Nghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trị

Nghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trịNghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trị

NCS NGUYỄN VĂN TUYÊN

NGHIÊN CỨU NHIỄM GIUN, SÁN ĐƯỜNG TIÊU HÓA VÀ HÔ HẤP Ở LỢN BẢN ĐỊA TỈNH ĐIỆN BIÊN,

ĐẶC ĐIỂM BỆNH DO GIUN PHỔI Metastrongylus spp GÂY RA

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học Thú yMã số: 9.64.01.04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, 2022

Luận án được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS TS Nguyễn Thị Kim Lan 2 PGS.TS Nguyễn Thị Ngân

Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường: Họp tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia

- Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên

- Thư viện Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1 Tuyen N V., Lan N T K., Doanh P N (2019), “Morphological and

molecular characteristics of adult worms of Gnathostoma Owen,

1836 (Nematoda) collected from domestic pigs in Dien Bien

Province, northern Vietnam”, Folia Parasitologica, 66:010.

2 Nguyễn Văn Tuyên, Nguyễn Thị Kim Lan (2019), “Tình hình nhiễm

sán lá ruột F buski trên đàn lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên”, Tạpchí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XXVI, số 7, tr 74 - 79.

3 Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Tuyên, Nguyễn Thị Ngân

(2020), “Một số đặc điểm dịch tễ bệnh giun phổi trên lợn bản địa

tại huyện Điện Biên Đông và Mường Ảng, tỉnh Điện Biên”, Tạpchí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XXVII, số 5, tr 66 - 73.

4 Nguyễn Văn Tuyên, Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân (2020),

“Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh giun phổi trên

lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y,

tập XXVII, số 7, tr 59 - 66.

5 Tuyen N V., Lan N T K., Doanh P N (2021), Molecular

phylogenetic relationships of Metastrongylus nematodes withemphasis on specimens from domestic pigs in Vietnam, Journalof Helmlnthotogy, 95, e52, 1 - 6.

6 Nguyễn Văn Tuyên, Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân,

Phạm Diệu Thùy (2021), “Tình hình nhiễm giun đầu gai

Macracanthorhynchus hirudinaceus Pallas, 1781 ở lợn bản địanuôi tại tỉnh Điện Biên”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập

XXVII, số 6.

MỞ ĐẦU1.Tính cấp thiết của đề tài

Chăn nuôi lợn chiếm một vị trí vô cùng quan trọng trong ngành chănnuôi gia súc ở các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam Hiện nay, sựphát triển chăn nuôi lợn ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn về dịch bệnh,ngoài bệnh truyền nhiễm lợn cũng dễ mắc các bệnh ký sinh trùng Thốngkê cho thấy, đã phát hiện được trên 50 loài ký sinh trùng gây bệnh ở lợn(Phạm Sỹ Lăng và cs., 2006) Những bệnh ký sinh trùng đã làm ảnh hưởngđến quá trình sinh trưởng của lợn, làm tăng tiêu tốn thức ăn, giảm tăngtrọng và các chi phí như thuốc điều trị, công chăm sóc nuôi dưỡng so vớilợn không bị bệnh Không chỉ vậy, giun, sán ký sinh còn gây ra các tổnthương làm giảm sức đề kháng của lợn và mở đường cho nhiều loại vikhuẩn, virus xâm nhập, gây bệnh Trong đó có các loài giun phổi ký sinhvà gây bệnh ở đường hô hấp lợn.

Bệnh giun phổi do một số loài giun tròn thuộc giống Metastrongylus gây

ra Giun phổi gây các tổn thương ở đường hô hấp, gây viêm phế quản, viêmphổi, làm giảm tăng trọng so với lợn không mắc bệnh và dễ chết nếu khôngđược điều trị kịp thời (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012; Heinz Mehlhorn, 2016).

