

Sơn Hoà

Đồng Xuân

Phú Hoà

Tây Hoà

Tuy

An

Đông Hoà

Tuy Hoà

Sông Cầu

Trước nhu cầu tiêu thụ của thị trường nói chung và xu hướng sản xuất của địa phương nói riêng, Nhà nước đã xây dựng định hướng lâu dài cho việc sản xuất nông sản, tạo động lực thúc đẩy các vùng sản xuất rau, quả phát triển theo hướng bền vững, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng bằng nhiều văn bản, cụ thể như Quyết định số 124/QĐ-TTg ngày 02/02/2012 về việc phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030, Quyết định số 899/QĐ-TTg ngày 10/6/2013 về việc phê duyệt Đề án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theo hướng nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững của Thủ tướng Chính phủ; Quyết định

số 1976/QĐ-UBND ngày 10/10/2017 về việc phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất nông nghiệp tỉnh Phú Yên đến năm 2025, tầm nhìn đến năm 2030, Chỉ thị số 14/CT-UBND ngày 23/8/2013 về việc tăng cường quản lý sản xuất, tiêu thụ rau để đảm

để đảm bảo an toàn thực phẩm trên địa bàn tỉnh của UBND tỉnh Phú Yên; Công văn số 854/SNN ngày 26/8/2013 về việc tăng cường quản lý sản xuất tiêu thụ rau để đảm bảo ATTP trên địa bàn tỉnh, Công văn số 916/SNN ngày 14/10/2011 về việc tăng cường kiểm soát việc sử dụng hóa chất trong sản xuất thực phẩm nông sản của Sở Nông nghiệp và PTNT Phú Yên Để đảm bảo chất lượng các loại nông sản, đặc biệt sản phẩm rau, quả xanh đòi hỏi các nhà khoa học và người sản xuất cần đưa ra nhiều giải pháp thực hiện

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH NỨT THÂN CHẢY NHỰA TRÊN CÂY DƯA HẤU

DO NẤM Didymella bryoniae GÂY RA

1.3.1 Vị trí phân loại nấm Didymella bryoniae

Nấm Didymella bryoniae thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, bộ Dothideomycetes, họ Didymellaceae, chi Didymella Tên khoa học là Mycosphaerella

melonis hay Didymella bryoniae (sinh sản hữu tính) và Phoma cucurbitacearum (Fr.)

Sacc (sinh sản vô tính)

Họ Didymellaceae là một trong những họ đa dạng nhất trong bộ nấm Pleosporales (Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes), với hơn 5400 taxo được liệt kê tại MycoBank (Crous và cs, 2004) [64] Hệ thống phân loại của họ Didymellaceae đã trải qua những thay đổi đáng kể thông qua các phân tích về hình thái học và phát sinh loài dựa trên dữ liệu về trình tự DNA của các chủng được được định danh trước đó (Chen và cs, 2015a) [55] Theo Aveskamp và cs (2010) [39], họ

Didymellaceae gồm ba chi chính là Ascochyta, Didymella, Phoma và các nhóm tương

đồng khác được nhóm lại trong họ Didymellaceae, vùng ranh giới của họ

Didymellaceae, gồm các chi Epicoccum, Peyronellaea, Stagonosporopsis và đề nghị thêm các chi khác là Boeremia, Leptosphaerulina và Macroventuria Trong những

nghiên cứu mới nhất, dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự DNA đa locus, họ

Didymellaceae được phân loại và phân chia thành 19 chi, bao gồm: Allophoma,

Heterophoma, Calophoma (Chen và cs, 2015a, b) [55, 56], Ascochyta, Didymella,

Phoma, Phomatodes, Epicoccum, Peyronellaea, Stagonosporopsis, Boeremia, Leptosphaerulina, Macroventuria, Nothophoma (Aveskamp và cs, 2010) [39], Briansuttonomyces (Crous và Groenewald, 2016), Neomicrosphaeropsis

(Thambugala và cs, 2017), Didymellocamarosporium (Wijayawardene và cs, 2016),

Heracleicola, Neodidymella (Ariyawansa và cs, 2015) (Chen và cs, 2017) [57]

Các loài nấm gây bệnh thuộc họ Didymellaceae có tính toàn cầu và môi trường phân bố đa dạng, phạm vi phân bố rộng và xuất hiện phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Caribê, Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Đại Dương (CABI, 2015) [52] Hầu hết các thành viên trong họ này là mầm bệnh của nhiều loài thực vật ký chủ, gây bệnh trên

lá và thân (Aveskamp, 2010, 2010; Chen, 2015a, b) [39, 55, 56] Khoảng 70 loài thực vật đóng vai trò là cây ký chủ của họ Didymellaceae, bao gồm các loài cây thuộc họ Cúc (Asteraceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Hòa thảo (Poaceae), họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoa hồng (Rosaceae), họ Bầu bí (Cucurbitaceae) và họ Cà

(Solanaceae) (Chen, 2017) [57] Nấm D bryoniae phân bố khắp Thế giới, ghi nhận xuất

hiện nhiều ở Trung và Nam Mỹ, Caribê, Châu Á, Châu Phi, Châu Âu và Châu Đại Dương (CABI, 2015) [52] Dựa trên sự biến động di truyền của thực vật ký chủ và tác

nhân gây bệnh, Santos và cs (2009) [154] đã đánh giá khả năng gây bệnh của nấm D

bryoniae đối với cây trồng

1.3.2 Đặc điểm hình thái và di truyền nấm Didymella bryoniae

Các đặc điểm về cấu trúc bào tử của nấm D bryoniae có thể được xác định bằng

các phương pháp gồm phân tích môi trường sinh trưởng, phát triển của bào tử nấm gây bệnh, các đặc điểm về cấu trúc, hình dạng bào tử, kích thước bào tử nấm gây bệnh và kỹ

thuật sinh học phân tử Nấm D bryoniae có hai hình thức sinh sản là sinh sản hữu tính và

sinh sản vô tính (Newark, 2014) [132] Trên thân và lá của cây bị nhiễm bệnh có thể quan sát cả hai hình thức sinh sản Các sợi nấm phát triển bên trong mô của cây và tạo ra các đốm bệnh trên lá hoặc vết nứt trên thân hoặc nhánh (Nguyễn Thị Thu Nga, 2009) [19]

Ở giai đoạn sinh sản vô tính, nấm có tên khoa học là Phoma cucurbitacearum (Fr.) Sacc Tên khoa học Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm được công bố năm 1881

do Rehm đề nghị, sau đó ông chuyển những loài đuợc mô tả bởi Auerswald (1869) đến

chi mới là Didymella Sacc (Nguyễn Thị Thu Nga, 2010) [134] Quả thể vô tính có tên

là quả cành (pycnidia) tạo ra các bào tử phân sinh (conidia) để thực hiện cơ chế di truyền Quả cành có dạng hình cầu, màu đen, đường kính 120 – 180 µm và được hình thành ngay trên bề mặt mô ký chủ Quả cành chứa bào tử phân sinh, mỗi bào tử có 1 - 2 tế bào dạng hình thoi, kích thước 6 - 13µm (Keinath, 2002) [158] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Giai đoạn sinh sản vô tính Phoma cucurbitacearum

(A) Quả cành (pycnidia) màu đen, 120 – 180µm, bám trên bề mặt lá, thân và

quả (B) Bào tử phân sinh (conidia), đơn bào, đầu trong, hình trụ, trong suốt, không có

vách ngăn hoặc vách ngăn đơn (Newark và cs, 2014) [132]

Ở giai đoạn sinh sản hữu tính, nấm có tên là Mycosphaerella melonis (Pass.) Chiu

& J C Walker hay D bryoniae (Auersw.) Rehm (Chiu và Walker, 1949) [60], cơ chế

di truyền được thực hiện bằng quả thể có dạng hình bầu (perithecia) tạo ra các bào tử túi (ascospores) Quả thể dạng hình bầu được hình thành do sự dung hợp hữu tính của hai sợi nấm khác nhau, sợi nấm có vách và sợi nấm phân nhánh Nhân của sợi nấm dung hợp thành hợp tử (n × n = 2n), sau các lần phân bào nguyên phân và giảm phân tạo ra bốn tế bào đơn nhân Các tế bào này kéo dài và phân bào nguyên phân tạo ra tám bào tử túi (ascospore) được chứa bên trong một túi bào tử (asci) Quả thể dạng hình bầu màu đen, đuờng kính từ 140 – 200µm, bên trong chứa các túi bào tử có kích thuớc 60 - 90 ×

10 - 15µm Bào tử túi có dạng hình trụ hoặc elip, nhọn hai đầu, có vách ngăn ngang và kích thuớc 15 - 21 × 5 - 8µm (Punithalingam và Holiday, 1972) [144] (Hình 1.3) Giai đoạn hữu tính của nấm được quan sát thấy xảy ra ngoài tự nhiên tại các vùng trồng dưa hấu ở Brazil (Santos và Filho, 2009) [154]

Ngoài ra, một trường hợp đặc biệt hiếm khi xuất hiện ở giai đoạn sinh sản hữu tính

là sự xuất hiện của các cấu trúc giả quả thể bầu (psuedothecia) Quả thể giả dạng hình bầu chỉ được tìm thấy trên cây bị nhiễm bệnh, đặc biệt là thân cây Quả thể giả có màu đen, kích thước 125 – 213 µm, chứa các túi bào tử Mỗi túi bào tử chứa tám bào tử túi (Hình 1.4)

Tùy vào thời điểm và điều kiện thời tiết, nấm D bryoniae có thể hình thành quả

thể dạng hình bầu bầu hoặc quả cành trên cây ký chủ hay đôi khi có thể được tìm thấy trong cùng mô cây ký chủ bị tổn thương Các bào tử túi ở giai đoạn hữu tính đóng vai trò là nguồn bệnh sơ cấp, đó là mầm bệnh chính và dễ dàng phát tán xa nhờ gió Bào tử phân sinh ở giai đoạn vô tính đóng vai trò là nguồn bệnh thứ cấp, được giải phóng ở dạng keo, di chuyển trong khoảng cách ngắn nhờ giọt nước

Hình 1.3 Giai đoạn sinh sản hữu tính Didymella bryoniae

(A) Quả thể dạng hình bầu (perithecia) màu đen, 200 µm (B) Túi bào tử (asci) chứa bào tử túi (ascospore) (C) Bào tử túi (Newark và cs, 2014) [132]

Hình 1.4 Giai đoạn sinh sản hữu tính Didymella bryoniae

(A) Quả thể giả dạng hình bầu (pseudothecia) màu đen, 125 – 213 µm (B) Túi bào tử (asci) chứa 8 bào tử túi (ascospore) (C) Bào tử túi, 14 – 16 x 4 – 6 µm (Newark

và cs, 2014) [132]

Để chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh, các mẫu bệnh thu được cần phải được phân lập và làm thuần, sau đó so sánh với các mẫu đã biết trước đó hoặc được kiểm tra lại bằng cách lây nhiễm bấm bệnh trên cây khỏe Để chứng minh chủng vi sinh vật thu thập và phân lập được thuộc họ Didymellaceae cần đánh giá dựa trên các quan sát về hình thái và xác định loài thực vật ký chủ (Aveskamp, 2010; Chen, 2015a) [39, 55] Tuy nhiên, việc định danh chính xác loài nấm cần dựa trên các phân tích về mặt di truyền bằng các kỹ thuật sinh học phân tử gồm kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction – PCR) và kỹ thuật DNA đa hình và nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) (Somai, 2002; Basim, 2016) [158, 43] Qua đó, xác định trình tự vùng phiên mã bên trong 5,8S rDNA (ITS), trình tự DNA của tiểu đơn vị lớn 28S rDNA (LSU), tiểu đơn vị

nhỏ 18S rDNA (SSU), trình tự của RNA polymerase II của tiểu đơn vị lớn thứ hai (rpb2)

và vùng gen β-tubulin (tub2) (Babu, 2015; Chen, 2015a) [42, 55] để để nhận dạng thành

công, chính xác loài D bryoniae

Từ thập kỷ 80 của thế kỷ XX, các phương pháp sử dụng chỉ thị di truyền đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử Chỉ thị di truyền là chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các loài khác nhau, không thể hiện cho các gen mục tiêu mà chỉ là dấu hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu” Các chỉ thị di truyền chiếm một vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể

(NST) được gọi là locus, liên kết với gen và thực hiện di truyền theo các qui luật di truyền

Chỉ thị di truyền gồm chỉ thị truyền thống và chỉ thị phân tử Chỉ thị truyền thống gồm chỉ thị hình thái (tính trạng; đặc điểm hình thái như màu sắc, kiểu hình hạt; đặc điểm sinh trưởng…), chỉ thị tế bào (cấu trúc nhiễm sắc thể) và chỉ thị sinh hóa Chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) nằm gần hoặc liên kết với gen, ít hoặc không ảnh hưởng đến kiểu hình, đánh dấu sự thay đổi trong phân tử DNA và được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau

về phương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình Chỉ thị DNA được sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen; chọn lọc nguồn gen và chọn giống (Nguyễn Đức Thành, 2014) [25]

Các phân tích dựa trên phương pháp điện di đã chứng minh việc phân loại các loài thành nhiều chi khác nhau tùy theo sự giống nhau về mặt tiến hóa dựa trên trình tự các vùng ITS của chúng Các trình tự được phân tích cho thấy mối liên hệ với các chủng

phân lập có liên quan đến D bryoniae và phù hợp với đặc điểm nhận dạng nucleotide

được khai thác từ cơ sở dữ liệu GenBank Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR thông thường đã tạo ra các đoạn phân tử khuếch đại có kích thước khoảng 120; 780 và 560bp tương ứng với các đoạn cặp primer DB-F3/DB-R3, GSBF1/GSBR1 và ITS1/ITS4 (Bảng 1.4) (Basim, 2016) [43]

Bảng 1.4 Primer và điều kiện phản ứng PCR để xác định Didymella bryoniae

Primers Chuỗi trình tự nucleotid

Điều kiện thực hiện phản ứng PCR điện di

Điều kiện thực hiện phản ứng PCR – real time

3’

1.3.3 Bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu do nấm Didymella bryoniae gây ra

Các đối tượng sinh vật gây hại trên cây trồng thuộc họ Bầu bí gồm sâu hại, bệnh hại gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng Trong đó, bệnh nứt thân chảy nhựa

do nấm Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm gây ra là bệnh gây hại chính trên nhóm

cây họ Bầu bí nói chung và cây dưa hấu nói riêng (Somai và cs, 2002; Newark, 2014) [158, 132] Bệnh nứt thân chảy nhựa được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới nhưng bệnh gây hại nặng nhất ở những vùng địa lý có khí hậu nóng và ẩm (Sitterly và Keinath,

1995, Choi và cs, 2010) [97, 59] Bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm D bryoniae gây ra

có nguồn bệnh tồn tại từ đất, không khí hoặc lây lan từ nguồn hạt giống Tuy nhiên những bộ phận của cây bị nhiễm và chết từ vụ trước là một trong những nguồn lây bệnh quan trọng nhất Nguồn bệnh từ không khí cũng được ghi nhận như là nguồn xâm nhiễm chính trên dưa hấu (Nguyễn Thị Thu Nga, 2009) [15] Nguồn bệnh sơ cấp trên ruộng

dưa mới trồng có thể từ hạt giống, trong đất hay từ không khí do gió mang bào tử từ nơi

khác đến Nấm D bryoniae có thể tồn tại trong hạt Bào tử trên bề mặt hạt có thể sống

sót 21 tháng và sự tồn tại của sợi nấm trong hạt được ghi nhận 41,7% sau 24 tháng (Chen

và cs, 2021) [58] Hầu hết cây con được ghi nhận do nấm D bryoniae trong nhà lưới

trước khi đem ra ngoài đồng Việc sử dụng những hạt giống bị nhiễm bệnh để gieo trồng

làm gia tăng sự nghiêm trọng của bệnh trên đồng ruộng Trong đất, D bryoniae có thể hình thành bào tử áo để lưu tồn ít nhất trong hai năm (Keinath, 2002) [158] Nấm D

bryoniae có thể tồn lưu trong hạt giống hay trên xác bả thực vật nằm trong đất trên hai

năm ở dạng vô tính (pycnidia) hay hữu tính (pseudothecia), sợi nấm hoặc các bào tử

vách dày Nguồn bệnh nấm D bryoniae có thể bắt nguồn từ đất, hạt giống, không khí,…

Trong các con đường lan truyền thì lan truyền qua đất là nghiêm trọng nhất Ngoài ra mầm bệnh có thể bắt nguồn do mưa và nước tưới từ lá, thân cây bệnh xâm nhiễm lên các lá cây khỏe Bệnh gây hại nặng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất trái (Guner

và Wehner, 2003; Santos, 2009) [83, 154] Bệnh còn một số tên gọi phổ biến khác như bệnh chạy dây, bệnh bã trầu, bệnh xì mủ thân, bệnh bạc lá…

Trong các chỉ số về khí hậu, nhiệt độ và ẩm độ là hai yếu tố chủ đạo xác định tính chất biến động di truyền của nấm gây bệnh, ảnh hưởng đến diễn biến phát sinh gây hại của bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa Ngoài đồng ruộng, nhiệt độ tối ưu cho khả năng bệnh phát sinh gây hại nặng trên cây dưa hấu là là 24 oC Trong điều kiện phòng

thí nghiệm, sự xâm nhiễm mạnh của nấm D bryoniae và gây thối quả khi nhiệt độ dao

động khoảng 27,2 - 23,8 oC và diễn biến bệnh giảm ở 29,4 oC Ngoài ra, ẩm độ cũng

đóng vai trò quan trọng gây ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của nấm D bryoniae

và phát triển của mầm bệnh, ẩm độ tuyệt đối cao và đất ẩm ướt là điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhiễm

Cây dưa hấu có thể bị nấm D bryoniae xâm nhiễm ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng

nào của cây, từ cây con đến cây trưởng thành, ra hoa, đậu quả (Newark, 2014) [132] Triệu chứng nhiễm bệnh có thể quan sát thấy trên các bộ phận của cây dưa hấu như lá,

thân, rễ và trái (Neergaard, 2010) [65, 134] Bào tử nấm D bryoniae có thể xâm nhập

vào cây ký chủ gián tiếp qua vết thương cơ học hay côn trùng chích hút hoặc trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp xâm nhiễm qua lớp cutin trên bề mặt lá hay khí khổng (Neergaard, 1989; 2010) [65; 134] Thông thường vị trí nấm xâm nhiễm xảy ra ở tế bào biểu bì hoặc giữa những tế bào bảo vệ của khí khổng này với khí khổng kia Sau khi xâm nhiễm thành công, sợi nấm tăng trưởng trong những khoảng trống gian bào, kết

quả là tế bào bị phá hủy (Nguyễn Thị Thu Nga, 2009) [19] Nấm D bryoniae tạo ra nhiều loại enzyme thủy phân như polygalacturonase (PG), pectin methylesterase và

cellulase, trong đó polygalacturonase là enzyme quan trọng nhất dẫn đến sự phá vỡ tế

bào Chiu và Walker (1949) [60] cũng quan sát thấy trường hợp nấm D bryoniae xâm

nhiễm trực tiếp lên lớp biểu bì lá cây dưa hấu, sự xâm nhiễm qua khí khổng không quan sát được

Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh hại được người nông dân áp dụng chủ yếu

là sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên, với việc sử dụng thuốc không đúng liều lượng, không đảm bảo thời gian cách ly dẫn đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên quả vượt mức cho phép Nhằm quản lý bệnh hại có hiệu quả, an toàn cho môi trường và đảm bảo chất lượng sản phẩm, cần xây dựng và thực hiện một hệ thống quản lý sinh vật hại tổng hợp với nhiều biện pháp như canh tác, giống, sinh học và hóa học Trong đó, việc sử dụng vi sinh vật như một tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại đang là xu hướng tích cực trong quản lý nông nghiệp hiện đại

1.3.4 Các nghiên cứu về nấm Didymella bryoniae trên Thế giới và Việt Nam

Chiu và Walker (1949) [60] đã thực hiện các nghiên cứu đầu tiên về bệnh nứt

thân chảy nhựa do nấm D bryoniae gây ra trên cây họ Bầu bí thông qua các quan sát đặc điểm hình thái của của bào tử và độc tính gây bệnh của nấm D bryoniae Các

nghiên cứu khác tiếp tục được thực hiện dựa vào sự đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp kỹ thuật hiện đại như RAPD (Random-amplified polymorphic DNA), AFLP của đoạn ITS rDNA hay giải trình tự đoạn ITS rDNA (Somai và cs, 2002; Babu, 2015; Basim, 2016) [158, 42, 43] Nghiên cứu về độc tính của nấm cho thấy các enzym

phân hủy thành tế bào như polygalacturonase (PG), pectate lyase (PL), pectin lyase (PNL), β-galactosidase (β-Gal) và cellulase (Cx) liên quan đến khả năng gây bệnh của nấm D bryoniae (Zhang và cs, 2010) [48]

Nghiên cứu của Basim và cs (2016) [43] ghi nhận khả năng gây bệnh của nấm

D bryoniae trên cây dưa hấu (Citrullus lanatus (Thumb.)), dưa lưới (Cucumis melo L.),

dưa chuột (Cucumis sativus L.) và bí ngô (Cucurbita spp.) Cây dưa hấu mẫn cảm đối với bệnh nứt thân chảy nhựa do nấm D bryoniae hơn so với các loài cây trồng khác

trong họ Bầu bí (Santos, 2009) [154] Các triệu chứng biểu hiện bệnh xuất hiện sớm hơn

và tỷ lệ mô thực vật bị tổn thương trên cây dưa hấu cao hơn so với các loài cây khác như dưa gang, dưa chuột hay bí

Một số nghiên cứu phòng chống sinh học đối với bệnh nứt thân chảy nhựa đã được thực hiện như biện pháp kích kháng bằng hóa chất, phun dịch bào tử vi khuẩn có ích lên bề mặt lá hoặc dịch trích thực vật (Utkhede và Kock, 2004) [169]

Nghiên cứu của Zhao và cs (2016) [93] cho thấy chủng Streptomyces A12 và C28 hạn chế rõ ràng nấm D bryoniae trong in vitro Hai chủng A12 và C28 cũng hạn chế rõ

ràng bệnh hại trên rễ với hiệu lực 44,2% và trên các bộ phận phía trên 40,3% Khi sử dụng cho cây trong vườn ươm và thời điểm trồng ra ruộng chủng A12 còn làm tăng sinh

khối 18,4-49,0% so với đối chứng Các chủng A12 và C28 đều thể hiện khả năng khu trú tốt trên rễ dưa hấu (Zhao và cs, 2022) [72]

Tác nhân gây bệnh, nấm D bryoniae có khả năng tồn tại trên nhiều vị trí, gây

hại ở nhiều bộ phận của cây trồng do đó để hạn chế bệnh hại cần sử dụng một hệ thống tổng hợp bao gồm sử dụng hạt giống sạch bệnh, giống kháng bệnh, sử dụng cây con sạch bệnh, loại bỏ tàn dư cây bệnh, loại bỏ cây ký chủ phụ, luân canh cây trồng, cày vùi tàn dư, sử dụng tác nhân sinh học, sử dụng thuốc hóa học và thu hoạch bảo quản tốt để hạn chế bệnh thối trái sau thu hoạch… (Paret và cs, 2015) [117]

Tại Việt Nam, bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu đã được xác nhận do D

bryoniae gây ra ở miền Trung trên cơ sở triệu chứng bệnh hại và đặc điểm hình thái tác

nhân gây bệnh (Vũ Huy Trung và cs, 2005) [27] Các tác giả cũng đã công bố về biện pháp quản lý bệnh nứt thân chảy nhựa dưa hấu trong đó sử dụng thuốc hóa học như Topsin M, Viben-C, Derosal, Ridomil đem lại hiệu quả kinh tế cao (Vũ Huy Trung và

cs, 2005) [27] Biện pháp canh tác gồm vệ sinh đồng ruộng sau vụ trồng, khử trùng hạt giống, khử trùng đất trước khi trồng là cần thiết Luân canh những cây khác họ bầu bí ít nhất là 2 năm có hiệu quả để giảm tỷ lệ bệnh (Paret và cs, 2014; 2015) [132, 117]