Điện Biên là một tỉnh miền núi ở khu vực Tây Bắc Việt Nam Theothống kê, toàn tỉnh hiện có trên 290.000 con lợn (Tổng cục thống kê,2021), trong đó giống lợn bản địa được nuôi phổ biến với quy mô một vàicon tại các hộ gia đình Lợn bản địa chịu đựng tốt với điều kiện chăn nuôiở các nông hộ nghèo, ít bệnh tật, thịt thơm ngon Tuy nhiên, do điều kiệnkinh tế còn gặp rất nhiều khó khăn, mặt bằng dân trí còn thấp, chăn nuôilợn của tỉnh vẫn mang tính quảng canh, tận dụng, chủ yếu theo phươngthức nuôi thả rông, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuấtchăn nuôi còn nhiều hạn chế Do vậy đàn lợn nuôi tại tỉnh Điện Biên dễ bịnhiễm giun, sán, đặc biệt là giun phổi lợn.

Xuất phát từ nhu cầu cấp bách của thực tiễn chăn nuôi và phòngchống bệnh cho đàn lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên, chúng tôi thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợnbản địa tỉnh Điện Biên, đặc điểm bệnh do giun phổi Metastrongylusspp gây ra và biện pháp phòng trị”.

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định thành phần loài, sự phân bố, tình hình nhiễm giun, sán

đường tiêu hóa và hô hấp, đặc điểm bệnh giun phổi do Metatrongylus

spp gây ra trên lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên Xác định các yếu tốnguy cơ mắc bệnh giun phổi ở lợn bản địa theo phương thức chăn nuôi

tại tỉnh Điện Biên Từ đó, đề xuất được biện pháp phòng trị bệnh giun,sán nói chung và bệnh giun phổi nói riêng cho lợn bản địa ở tỉnh ĐiệnBiên có hiệu quả.

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về thực trạng nhiễmcác loài giun, sán ở đường tiêu hóa và hô hấp của lợn bản địa tại tỉnhĐiện Biên; đặc điểm dịch tễ, vòng đời sinh học, đặc điểm bệnh lý vàlâm sàng của bệnh giun phổi; từ đó có cơ sở khoa học xây dựng quytrình phòng, trị bệnh giun phổi cho lợn có hiệu quả cao.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để khuyến cáo người chănnuôi lợn tại tỉnh Điện Biên áp dụng các biện pháp phòng chống bệnhgiun, sán hữu hiệu nhằm giảm thiểu tác động có hại do các loài giun,sán gây ra ở lợn nói chung và hạn chế tỷ lệ nhiễm bệnh giun phổi cholợn nói riêng, góp phần phát triển chăn nuôi lợn theo hướng bền vững.

4 Những đóng góp mới của đề tài

- Đã xác định được thành phần loài và tình hình nhiễm giun, sánđường tiêu hóa và hô hấp trên lợn bản địa.

- Phát hiện được 1 loài giun tròn thuộc giống Gnathostoma hoàn

toàn mới về đặc điểm di truyền so với những loài đã công bố trên ngânhàng gen quốc tế.

- Định danh được loài M elongatus và M pudendotectus gây bệnh

giun phổi trên đàn lợn bản địa bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

- Định danh được 2 loài giun đất - vật chủ trung gian của giun phổi

lợn là Pontoscolex corethrurus và Pheretima aspergillum; Xác định

được thời gian hoàn thành vòng đời của giun phổi ở lợn gây nhiễm là31 - 36 ngày.

- Đề xuất được biện pháp phòng, trị bệnh do giun phổi

Metastrongylus spp gây ra cho lợn có hiệu quả, khuyến cáo và áp dụng

rộng rãi tại các nông hộ nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Điện Biên và các tỉnhkhác.

5 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 115 trang (không kể danh mục tài liệu tham khảo vàphụ lục), mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 28 trang, đối tượng, vật liệu,nội dung và phương pháp nghiên cứu 17 trang, kết quả và thảo luận 65trang, kết luận và đề nghị 2 trang Luận án gồm 32 bảng, 107 hình ảnh và

biểu đồ, 134 tài liệu tham khảo (35 tài liệu tiếng việt, 98 tài liệu tiếngnước ngoài, 1 tài liệu internet, trong đó 52 tài liệu từ năm 2016 - 2021).

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tại Việt Nam, đã phát hiện được 52 loài ký sinh trùng ký sinh ởlợn, bao gồm các lớp giun tròn, sán dây, sán lá, giun đầu gai, đơn bàovà côn trùng ký sinh Trong đó, lớp giun tròn có số lượng loài phongphú và đa dạng nhất (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2006).