Theo Nguyễn Thị Thu Nga và cs (2010) [134] vi khuẩn P fluorescens 231-1 đã được định danh lại là Pseudomonas aeruginosa 231-1, có khả năng ức chế sự phát triển của ty nấm D bryoniae trong điều kiện phòng thí nghiệm Ngoài ra, đây còn là vi khuẩn

nội sinh có khả năng di chuyển và nhân mật độ cao trong thân cây dưa hấu và hiện diện

tại vị trí nấm D bryoniae xâm nhiễm Áo hạt và tưới đất với vi khuẩn trên cây dưa hấu

giúp giảm được bệnh nứt thân chảy nhựa dựa trên cơ chế ức chế mầm bệnh bao gồm cơ chế tiết kháng sinh và kích thích tính kháng bệnh Một số kết quả nghiên cứu về vi khuẩn cho thấy sử dụng vi khuẩn có khả năng hạn chế một phần bệnh nứt thân chảy nhựa với thí nghiệm đồng ruộng

Từ những dữ liệu khoa học trên có thể thấy rằng chưa có nhiều công bố về nghiên

cứu sự đa dạng di truyền quần thể nấm D bryoniae gây hại trên cây trồng ở Việt Nam

Các nghiên cứu chủ yếu tập trung nghiên cứu giám định và các biện pháp quản lý bệnh như hóa học và sinh học Đây là là cơ sở khoa học và thực tiễn cho thực hiện đề tài thành công có đóng góp về khoa học và ứng dụng vào thực tiễn sản xuất ở miền Trung

1.4 BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH

1.4.1 Vi khuẩn Bacillus và khả năng kiểm soát tác nhân gây bệnh cây trồng

1.4.1.1 Cơ chế kiểm soát bệnh tác nhân gây bệnh cây trồng của vi khuẩn

Trong tự nhiên các loài vi sinh vật có ích luôn tồn tại, phần lớn đều có lợi cho con người, cây trồng và nguồn tài nguyên thiên nhiên Nghiên cứu và ứng dụng vi sinh

vật có ích nói chung và vi khuẩn nói riêng là biện pháp kiểm soát sinh học tác nhân gây bệnh hại cây trồng, đây chính là chìa khóa khởi tạo nền nông nghiệp bền vững (Azcón-Aguilar và Barea, 1997) [41] Hiện nay nhóm vi sinh vật sử dụng nhiều để kiểm soát và hạn chế diễn biến bệnh gây hại cây trồng là các chủng vi sinh vật vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR – Plant Growth Promoting Rhizobacteria) PGPR là những vi sinh vật cư trú tại vùng rễ của cây trồng, dễ dàng hình thành khuẩn lạc, có hệ số nhân lớn và ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tác nhân gây bệnh hại ở thực vật Vi khuẩn

có thể có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng hoặc trung tính, vi khuẩn vùng rễ có những khác biệt ưu thế hơn so với vi khuẩn trong đất (Lynch, 1990;

Lê Như Cương và cs, 2019; Nguyễn Xuân Vũ, 2021) [124, 8, 32] Trong các nhóm tác nhân sinh học được sử dụng để phòng chống bệnh hại cây trồng, nấm và vi khuẩn là nhóm vi sinh vật đang được nghiên cứu ứng dụng phổ biến trên Thế giới cũng như tại Việt Nam Tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng sử dụng tác nhân sinh học cụ thể và trên diện rộng trong việc phòng chống bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu vẫn còn hạn chế

Trong các vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm ưu thế với khoảng 95% về số lượng Một gram đất có thể chứa 10 8 – 10 9 tế bào vi khuẩn và số lượng vi khuẩn có thể phân lập và nuôi cấy được chiếm khoảng 1% số vi khuẩn hiện diện trong đất (Glick, 2012) [84] Các loài vi khuẩn có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật gây hại khác được gọi là vi khuẩn đối kháng Sự phân bố vi khuẩn trong đất phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng trong đất như nhiệt độ, ẩm độ, và một số các yếu tố khác như muối, acid và thảm thực vật Quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn có ích và tác nhân gây bệnh cho cây trồng phụ thuộc vào môi trường, cây ký chủ và tính đặc hiệu

Vi sinh vật có thể có thể tác động đến cây trồng thông qua cơ chế đối kháng tác nhân gây bệnh như sản sinh các chất kháng sinh (Brucker, 2008; Mazurier, 2009; Sherathia, 2016) [50, 128, 160] hoặc thông qua sự tổng hợp, khoáng hoá hoặc chuyển hoá các chất dinh dưỡng xảy ra trong quá trình chuyển hoá vật chất của vi sinh vật như quá trình cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp auxin, gibberellin, etylen (Costa, 2018; Gomes, 2018) [61, 82] Bằng cách tận dụng các chất dinh dưỡng được giải phóng liên tục từ rễ hoặc lá của cây trồng đang sinh trưởng và phát triển, các chủng vi khuẩn

có ích sẽ xâm nhập bề mặt lá, hệ thống rễ và lớp đất xung quanh cây trồng một cách hiệu quả

Vi khuẩn tác động có lợi đến cây trồng bằng cách bảo vệ cây tránh bị mầm mống gây bệnh thực vật tấn công cây trồng thông qua ba cơ chế chính: [1] Cạnh tranh chất dinh dưỡng; [2] Sản sinh các độc chất thực vật (allelochemical); [3] Kích thích tính kháng hệ thống kháng ở cây trồng (ISR – Induced Systemic Resistance) (Cawoy

và cs, 2011) [54]