Đến nay, đã có 5 loài giun phổi lợn được phát hiện, trong đó loài

M elongatus, M pudendotectus và M salmi có phân bố rộng hơn 2 loàiM asymetricus và M confusus Loài M asymetricus giới hạn ở châuÂu và Đông Á, trong khi loài M confusus chỉ được tìm thấy ở châu Phi

và châu Âu Phạm Văn Khuê (1982), Phan Địch Lân và cs (2005),Trương Vĩnh Yên (2008) cho biết, tại Việt Nam, có 3 loài giun tròn

thuộc giống Metastrongylus ký sinh ở khí quản lợn gồm: M elongatus,M pudendotectus và M salmi Trong đó loài M salmi có khả năng gây

bệnh cho người (Calvopina M và cs., 2016).

Ở các lứa tuổi khác nhau thì tỷ lệ nhiễm giun phổi khác nhau.Giovanni Poglayen và cs (2016), Nguyễn Hữu Hưng (1997) đều chobiết: lợn nhiễm giun phổi cao nhất ở giai đoạn 3-6 tháng tuổi, sau đógiảm dần Tuy nhiên, Phan Địch Lân và cs (2005) cho rằng: tỷ lệ nhiễmgiun phổi tăng dần theo tuổi lợn, tuổi lợn càng cao thì tỷ lệ nhiễm giunphổi càng nhiều Ngoài ra, điều kiện thời tiết, khí hậu, thổ nhưỡng, tậpquán chăn nuôi lợn có ảnh hưởng lớn đến sự phân bố cũng như phát triểncác loài giun phổi ở lợn

Vòng đời phát triển của giun phổi Metastrongylus spp có sự tham

gia của vật chủ trung gian là một số loài giun đất Khi lợn nhiễm giunphổi nhẹ thì không có triệu chứng rõ rệt, con vật vẫn ăn bình thườngnhưng gầy dần Khi bị nặng, con vật mệt mỏi, kém ăn, ít vận động, gầycòm, suy dinh dưỡng, ho, khó thở, nhất vào sáng sớm và buổi tối Nếukhông điều trị kịp thời và nuôi dưỡng chăm sóc chu đáo thì tỷ lệ chếtkhoảng 15 - 30% (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012).

Về mặt mô học, tổ chức phổi trở nên cứng, rắn chắc và có màu xám hoặctrắng, khí thũng ở phổi, phổi phù và xuất huyết; bạch cầu ái toan tăng, tế bào phổibị xơ hóa, hạch phổi sưng to (Patra G và cs., 2013, Lechner B và cs., 2016).

Để phòng bệnh do giun phổi gây ra cho lợn, cần tránh cho lợn tiếpxúc giun đất - vật chủ trung gian truyền bệnh (Schwartz K J., 2004;

Stewart T B.và Hoyt P G., 2006), dùng doramectin, moxidectin vàalbendazol để điều trị bệnh (Calvopina M và cs., 2016).

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn bản địa nuôi tại 5 huyện của tỉnh Điện Biên.- Giun, sán ký sinh ở đường tiêu hóa và hô hấp của lợn bản địa.

- Bệnh giun phổi do Metastrongylus spp gây ra trên lợn bản địa.

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

* Thời gian nghiên cứu: 2017 - 2021.* Địa điểm nghiên cứu:

- Các hộ chăn nuôi lợn bản địa tại 5 huyện thuộc tỉnh Điện Biên.- Địa điểm xét nghiệm mẫu: phòng thí nghiệm trường Cao đẳngKinh tế - Kỹ thuật Điện Biên; Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật; ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương; Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, Bệnhviện Đa Khoa tỉnh Điện Biên; Phòng khám Đa khoa Thanh Hải tỉnh ĐiệnBiên; trường Đại học Cần Thơ.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Động vật và các loại mẫu nghiên cứu

* Động vật nghiên cứu: lợn nuôi tại 5 huyện của tỉnh Điện Biên

* Mẫu nghiên cứu: mẫu phân lợn ở các lứa tuổi; mẫu giun sán thu

thập qua mổ khám; mẫu giun đất; mẫu máu lợn gây nhiễm giun phổi vàlợn khỏe; mẫu khí quản, chi nhánh khí quản, phổi, tim, gan, ruột củalợn gây nhiễm giun phổi và các mẫu tương ứng ở lợn khỏe mạnh.

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

Những hóa chất, dụng cụ cần thiết trong nghiên cứu ký sinh trùngvà sinh học phân tử, giải trình tự gene.

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm nhiễm giun, sánđường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên

- Định danh thành phần loài giun, sán ký sinh ở đường tiêu hóa vàhô hấp của lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên.

- Xác định đặc điểm nhiễm giun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ởlợn bản địa tại tỉnh Điện Biên.

2.3.2 Nghiên cứu giun phổi Metastrongylus spp và bệnh do giunphổi gây ra ở lợn bản địa

2.3.2.1 Định danh loài giun phổi thu được từ lợn

- Định danh loài giun phổi lợn bằng kỹ thuật hình thái học.- Thẩm định loài giun phổi lợn bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

2.3.2.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh giun phổi Metastrongylus spp trên lợnbản địa

* Qua mổ khám:

- Tỷ lệ và cường độ nhiễm giun phổi ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên.- Tỷ lệ và cường độ nhiễm đơn lẻ và hỗn hợp giun phổi

* Qua xét nghiệm phân:

- Tỷ lệ và cường độ nhiễm giun phổi ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên.- Tỷ lệ và cường độ nhiễm giun phổi theo tuổi lợn, phương thứcchăn nuôi, vùng địa hình và mùa trong năm.

2.3.2.3 Nghiên cứu nguy cơ nhiễm giun phổi ở lợn theo các phương thứcchăn nuôi

2.3.2.4 Nghiên cứu về loài giun đất - vật chủ trung gian của giun phổi

- Định danh các loài giun đất thu thập tại tỉnh Điện Biên

- Xác định loài giun đất là vật chủ trung gian của giun phổi lợn quaviệc xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng giun phổi ở giun đất.

2.3.2.5 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý và lâm sàng bệnh giun phổi trên lợnbản địa gây nhiễm và lợn nhiễm bệnh tự nhiên ngoài thực địa.

2.3.2.6 Nghiên cứu biện pháp phòng chống bệnh giun phổi cho lợnbản địa tại tỉnh Điện Biên

2.3.2.7 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh giun phổi cho lợn bảnđịa tại tỉnh Điện Biên

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm nhiễmgiun, sán đường tiêu hóa và hô hấp ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên

- Sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang (Nguyễn NhưThanh và cs., 2001).

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc.

- Mổ khám toàn diện cơ quan tiêu hoá và hô hấp của Skrjabin(1928), cố định tiêu bản và định danh theo khóa định loại của NguyễnThị Lê và cs (1996); Nguyễn Văn Đức và cs (2017) Đối với giun phổi

và những loài nghi ngờ như giun dạ dày Gnathostoma sp sẽ được thẩm

định bằng phân tích phân tử, có sử dụng đoạn chèn ITS2 của gen nhân

và một phần gen cox1 của hệ gen ty thể để phân tích Cường độ nhiễm

được xác định bằng cách đếm số lượng giun, sán ký sinh/lợn.

- Xét nghiệm phân tìm trứng giun, sán theo phương phápcherbovick và phương pháp lắng cặn Benedek (1943) Cường độ nhiễmđược xác định bằng cách đếm số trứng có trong 1 gam phân bằngbuồng đếm Mc Master.

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu giun phổi Metastrongylus spp vàbệnh giun phổi gây ra ở lợn bản địa

2.4.2.1 Định danh loài giun phổi ký sinh ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên* Phương pháp định danh loài giun phổi lợn bằng hình thái học

Theo khóa định loại của Nguyễn Thị Lê và cs (1996), Nguyễn VănĐức và cs (2017), căn cứ vào đặc điểm về hình thái, kích thước và cấutạo giun trưởng thành kết hợp với quan sát cấu trúc siêu vi của giunphổi dưới kính hiển vi điện tử quét FE-SEM S4800.