[1] Cơ chế cạnh tranh không gian sống và chất dinh dưỡng

Sự cạnh tranh về không gian sống, các nguồn tài nguyên như chất dinh dưỡng và oxy, sinh kháng sinh hay tạo protein thường xảy ra giữa các sinh vật sống trong đất Đây là quá trình diễn ra liên tục giữa các nhóm vi sinh vật trong đất để đạt trạng thái cân bằng Với mục đích kiểm soát sinh học, vi khuẩn có ích cạnh tranh trực tiếp với tác nhân gây bệnh để chiếm các nguồn dinh dưỡng Với lượng chất nền tương đối thấp trong vùng

rễ, hiệu quả hấp thu và chuyển hóa chất dinh dưỡng của vi khuẩn là yếu tố then chốt trong khả năng cạnh tranh Sự cạnh tranh về các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm, mangan … cũng xảy ra trong đất Sắt là yếu tố tăng trưởng thiết yếu cho mọi sinh vật sống và sự khan hiếm dạng đặc hiệu sinh học ở môi trường sống trong đất dẫn đến sự cạnh tranh gay gắt (Loper và Henkels, 1997) [120] Siderophore là một loại proteine sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe+3

trong môi trường với áp lực cao nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trưởng và hô hấp của vi sinh vật, làm cho môi trường xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không có đủ ion Fe+3 cho quá trình sinh trưởng của cây, do đó chúng sẽ không sinh trưởng được (Loper và Henkels, 1997; Haas và Défago, 2005; Đặng Thị Ngọc Thanh và

cs, 2016; Louden và cs, 2011) [120, 88, 24, 122]

[2] Cơ chế ức chế trực tiếp tác nhân gây bệnh hại cây trồng

Cơ chế kháng sinh: Vi sinh vật có thể tiết ra một số hoạt chất kháng sinh (antibiosis) có tác dụng kìm hãm sự phát triển của sinh vật khác, ức chế mầm bệnh được sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, giúp cây trồng sinh trưởng và phát

triển Trong số rất nhiều phân tử có hoạt tính sinh học được Bacillus tổng hợp, các hoạt

chất kháng sinh như kanosamine, zwittermicine hay aminoglycoside hoặc các phân tử hợp chất peptide có khả năng kháng nấm hay diệt khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh hại thực vật Đối kháng (hay kháng sinh) là cơ chế được biết đến nhiều nhất và quan trọng nhất được sử dụng để hạn chế sự xâm nhập của mầm bệnh vào mô cây chủ

Các loài Bacillus như B amyloliquefaciens, B subtilis, B cereus, B licheniformis,

B megaterium, B mycoides và B pumilus được biết đến là những vi khuẩn sản xuất các

phân tử kháng sinh Bacillus subtilis có 4 – 5% bộ gen dùng để tổng hợp kháng sinh và có

khả năng tạo ra hơn 20 hợp chất kháng khuẩn với cấu trúc đa dạng (Stein, 2005) [164] Các

hợp chất peptide đại diện cho nhóm kháng sinh Bacillus chiếm ưu thế, thể được cấu tạo hoàn toàn từ các acid amin và có nhiều kích thước khác nhau Các loài vi khuẩn Bacillus

spp Có thể sản xuất ra nhiều chuỗi polipepide để hình thành nên nhiều hoạt chất kháng sinh như oligopeptide, rhizocticin phosphono-oligopeptide, lipopeptide tuần hoàn (cLP) Các

loại kháng sinh peptide chính của Bacillus có thể khác nhau về loại và trình tự của các gốc

acid amin, bản chất của chu trình peptide, độ dài và sự phân nhánh của chuỗi axit béo

(Ongena và Jacques, 2008) [136] Các oligopeptide tuần hoàn hoặc tuyến tính, được cấu tạo từ các chuỗi peptide cơ bản và xuất hiện hoạt chất kháng sinh aminoglycoside (Stein,

2005) [164] Các lipopeptide cLP Bacillus thể hiện các hoạt động kháng sinh cụ thể nên

có thể tham gia một cách khác nhau vào sự đối kháng của các mầm bệnh thực vật khác

nhau Ngoài ra, các loài vi khuẩn Bacilluscòn có thể tạo ra các chuỗi heptapeptide có

khả năng liên kết với acid béo tự do để hình thành các hoạt chất kháng sinh như surfactin, iturin và fengycin

Cơ chế ức chế khác: Khác với cơ chế kháng sinh với khả năng sản sinh các hoạt chất có trọng lượng phân tử thấp và không cần tiếp xúc vật lý, cơ chế ký sinh cũng là một cơ chế quan trọng được sử dụng bởi một số vi sinh vật có khả năng phá hủy thành

tế bào mầm bệnh bằng các enzyme phân hủy Vi khuẩn có khả năng ký sinh và sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào và gắn lên bào tử hoặc sợi nấm của mầm bệnh (Whipps, 2001) Một số tương tác khác xảy ra giữa tác nhân gây bệnh và vi khuẩn có ích đã dẫn đến khả năng kiểm soát sinh học như sự hình thành màng sinh học, bất hoạt yếu tố nảy mầm của mầm bệnh và suy thoái các độc tố gây bệnh

[3] Cơ chế kích kháng

Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB) là vi khuẩn sống xung quanh vùng rễ của cây trồng, khi tương tác với rễ cây có thể kích thích cơ chế kháng bệnh tự nhiên của cây trồng, chống lại vi khuẩn hay nấm gây bệnh Hiện tượng này được gọi là tính kháng hệ thống (ISR) (Ryu và cs, 2004) [152] Các vi khuẩn có khả năng sản sinh

chất gây cảm ứng ISR bao gồm các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas spp và Serratia spp hay vi khuẩn gram dương là Bacillus spp (Bent, 2006; Kloepper và cs, 2004, 2006)

[45, 99, 68]

Tính kháng hệ thống cây trồng (ISR) là một quá trình gồm i) tế bào thực vật nhận biết các chất kích thích được tạo ra bởi các tác nhân cảm ứng, ii) sự truyền tín hiệu cần thiết để truyền trạng thái cảm ứng trong cây và iii) cơ chế bảo vệ được kích hoạt hạn chế hoặc ức chế sự xâm nhập của mầm bệnh vào mô thực vật (Van Loon, 2007) [44] Việc phân lập một số chủng PGPR có hiệu quả trong kiểm soát sinh học hoạt động của tác nhân gây bệnh đã làm sáng tỏ sự đa dạng trong phương thức hoạt động của vi khuẩn có ích thông qua cơ chế kích hoạt hệ thống bảo vệ ở cây trồng Do tính hệ thống của cây trồng, khả năng phòng thủ được nâng cao được thể hiện ở rễ cũng như ở lá Sự kích thích hệ thống miễn dịch thực vật này đại diện cho một trong những khía cạnh mới được phát hiện về tương tác giữa thực vật và vi khuẩn (Bakker và Van Loon, 2007) [44] Một

số chủng vi khuẩn có thể làm giảm sự xâm nhiễm bệnh thông qua kích hoạt nhanh các phản ứng phòng vệ của cây khi mầm bệnh tấn công, tăng cường sức đề kháng của cây trồng (Conrath và cs, 2006) [63] Các phân tử bảo vệ như phytoalexin hay protein (chitinase, β-1,3-glucanase, chất ức chế proteinase…) và lignin có tác dụng củng cố

thành tế bào (Van Loon, 2007) [44] Thành tế bào dày lên, phân tử bảo vệ dính vào thành

tế bào hoặc các mô lân cận tế bào thực vật bị tổn thương là những rào cản ngăn chặn mầm bệnh lấy chất dinh dưỡng và làm chậm sự xâm nhập của nấm (Lugtenberg và cs, 2002) [107]

1.4.1.2 Các nghiên cứu về khả năng kiểm soát tác nhân gây bệnh cây trồng của vi khuẩn

Bacillus trên Thế giới và Việt Nam

Vi khuẩn Bacillus là loài vi sinh vật có ích tiềm năng cho hoạt động sản xuất chế

phẩm sinh học vì khả năng vi khuẩn tồn tại lâu dài trong chế phẩm

Trên Thế giới, các nghiên cứu kinh điển đã mở đầu cho xu hướng sử dụng các vi

khuẩn Bacillus trong việc kiểm soát bệnh gây hại cây trồng phải kể đến các nghiên cứu của Baker và cộng sự (1983) sử dụng chủng vi khuẩn B subtilis chủng APPL-1 để chứng minh khả năng kiểm soát bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương do nấm Uromyces

appendiculatus gây ra hay Centurion (1991) dùng B subtilis W401 làm giảm 80-100%

sự xuất hiện bệnh (Ongena, 2014) [137] Bettiol (2011( [54] đã dùng dịch chiết vi khuẩn

B subtilis thu được từ kết tủa sau phản ứng với amoni sunphat ở pH 2.0 đã ức chế hoạt

động của nấm Uromyces appendiculatus Vi khuẩn B ehimensis (Hoster và cs, 2005) [92] tạo ra các enzyme phân hủy chitin, B subtilis AF1 thể hiện một số độc tính đối với

nấm bệnh thông qua việc tiết hoạt chất N-acetyl glucosaminidase và glucanase (Manjula

& Podile, 2005) [127] Ngoài ra, vi khuẩn B subtilis cũng có thể hạn chế bệnh thán thư

trên cây đậu tương và cây bông (Bakker, 2007; Bettiol, 2011) [44, 54]

Hoạt động đối kháng của Bacillus spp liên quan đến nhiều cơ chế như kháng

sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống và kích kháng, trong đó kháng sinh là

cơ chế phổ biến Các vi khuẩn vùng rễ thuộc chi vi khuẩn Bacillus gồm nhiều loài như

B subtilis, B cereus, B amyloliquefaciens, B pumlus, B maycoides, B pastueri, B sphaericus… có thể sản sinh nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau và có ức

chế nhiều mầm bệnh gây hại thực vật (Gnanamanickam, 2009; Narayanasamy, 2013) [81, 131] Nghiên cứu của Manjula và cs (2004) [126] cho thấy sử dụng tế bào vi khuẩn

B subtilis chủng AF1 có hiệu quả hạn chế bệnh thối trái ở cây cam và bệnh gỉ sắt ở cây

lạc Chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus để trừ nấm bệnh hại cây trồng như nấm R solani,

Fusariumspp., Pyricularia oryzae (Kumar và cs, 2011; Jangir và cs, 2018) [101, 79]

Một số vi khuẩn Bacillus spp có khả năng tiết ra các loại kháng sinh như

surfactin, fengycin, iturin có bản chất là lipopeptide và các enzyme phân hủy vách tế

bào nấm như chitinase và cellulases (β-1,3, β-1,4), dẫn đến ức chế và kìm hãm khả năng

gây hại của nấm bệnh (Gisi và cs, 2009; Ashwini và Srividya, 2014) [87, 40] Các hoạt

chất liên quan đến khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn Bacillus như pumilacidin sản sinh bởi B pumilus có khả năng hạn chế nấm bệnh R solani, Pythium aphanidermatum

và S rolfsii ; surfactin và fengycin lipopeptides của B subtilis có tác dụng như một chất

tăng khả năng kháng bệnh hệ thống cho cây trồng (Ongena và cs, 2007) [135] Hoạt chất kháng sinh peptide như lantibamel hay rhizocticin phosphono – oligopeptide được sản

xuất bởi B subtilis thể hiện các hoạt động kháng nấm và diệt khuẩn (Stein, 2005; Borisova và cs, 2010) [164, 48] B cereus UW85 tạo ra hai loại kháng sinh diệt nấm,

zwittermicin A và kanosamine, được cho là góp phần ngăn chặn bệnh chết cây cỏ linh

lăng do Phytophthora medicaginis gây ra (Silo-Suh và cs, 1994) [155] Zwittermicin A

cũng có thể kiểm soát bệnh thối quả dưa chuột (Smith và cs, 1993) [157] và ngăn chặn các bệnh khác ở cây trồng (Silo-Suh và cs, 1998) [167]