* Phương pháp định danh loài giun phổi lợn bằng kỹ thuật sinhhọc phân tử PCR và giải trình tự

Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để thẩm định 6 mẫu giun phổi thutừ lợn bản địa đã được định loại bằng kỹ thuật hình thái học Trong đó, loài

M elongatus (3 mẫu) và M pudendotectus (3 mẫu) Các mẫu giun trên

được bảo quản trong cồn Ethanol 96% cho đến khi phân tích phân tử đểgiám định loài Sử dụng đoạn chèn ITS2 (second internal transcribed

spacer) của gen nhân và một phần gen cox1 (Cytochrome c oxidase

subunit 1) của hệ gen ty thể để phân tích 6 mẫu trên.

Tách chiết DNA

Thực hiện phản ứng PCR

Nhân bản trình tự ITS2 và cox1 bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn sử

dụng cặp mồi 3S, A28 cho trình tự ITS2 và cặp mồi JB3, JB4 để nhân

bản đoạn gen cox1 (Bowles et al., 1993).

Bảng 2.1 Trình tự mồi tương ứng với đoạn gen

Đoạngen

JB4 5’-TAA AGA AAG AAC ATA ATG AAA ATG-3’

Phân tích, so sánh, vẽ cây phát sinh chủng loại bằng phương phápMaximum Likeklihood trên phần mềm MEGA 7.0 (Tamura et al., 2013).

2.4.2.2 Phương pháp xác định đặc điểm dịch tễ bệnh giun phổiMetastrongylus spp trên lợn bản địa qua xét nghiệm phân

Phương pháp xét nghiệm, xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm giunphổi ký sinh ở lợn bản địa được tiến hành theo phương pháp như đãtrình bày ở mục 2.4.1

2.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu nguy cơ nhiễm giun phổi ở lợn bảnđịa theo các phương thức chăn nuôi

Dùng chỉ số nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR) và tỷ số giữa2 xác suất (Odds ratio - OR) để so sánh các nguy cơ trên.

2.4.2.4 Phương pháp nghiên cứu giun đất - vật chủ trung gian của giunphổi lợn

- Phương pháp định danh phân loại giun đất: dựa vào tài liệu củacác tác giả Thái Trần Bái (1983), Đỗ Văn Nhượng (1995), NguyễnThanh Tùng (2013) Trên cơ sở định danh, xác định loài giun đất là vậtchủ trung gian để đem đi gây nhiễm.

- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng giun phổi trong giun đất:mổ từng cá thể giun đất thu được, ép nội quan của chúng lên phiến kính vàquan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 - 400 lần Việc xác định,phân biệt ấu trùng giun phổi với một số ấu trùng khác trong giun đấtdựa vào mô tả, xác định thông qua các đặc điểm như vị trí ký sinh, hìnhdạng ấu trùng … mà Nguyễn Đức Tân (1996) đã xác định

2.4.2.5 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý và lâm sàng bệnh giun phổi ở lợnbản địa

a Nghiên cứu trên lợn gây nhiễm- Thu thập giun đất để gây nhiễm

Giun đất được thu thập ở những nơi không chăn nuôi lợn, kiểm tra,

xác định chính xác loài giun đất Pontoscolex corethrurus là vật chủ

trung gian của giun phổi lợn Kiểm tra một số cá thể giun để chắc chắnsố giun thu thập không nhiễm ấu trùng và trứng giun phổi Sau đó nuôi320 cá thể giun đất trong các hộp, mỗi hộp có kích thước 60 x 30 x 20cm, cho đất, mùn vào hộp.

- Nuôi cấy ấu trùng giun phổi

Tiến hành thu thập giun phổi từ quá trình mổ khám tại các nông hộvà các cơ sở giết mổ Tất cả những giun còn sống được đưa vào cốc

thủy tinh có chứa dung dịch nước muối sinh lý 0,9% Trong điều kiệnphòng thí nghiệm, với nhiệt độ bình thường, giun phổi sống được trongnước muối sinh lý khoảng 3 - 5 ngày Trong khoảng thời gian này, giunphổi cái vẫn tiếp tục thải một lượng lớn trứng ra môi trường nuôi giun.Thu số lượng lớn trứng từ cặn lắng Trứng giun phổi thu được, được rảiđều lên bề mặt đất trong hộp nuôi giun đất Hàng ngày theo dõi độ ẩm,không để đất quá khô hoặc quá ướt.

Kiểm tra ấu trùng giun phổi trong giun đất 3 ngày 1 lần dưới kính hiểnvi Mỗi lần lấy 2 giun đất, rửa sạch, cắt dọc thân từ phần đầu giun đất, épcác nội quan của chúng lên trên phiến kính và quan sát dưới kính hiển vi.Khi phát hiện được ấu trùng giun phổi, đo kích thước của ấu trùng giunphổi bằng thước trắc vi thị kính Những ấu trùng có sức gây bệnh đượcdùng để gây nhiễm cho lợn Ấu trùng giun phổi có sức gây bệnh là ấutrùng có hình cong lưỡi liềm, chóp đuôi tù, có điểm dày giống nút áo.

- Thu thập ấu trùng có sức gây bệnh từ giun đất

Sau khi gây nhiễm trứng, ấu trùng giun phổi cho giun đất, kiểm trathấy ấu trùng giun phổi trong giun đất có hình cong lưỡi liềm, chópđuôi tù hoặc có điểm dày giống nút áo thì tiến hành thu thập Nghiềntoàn bộ số giun đất đã được gây nhiễm, cho vào cốc thủy tinh chứadung dịch nước muối sinh lý với tỷ lệ 1:10 (1 gram giun đất: 10ml dungdịch NaCl 0,9%), thả một số viên bi nhỏ vào cốc rồi đưa lên máy lắckhoảng 30 phút cho tan giun đất, lọc qua lưới lọc có đường kính lỗ lọc0,5mm để bỏ cặn thô Nước lọc được ly tâm 2500 vòng/phút trong 2phút, gạn bỏ nước bên trên, lấy cặn; cặn được cho vào ống nghiệm chứadung dịch Ringer’s, ly tâm tiếp 2 lần, thu cặn Đếm số ấu trùng có trongcặn rồi tập trung ấu trùng vào 1 cốc thủy tinh có chứa 50 ml dung dịchnước muối sinh lý, đảm bảo trong 1 ml chứa khoảng 100 ấu trùng giunphổi có sức gây bệnh, từ đó tính liều ấu trùng để gây nhiễm cho lợn.

- Phương pháp theo dõi thời gian hoàn thành vòng đời của giunphổi trên lợn gây nhiễm

Sau khi gây nhiễm, mỗi lợn được nuôi riêng trong một lồng, cáchly hoàn toàn, ăn thức ăn không có thuốc phòng, trị giun, sán Lô đốichứng (5 con) cũng được nuôi trong điều kiện tương tự.

Từ ngày thứ 21 sau gây nhiễm trở đi, tiến hành xét nghiệm phânlợn hàng ngày cho tới khi phát hiện được trứng giun phổi trong phân.

Theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn Thời gian bắt đầu xuất hiệntrứng giun phổi trong phân lợn gây nhiễm chính là thời gian hoànthành vòng đời của giun trên cơ thể lợn.

- Phương pháp nghiên cứu bệnh lý và lâm sàng của lợn gây nhiễm+ Quan sát triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm

Theo dõi tốc độ sinh trưởng của lợn được xác định bằng việc cânkhối lượng lợn ở cả 2 lô vào thời điểm trước và sau thí nghiệm 63 ngày.Sau khi lợn gây nhiễm xuất hiện trứng giun phổi trong phân, tiến hànhquan sát, theo dõi về thân nhiệt, thể trạng, vận động, ăn uống, lông da, trạngthái thần kinh của lợn Cũng quan sát như vậy với những lợn ở lô đối chứng.

+ Xét nghiệm máu để xác định sự thay đổi công thức bạch cầu củalợn nhiễm giun phổi do gây nhiễm và lợn đối chứng.

Phương pháp lấy mẫu:

Sau khi xét nghiệm thấy trứng giun phổi trong phân lợn gây nhiễmthì tiến hành lấy mẫu máu của lợn ở cả 2 lô trong cùng thời điểm nuôi.

Phương pháp xét nghiệm

Các chỉ tiêu hệ bạch cầu như số lượng bạch cầu, công thức bạchcầu (tỷ lệ bạch cầu có hạt, bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân lớn)được thực hiện trên máy phân tích huyết học BK-6310.