Bacillusbrevis (BreviBacillus brevis) và B polymyxa (PaeniBacillus polymyxa)

sản xuất kháng sinh gramicidin S và polymyxin B peptide có tác dụng ức chế mạnh sự

nảy mầm của nấm Botrytis cinerea gây bệnh mốc xám trong ống nghiệm nhưng cũng thể hiện hoạt tính cao trong điều kiện tự nhiên chống lại bệnh do nấm B cinerea gây ra

trên dâu tây (Haggag, 2008) [89]

Thí nghiệm trên cây đậu và cà chua cho thấy sự biểu hiện quá mức của gen sinh

tổng hợp hoạt chất kháng sinh surfactin và fengycin ở chủng B subtilis sản xuất có liên

quan đến sự gia tăng đáng kể về khả năng gây ra tính kháng của các dẫn xuất Hơn nữa, việc giảm bệnh ở cấp độ vĩ mô do sản xuất quá nhiều surfactin có liên quan đến những thay đổi trao đổi chất liên quan đến phòng vệ trong các mô thực vật chủ (Ongena và cs, 2007) [135] Các hợp chất dễ bay hơi như 2,3-butanediol (Ryu và cs, 2004) [152] và

lipopeptide là những hợp chất duy nhất được hình thành bởi Bacillus spp được xác định

là tác nhân có thể gây ra hiệu ứng kích kháng cho cây trồng

Tại Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy tiềm năng của việc sử dụng các chủng vi

khuẩn Bacillus spp như là tác nhân phòng trừ sinh học có hiệu quả trong kiểm soát một

số bệnh gây hại trên cây trồng (Nguyễn Thị Thu Cúc và cs, 2016) [2] Việc áp dụng vi khuẩn vùng rễ trong sản xuất nông nghiệp đang chủ yếu khai thác theo 2 hướng, như phân bón vi sinh và ứng dụng trong phòng trừ sinh học Các kết quả nghiên cứu đã xác

định khả năng phòng trừ sinh học của các chủng vi khuẩn vùng rễ như B

amyloliquefaciens (Trần Vũ Phến và cs, 2011; Trần Vũ Phến và cs, 2013) [20, 21], Bacillus spp (Trịnh Thành Trung và cs, 2013; Trần Vũ Phến và cs, 2014) [30, 22]

Nguyễn Thị Thu Nga và cs (2010) [134] đã thực hiện nghiên cứu đầu tiên sử

dụng hai chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 231-1 và Bacillus 8 có khả năng phòng chống bệnh nứt thân chảy nhựa trên cây dưa hấu do nấm D bryoniae gây ra trong điều kiện nhà lưới Tiếp đó, việc sử dụng vi khuẩn P fluorescens 231-1 với nghiệm

thức (áo đất, tưới hạt và phun lá) cũng mang lại hiệu quả phòng chống cao đối với bệnh

nứt thân chảy nhựa do nấm D bryoniae gây ra ở điều kiện ngoài đồng (Nguyễn Thanh

Giàu và Nguyễn Trung Long, 2010) [134]

Vi khuẩn B subtilis có thể kết hợp với thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh héo

xanh khoai tây cho hiệu quả cao (Nguyễn Tất Thắng và cs, 2011) [26] Nghiên cứu của

Trịnh Thành Trung và cs (2013) [30] cho rằng vi khuẩn Bacillus với chủng B

amyloliquefaciens subsp plantarumspp 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên

là chủng có tiềm năng trong sản xuất chế phẩm sinh học để thương mại với hiệu quả cao Một số nghiên cứu về tác nhân sinh học trong quản lý bệnh hại cho thấy sử dụng TRICO-ĐHCT trộn và tưới vào đất có khả năng hạn chế bệnh hại so với đối chứng (Dương Minh và cs, 2010) [16]

Một số chủng vi khuẩn Bacillus trên cây trồng tại miền Trung Việt Nam đã được

phân lập và định danh (Le và cs, 2018) [109]

1.4.2 Vi khuẩn Bacillus và khả năng kích thích sinh trưởng thực vật

1.4.2.1 Cơ chế kích thích sinh trưởng thực vật của vi khuẩn

Vi sinh vật được sử dụng như một liệu pháp kiểm soát một số đối tượng sinh vật gây hại thân thiện với môi trường thay cho các liệu pháp hoá học, góp phần tạo nên một nền nông nghiệp xanh và bền vững Ứng dụng vi sinh vật vào nông nghiệp không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khoẻ con người, vật nuôi hay ô nhiễm môi trường, làm tăng năng suất, chất lượng nông sản Ngoài khả năng trực tiếp làm giảm tỷ lệ mắc bệnh trên cây trồng, các vi sinh vật có ích còn có tác dụng tích cực khác đối với cây trồng như thúc đẩy sự tăng trưởng và dinh dưỡng thực vật (chất kích thích thực vật hay phân bón sinh học) hoặc tạo điều kiện cho sự tương tác giữa cây chủ và các sinh vật có ích khác (Antoun và Prevost, 2006) [38] (Hình 1.5)

Trong quá trình sinh trưởng, PGPR có khả năng tăng cường sinh trưởng của cây trồng thông qua cơ chế tác động gián tiếp hoặc trực tiếp Cơ chế gián tiếp gồm hoạt hoá ACC deaminase, tổng hợp antibiotics và các enzyme thuỷ phân, tăng cường tính kháng

hệ thống (Brucker và cs, 2008; Mazurier và cs, 2009; Sherathia và cs, 2016) [50, 128, 160] Cơ chế trực tiếp gồm: [i] Tăng cường quá trình trao đổi và hoạt hóa các chất dinh dưỡng cho cây như hoà tan phosphate, cố định nitơ, tổng hợp siderophore; [ii] Tác động trực tiếp đến phytohormone, sản sinh các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (CĐHTTTV) nội sinh (Costa và cs, 2018; Gomes và cs, 2018) [61, 82]

Một số vi sinh vật có khả năng sản xuất CĐHTTTV như auxin, gibberellin, cytokinin hay tạo ra enzyme phân hủy tiền chất ethylene để hạn chế nồng độ ethylene nội sinh trong cây, làm tăng khả năng sinh trưởng và sự phát triển của thực vật đặc biệt trong điều kiện stress (Francis và cs, 2010; Lugtenberg và Kamilova, 2009) [62, 106]