- Phương pháp xác định những tổn thương đại thể

Mổ khám tất cả số lợn gây nhiễm và đối chứng ở ngày thứ 64 và 65sau gây nhiễm bằng phương pháp mổ khám không toàn diện Quan sát kỹbằng mắt thường và kính lúp dọc theo đường hô hấp, đường tiêu hóa vàtim của lợn Tìm giun phổi ở chi nhánh khí quản Chụp ảnh những vùngcó tổn thương đại thể điển hình Lấy bệnh phẩm là phổi, gan, tim, khíquản và ruột của lợn gây nhiễm, ngâm trong dung dịch formol 10% đểlàm tiêu bản vi thể.

- Phương pháp xác định những tổn thương vi thể

Xác định tổn thương vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chứchọc theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin, đọckết quả dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 200 - 400 lần.Chụp ảnh những biến đổi vi thể điển hình trên tiêu bản.

b Nghiên cứu trên lợn nhiễm tự nhiên ngoài thực địa

Theo dõi biểu hiện lâm sàng và xác định tổn thương đại thể đượcxác định như đối với lợn gây nhiễm

2.4.2.6 Phương pháp nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh giun phổicho lợn bản địa nuôi tại Điện Biên

Đánh giá hiệu lực, độ an toàn của 3 loại thuốc tẩy tetramisol (15 mg/kg TT), ivermectin (0,3 mg/kg TT), fenbendazol (5 mg/kg TT) trên lợngây nhiễm, diện hẹp và diện rộng tại các địa phương.

2.4.2.7 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh giun phổi cho lợn bảnđịa tại tỉnh Điện Biên.

Từ những kết quả nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ và kết quả thửnghiệm thuốc nói trên, đề xuất biện pháp phòng chống tổng hợp bệnhgiun phổi cho đàn lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên.

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh họccủa Nguyễn Đình Hiền và Đỗ Đức Lực (2017), trên phần mềm Excel2007, Epicalc 2000 và Minitab 16.0.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thành phần loài và đặc điểm nhiễm giun, sán ở lợn bản địa

3.1.1 Thành phần loài giun, sán ký sinh ở lợn bản địa

Bảng 3.1 Thành phần loài và sự phânbố các loài giun, sán đường tiêu hóa và

hô hấp ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên

Tên loài giun, sánVị trí kýsinh

Địa điểm nghiên cứu (huyện)Tầnsuấtxuấthiện(%)Điện

Mường Nhé

Phát hiện được 8 loài giun, sán ký sinh ở đường tiêu hóa và hô hấp

lợn tại Điện Biên: Fasciolopsis buski, Ascaris suum, Trichocephalussuis, Ascarops strongylina, Gnathostoma sp., Metastrongylus elongatus,Metastrongylus pudendotectus, Macracanthorhynchus hirudinaceus;trong đó, F buski, A suum, Trichocephalus suis, M elongatus, M.hirudinaceus đều xuất hiện ở cả 5 huyện với tần suất xuất hiện 100%.

Trong 8 loài giun, sán được phát hiện thì loài Gnathostoma sp có hìnhthái loài giống với G doloresi nhất, với một chút khác biệt về gai sinh dục

của giun đực Tuy nhiên, về mặt sinh học phân tử, chúng có sự khác biệt lớn

về mặt di truyền so với G doloresi và các loài Gnathostoma khác trong cảhai trình tự ITS2 và cox1 Trình tự ITS2 có chiều dài 578 bp và trình tựcox1 có chiều dài 393 bp Dữ liệu hình thái học và sinh học phân tử đã xácnhận rõ ràng loài giun trong Gnathostoma sp trong nghiên cứu này là một

loài mới có nguồn gốc từ lợn của Việt Nam (kết quả mô tả, định danh bằng

hình thái học và sinh học phân tử của loài Gnathostoma spp được trình bày

chi tiết ở luận án chính).

3.1.2 Đặc điểm nhiễm giun, sán đường tiêu hóa vàhô hấp ở lợn bản địa

3.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm giun, sán ở lợn bản địa tại các địaphương thuộc tỉnh Điện Biên

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm giun, sán ở lợn bản địa tại tỉnh Điện Biên

(Qua mổ khám)

Địa phương(huyện)

Sán láGiun trònGiun đầu gaiSố lợn

Tỷ lệ(%)

Số lợnnhiễm(con)

Tỷ lệ(%)

Số lợnnhiễm(con)

Tỷ lệ(%)